Metody studia organismů

Metody studia organismů
Odběry vzorků, mikroskopické analýzy, kultivační metody
Biologické metody
• Mikrobiologické a hydrobiologické metody –
různé typy vzorků, kvantifikace, využití v praxi (?)
• Mikroskopické metody
• Kultivační metody (typy kultivací, médií,
diagnostika mikroorganismů – metody cytologické a
diagnostické)
• Biochemické metody (stanovení koncentrace
chlorofylu-a, testy biologické aktivity, ATP)
• Metody molekulární biologie
1.1 Metody odběru vzorků
• Vzorky vody, filtráty
• Nárosty, biofilmy, přisedlá společenstva
• Sedimenty, kaly
Vzorkovnice určené k odběru vzorků Konzervace vzorků (barvení)
Planktonní síť
Odběrák
van Dorna
Integrovaný odběrák
Drapák sedimentů
Horizontální vzorkovač
Odběr hadicí
– profil
nádrže,
směsný
vzorek
a)
spouštění hadice
1-lano, 2-korek, 3-závaží
b) zvedání hadice se vzorkem
Smyčky,
exponovaná skla
Vatové stěrky, odběr biofilmů, nárostů
Otisky
1.2 Úprava vzorků
• Centrifugace
• Sedimentace
• Filtrace
Centrifuga, centrifugační zkumavky
Sedimentační komůrky
Metoda proměřování
buněk řas – zjištění
objemové biomasy
Použití inverzního
mikroskopu
Membránová filtrace –
vícestupňová filtrace
2. Mikroskopické metody
Vzdálenost
tubusu
okuláry
160/0.17
60/0.85
Zvětšení
objektivu
Objektiv
Příprava preparátu
Tloušťka
krycího
skla
Numerická
apertura
objektivy
křížový stolek
kondenzor
makro- a
mikrošroub
clona a
matnice
Fluorescenční mikroskop
Typy preparátů,
pozorování
Barvení bakterií
Barvení mikromycet
2.1 Kvantifikace (mikroskopie)
Počítací komůrky, pomůcky pro mikroskopický rozbor
Počítací komůrka
Cyrus I.
Mikropipetka
Centrifugační zkumavka
Bürker
10 mm
125 m
250 m
2.
1.
3.
4.
6.
5.
7.
f = (K/n).v.10
K … 1600, n … vyšetřená pole,
v … odstředěný zbytek
8.
10.
9.
6
1 2 3
y´ … objektivní měřítko
y …okulárové měřítko
Pomůcka pro zjišťování rozměrů organismů
 y 
1dílek     0.01mm
 y
Konečně měřený objekt
10x objektiv
40x objektiv
1
2
3
4
5
6
7
8
3. Kultivační metody
Důležitá je sterilita práce a
prostředí
Dezinfekce
Sterilizační nádoby,
očkovací kličky, boxy,
Petriho misky
Nalévání roztopeného agaru do Petriho
misek
Příprava šikmého agaru
Očkování Petriho
misky pipetou
Přenesení filtru na agarovou plotnu
Očkování Petriho misky kličkou
Práce se vzorky,
média
Média, úprava vzorků
Želatinový disk
bakterie
Roztěry, přímý výsev, membránová filtrace
Organotrofní
organismy – 22°C a
36°C
Nanášení vzorku pipetou
Uložení misek v termostatu
Nalité misky
Membránový filtr
Odečty
Compact Dry YC,
Compact Dry EC,
Compact Dry TC
DST metody
Colilert- P/A
-Žlutá (P)
-Modrá (E.coli)-fluorescence
Colilert QuantiTray
Vzorek s činidlem do plata QuantiTray, QT/2000 –
zatavovačka – kultivace 24h
Identifikace mikromycet (?)
Kultivace na SBA,
mikroskopická identifikace
Testery
- koliformní,
dezinfekce, celkové,
mikromycety
4. Biochemické metody
Měření koncentrace chlorofylu-a
Postup:
filtrace (skleněná vlákna),
extrakce v 90% etanolu, vodní
lázeň při 75°C (5 min), vyčištění
extraktu (centrifugace),
měření při 665 a 750 nm před a
po okyselení vzorku HCl,
výpočet (výsledky v µg/l) dle
známých vlastností chlorofylu-a
BART
Železité
Slizotvorné
Aktivita mikroorganismů – měření ATP
5. Metody molekulární biologie
• nahrazují či doplňují klasické kultivační metody
• metody centrifugační, metody extrakce a purifikace DNA (RNA),
elektroforetické (DGGE, TGGE), hybridizační a amplifikační metody
(PCR)
Gelová elektroforéza
Polymerázová řetězcová reakce (PCR)
PŘÍPRAVA TEMPLÁTU (ČISTÉ DNA): inkubace, lyzostafin, TE •
resuspendace, homogenizace, inkubace (lázeň 37C/15 min)
• denaturace DNA (95 C/15 min) • homogenizace, centrifugace při
13 000 ot./15 min • templát je hotov
20 až 40 cyklů ve
3 krocích:
PŘÍPRAVA AMPLIKONU :
reakční směs pro PCR (Taqpolymeráza, nukleotidy a Mg2+,
2 primery a destilovaná voda)
cycler, templátová DNA ke směsi
1 minuta, 94 °C
45 sekund, 54 °C
2 minuty, 72 °C
jen dNTP
1)
2)
3)
FISH - fluorescenční in situ hybridizace
• využití specifických sekvencí nukleových kyselin (zejména 16S a 23S) pomocí
tzv. genových sond (uměle syntetizované oligonukleotidy, 15-30 nukleotidů),
které hybridizují s cílovou nukleovou kyselinou na základě komplementarity bází,
které jsou pro zviditelnění obvykle fluorescenčně označeny
• Fixace bakterií, inkubace a promývání, hybridizace a mikroskopování
G+ a G- jiné
metody fixace
Využití sond Cy-3 a
Cy-5 při detekci
nitrifikačních bakterií