Vznik nádorového onemocnění z hlediska molekulární patobiochemie

Vznik nádorového onemocnění z hlediska molekulární patobiochemie

Maligní tumor je genetické onemocnění
VZNIK NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNÍ
z hlediska molekulové patobiochemie
Jaroslav Masopust
Ústav klinické biochemie a patobiochemie
2. Lékařská fakulta UK v Praze
Počet buněk
• Přechod normální tkáně do stavu invazívní
nádorové choroby trvá obvykle 5 – 20 let
• Ovlivňují to hereditární genetické faktory
a somatické genetické změny
• Progresi podporuje postupné (!) hromadění
genetických změn
nekontrolovaný růst způsobený kupř.:
- trvalou aktivaci signální transdukce
růstového stimulu
- alteraci kritických bodů buněčného
cyklu
- deregulaci DNA-transkripčních
faktorů
Progrese
Generalizace - metastázy
1012
ORGANISMUS
109
1
BUŇKA
CHROMOSOM
1.
Morfologické
a
laboratorní
známky
Nádor „in situ“
TKÁŇ
mutace
Klinické
příznaky,
NÁDOROVÉ
ONEMOCNĚNÍ
Nádorový
FENOTYP
Maligní transformace
Nádorový GENOTYP
1
2.
1
11+2
3.
11
1+2
1+2
1+2+3
Normální
buňka
Nádorový
potenciál
4.
1+2+3
1+2
Hromadění
mutací
1
Maligní
transformace
1
Potenciál
agresivity
Hyperplazie
Dědičná
predispozice
Odezva organismu
Somatické genetické
změny
Klonální Invazivní Metastázy
dysplazie progrese
Angiogeneze
aktivace onkogenů
ztráta heterozygozity
genetický karyotyp instability
defekt v opravách DNA
NÁDOROVÝ GENOTYP
výsledek nahromadění mutací (alterací)
genů pro řízení
* proliferace
* diferenciace
* zániku
čas
BUNĚK
PO PU LA C I m ožno ro zdě lit na 4 g ene tick é
O N K O D ÉM Y
PROTOONKOGE NY
(d le vz tah u vý vo je ná d oru ke ge n etic ké ne b o e n virom e ntáln í
zá těži)
(kontrolují růst a diferenciaci buněk)
aktivace
(1 ) ZÁ K LAD N Í - norm ální popula ce k de riziko nádorové ho
onem ocnění vzniká na hrom aděním bodový ch m uta cí
(2 ) E N V IR O M EN TÁ LN Í - č ást norm á lní populac e kde rizik o
se zvyšuje působením ok olních podm íne k
(c he m ie ,ra diac e,viry)
(3 ) E N V IR O M EN TÁ LN Ě G EN E TIC K Á - čá st populac e se
zvýš enou nác hylnos tí k e nvirom e ntálním k anc erogenům
(4 ) G EN E TIC KÁ - čá st popula ce s ge ne tick y pře nos ným
rizik em
"R a kovina je genetic ká poruc ha som atick ýc h buněk :
m aligní tum ory obsa hují buňk y nes oucí m utac e nebo
delec e kritick ých nádorový ch genů"
"M uta ce zá rode čnýc h buněk přená ší ná chylnos t k
nádorovém u onem ocnění z rodič ů na dě ti"
⇓ ← mutace,translokace,amplifikace
⇓
O N K O G EN Y
pro růstový pro receptory intracelul. pro transkripční pro
faktor
růst.faktorů kinasy
faktory
transdukční
proteiny
sis
erbB-1
src,abl
c-myc,L-myc
K -ras
erbB-2
N-myc,E 2A
H -ras
fms,trk
fcs,gli
N-ras
net,ros
gip
_______________________________________________________
2
TUMOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY
(= ANTIONKOGENY)
(účastní se na přenosu signálu mezi buňkami a kontrolují
programovaný zánik buněk)
inaktivace
⇓ ←mutace,amplifikace
⇓
RB p53 DCC APC MCC NF-1 WT-1
↓
p53 protein
(autoprotilátka proti p53)
GENY predisponující GENETICKOU
INSTABILITU
(Defekt v opravě chybné DNA pro poruchu
v „opravném čtení“ při replikaci DNA)
Gen na chromosomu 2
mutace
Gen pro HNPCC
(Hereditární nepolymatózní kolorektální karcinom)
3
5´
OH
A
C
T
T
A
G
G
C
T
A
A
C
G
T
A
G
C
G
T
G
T
GMe
A
T
G
A
C
Přímá obnova poškození
Oprava baze vystřižením
T
U
C
Gox
A
T
T
premaligní buňku k proliferaci
maligních dceřinných buněk
Oprava nukleotidu vystřižením
G
C
A
G
C
Oprava „mis-match“ chyby
(chybného párování bazí)
OO
• Genová instabilita může predisponovat
O
Oprava přerušení jednoho vlákna
• Instabilita se může projevovat na
makroúrovni:
(změny v karyotypu) nebo
mikroúrovnI (oprava DNA-sekvence)
A
C
O
O
Oprava přerušení dvojvlákna
3´
Genotoxický stres
UV-záření
Poškození DNA
Možné cesty k maligní transformaci
• ZMĚNA SIGNALIZACE
UbUb
• NEADEKVÁTNÍ EXPRESE strukturálně
normálního proteinu
p53
MDM2
ARF
MDM2
p21CIP
c-Myc
UbUb
CyklinD1
CDK4
Degradace
p53
Cyklin E
CDK2
Kaskáda
kaspas
P P P
c-Myc
• PORUCHA ZÁNIKU BUNĚK
Apaf-1
Bcl-2
p53
• UVOLNĚNÍ REPRESE
• GENETICKÁ NESTABILITA
Bax
p53
pRb
Apoptóza
E2F
pRb E2F
Progrese
cyklu
4
EGF
EGFR
Protoonkogen
pro receptor
delece
Růstový
faktor
neu
membrána
val
receptor
SHC GRB
SOS Ras
P
p
P
gln
P
PI-4-P
P
PI3-kinasa
PI-4,5-P2
cytosol
TEP-1
p
PDK
P
p
Onkogen
pro receptor
Akt
14-3-3
P P
IKK-α
p50
p65
IκB
NF-kB
BcL-XL Bad
p50
Bad
BcL-XL
p65
trvalá stimulace
Antiapoptóza
Apoptóza
Antiapoptóza
NÁDOROVÝ FENOTYP
MALIGNÍ TRANSFOMACE BUŇKY
• Ztráta kontroly PROLIFERACE
- alterace buněčného cyklu
- antiapoptóza („nesmrtelnost buňky“)
- alterace v transdukci signálu
• Ztráta kontaktu buňka-buňka
• Invazivita
• Alterace v metabolismu
(anaerobní glykolýza, „uchvacování“ dusíku, lipolýza
tvorba nádorových antigenů)
• Podpora angiogeneze
5
FOSFORYLACE
(kinasy)
Promotor
GEN pro růstový faktor
„ZAPNUTÍ“
(aktivace)
Rb-protein
PROTEIN-(Tyr, Ser, Threo)
Transkripční aktivátor
(blokován)
+ ATP
Cdk 4
„VYPNUTÍ“
(inaktivace)
mRNA
DEFOSFORYLACE
Transkripce zahájena
(FOSFATASY)
P
Fosforylovaný Rb-protein
se odpoutá od aktivátoru; ten se naváže na promotor
p15INK4b
cdk4
p21Cip1/Waf1
2. cAMP a 3. Inhibice kontaktem
p27Kip1
aktivita komplexu cdk/cyklin
PPPPP
1. TGFσ
Růstové faktory
Pos.
neg
pRb
E2F
pRb
hypofosforylovaný
DP-1
E2F
negativně
PPPPP
Cdk1 (konc.)
pozitivně
DP-1
pRb
DP-1
E2F
E2F locus
Začátek
transkripce
TATA
DP-1
E2F
E2F locus
Začátek
transkripce
Cyklin (konc.)
TATA
S
Represe transkripce
M
S
M-fáze
Cdk1 aktivita
Aktivace transkripce
6
G0
Kontrolní body
cyklin B/ Cdk1G0
G2
M
S
ATM
P
Restrikční bod
M
/cyklin D1
Cdk4/cyklin D2
Cdk6/cyklin D3
CDK4
P53P cyklinD2
pro
P21
CDK1
Cyklin A
cyklin A/
cdk1
CDK1
cyklin B2-P
CDK2
Cyklin A
p21
G2
cyklin E/ Cdk2
cyklin A/ Cdk2
„NESMRTELNOST BUŇKY“
Normální somatická buňka má omezenou kapacitu
proliferace danou určitým počtem možných dělení
a řízenou opakovanou sekvencí konce DNA
CDK1
Cyklin A
CDK1
cyklin B2-P
P
Cdc2 5C
CDK1
cyklinA
cdc 25C
14-3-3
P
P
P chk1 chk2 P
P
p53
P
cdc2 5C-P
14-3-3
G1
E2F
RB-P
CDK2
CDK7
CDK2 cyklinE P Cyklin H
Maf 1
Cyklin A P
P
RB
P
P
E2F
CDK4
DD1
Cyklin D1
CDK1
Cyklin B2-P
G1
radiace
P
ATM
radiace
P
CDK2
Cyklin A
P
E2F
RB-P
CDK2
Cyklin E
P
E2F
DP1
CDK7
Cyklin H
Maf 1
RB-P
P
CDK4
Cyklin D1-P
CDK1
Cyklin B1
S
CDK1
Cyklin B2
Přenos signálu z vnějšku do jádra buňky
(Transdukce signálu)
SIGNÁL
membr. Transdukční Transkrip . Transkripce
receptor proteiny faktory
genu
- TTAGGG tzv. telomery
1 cyklus = zkrácení o 1 telomer
mRNA
Nové nastavení umožňuje
TELOMERASA
Zvýšená aktivita telomerasy u nádorových buněk
PROTEIN
(činnost)
7
Kategorie členů signálních drah
Růstové
faktory
Receptory růstových faktorů (II)
(I)
Receptory non-tyr.
kinas: c-mas
Membr. nerecept.
tyrosin-kinasy
c-sec, c-lok, c-fgr
c-yes
(III)
G-protein
c-ras, c-gsp,
c-gip
Receptory růst. f.
tyrosin-kinasy
Růstové fakt.
PDGF (c-sis)
FGF-like (c-int2)
Intracelulární
oblast (tyrosinová
protein-kinasa)
Intracel.
transducery
Druhý posel
(fosforyl. protein)
Intracel.receptor
(II)
Protein-kinasy
c-raf, c-mos, c-pim 1
c-erbβ, c-fms, c-ret
Transkripční faktory (IV)
c-ros, c-kit, c-nue
DNA
transkripce
Regulátory nukl.
traskr. proteinů
RNA
Proteiny kontroly
buněčného cyklu (V)
c-myc, c-myb, c-jun
c-rel, c-erbA, c-fos
mRNA
PROTEIN
WNT
Frizzled
Dishvelled
GSK3β
X
APC
X
DRÁHY
KANCEROGENEZE
X
β−katenin
TGFβ
TCF
Rovnovážný stav počtu buněk v tkáních
Replikační
životnost
MYC
X
SMADs
RB
INK4B
X
X
INK4A Cyk-CDK4
GRB2-SOS
E2Fs
Buněčný
cyklus
TERT
CykE-CDK2
RAS
GPCR
ARF
RAF
X
RTK
PI3K
ALT
BAX
Změny
genové
exprese
MAPK
G-protein
Růstový
faktor
p53
MDM2
MEK
PP2A
Proliferace
-
Zánik
onkogeny
x
antionkogeny
PRO
apoptotické geny
ANTI
APOPTÓZA
RSK
PTEN
X X
X
=
X
X
X
Cytokiny
Počet
buněk
Mobilizace
zdrojů
X elF4E
TOR
AKT
8
PROTINÁDOROVÁ IMUNITNÍ OBRANA
(efektorové buňky)
Cytotoxický T-ly
CTL
Y Y
Y
Onkoproteiny
Specifické protilátky
produkce IL-12
APC-aktivace
cytokiny
zvýšení produkce
kostimulačních molekul
IFNγ
produkce IL-2
aktivace a proliferace
tumor-reaktivních buněk
CD4+ a CD8+
Přirozený
zabiječ
podpora odpovědi
Th1-buněk
NK
LAK
Aktiv. makrofág
Lymfokiny akt. zabiječ
Renezance Burnetovy a Thomasovy teorie
protinádorového imunologického dohledu
Onkoprotein
(„cancer immunoediting“)
1. Fáze eliminace:
NK, NKT, γδT rozpoznávají antigeny nádorových
buněk
produkce INFγ
kaskáda přirozené imunity
(angiostatické chemokiny, stimulace NK a dendrit.bb
a IL 12)
drť tumorových bb. fagocytována
do
uzlin; odtud difer. T-bb CD4+ a CD8+ putují k nádoru,
rozpoznávají a ničí tumorové bb. (IFNγ, IL 12, TNF, perforin)
apoptóza
NFκB
proliferace
inhibice diferenciace
angiogeneze
metastázy
2. Fáze ekvilibrace:
selekční tlak
nové klony nádorových bb.:
tvorba a ničení v rovnováze
NFκB
3. Fáze vymanění:
selekční tlak vytvoří varianty
unikající rozpoznání, ničící cytotox. T-bb. (apoptoza Fas-lig)
9
PODPORA
ANGIOGENEZE
VGF
VGFR
METASTATICKÝ (invazivní) FENOTYP
• Zvýšení motility (invazivita)
(průnik do stromatu a přes cévní stěnu)
PLCγ
FAK
• Vytváření embolů v cirkulaci
Ras
DAG
IP3
PKC
Ca++
• Adherence ke stěně cévy
paxillin
MAPK
Proliferace
endotelií
Změna cytoskeletu
Migrace endotélií
Proliferace
endotelií
Permeabilita
cévy
NOS
NO
Motilita
Invazivita
Emboly v
cirkulaci
Adherence
k endotelu
Extravazace do
parenchymu
Metastázy
metastáz
• Vytvoření metastázy (proliferace v místě,
angiogeneze, odpověď na mikroprostředí)
• Metastázy metastáz
• Nádorová generalizace
ANGIOGENEZE
Maligní transformace,
angiogeneze
• Průnik do parenchymu
Odpověď na
mikroprostředí
Proliferace
angiogeneze
METASTÁZA
10
GENETICKÉ ZMĚNY při rozvoji KOLOREKTÁLNÍHO
KARCINOMU
Chromosom 5q
18q
Mutace
delece
delece
APC
K-ras
β−katenin
Normální
epitel
adenom
17p
delece
BAT-26
8p
delece
10-letí
• Mutace APC, K-ras, p53 genů….u většiny
• Aneuploidie s delecí raménka chromosomu
1p, 5q, 8p, 18q, 17p u 85 %
pozdní
adenom
časný
karcinom
pozdní
karcinom
Období gestace
Možnosti detekce rizika
2 – 5 let
2 - 5 let
• Diploidie (15 %) s mutací BAT-26 …. u 95 %
• „Dlouhá“ DNA (nepodléhá apoptóze) .. až u 90 %
Kolorektální karcinom je klinicky, fenotypově
a genotypově hetorogenní:
Multikomponentní stanovení
Rozlišení nádorové DNA
5-fluorouracil
Souprava pro detekci tumoru: BAT-26 v stolici
Irreversibilní blokáda
(PreGen 26)
5-fluorodeoxyuridylát
pozitivní u > 90% HPNC
thymidylátsynthasa
dUMP
dTMP
N5,N10-methylentetrahydrofolát
11
REZISTENCE vůči CHEMOTERAPII
Genová amplifikace dihydrofolátreduktasy (DHFR):
Je navozena jejím inhibitorem – methotrexátem
(přežívající nádorové buňky amplifikují gen DHFR
až 1000násobné kopie – nikoliv buňky normální)
Je to transmembránový fosfoprotein (ATP-pumpa):
vytlačuje hydrofobní toxické látky z buňky ven
(Je normálně v hepatocytech, enterocytech,
renálních tubulech – součást ABC-transporterů
ATP-binding casette transporter)
Vývoj molekulových markerů urothelkarcinomu
9qDel
Ta
RAS
Ta
Méně dobrá
T2-4
Normální urothel
TP53
RB
N+/M+
Tis
Diferenciace primitivního neuroblastu na zralou
gangliovou buňku nervovým růstovým faktorem (NGF)
(také jako TrkA-receptor)
Neuroblastom
ganglioneurom (benignější)
Insulinový růstový faktor 2 (IGF-2) (nezralejší)
neu (ErB-2) onkoprotein (nezralejší)
CHEMOPREVENCE
Dobrá prognóza
9pDel (INK4A)
T1
Rezistence vůči chemoterapii
- multidrug-resistence protein (MRP)
- LRP, glutathion-S-transferasa
- topoisomerasa, thymidylátsynthasa, metalothionein
- zvýšená exprese bcl-2
Amplifikace genu multidrug-transport protein
neboli P170
Superficiální
tumor
Molekulárně genetické vyšetření při léčení
neuroblastomu
VITAMINY: folát, vitamin E, D (membránové receptory)
MINERÁLY: Ca, Se (selenomethionin)
Látky z rostlin: diallylsulfid (setrvání v G-fázi), kurkumin,
genistein (ze sóje: potlačuje ca-prostaty), indol-3-karbinol; isoflavonony, lykopen, polyfenon E ….
Syntetické látky: raloxifen, 9-cis-retinová kys., (selektivní
inhibitory estrogenních receptorů), inhibitory COX 2 ….
Špatná prognóza
Infiltrující
tumor
T1
5qDel, 3pDel
T2-4
6qDel, 11pDel, 18qDel
12
Anti-iniciace
* alterace metabolismu kancerogenu
* podpora detoxikace
kancerogenu
Anti-promoce,
anti-proliferace
Mechanismus
CHEMOPREVENCE
* odstranění reaktivních forem kyslíku
* ovlivnění genové exprese
* potlačování zánětlivé reakce
preneoplastické buňky
iniciovaná buňka
nádorové buňky
* podpora opravy DNA
* odstranění elektrofilních látek a reaktivních forem kyslíku
HERCEPTIN (trastuzumab)
Humanizovaná monoklonlní protilátka proti proteinu 2
receptoru epidermálního růstového faktoru - Her-2/neu
(c-erbB2) nadměrně exprimovaného
(nádorová amplifikace genu) u některých epitelových
nádorů (25 % karcinom prsu)
Možné úspěšné léčení metastazujících karcinomů prsu
(neopovídajících na antiestrogenovou terapii)
Nutno dříve prokázat přítomnost HER-2 při biopsii nádoru
a pak aplikovat Heceptin
* potlačení proliferace
* indukce diferenciace
* navození apoptózy
* podpora imunity
* omezení angiogeneze
Mechanismus účinku Herceptinu
Signální dráha epidermálního růstového faktoru HER2/neu
redukuje hladinu p27Kip1 navozením jeho degradace ubikvitinací;
to navozuje uvolnění Cdk2 (cyklin-dependentní kinasy2) a aktivaci cyklu
buněčného dělení (=nádorová proliferace při nadměrné expresi)
Trastuzumab (Herceptin) působením na receptor (HER2/neu-R) zvyšuje
hladinu inhibitoru p27Kip1 podporuje jeho asociaci s cyklindependentní
kinasou CdK2, čímž inhibuje aktivitu této kinasy a způsobuje zástavu cyklu
v G-1 fázi (a brání tak nádorové proliferaci).
Pozdější rezistence nádorových buněk na Heceptin se vysvětluje
nadměrnou expresí Skp2 (= ubikvitin-ligasa),
(která je nutná pro průběh ubikvitinace p27/Kip1 ) adaptovanými nádorovými
buňkami; neodstraněný p27Kip1 pak neblokuje aktivitu Cdk2 a nádorové
buňky se mohou dále dělit (Podpořeno experimentem in vitro pomocí
IGF-1, který má účinek „anti-trastumuzabový“)
Signální dráha realizující účinek HER2/neu i IGF-1 se děje prostřednictvím
signalizace PI3K (fosfoinositid-3-kinasy); amplifikace genu PI3K nebo delece
genu pro PTEN (specifická fosfatasa), nalézané u řady karcinomů, způsobují
deregukaci buněčného cyklu
Mechanismus účinku trastuzumabu a rezistence vůči
němu
IGF-IR
IGF-IR
IRS
HERCEPTIN
p85
p85
IGF-1
PI3K
PI3K
IGFBP-3
Následná signalizace
Zrušeni
zástavy cyklu
v G-1 fázi
Skp2
p27Kip1
Uvolnění
blokády Cdk2
p27Kip1 - degradace
13
LÉKY ve zkoušení (na bazi molekulové patologie)
LymphoRad-131:
humanizovaná monoklonální
protilátka nesoucí radionuklid (Jod-131)
blokuje receptor stimulátoru B-lymfocytů (nepůsobí
na prekurzory B-buněk) – inhibuje myelom
TRAIL-1 R Mab:
humaniz. monokl. protilátka ;
tumory s tímto receptorem zanikají na apoptózu
ZDRAVÍ je CENA, kterou platíme za ŽIVOT
„Na samém začátku vzniku života jedince je
progrese buněčného dělení nutným předpokladem
vývoje jedince,
později může být příčinou jeho záhuby“
Inhibitory Bcl-2 a Bcl-X: podporují apoptózu
nádorových buněk (non-Hodgkinský lymfom)
„Osobní vakcína“: vůči proteinu tepl. šoku (HSP70)
Molekulová patobiochemie dává možnost
tento proces ovlivnit
+ imanitib mesylát působí jako „fingerprint“ tumorových
buněk pacienta – chronické myeloidní leukemie
14