Kapalinová chromatografie.

Kapalinová chromatografie v
analytické toxikologii
Věra Pacáková
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta,
katedra analytické chemie
Obsah
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Úvod
Principy HPLC
Instrumentace
Úprava vzorku
Analýza drog a jejich metabolitů
Závěry
1. Úvod
GC – obvykle vyžaduje derivatizaci, bezvodé vzorky
HPLC - doplňuje a nyní i nahrazuje GC
Výhody – 85 % všech látek lze stanovit (tepelně
labilních, polárních, nízko- i vysokomolekulárních), přímá analýza bez derivatizace –
časová úspora, přímý nástřik vodných vzorků
Ve spojení s citlivou detekcí – MS – možnost
identifikace a kvantifikace
Nevýhody: pomalá difúze v kapalinách, nižší
účinnost než GC, vyšší finanční náklady na
analýzu (nákladnější přístroj, rozpouštědla)
2. Principy HPLC
• Mobilní fáze:
kapalina
složení mobilní fáze ovlivňuje
separaci
• Stacionární fáze: chemicky vázané fáze
adsorbenty
měniče iontů
gely (pro SEC)
afinitní fáze
Vysoká účinnost a rychlost analýzy – vysoké tlaky a
malé částice s jednotnou velikostí, homogenně
naplněné v koloně
Chromatogram (kvalita, kvantita, účinnost separace)
tR – retenční čas, t´R – redukovaný čas, plocha nebo výška píku,
w – šířka píku
Závislost H na lineární průtokové rychlosti
mobilní fáze u
H (výškový ekvivalent teoret. patra) = L/n
n (počet pater) = 16(tR/w)2
H
A + B/u + Cu
B/u
Cu
A
u
Závislost H na velikosti částic
Čím < velikost částic, tím < H a tím > účinnost separace
8 m
5 m
3 m
2 m
Volba kolony
Náplně:
• zcela porézní částice 2- 10 m, velikost pórů 10 – 50
nm, pravidelného kulovitého tvaru, homogenně
naplněné v koloně
• pelikulární – polopropustné (nepropustné jádro, tenká
pórovitá vrstva
• nepórovité – rychlá sorpce, malá zátěž, póry 0,2 – 0,4
nm nedostupné pro solut
• monolitické kolony, vtištěné polymery
Specifický povrch zátěž (dávkování)
póry 10 nm 170 m2
30 nm 100 m2
nepórovité 0,6 – 6 m2/g
Miniaturizace ( HPLC)
Zmenšování velikosti částic a průměru kolony
Výhody:
• snížení spotřeby a odpadu rozpouštědel, stacionární
fáze a vzorku
• vyšší účinnost separace
• vyšší citlivost detekce
• kompatibilita s MS detekcí
Průměr kolony
4,5 mm
1 mm
0,25 mm
Průtok
1 mL/min
0,047 mL/min
0,003 mL/min
Chemicky vázané fáze
• Univerzální, vhodné pro biologické vzorky, rychlé
ustavování rovnováhy- vysoká separační účinnost
• Nosič (silikagel, organický polymer) s navázanými
funkčními skupinami:
alkyly, zejména oktyl, oktadecyl, fenyl – nepolární
(reverzní) fáze – nejvýznamnější (RPLC)
normální fáze – polární – méně používané
iontově výměnné skupiny -SO3H, - COOH, -NH2,
-N+(R)3
chirální stacionární fáze (cyklodextriny a další)
Struktura chemicky vázaných fází
Mobilní fáze
• Mobilní fáze není inertní, ovlivňuje separaci
• Možnosti změny složení mobilní fáze jsou prakticky
neomezené
• Obecné požadavky: dobrá rozpustnost pro soluty,
kompatibilita s detekcí (UV hrana), toxicita, viskosita,
těkavost
• reverzní fáze – voda + organická rozpouštědla (pufry, pH,
iontově párová činidla…)
retence (log k) ~ obsah org. rozpouštědla
• nepolární fáze – nepolární organické rozpouštědlo +
polární modifikátor (<1 %)
• měniče iontů – pufry
Izokratická vs. gradientová eluce (obdoba programování
teploty v GC)
Derivatizace
• Derivatizací měníme fyzikální a chemické
vlastnosti analytů. Hlavní důvody pro převedení
analytů na deriváty jsou tyto:
• zlepšení detekovatelnosti (nejčastěji v
kombinaci s fluorescenčním detektorem)
• zvýšení těkavosti (v GC)
• zlepšení chromatografických vlastností (např.
změna polarity),
• zlepšení stability analytů,
• umožnění chirální separace,
• změna matrice pro lepší separaci.
Kvalitativní analýza
k = (tR – tM) /tM
(retenční poměr)
r12 = 12 = t´R2/t´R1 = k2/k1
(relativní retence, selektivita)
Reprodukovatelnost:
složení mobilní fáze, pracovní teplota, příprava
stacionární fáze
Kvantitativní analýza
Zdroje chyb:
•
•
•
•
Odběr reprezentativního vzorku
Úprava vzorku (nejvýznamnější)
Dávkování (1-2 %)
Stacionární fáze
• Instrumentace, zpracování signálu a interpretace
Pracovní techniky při vyhodnocování chromatogramů
• Vnitřní normalizace:
A – plocha
m – množství
Vi, Vs – objemy při ředění
vi,vs – dávkované objemy
vzorku a stand.
RMR – relativní mol.
odezva
xi = (Ai / Aj ) 100
• Absolutní kalibrace
mi = (Ai/As) ms
• Vnitřní standardizace
mi = (RMRsr/RMRir) (Ai/As) (Vs/ Vi) ms
• Metoda standardního přídavku
mi
Vs
ms
Vi Ais vi
V
1 s
Ai vis
Vi
1
3. Instrumentace
Blokové schéma chromatografu
1 - zdroj mobilní fáze, 2 – čerpadlo, 3 – dávkovač, 4 - kolona,
5 - detektor, 6,7 - zařízení pro zpracování signálu detektoru
• Zásobník m.f. – uzavřená nádoba, odplynit
• čerpadla – bezpulzní, vysokotlaká, průtoky od
l/min po mL/min
• dávkovače – smyčkové (vzorky v l) automatické
dávkovače
• kolony – preparativní či analytické, náplňové i
kapilární, vnitřní průměr od desítek m po
jednotky mm, nerezové či skleněné
• detektory – spektrofotometrický (diode-array)
refraktometrický, elektrochemický, fluorescenční,
hmotnostní
• vyhodnocovací zařízení
Čerpadlo reciprokační
Schéma šesticestného dávkovacího ventilu se smyčkou
a - plnění smyčky, b - vymývání smyčky do kolony
1, 4 - připojení smyčky, 2 - přívod mobilní fáze od čerpadla, 3 připojení kolony, 5, 6 - odpad; nástřik v poloze 4
Kolony:
•
•
•
•
náplňové 3 – 5 mm, ~ 1 mL/min
mikronáplňové ~ 1 mm, ~ 20 - 60 L/min
kapilární ~ 10 m, ~ nl/min
Materiály: silikagel (pH 2-8, endcapping)
alumina (pro bazické látky)
organické polymery
Monolitické kolony
Vtištěné polymery
Monolitické kolony
• až 97 % objemu kolony zaujímá stacionární fáze (oproti ca
70 % u náplňových kolon)
• vyšší účinnost separace
• velká porozita vysoký průtok, rychlé analýzy
makropóry – 2 m
mesopóry – 13 nm
velký průtok, malý tlakový spád
velký povrch pro sorpci analytů
• na bázi silikagelu nebo organických polymerů
Detektory
• UV/VIS – nejběžnější, s diodovým polem (DAD),
téměř univerzální
• fluorescenční – citlivý, selektivní, derivatizace
• elektrochemický- citlivý i selektivní, omezené
použití
• hmotnostní – nejvyšší vypovídací schopnost
(kvalita i kvantita), vysoká citlivost a selektivita
UV/VIS detektor
(a) schéma, (b) uspořádání mřížky
Schéma fluorescenčního detektoru
1, 2 - vstup a výstup mobilní fáze, 3 - excitační záření, 4 - emitované
záření, 5 - vnější plášť cely, 6 - optický systém, 7 - cela (5 l), 8 - držák
Blokové schéma hmotnostního spektrometru
• Iontový zdroj - převedení analytu do ionizovaného
stavu, fragmentace.
• Hmotnostní analyzátor rozděluje v prostoru nebo
čase směs iontů o různých poměrech hmotnosti ku
náboji (m/z), produkovanou v iontovém zdroji.
• Detektor poskytuje analogový signál úměrný počtu
dopadajících iontů.
• Po digitalizaci převeden do počítače a zpracován do
hmotnostních spekter.
• Hmotnostní spektrometr pracuje za velmi nízkých
tlaků - výkonný vakuový čerpací systém.
• Vstup umožňující převedení vzorku do iontového
zdroje.
• GC-MS nebo HPC-MS vhodné rozhraní (interface)
snižující podíl mobilní fáze
Iontové zdroje
• Ionizační energie 7-16 eV
• Výtěžek ionizace kolem 0,01%
• Ionizační techniky měkké (nízká fragmentace) a tvrdé
(vysoká fragmentace)
GC
• Ionizace elektronem (electron ionization, EI)
• Chemická ionizace (chemical ionization, CI)
HPLC
Sprejové ionizační techniky v kapalné fázi, měkké
• termosprejová ionizace (thermospray, TS)
• elektrosprejová ionizace (electrospray, ES)
• chemické ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric
pressure chemical ionization, APCI )
Schéma iontového zdroje ES
Schéma iontového zdroje APCI
Analyzátory
•
•
•
•
Magnetický hmotnostní analyzátor
Kvadrupólový analyzátor
Iontová past (ion-trap)
Průletový analyzátor (time of flight, TOF)
Interface
• Rozhraní s pohybujícím se kovovým páskem (moving
belt interface)
• sprejové ionizace – většina těkavých látek odvedena
mimo MS – bez interface
• mikroHPLC - přímý vstup
MS/MS-LC
• systém se třemi kvadrupóly: První pro výběr
mateřského iontu, do druhého se přivádí pod tlakem
inertní plyn a slouží jako kolizní cela pro řízenou
fragmentaci mateřského iontu, skenováním třetího
kvadrupólu se rozdělí vzniklé dceřiné ionty
Rozhraní (interface) s pohybující se kovovou
smyčkou
Hybridní tandemový hmotnostní spektrometr s dvojicí
kvadrupólů a průletovým hmotnostním analyzátorem
Požadavky na HPLC-MS systém
• Kolona – malý průměr, malé průtokové rychlosti
přímý převod do MS (bez interface)
• Mobilní fáze těkavá, omezit obsah solí, protože
snižují výtěžek ionizace a zanášejí iontový zdroj
• Vhodnější methanol než acetonitril, vyšší výtěžek
ionizace
4. Úprava vzorku – přečištění, zakoncentrování
Kapalné vzorky (moč, serum, sliny):
• extrakce kapalinou (LLE)
• extrakce tuhou fází (SPE) – nejběžnější
materiály: chemicky vázané fáze, ionexy, SEC fáze,
vtištěné polymery, atd.
• mikroextrakce na vláknech nebo v kapiláře (SPME)
Tuhé vzorky (tkáně, vlasy):
• Soxhlet
• zrychlená extrakce rozpouštědly (ASE)
• extrakce ultrazvukem
• extrakce nadkritickými tekutinami (SFE)
SPME
Solid phase microextraction
a-SPME extrakce, b-desorpce v GC, c-desorpce v
HPLC
Přímé spojení SPME v kapiláře s HPLC
a) extrakce
b) Desorpce
Příprava vtištěných polymerů
5. Analýza drog a jejich metabolitů
Analýza tělních tekutin
•
•
•
•
•
•
Analýza krve - deproteinizace
extrakce rozpouštědly (LLE)
extrakce tuhou fází (SPE, SPME)
přečištění extraktu na měničích iontů
zakoncentrování odpařením
vlastní analýza HPLC-ESI (API)-MS
Analýza vlasů
• Odběr vzorku – velká variabilita (místo
odběru, stáří, pohlaví) - 10 – 250 mg vzorku
• dekontaminace vlasů (kosmetické
přípravky, prach a pod.)
• extrakce, přečištění extraktu,
zakoncentrování
• vlastní analýza
(A) Chromatogram extraktu z krve oběti předávkované
amobarbitalem
(B) hmotnostní spektrum této látky
Rychlá HPLC-ESI-MS identifikace a kvantifikace
významných nox
Podmínky analýzy
• Gradientová eluce metanolem s 0,1% HCOOH
• Monolitická kolona Chromolith
• Detekce ESI-MS
• Doba analýzy 5 min. včetně stabilizace
• Všech 14 látek (neutrální, bazické, kyselé) jsou účinně
ionizovány pozitivní ESI
• Detekční limity 10,0 až 50,0 ng/ml
(K. Pihlainen et al., J. Chromatogr. A, 994 (2003) 93–102)
(I)
amfetamin,
(II) 3,4-MDMA,
(III) buprenorfin,
(IV) clenbuterol,
(V) salbutamol,
(VI) LSD,
(VII) metandienon,
(VIII) nandrolon,
(IX) stanozolol,
(X) testosteron,
(XI) morfin,
(XII) fenobarbital,
(XIII) psilocybin,
(XIV) temazepam
MS–MS spektra amfetaminu a 3,4-MDMA
A p-OH-AP, B p-OH-MA, C norefedrin D, efedrin, E AP; F 3,4methylendioxyamfetamin (MDA), G 3,4-methylendioxymethamfetamin
(MDMA), H MA, I methoxyfenamin, J DMA. K dibenzylamin (I.S.)
Rekonstruovaný iontový chromatogram
(1) psilocybin
(2) morfin
(3) salbutamol
(4) amfetamin
(5) 3,4-MDMA
(6) clenbuterol
(7) LSD
(8) fenobarbital
(9) buprenorfin
(10) temazepam
(11) nandrolon,
(12) metandienon
(13) testosteron
(14) stanozolol
Analýza amfetaminů
Mikroextrakce monolitickou kapilárou on-line s
HPLC (UV detekce) pro analýzu amfetaminu,
methamfetaminu a jejich methylendioxy- derivátů v
moči
D.L. 1.4–4.0 ng/mL.
Vysoká reprodukovatelnost (RSD < 2.9%) v rozsahu
0.05–5 g/mL, doba analýzy 25 min.
(Yi F. et al., J.Chromatogr.A, 1074 (2005) 9–16.)
Amfetamin (PA), methamfetamin (MPA), 3,4-methylendioxoamfetamin (MDA), 3,4-methylendioxomethamfetamin (MDMA)
Analýza vzorku s PA,MDA,MPA, MDMA (1 g/mL) s SPME
(a) a přímý nástřik (b)
Analýza moči 3 osob podezřelých ze závislosti na
amfetaminech
Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta
zneužívajícího DMA
4 – MA
5 – AP
6 – DMA-N-oxid
7 –DMA
Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta
zneužívajícího selegilin
1 - SG-N-oxid
2 – desmethylselegilin
3 – ethylamfetamin
4 – MA
5 - AP
Struktura Fen, Norf a N-Fen
N-Fen v čínských přípravcích k hubnutí – Fen a Norfmetabolity, škodlivé účinky, zakázané
A – extrakt vlasů, B – extrakt vlasů se 100 pg/mg norfenfluraminu a 230
pg/mg fenfluraminu, C - extrakt 1 vlasu pacienta (HPLC s fluorescenční
detekcí po derivatizaci)
Stanovení meprobamatu ve vlasech
Předběžná úprava: 1 M HCl přes noc při 60 oC
Extrakce: LL s fosfátovým pufrem (pH 5,5) a
chloroformem
Analytická metoda: HPLC-MS nebo GC-MS pro
derivatizaci s trimethylfenylamonium hydroxide
Měřené koncentrace 3,32 and 4,21 ng/mg (2
osoby)
DL 0,2 ng/mg [28]
Dávka: 400 mg 4,27–6,08 ng/mg.
800 mg 8,54–13,01 ng/mg
1200 mg 11,89–17,64 ng/mg
Sulfonylmočovinové antidiabetikum glibenclamid
Extrahovaný iontový chromatogram m/z 221, celkový iontový chromatogram a
hmotnostní spektrum ethylglukuronidu (metabolit ethanolu)
Tetrodoxin - toxin z ryby ježíka
Stanovení halucinogeních aminů
• Psilocybin (4-fosforyloxy-N-dimethyltryptamin)
• Psilocin (4-hydroxy-N,N-dimethyltryptamin)
• HPLC s elektrochemickou detekcí, + 1,0 V
(Ag/AgCl), mobilní fáze 0,1 M fosfátový pufr, pH 3,8
+ 10 v/v ethanolu
Obsah v houbě Psilocybe bohemica Šebek
Psilocybin
0,57 %
Psilocin
0,061 %
HPLC analýza extraktu houby Psilocybe bohemica Šebek
s UV a elektrochemickou detekcí
(R.Kysilka a spol., J.Chromatogr. 320, 414 (1985))
Antiepileptika – HPLC-MS (API-ES positive)
kafein, fenylethylmalonamid,ethosuximid, primidon, fenobarbital,
methylfenylsukcimid, karbamazepinepoxid,
fenoytoin,karbamazepin)
HPLC-UV analýza Ginko biloby
(SPE –C18, gradientová eluce methanol-H3PO4 -voda
HPLC-DAD analýza extraktu rostliny Ephedra Sinica Stamp
(extrakce etherem, gradientová eluce acetonitril, H3PO4,voda)
Chirální separace
• Důležité ve farmaceutickém průmyslu, ale i při
stanvoení metabolitů
• Derivatizace s chirálním činidlem v kombinaci
s nechirální stacionární fází
• Chirální stacionární fáze – chemicky vázaný
cyklodextrin, ergotalkaloidy, albumin atd.
Extase (ADAM, E, XTC)
• MDMA – 3,4-methylendioxymethamfetamin
• 1912 – vyvinuto firmou Merck jako anoretikum,
neuvedeno na trh
• euforické a stimulující účinky
• enantimery, S+ forma je potentnější než R- forma
• chirální separace s chemicky vázanou fází
(cyklodextrin)
Extrahovaný chromatogram (A) moči a MS spektra L-AP (B) a L-MA (C)
1, D-AP; 2, L-AP; 3, D-MA, 4 L-MA
Závěry
• HPLC-MS stává rutinní metodou v analytické
toxikologie
• Umožňuje identifikaci a stanovení drog a jejich
metabolitů
ve stopových koncentrací
ve složité matrici
• Miniaturizace usnadňuje spojení HLPC-MS
• Nové stacionární fáze: zrychlení analýzy,
vyšší selektivita
• Doporučená literatura
• V. Pacáková, K. Štulík, Vysokoúčinná
kapalinová chromatografie, SNTL, Praha
1986.
• K.Štulík a kol., Analytické separační
metody, Karolinum, Praha 2004