Přirozená rezistence bakterií rodu Streptomyces - Česko

STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST
Obor SOČ: Obor 08 - Ochrana a tvorba životního prostředí
Přirozená rezistence/citlivost bakterií rodu
Streptomyces vůči vybraným druhům antibiotik a
produkce sekundárních metabolitů
Natural resistence/sensitivity of bacteria of genus Streptomyces
against selected genera of antibiotics and production of
secondary metabolites
Autor:
Kateřina Kalistová
Škola:
Česko-anglické gymnázium, s. r. o.
Třebízského 1010
370 06 České Budějovice
Kraj:
Jihočeský
Interní konzultant:
RNDr. Květa Tůmová
Česko-anglické gymnázium, s. r. o.
Externí konzultant:
Ing. Václav Krištůfek, CSc.
BC ČAV, v. v. i. – ÚPB České Budějovice
České Budějovice 2015
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem svou práci SOČ vypracovala samostatně a použila jsem pouze
podklady (literaturu, projekty, SW atd.) uvedené v seznamu vloženém v práci SOČ.
Prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce SOČ jsou shodné.
Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č.
121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o
změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění.
V Českých Budějovicích dne ………………… podpis: ……………………………
Poděkování
Děkuji Ing. Václavu Krištůfkovi, CSc. za jeho obětavou pomoc, zasvěcení do
práce v laboratoři a jeho čas, který mi věnoval. Také za podnětné připomínky,
které mi během práce poskytoval. Dále bych chtěla poděkovat RNDr. Miloslavu
Devetterovi, Ph.D. a RNDr. Petru Doležalovi, Ph.D. za jejich informace o tamní
vegetaci, vzorky půd a fotografie přímo z místa odběru, také za naší diskuzi
ohledně hypotéz. Taktéž bych chtěla poděkovat paní Miroslavě Jordákové, která se
mnou strávila mnoho času v laboratoři. V neposlední řadě bych ráda poděkovala
Mgr. Jiřímu Petráskovi, který mi ukázal, jak nekontaminovat vzorky. Dále nesmím
opomenout významnou pomoc od doc. RNDr. Ivy Dostálkové, Ph.D., která mi
pomohla zpracovat grafy a statistiky v práci. Nakonec bych ráda poděkovala
celému Ústavu půdní biologie v Českých Budějovicích, jelikož práce
v laboratořích tohoto ústavu mi přinesla mnoho nových cenných zkušeností. Mé
díky také patří projektu Změny ve struktuře vegetace a růst stromů dle nadmořské
výšky na Mt. Cameroon – západní Afrika (Dr. P. Doležal).
Anotace
V dnešní době je rezistence bakterií na antibiotika velkým tématem. Mnoho
bakterií tuto rezistenci získalo nadužíváním antibiotik v celosvětovém měřítku.
V této práci jsem se zabývala tím, zda-li je u bakterií rodu Streptomyces tato
rezistence přirozená. Bylo zjištěno, že díky velké konkurenci jiných bakterií v dané
oblasti, respektive v okolí hory
Mt. Cameroon v Kamerunu tomu tak opravdu
je. Dále bylo zjištěno, které bakterie produkují sekundární metabolity vůči
grampozitivním a gramnegativním bakteriím a také vůči houbě, což by mohlo být
významné v oblasti bioprospektingu.
Klíčová slova: rezistence, Streptomyces, Kamerun, bioprospekting
Annotation
Nowadays is a resistence of bacteria against antibiotics a huge topic. Many bacteria
this resistence obtained by overusing of antibiotics in the global measure.
Nevertheless, in this work was discovered that many bacteria of a genus
Streptomyces are natural resistant because of competitors of other bacteria in this
area, more precisely in the vicinity of the mountain Mt. Cameroon in Cameroon.
Further was found which bacteria product secondary metabolites against
grampositiv and gramnegativ bacteria and against a fungus, too. It can be
significant for the bioprospekting.
Key words: resistence, Streptomyces, Cameroon, bioprospecting
Obsah
1. Úvod.......................................................................................................................................................... 6
1.1. Cíle práce ........................................................................................................................................... 6
1.2. Historie antibiotik .............................................................................................................................. 7
1.3. Antibiotika a rezistence ..................................................................................................................... 8
1.4. Hypotézy.......................................................................................................................................... 10
2. Materiály a metodika .............................................................................................................................. 11
2.1. Použitá antibiotika ........................................................................................................................... 11
2.1.1. Peniciliny .................................................................................................................................. 11
2.1.2. Cefalosporiny ............................................................................................................................ 13
2.1.3. Aminoglykosidy ........................................................................................................................ 13
2.1.4. Chinolony .................................................................................................................................. 14
2.1.4. Chloramfenikol ......................................................................................................................... 15
2.1.5. Tetracykliny .............................................................................................................................. 15
2.2. Odběr půdních vzorků a jejich zpracování - charakteristika lokality odběru půdy ......................... 16
2.2.1. Půdní charakteristiky................................................................................................................. 17
2.2.2.Metodika .................................................................................................................................... 19
3.Výsledky .................................................................................................................................................. 28
3.1. Rezistence bakterií rodu Streptomyces na vybrané druhy antibiotik ............................................... 28
3.1.1. Zpracování metodou počtu jedinců, kteří tvoří určitou velikost zóny ...................................... 28
3.1.2. Průměrná inhibiční zóna v dané nadmořské výšce se směrodatnou odchylkou........................ 45
3.1.3. Multirezistence vzorků .............................................................................................................. 53
3.2. Produkce sekundárních metabolitů vůči Escherichia coli, Bacillus subtilis a Sacharomyces
cerevisiae ................................................................................................................................................ 54
3.2.1. Bacillus subtilis ......................................................................................................................... 54
3.2.2. Escherichia coli......................................................................................................................... 55
3.2.3. Sacharomyces cerevisiae .......................................................................................................... 56
3.3. Fungicidní aktivita určitých druhů bakterií rodu Streptomyces vybraných ze sbírky BC ČAV ...... 57
4. Závěr ....................................................................................................................................................... 58
5. Zdroje ...................................................................................................................................................... 61
5
1. Úvod
Bakterie z rodu Streptomyces jsou nejrozšířenějším rodem z třídy Actinobacteria, podtřídy
Actinobacteridae a řádu Actinomycelates. Jedná se o grampozitivní bakterie, které se nachází
zejména v půdě. Tyto bakterie rozkládají v půdě celulózu a chitin, a tím se stávají nedílnou
součástí koloběhu uhlíku. U mnoha z nich byla již v minulosti potvrzena antibakteriální nebo
fungicidní aktivita.
Bakterie rodu Streptomyces jsou často rezistentní vůči antibiotikům. Tento trend ukazují již starší
výzkumy, ale není tak docela známo, zda-li se jedná o rezistenci sekundárně získanou či
primárně zděděnou. Bakterie všeho druhu si totiž dokáží předávat geny odolnosti různými
způsoby. První možností je dědění genu mateřské bakterie, druhou možností je mutace - pokud
se bakterie dlouhodobě vyskytuje v prostředí, kde na ní působí antibiotika, je schopná jim
odolávat - např. Bacteroides ve střevech. Další, zatím nejmenovanou možností, je získání genu z
odumřelé bakterie. Nebo mohou získat informaci od bakteriofágů. Poslední možností je nejvíce
znepokojující typ - získání genetické informace od cizí bakterie, která ani nemusí být stejného
rodu jako bakterie, která gen přijímá.
Tyto bakterie ale nevynikají jen v rezistenci na antibiotika či antibiotické aktivitě, některé druhy
také brání růstu hub, což by mohlo přinést průlom zejména v pěstování obilovin, například
ječmene, které jsou často napadány různými druhy plísní.
Pokud není uvedeno jinak, bylo
čerpáno převážně z ústně předaných informací
Ing. Václavem Krištůfkem, CSc. v letech 2013-2015.
1.1. Cíle práce
Cílem první části práce bylo zjistit, zda-li bakterie, které pravděpodobně nikdy nepřišly do
kontaktu s antibiotiky, jsou rezistentní na některé běžně užívané typy antibiotik. Zkoumané
bakterie byly izolovány z půdy v Kamerunu, v okolí hory Mount Cameroon a to v různých
nadmořských výškách, tudíž bylo možné sledovat, v jaké části transektu jsou bakterie rodu
Streptomyces více rezistentní. Dále byla pozorována antibiotická aktivita vůči zástupcům hub,
grampozitivních a gramnegativních bakterií.
6
Fluoresenční mikroskopií byly zjištěny i přesné počty bakterií ve sledovaném transektu. Pro
výzkum byla použita následující antibiotika: Tetracyklin, Gentamicin, Ampicilin, Amoxicillin,
Cefazolin, Ciprofloxacin, Chloramfenikol a Penicilin.
Další část práce se zabývá fungicidními účinky vybraných bakterií rodu Streptomyces, tedy které
z nich omezují či nedovolují růst hub, respektive plísní. Tentokrát již nebyly použity kmeny
izolované v Kamerunu, ale byly vybrány určité druhy streptomycetů ze sbírky Culture Collection
of Soil Actinomycetes České Budějovice (CCSACB, www.actinomycetes.cz) vykazující, podle
předchozích testů prováděných na pracovišti Ústavu půdní biologie, aktivitu vůči houbám. Tento
výzkum by mohl mít přínos hlavně v zemědělství či pivovarnictví, jelikož mikroskopické houby
z rodu Fusarium ohrožují kvalitu ječmene.
1.2. Historie antibiotik
Již od pradávna lidstvo využívalo různé přírodní, převážně rostlinné, látky - kupříkladu cibuli
nebo česnek s antibakteriálními účinky k ošetřování ran. První chemicky vytvořená látka
Paracelsus, která se používala v tehdejším léčitelství, byla rtuť rozpuštěná v sádle hojně
využívaná na potírání vředů na kůži při syfilitidě.
Antibiotika jako taková byla poprvé popsána v roce 1899 českými vědci Honlem a Bukovským.
Jednalo se o relativně hojně používáný extrakt z kultury Pseudomonas aeruginosa (lidský
patogen způsobující zánět močových cest, středního ucha ad.) až do konce druhé světové války,
ale nebylo možné jí používat plošně kvůli nejasnému složení.
Na konci 19. století v tomto odvětví bádal Paul Ehrlich, který hledal antibiotikum na spavou
nemoc. Zpracoval přes 900 vzorků, ale všechny byly buďto málo účinné nebo příliš toxické. Jeho
mladší kolega Sahachiro Hata zpětně otestoval látky vůči původci syfilis a v první polovině
dvacátého řešení objevil Arsphenamin neboli Salvarsan. Jeho nevýhodou byla nutnost podání
injekčně a mnoho nežádoucích účinků jako například slepota. V roce 1912 byla vytvořena
náhrada - Neosalvarsan - která byla jednodušší na přípravu a měla méně nežádoucích účinků,
avšak každodenní zvracení bylo stále velmi časté.
7
V roce 1928 byl publikován objev penicilinu, což změnilo celý svět. Alexander Flemming
objevil čirou náhodou baktericidní látku v plísni, kterou se mu však nedařilo izolovat. Účinnou
látku z Penicillium notatum izolovali až Howard Walter Florey a Ernst Boris Chain.
Všichni tři dostali v roce 1945 Nobelovu cenu za medicínu a fyziologii. V roce 1944 se Penicilin
začal hojně využívat pro všechna válečná zranění.1
1.3. Antibiotika a rezistence
Antibiotika jsou přirozené nebo syntetické látky potlačující růst jiných mikroorganismů.
Nejvýznamnějšími producenty antibiotických látek jsou bakterie, houby, řasy a lišejníky.
Některé mikroorganismy mohou být na určitá antibiotika rezistentní. Tuto rezistenci je možné
rozdělit na dva typy:
- primární: relativně vzácná, dána druhem bakterie, mikroorganismus nenese zásahové místo,
tudíž nemůže být antibiotikem ohrožen
- sekundární: většina rezistencí získána důsledkem mutací a genetických přenosů
Mikroorganismy mohou rezistenci získat hned několika způsoby:
1. od mateřského mikroorganismu - geneticky zděděné
2. mutací - vyskytuje-li se organismus v prostředí pod tlakem antibiotik (zažívací trakt)
3. z odumřelé bakterie
4. bakteriofágem
5. od rodově cizí bakterie (konjugace)2
Již 70 let člověk hojně využívá antibiotika na všechny možné potíže. Léčí s nimi sám sebe i
okolní faunu. Většina z nás si ani neuvědomuje to riziko; mnoho lidí s jakoukoliv virózou
používá antibiotika, což je nejen neúčinné, ale i nebezpečné, jelikož když se v budoucnu nakazí
1
LEFNEROVÁ Danuše: Sada fólií k přednáškám z mikrobiologie pro bc. studium výživy
člověka, folie 9 - 15. ;
ŠIMŮNEK Jan, SMOLA Jan: Antibiotika, sulfonamidy a chinolony, nepublikovaný opravený rukopis druhého
vydání.;
ROTTENBORNOVÁ, Drahomíra. Antimikrobní terapie. In: Mikrobiologie.wz.cz [online]. [cit. 2015-02-25].
Dostupné z:http://mikrobiologie.wz.cz/03-Antimikrobni_terapie.pdf ;
Pseudomonas aeruginosa. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia
Foundation, 2001- [cit. 2015-02-25]. Dostupné z:http://cs.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa ;
Arsphenamine. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001[cit. 2015-02-25]. Dostupné z:http://en.wikipedia.org/wiki/Arsphenamine
2
SPÍŽEK, Jaroslav. Rezistence na antibiotika. Vesmír. 1999, roč. 78, č. 27.
8
nějakou nemocí, kterou způsobují bakterie, nebudou na ně již antibiotika působit. Díky tomu se
léčba pacienta, který nadužíval nebo nesprávně používal antibiotika, může nepříjemně
prodloužit a také prodražit.
Vývoj nových antibiotik trvá dlouhou dobu a je finančně náročný, a proto by se mělo myslet na
budoucnost a nadužívání antibiotik celosvětově striktně omezit.3
Novým trendem se u mikroorganismů stává tzv. multirezistence, která je poslední dobou stále
častější. Je to zapříčiněno tím, jak lidstvo nadužívá antibiotik, která obvykle procházejí
zažívacím traktem bez jakékoliv změny a v tomto stavu putují do kanalizací, dále do čističek
odpadních vod, kde se odpad používá relativně často na hnojení půdy a zalévání rostlin. Zatím
není jasné, jak dlouho zůstanou antibiotika aktivní, pokud jsou navázané na humus. Dochází k
výměně rezistorů s půdními bakteriemi, a tím se stávají bakterie všeobecně stále rezistentnější. 4
3
Přehled základních skutečností rezistence vůči antibiotikům. WHO [online]. 2011
[cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.who.cz/attachments/article/27/WHD_factsheet_every_CZE.pdf
4
ELHOTTOVÁ, Dana, přednáška: Antibiotika - 70 let ve službách člověka, 18.3.2013.
9
1.4. Hypotézy
1. Půdy v okolí hory Mt. Cameroon jsou významným zdrojem bakterií rodu Streptomyces,
které produkují antibiotické látky a mohou tak stát v popředí bioprospektingu.
2. Klimatické podmínky, kupříkladu sopečná aktivita, ovlivnily půdy, což je vhodné pro
bakterie rodu Streptomyces.
3. Bakterie rodu Streptomyces vykazují vyšší produkci sekundárních metabolitů vůči
grampozitivním bakteriím.
4. Více producentů sekundárních metabolitů se vyskytuje v nižších nadmořských výškách.
Vlhké a teplé prostředí s dostatkem organických látek působí příznivě na růst
mikroorganizmů, vytváří se tím velké konkurenční prostředí a tím je také ovlivněna
přirozená rezistence bakterií rodu Streptomyces, tzn. nejvíce rezistentní bakterie se
vyskytují v nížinném pralese.
5. Bakterie rodu Streptomyces produkují fungicidní látky se specifickými účinky.
6. V nížinném a mlžném lese jsou bakterie rodu Streptomyces více rezistentní, jelikož zde
mají více konkurence.
Hypotézy vyplynuly z diskuze s vědeckými pracovníky (Dr. M. Devetter, Dr. J. Doležal).
10
2. Materiály a metodika
2.1. Použitá antibiotika
2.1.1. Peniciliny
Struktura je tvořena β-laktamovým („čtverec“ s dusíkem, na kterém je ketoskupina) a
thiazolidindionovým („pětiúhelník“ se sírou a dusíkem) kruhem a připojenou skupinou R.
Penicilin účinkuje tak, že inhibuje buněčnou stěnu, tudíž jde o baktericidní antibiotika.
Jako nežádoucí účinky se mohou projevit různé typy alergických reakcí - kupříkladu vyrážka, či
zvracení nebo průjem při perorálním podání. Může také dojít k podráždění neuronů či se projeví
hyperkalemie (křeče, koma).
Rezistence může nastat v případě tvorby β-laktamáz, vazebných proteinů nebo pokud dojde k
omezení průniku buněčnou stěnou.
1. Peniclin (základní peniciliny) není odolný vůči β-laktamázám, používá se při lehčím
průběhu infekcí citlivými bakteriemi kvůli jeho nekompletní absorpci.
Působí vůči pneumokokům, streptokokům, meningokokům, gonokokům a stafylokokům
neprodukujícím β-laktamázu.
11
2. Ampicilin (aminopeniciliny) je semisyntetické antibiotikum účinné vůči
pneumokokům, meningokokům, gonokokům, enterokokům, ale má nižší účinnost
na streptokoky. Hojně se využívá při léčbě onemocnění lymfatického systému.
3. Amoxicilin (aminopeniciliny) je účinný na stejné bakterie jako penicilin, ale má výhodu,
že při perorálním podání se kompletně absorbuje nezávisle na přijaté potravě.5
5
Peniciliny. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Peniciliny
12
2.1.2. Cefalosporiny
Cefalosporiny jsou β-laktamová antibiotika, tzn. Základ jejich struktury je stejně jako u
penicilinů tvořen β-laktamovým kruhem. Inhibují buněčnou stěnu, takže mají baktericidní
účinky.
Nežádoucími účinky se mohou jevit kožní vyrážky, bolesti kloubů, horečka, ale také zde existuje
riziko anafylaktického šoku.
Rezistence vůči Cefalosporinům může vznikat tvorbou β-laktamáz, změnou vazebných míst pro
antibiotikum, snížení propustnosti membrány či efluxem (aktivní vyloučení antibiotika z buňky).
1. Cefazolin působí vůči stafylokokům, využívá se k léčení sepsí, meningitidy, těžkých
infekcí dolních cest dýchacích a močových infekcí.6
2.1.3. Aminoglykosidy
Aminoglykosidy jsou antibiotika, která působí tak, že inhibují syntézu bílkovin, tudíž se jedná o
baktericidní typ antibiotik.
Působí především proti grampozitivním i gramnegativním bakteriím, naopak téměř neúčinkují
vůči streptokokům a enterokokům. Přirozeně rezistentní jsou anaeroby.
Léčba aminoglykosidy se využívá při infekcích centrální nervové soustavy, cest dýchacích či
močových cest aj.
6
Cefalosporiny. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Cefalosporiny
13
1. Gentamicin se nesmí podávat těhotným ženám, novorozencům a nedonošencům. Jedná
se o širokospektré antibiotikum, které má nežádoučí účinky - například ototoxicita
(závratě), kožní vyrážky, zvýšení jaterních testů atd.7
2.1.4. Chinolony
Řadá se do chemoterapeutik. Jedná se o primárně baktericidní antibiotika, která narušují DNA v
buněčné stěně Chemicky jsou buď nefluorované (1. generce) nebo fluorované (2.,3.,4. generace).
Chinolony jsou účinné vůči grampozitivním i gramnegativním kokům, anaerobům,
enterobakteriím i proti intracelulárním patogenům.
Používají se hlavně při léčbě infekcí močových cest, prostatid či infekcí kostí a měkkých tkání.
1. Ciprofloxacin je širokospektré antibiotikum, které se může podávat perorálně a dokáže v
krvi působit dostatečně baktericidně.8
7
Aminoglykosidy. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Aminoglykosidy
8
Chinolony. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Ciprofloxacin#Chinolony_3._generace
14
2.1.4. Chloramfenikol
Bakteriostatické antibiotikum inhibující syntézu proteinů na ribozomální úrovni. Chloramfenikol
je velmi účinný, ale nebezpečný, nikdy se nepoužívá jako lék první volby. Vůči tomuto
antibiotiku je citlivá většina aerobních i anaerobních grampozitivů a negativů včetně např.
Chlamydií. Účinkuje na meningokokové nebo pneumokokové infekce centrální nervové
soustavy, břišní tyfus ad.9
2.1.5. Tetracykliny
Jde o bakteriostatické širokospektré antibiotikum, které inhibuje syntézu proteinů. Dříve bylo
toto antibiotikum hojně využíváno v pediatrii, ale jen do doby, než bylo zjištěno, že poškozuje
zubní sklovinu a růstové chrupavky.
Tetracykliny jsou účinné na grampozitivní i gramnegativní bakterie, chlamydie ad. Avšak mnoho
bakterií je na toto antibiotikum rezistentních. Tetracykliny jsou využívány k léčbě tyfu,
chlamydiových infekcí či boreliózy atd. Užívá se také ve stomatologii.10
9
Chloramfenikol. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Chloramfenikol
10
BENEŠ, Jiří. Přehled antibiotik [online]. 2003 [cit. 2014-11-09].
Tetracykliny. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Tetracyklin
15
2.2. Odběr půdních vzorků a jejich zpracování - charakteristika
lokality odběru půdy
Z afrického kontinentu bylo dovezeno 114 různých vzorků půdy, které byly sesbírány v
bezprostřední blízkosti hory Mt.Cameroon (4095 m), která je považována za centrum světové
biodiverzity a obsahuje velké množství endemitních druhů. Na ploše 50 x 50 km² se vyskytuje
přes 2 300 druhů rostlin, protože se nachází poblíž moře, a proto nebyla ovlivněna fragmentací
ve čtvrtohorách, která zasáhla téměř celý africký kontinent. Bohatost tropického lesa je
způsobena neměnnými podmínkami, což přispívá ke speciaci, která je ovšem narušována
erupcemi sopek, tudíž jsou pozorovatelné pruhy vegetace různého stáří a široká heterogenita.11
Jedná se o jedno z nejdeštnatějších míst na světě - tzn. množství srážek je zhruba 10 m/rok. V
této lokalitě jsou srážky v podstatě celoroční, z toho vyplývá, že i v období sucha (listopad duben) jsou srážky velmi výrazné. Tyto podmínky ovlivňují růst vegetace, což je pozorovatelné
kupříkladu na stromech - v učebnicích se uvádí, že v nižších elevacích v období dešťů vegetace
spí, protože není vidět slunce, tento trend se mění se zvyšujícím se výškovým gradientem a
vegetace hibernuje v období sucha. Bylo však pozorováno, že stromy v této lokalitě rostou
rovnoměrně díky stejným klimatickým podmínkám, a proto netvoří letokruhy, které jsou tvořeny
změnou morfologie buněk (na začátku sezóny jsou cévy stromů roztažené, protože potřebují
načerpat xylen, zato na konci sezóny se ztlustí buněčné stěny, čímž se utvoří letokruh), to má za
následek nemožnost pozorování stáří stromů pomocí letokruhů.
Tato hora je sopečného původu, hornina je tedy pórovitá, půda bazická a krajina není příliš
obydlená, jelikož sopka přibližně každých 10 let vylévá magma. Oba tyto faktory také způsobují
nedostatek vápníku v půdě. V okolí celé sopky se vyskytuje alkalický popel, který mění pH
půdy na průměrnou hodnotu 8,9.
11
DOLEŽAL, Jiří. AV ČR. Altitudinal changes in vegetation structure and tree growth on Mt. Cameroon, Western
Africa. Č. Budějovice, 2015.
16
Vzorky pocházejí z různých pásů: nížinný les, horský mlžný les, savana a Afro-alpinský trávník.
Jelikož se místo sběru vyskytuje v blízkosti oceánu, je zde pozorovatelný koloběh větru, kdy
studený vzduch přinášející srážky fouká od oceánu směrem do středozemí, kde se vítr zvedá,
ochlazuje a opět proudí směrem k oceánu s tím rozdílem, že již nenese žádné srážky. Srážky
obvykle spadnou v údolí, jelikož se mraky zarazí o sopku, kde tvoří prstence kolem vrcholů. K
odběru půdních vzorků byl použit nerezový váleček, který se zasunul do hloubky 4 cm; každý
vzorek se skládá ze tří dávek půdy odebrané tímto způsobem.12
2.2.1. Půdní charakteristiky
-Nížinný les (0-650 m.n.m.): skalnatý povrch s minimem půdy, která je brána srážkami;
minimální rozdíly mezi obdobím děšťů a obdobím sucha, opad po celý rok (na zemi jen čerstvé
listy - rychle sžírány mnohonožkami atd.) - tudíž se zde nevyskytuje humus - viz foto č. 1
-Horský mlžný les (1100-2200 m.n.m.): v období sucha žádné vertikální srážky, mlha se plazí
po zemi, protože voda nekondenzuje - výrazná sezonalita, stromové kapradiny, opad zůstává;
aktivita slonů (specifický druh slona, který má v kohoutku cca 2 m) - systematicky likvidují
stromy, tudíž vzniká bylinná vegetace, kde je možné pozorovat vychozené cesty od těchto zvířat
- viz foto č. 2
-Savana (2600-3100 m.n.m.): láva v této oblasti tvoří útvary, na kterých zprvu dokáže růst
pouze lišejník, dnes bez zvířat (dříve antilopy) - nikdo nesžírá vegetaci; malá biodiverzita rostlin;
kolem 3100 m.n.m. rostou stromy, jelikož zde jsou opět vhodné podmínky - viz foto č.3
-Alpínský trávník (3600-4000 m.n.m.): v tomto pásu nikdy neprší - pouze horizontální srážky,
zvětralá skála - sypký materiál, velmi chudá vegetace13 - viz foto č.4
12
13
DOLEŽAL, Jiří; DEVETTER, Miloslav, KRIŠTŮFEK, Václav, diskuse, 13.2.2015.
DEVETTER, Miloslav, soukromá přednáška, 16.10. 2014.
17
Foto č.1 . - Elevace nížinný les – J. Doležal
Foto č.2 - Elevace mlžný les - J. Doležal
Foto č.3 - Elevace savana – M. Devetter
Foto č.4 - Elevace alpínský trávník - M. Devetter
Foto č.5 – Pohled na dovezené vzorky
V laboratoři. - K. Kalistová
18
Tabulka č.1 - Charakteristiky půd, z kterých byly izolovány kmeny bakterií, specifikující
nadmořskou výšku, množství opadu, hmotnost, vlhkost, pH půdy a počet bakterií ve zkoumaném
vzorku (Gram dry weight). Se zvyšující se nadmořskou výškou se snižovala vlhkost půdy a
množství bakterií ve vzorku půdy. Naopak se zvyšovalo pH, což znamená, že půda v nížinném
lese byla kyselejší než v alpínském trávníku.
Oblast Elevace
(m.n.m.)
Počet
vzorků
Čistá hmotnost
vzorku (g)
Hmotnost
sušiny (g)
Vlhkost
v%
1
0-650
43
110,5
49,5
54,7
4,2 (+-0,5)
8,3 (+-4,6)
2
1100-2200
22
66,7
37,4
52,3
4,8 (+-0,3)
9,2 (+-2,7)
3
2600-3100
28
60,7
46,7
22,2
5,5 (+-0,3)
4,3 (+-2,3)
4
3600-4000
21
83,1
50,2
24,5
5,3 (+-0,2)
4,1 (+-0,6)
pH
Gram dry
weight
(x
2.2.2.Metodika
2.2.2.a Odběr vzorků půdy a zpracování
Odběry půd byl proveden v roce 2013 v rámci projektu Změny ve struktuře vegetace a růst
stromů dle nadmořské výšky na Mt. Cameroon - západní Afrika. Vzorky byly odebrány
RNDr. M. Devetterem Ph.D. (BC ČAV, v. v. i. – ÚPB v Č. Budějovicích), poté rozděleny na
různé menší části, které byly přiděleny vědeckým pracovníkům. Naše skupina dostala z každé
elevace 5 g této vzácné půdy. Vzorky byly před dalším zpracováním homogenizovány.
2.2.2.b Příprava agaru vhodného pro kultivaci bakterie rodu Streptomyces
Ke kultivaci bakterií byl použit Yeast-extract-malt-extract agar, který se připravuje podle
receptu: Bacto-yeast extract 4 g/l, Bacto-malt extract 10 g/l, Bacto-dextrose 4 g/l, Bacto-agar
20 g/l,destilovaná voda l litr, pH bylo upraveno na hodnotu 7,3.
19
2.2.2.c Stanovení antibiotické aktivity bakterií rodu Streptomyces
Z půd bylo izolováno celkem 140 kmenů bakterií rodu Strepromyces, které se připravily do
konzerv a vytvořila se suspenze obsahující určitý kmen. Dále byla použita disková difuzní
metoda - Petriho misky s bakteriální půdou, respektive živným médiem byly předem zbaveny
všech potencionálních kontaminací sterilizací v autoklávu. Kmeny byly poté vyočkovány a
inkubovány v termostatu se stálou teplotou 28°C, aby nedošlo ke změně vlhkosti, a tím
poškození růstu bakterií.
Dalším krokem bylo setření narostlého kmene bakterie očkovací kličkou, smícháním s 1 ml
destilované vody až do vytvoření suspenze o 0,5 stupně McFarlandovy zákalové stupnice. Poté
byly suspenze homogenizovány a naočkovány na nové živné médium. Pro každý kmen bakterie
byly použity tři Petriho misky. Na každé P. misce byly umístěny 3 terčíky s antibiotiky.
Viz foto č. 6, 7 a 8.
20
Foto č.6 - Vyhodnocování velikostí zón utvořených
Foto č.7– Kmen reaguje na Chloramfenikol tak,
bakteriemi z rodu Streptomyces vůči antibiotikům. že v jedné úrovni vůbec neroste a
- K. Kalistová
v druhé úrovni nesporuluje. - K. Kalistová
Foto č.8 - Bakterie 1592 reaguje na Chloramfenikol (CH) tím, že přestala růst, avšak na Cafazolinu (CEF)
je naopak vidět větší nárůst okolo terčíku s antibiotikem. - K. Kalistová
21
2.2.2.d Stanovení suché hmotnosti půdy
Ke stanovení byly použity hliníkové váženky o známé hmotnosti, byl vložen vzorek půdy, dále
bylo vše zváženo a vloženo na 4 h při 105°C do sušárny. Viz foto č. 8 a 9. Vzorek s váženkou se
po vychladnutí opět převážil. Výpočet sušiny: x= (
.100)
A….. hmotnost váženky [g]
B….. hmotnost váženky s vlhkou půdou [g]
C….. hmotnost váženky se suchou půdou [g]
2.2.2.e Určení počtu bakterií v testovaných vzorcích půd
K této části výzkumu byla použita fluorescenční metoda, tedy metoda obarvení barvou, která je
pozorovatelná zářením v jiné vlnové délce. Nejprve bylo naváženo 5 gramů daného vzorku, poté
byly vytvořeny suspenze v ředící řadě 10², 10³ a 104. Použita byla obyčejná vodovodní voda,
která nahradila fyziologický roztok. Při ředění 1 : 9 s 0,2% hexametafosforečnanem sodným a
následné homogenizaci došlo k desintegraci částic půdy, čímž se bakterie rozptýlily do roztoku.
Ze suspenze 103 bylo naočkováno 0,2 ml roztoku na živné medium, přičemž plotnová metoda
izoluje 1-10% přítomných bakterií, protože půdy jsou selektivní. Fluoresenčním mikroskopem je
možné vidět 99% bakterií daného vzorku. Ze suspenze 104 byl vyroben vzorek, který bylo možné
pozorovat tímto mikroskopem: 1 ml vzorku byl přefiltrován přes membránový filtr, poté bylo
použito 50
barvy DAPI, která se nechala působit 2 min a obarvila DNA bakterií. Poté byl do
vzorku přidán 1 ml destilované přefiltrované vody a celá suspenze byla opět přefiltrována před
membránový filtr, což způsobilo, že bakterie zůstaly na filtru. Na vzorek byl přidán imerzní olej,
který umožnil průchod UV paprsků. Viz foto č.9,10 a 11.
22
Foto č.9 - Ředící řada k určení množství
bakterií v daném vzorku. - K. Kalistová
Foto č.10- Pomůcky použité na přípravu vzorku
pro fluorescenční mikroskop použitý pro stanovení
počtu vzorků. – K. Kalistová
Foto č.11 - Fluorescenční mikroskopování. - V. Krištůfek
2.2.2.f Stanovení pH
Jeden gram půdy byl zředěn 5 ml vody, následně byla směs homogenizována a nechala se 1
hodinu stát. Poté bylo změřeno pH na přístroji pH 526. Viz foto č.12.
23
Foto č.12 - pH metr, kterým bylo měřeno pH vzorků. - K. Kalistová
24
2.2.2.g Produkce sekundárních metabolitů bakterií rodu Streptomyces vůči
zástupcům bakterií a hub
Další částí práce bylo pozorování antibiotické aktivity vůči zástupci grampozitivní,
gramnegativní bakterii a houbě. Použity byly následující zástupci: Bacillus subtilis, Escherichia
coli a Sacharomyces cerevisiae. Opět byla použita plotnová difuzní metoda, tedy daný zástupce
byl naočkován na živné médium pro něj určené a na něj byly kladeny terčíky s bakteriemi rodu
Streptomyces. Viz foto č.13, 14, 15 a 16.
Foto č.13 - Příprava bakterií z rodu
Streptomyces na položení v blízkosti
zástupců gramnegativní, grampozitivní
bakterie a houby - desková difuzní metoda.
- V. Krištůfek
Foto č.14 - Odebrané vzorky streptomycet připravené
na položení v blízkosti Escherichia coli, Bacillus subtilis
Sacharomyces cerevisiae. - K. Kalistová
25
Foto č.15 – Ukládání bločků bakterií
z rodu Streptomyces na desku.
-V. Křistůfek
Foto č.16 - Desková difuzní metoda použitá pro
zkoumání aktivity streptomycet vůči
Sacharomyces cerevisiae.- K. Kalistová
2.2.2.h Fungicidní aktivita vybraných druhů bakterií rodu Streptomyces ze sbírky
CCSACB
Použita byla plotnová difuzní metoda, přičemž na každou Petriho misku byly kladeny 3 terčíky s
určitými bakteriemi rodu Streptomyces a jednou určitou houbou rodu Fusarium. Viz foto č.17,18
a 19.
26
Foto č.17 - Naočkované bakterie z rodu Streptomyces
a houby z rodu Fusarium na Petriho miskách. –
K. Kalistová
Foto č.18 - Příprava vzorků bakterií pro test
produkce sekundárních metabolitů vůči
houbám z rodu Fusarium. - V. Krištůfek
Foto č.19 - Připravené vzorky bakterií na agaru vhodném pro houby z rodu Fusarium pro test produkce
sekundárních metabolitů. - K. Kalistová
2.2.2.i Zpracování grafů
Koláčové a sloupcové grafy byly zpracovány převážně po poradě s doc. RNDr. Ivou
Dostálkovou, Ph.D., některé z nich byly zpracovány přímo paní docentkou.
27
3.Výsledky
3.1. Rezistence bakterií rodu Streptomyces na vybrané druhy
antibiotik
3.1.1. Zpracování metodou počtu jedinců, kteří tvoří určitou velikost
zóny
28
3.1.1.a Ciprofloxacin
Graf č.1 - V nížinném lese třetina bakterií
vytvořila zónu o velikosti 20 mm a necelých 17% bylo rezistentních.
Graf č.2 - V mlžném lese vytvořila téměř třetina
zónu velkou 25 mm a méně než 13% bylo
vůči Ciprofloxacinu rezistentních.
Graf č.3 - V savaně čtvrtina vzorků vytvořila zónu
o 25 mm a celých 37% zónu velkou 30 mm.
Graf č.4: - V alpínském trávníku byly všechny
bakterie citlivé a téměř 30% vytvořilo zónu o 30 mm.
29
Graf č.1 - nížinný les: 16,7% vzorků z nížinného lesa bylo rezistentních vůči Ciprofloxacinu.
4,8% bakterií utvořilo zónu o velikosti 10 mm, 7,1% utvořilo zónu o 15 mm a 33,3% vzorků
utvořilo velikost zóny 20 mm. Zónu o velikosti 25 mm utvořilo 16,7% zkoumaných bakterií,
30 mm poté 4,8% vzorků a inhibiční zónu o 35 mm 7,1% testovaných bakterií. Zóna o velikosti
40 mm byla utvořena 7,1% bakteriemi a zóna 45 mm byla utvořena 2,4% bakteriemi.
Graf č.2 - mlžný les: Inhibiční zónu neutvořilo 12,5% bakterií, tzn. že byly rezistentní vůči
antibiotiku. 6,3% bakterií utvořilo zónu o velikosti 10 mm. 6,3% izolátů utvořilo zónu o 15 mm,
18,8% bakterií poté zónu o 20 mm a 31,3% vzorků vytvořilo inhibiční zónu o 25 mm. Zóna o 30
mm byla utvořena 12,5% vzorky, zóna o velikosti 35 mm byla utvořena 6,3% bakteriemi a 6,3%
testovaných izolátů utvořilo zónu o 40 mm.
Graf č.3 - savana: 3,7% izolátů bylo rezistentních vůči Ciprofloxacinu. 3,7% bakterií utvořilo
zónu o velikosti 10 mm, 7,4% vzorků pak zónu o 15 mm. 11,1% bakterií rodu Streptomyces
utvořilo inhibiční zónu velikosti 20 mm, 25,9% těchto bakterií zónu 25 mm a 37% izolátů
utvořilo zónu 30 mm. Zóny o 35 mm, 40 mm a 45 mm utvořilo vždy po 3,7% bakteriemi.
Graf č.4 - alpínský trávník: V této elevaci nebyly žádné rezistentní kmeny. 11,1% bakterií
utvořilo zónu velikosti 10 mm, 11,1% utvořilo zónu o 15 mm a 16,7% izolátů utvořilo zónu o
velikosti 20 mm. Inhibiční zónu o 25 mm utvořilo 22,2% vzorků, zónu o 30 mm 27,8% izolátů a
zónu velikosti 45 mm utvořilo 11,1% testovaných bakterií.
30
3.1.1.b Tetracyklin
Graf č.5 - V nížinném lese necelá čtvrtina
vzorků vytvořila zónu o 15 mm,
rezistence se neprojevila.
Graf č.6- V mlžném lese téměř třetina vzorků
utvořila zónu o velikosti 15 mm, rezistentních
bylo přes 6% bakterií.
Graf č.7 - V savaně skoro 15% vzorků utvořilo
zónu velkou 50 mm.
Graf č.8 - V trávníku alpínského typu téměř
po 16% utvořilo zóny 40 mm a 45 mm, zónu
50 mm vytvořila skoro čtvrtina vzorků.
31
Graf č.5 - nížinný les: Rezistence vůči tomuto antibiotiku se v této elevaci nevyskytla. Zónu o
velikosti 10 mm vytvořilo 11,9% bakterií, zónu o 15 mm 21,4% testovaných bakterií a zónu
velkou 20 mm utvořilo 14,3% bakterií. 25 mm velká zóna byla utvořena 9,5% izolátů, zóna o
30 mm byla utvořena 7,1% vzorků a zóna o 35 mm byla utvořena 4,8% bakterií. Stejné procento
bakterií utvořilo zónu velikosti 40 mm, 7,1% izolátů utvořilo zónu o velikosti 45 mm a zónu
velkou
50 mm utvořilo 7,1% bakterií rodu Streptomyces. Zóny 60 mm a 70 mm byly utvořeny
vždy 2,4% bakterií.
Graf č.6 - mlžný les: 6,3% testovaných bakterií bylo vůči antibiotiku rezistentní. Stejné
procento bakterií utvořilo zónu o 10 mm, 31,3% izolátů utvořilo zónu velikosti 15 mm a zónu
velikosti 20 mm utvořilo 12,5% vzorků. 12,5% bakterií také utvořilo zónu o velikosti 25 mm.
Zóny velikostí 35 mm, 40 mm, 50 mm, 55 mm a 70 mm byly utvořeny vždy 6,3% bakterií rodu
Streptomyces.
Graf č.7 - savana: V této elevaci bylo 3,7% rezistentních izolátů. Zóny o velikosti 10 mm,
15mm a 20 mm utvořilo vždy 7,4% bakterií. 3,7% testovaných bakterií utvořilo zónu velikosti
25 mm, 7,4% o velikosti 30 mm a zónu o velikosti 40 mm utvořilo 3,7% izolátů. 11,1% vzorků
vytvořilo zónu velkou 45 mm, 14,8% pak zónu velkou 50 mm. Zóny o velikosti 55 mm, 60 mm a
65 mm byly utvořeny vždy 7,4% vzorků. 11,1% izolátů utvořilo zónu velkou 70 mm.
Graf č.8 - alpínský trávník: 5,3% izolátů utvořilo zónu velikosti 5 mm, 10,5% bakterií utvořilo
zónu o 25 mm a stejné procento utvořilo zónu 30 mm. Zóny velikosti 40 mm a 45 mm utvořilo
vždy 15,8% vzorků. 21,1% bakterií rodu Streptomyces utvořilo zónu velikosti 50 mm, 10,5%
zónu velkou 55 mm a stejné procento utvořilo zónu o velikosti 80 mm.
32
3.1.1.c Chloramfenikol
Graf č.9 - V nížinném lese přes 28% vzorků
vytvořilo 20 mm, rezistenci prokázalo 12%.
Graf č.10 - V mlžném lese čtvrtina vzorků utvořila
zónu velkou 45 mm, rezistence se neprojevila.
Graf č.11 - V savaně přes čtvrtinu izolátů
utvořilo zónu o 50 mm, rezistence se
neprojevila.
Graf č.12 - V alpínském trávníku čtvrtina
vzorků vytvořila zónu velkou 20 mm.
33
Graf č.9 - nížinný les: 11,9% testovaných bakterií bylo rezistentních vůči Chloramfenikolu.
2,4% izolátů utvořilo zónu velikosti 10 mm, 7,1% bakterií utvořilo zónu velkou 15 mm a 20 mm
velká zóna byla utvořena 28,6% izoláty. Zóny velkosti 25 mm, 40 mm a 45 mm utvořilo vždy
9,5% bakterií. 50 mm velkou zónu utvořilo 11,9% vzorků, 7,1% vzorků vytvořilo zónu velikosti
55 mm a 2,4% izolátů utvořilo zónu o 60 mm.
Graf č.10 - mlžný les: Zónu velkou 15 mm utvořilo 18,8% izolátů. Zóny velké 20 mm, 25 mm a
40 mm byly utvořeny vždy 6,3% bakterií. 25% izolátů vytvořilo inhibiční zónu o velikosti 45
mm. 18,8% vzorků utvořilo zónu 50 mm, 12,5% bakterií rodu Streptomyces utvořilo zónu velkou
55 mm a 6,3% těchto bakterií zónu o 60 mm.
Graf č.11 - savana: 3,7% bakterií rodu Streptomyces utvořilo zónu o velikosti 20 mm, 14,8%
izolátů utvořilo zónu velkou 25 mm a 7,4% vzorků utvořilo zónu velkou 35 mm. Zóna o 40 mm
byla utvořena 14,8%, zóna velká 45 mm byla utvořena 7,4% izolátů a zóna o velikosti 50 mm
byla vytvořena 25,9% vzorků. 14,8% testovaných bakterií utvořilo zónu velkou 55 mm, 7,4%
vzorků utvořilo zónu velkou 60 mm a 3,7% izolátů vytvořilo zónu velkou 70 mm.
Graf č.12 - alpínský trávník: 25% testovaných bakterií utvořilo zónu velkou 20 mm, 6,3%
vzorků utvořilo zónu o 30 mm a 12,5% izolátů vytvořilo zónu 35 mm velkou. Stejné procento
vzorků utvořilo zónu velkou 40 mm, 18,8% z nich vytvořilo zónu velkou 45 mm a 12,5%
bakterií utvořilo zónu o 50 mm. Zóny velké 55 mm a 60 mm utvořilo vždy 6,3% izolátů.
34
3.1.1.d Gentamicin
Graf č.13 - V nížinném lese přes polovinu
vzorků vytvořilo zónu o 15 mm.
Graf č.14 - V mlžném lese téměř polovina
izolátů utvořila zónu velkou 15 mm.
Graf č.15 - V savaně přes polovinu bakterií
vytvořilo zónu o velikosti 15 mm, třetina
pak zónu o 20 mm.
Graf č.16 - V alpínském trávníku necelá
polovina vzorků vytvořila zónu o 15 mm a
třetina zónu velkou 20 mm.
35
Graf č.13 - nížinný les: Rezistence se projevila u 4,8% izolátů, zónu velkou 10 mm utvořilo
19% bakterií a 54,8% testovaných vzorků utvořilo inhibiční zónu velkou 15 mm. Zónu o
velikosti 20 mm utvořilo 19% bakterií a zónu velkou 25 mm 2,4% vzorků.
Graf č.14 - mlžný les: 6,3% bakterií rodu Streptomyces z elevace mlžného lesa bylo
rezistentních vůči tomuto antibiotiku. 18,8% bakterií utvořilo zónu velkou 10 mm, 43,8% izolátů
vytvořilo zónu velkou 15 mm a 20 mm velkou zónu utvořilo 31,3% testovaných bakterií.
Graf č.15 - savana: 7,4% bakterií utvořilo zónu 10 mm, 55,6% vzorků pak zónu velkou 15 mm
a 33,3% izolátů vytvořilo zónu velkou 20 mm. Zónu o velikosti 30 mm utvořilo 3,7%
testovaných vzorků.
Graf č.16 - alpínský trávník: Zónu o velikosti 10 mm utvořilo 13,3% bakterií rodu
Streptomyces, zónu o 15 mm poté utvořilo 46,7% z nich a zónu velkou 20 mm vytvořilo 33,3%
izolátů. 6,7% vzorků utvořilo zónu 25 mm.
36
3.1.1.e Cefazolin
Graf č.17 - V nížinném lese prokázalo přes
57% vzorků rezistenci vůči Cefazolinu.
Graf č.18 - V mlžném lese osmina vytvořila
zónu 15 mm, další osmina 20 mm a čtvrtina
zónu o velikosti 25 mm.
Graf č.19 - V savaně bylo rezistentních přes
čtvrtinu izolátů a téměř čtvrtina vytvořila
zónu o velikosti 35 mm.
Graf č.20 - V alpínském trávníku prokázalo
rezistenci 40% bakterií, přes čtvrtinu vzorků
vytvořilo zónu o 30 mm.
37
Graf č.17 - nížinný les: Žádnou citlivost neprokázalo 57,1% vzorků. 11,9% izolátů vytvořilo
zónu velkou 15 mm, 14,3% bakterií utvořilo zónu o 20 mm a 7,1% testovaných vzorků utvořilo
zónu velkou 25 mm. Zóna o velikosti 30 mm byla utvořena 4,8% bakterií a zóny velké 40 mm a
45 mm utvořilo vždy po 2,4% bakterií.
Graf č.18 - mlžný les: Cefazolin neúčinkoval na 6,3% bakterií. 12,5% izolátů utvořilo zónu
velkou 15 mm, stejné procento testovaných vzorků utvořilo zónu o 20 mm. 25 mm velkou zónu
vytvořilo 25% zkoumaných bakterií, zónu o velikosti 35 mm utvořilo 18,8% těchto bakterií,
stejné procento utvořilo zónu o 40 mm a zóna velká 50 mm byla vytvořena 6,3% bakteriemi.
Graf č.19 - savana: 25,9% bakterií rodu Streptomyces odebraných v této elevaci vůbec
nereagovalo na antibiotikum. 3,7% těchto bakterií utvořilo zónu o 10 mm, 14,8% izolátů utvořilo
zónu velkou 15 mm a 7,4% zkoumaných vzorků vytvořilo zónu o velikosti 20 mm. Zóna o
25 mm byla vytvořena 3,7% bakterií, zóna velká 30 mm byla utvořena 11,1% izolátů a zóna o
velikosti 35 mm byla vytvořena 22,2% vzorky. 7,4% izolátů utvořilo zónu velkou 40 mm a 3,7%
testovaných bakterií utvořilo zónu o 45 mm.
Graf č.20 - alpínský trávník: Cefazolin neprokázal žádnou účinnost u 40% vzorků z elevace
alpínského trávníku. 6,7% bakterií utvořilo zónu velkou 10 mm, 13,3% izolátů utvořilo zónu o
velikosti 20 mm, stejné procento utvořilo zónu o 25 mm a 26,7% bakterií vytvořilo zónu
velkou 30 mm.
38
3.1.1.f Amoxicillin
Graf č.21 - V nížinném lese téměř polovina
vzorků neprokázala citlivost vůči
Amoxicillinu.
Graf č.22 - V mlžném lese byla čtvrtina izolátů
rezistentních vůči ATB, zóny 15 mm, 20 mm a
25 mm vytvořilo po osmině vzorků.
Graf č. 23 - V savaně bylo téměř 15%
rezistentních.
Graf č.24 - V alpínském trávníku vytvořilo
přes 31% zónu o 25 mm a necelých 19%
utvořilo zónu velkou 30 mm.
39
Graf č.21 - nížinný les: 42,9% zkoumaných izolátů prokázalo přirozenou rezistenci vůči
Amoxicillinu. 2,4% bakterií utvořilo zónu o velikosti 10 mm, 16,7% testovaných vzorků utvořilo
zónu velkou 15 mm a 7,1% bakterií rodu Streptomyces vytvořilo zónu o 20 mm. Stejné procento
vytvořilo zónu o velikosti 25 mm a 14,3% zkoumaných izolátů utvořilo zónu 30 mm velkou.
Zóna o velikosti 35 mm byla utvořena 4,8% vzorků, zóna velká 40 mm byla vytvořena 2,4%
bakterií a stejným procentem vzorků byla utvořena i zóna o velikosti 60 mm.
Graf č.22 - mlžný les: 25% zkoumaných bakterií nereagovalo na toto antibiotikum. Zóny o
15 mm, 20 mm a 25 mm utvořilo vždy 12,5% bakterií. 6,3% izolátů utvořilo zónu velkou
30 mm, 18,8% testovaných bakterií vytvořilo zónu o 35 mm, 6,3% vzorků utvořilo zónu o
40 mm a stejné procento bakterií vytvořilo zónu o 60 mm.
Graf č.23 - savana: 14,8% bakterií rodu Streptomyces bylo rezistentních vůči Amoxicillinu.
3,7% těchto bakterií utvořilo zónu o velikosti 10 mm, 11,1% izolátů utvořilo zónu velkou 15 mm
a stejné procento vytvořilo zónu o 20 mm. Zóny o velikosti 25 mm a 30 mm byly utvořeny vždy
7,4% bakterií, zóna velká 35 mm byla vytvořena 3,7% bakteriemi a 40 mm velká zóna byla
utvořena 11,1% zkoumanými izoláty. 3,7% vzorků utvořilo zónu o 45 mm, 14,8% testovaných
bakterií utvořilo zónu o velikosti 50 mm a 11,1% izolátů vytvořilo zónu velkou 55 mm.
Graf č.24 - alpínský trávník: 6,3% izolátů bylo rezistentních vůči antibiotiku. 31,3%
zkoumaných bakterií utvořilo zónu o velikosti 25 mm, 18,8% těchto bakterií vytvořilo zónu
velkou 30 mm a 12,5% vzorků utvořilo zónu o 35 mm. Zóna o velikosti 40 mm byla utvořena
6,3% bakterií, stejné procento zkoumaných vzorků utvořilo zónu o 45 mm, 12,5% izolátů
utvořilo zónu o 50 mm a 6,3% testovaných bakterií vytvořilo zónu velkou 55 mm.
40
3.1.1.g Ampicilin
Graf č.25 - V nížinném lese téměř 62% bakterií
prokázalo rezistenci vůči Ampicilinu.
Graf č.26 - V mlžném lese téměř 19% neprokázalo
citlivost vůči ATB, necelých 19% vytvořilo zónu
o 20 mm, to samé procento zónu velkou 45 mm.
Graf č.27 - V savaně přes 22% bakterií bylo
rezistentních a téměř 19% utvořilo zónu
o velikosti 40 mm.
Graf č.28 - V alpínském trávníku vytvořilo
přes 22% izolátů zónu o velikosti 25 mm.
41
Graf č.25 - nížinný les: Rezistence vůči tomuto antibiotiku se projevila u 61,9% zkoumaných
bakterií. 2,4% izolátů utvořilo zónu velkou 10 mm, stejné procento vzorků utvořilo zónu o
15 mm. Zóny o velikostech 20 mm a 25 mm byly vytvořeny vždy 9,5% bakterií. 7,1%
testovaných vzorků utvořilo zónu velkou 30 mm, 4,8% izolátů vytvořilo zónu o 35 mm a zónu
velkou 55 mm utvořilo 2,4% testovaných bakterií.
Graf č.26 - mlžný les: 18,8 % testovaných vzorků neprokázalo citlivost vůči Ampicilinu. 6,3%
bakterií utvořilo zónu o velikosti 10 mm, 18,8% izolátů vytvořilo zónu velkou 20 mm, 6,3%
vzorků utvořilo zónu o 25 mm a stejné procento bakterií utvořilo zónu velkou 30 mm. Zóna
velká 35 mm byla utvořena 12,5% zkoumanými bakteriemi, zóna o velikosti 40 mm byla
vytvořena 6,3% bakteriemi, zónu velkou 45 mm utvořilo 18,8% izolátů a 6,3% vzorků vytvořilo
50 mm velkou zónu.
Graf č.27 - savana: 22,2% testovaných bakterií prokázalo rezistenci vůči tomuto antibiotiku.
11,1% izolátů utvořilo zónu o velikosti 15 mm, 14,8% vzorků vytvořilo zónu velkou 25 mm a
7,4% zkoumaných izolátů utvořilo zónu o 30 mm. Zónu velkou 35 mm utvořilo 11,1% vzorků,
zónu o velikosti 40 mm vytvořilo 18,5% testovaných izolátů, 3,7% bakterií utvořilo 45 mm
velkou zónu a 11,1% zkoumaných vzorků utvořilo zónu o 50 mm.
Graf č.28 - alpínský trávník: 5,6% bakterií rodu Streptomyces neprokázalo citlivost vůči
tomuto antibiotiku. 11,1% izolátů utvořilo 10 mm velkou zónu, 16,7% vzorků utvořilo zónu o
velikosti 15 mm a 11,1% testovaných bakterií vytvořilo zónu o 20 mm. 22,2% izolátů vytvořilo
zónu o velikosti 25 mm, 5,6% zkoumaných vzorků utvořilo zónu velkou 35 mm, 40 mm velkou
zónu utvořilo 11,1% bakterií, stejné procento vzorků utvořilo zónu o 45 mm a 5,6% testovaných
izolátů vytvořilo zónu o velikosti 55 mm
42
3.1.1.h Penicilin
Graf č.29 - V nížinném lese téměř polovina
vzorků prokázala rezistenci vůči Penicilinu.
Graf č.30 - V mlžném lese bylo rezistentních necelých
19% a čtvrtina vzorků vytvořila zónu velkou 15 mm.
Graf č.31 - V savaně bylo rezistentních 37%
izolátů, přes 18% vzorků vytvořilo zónu o
25 mm.
Graf č.32 - V alpínském trávníku se citlivost na
ATB neprojevila u třetiny vzorků, přes 22% izolátů
utvořilo zónu o velikosti 20 mm.
43
Graf č.29 - nížinný les: Rezistence vůči Penicilinu se projevila u 47,6% testovaných bakterií
odebraných v elevaci nížinného lesa. 4,8% izolátů utvořilo zónu velkou 10 mm, 16,7% bakterií
utvořilo zónu o 15 mm a 7,1% vzorků vytvořilo 20 mm velkou zónu. Zónu velkou 25 mm
utvořilo 9,5% vzorků, 30 mm velkou zónu vytvořilo 4,8% izolátů a stejné procento vytvořilo
zónu velkou 35 mm. Zóny 40 mm a 45 mm byly vytvořeny vždy 2,4% testovanými bakteriemi.
Graf č.30 - mlžný les: 18,8% bakterií bylo rezistentních vůči Penicilinu. 25% testovaných
vzorků utvořilo zónu o velikosti 15 mm, 12,5% izolátů utvořilo zónu o 20 mm a stejné procento
bakterií vytvořilo 25 mm velkou zónu. 6,3% zkoumaných bakterií utvořilo zónu o velikosti
30 mm, 12,5% izolátů vytvořilo zónu velkou 35 mm a stejné procento vytvořilo zónu o 40 mm.
Graf č.31 - savana: Rezistenci vůči tomuto antibiotiku prokázalo 37% vzorků z této elevace.
3,7% izolátů vytvořilo zónu o velikosti 15 mm, 7,4% testovaných bakterií utvořilo zónu o 20 mm
a 18,5% vzorků utvořilo zónu velkou 25 mm. Zóna o velikosti 30 mm byla vytvořena 14,8%
bakteriemi, zóna velká 35 mm byla utvořena 3,7% izolátů a zónu o 40 mm utvořilo 7,4% vzorků.
Zóny o velikostech 45 mm a 50 mm byly vytvořeny vždy 3,7% testovanými vzorky.
Graf č.32 - alpínský trávník: Toto antibiotikum bylo v této elevaci neúčinné ve 33,3% případů.
5,6% zkoumaných bakterií utvořilo zónu o velikosti 15 mm, 22,2% izolátů vytvořilo zónu velkou
20 mm a 16,7% utvořilo zónu o 25 mm. Zóna o velikosti 30 mm byla utvořena 5,6% bakteriemi
a zóna velká 35 mm byla utvořena 16,7% vzorky.
44
3.1.2. Průměrná inhibiční zóna v dané nadmořské výšce se směrodatnou
odchylkou
3.1.2.a Ciprofloxacin
Na svislé ose je vidět velikost zóny v milimetrech, na vodorovné elevace, přičemž 1 představuje
nížinný les, 2 – mlžný les, 3 – savanu a 4 – alpínský trávník. Toto značení bylo použito i u
dalších grafů podkapitoly 3.1.2.
Průměrná inhibiční zóna vůči Ciprofloxacinu v nížinném lese byla 18,6 mm se směrodatnou
odchylkou
. V mlžném lese byla naměřena průměrná hodnota 19,4 mm s odchylkou
. V savaně byla vypočítána jako průměrná hodnota 24,4 mm
typu byla průměrná inhibiční zóna velká 23,2 mm
mezi elevacemi významné.
45
a v trávníku alpínského
. Ze statistického hlediska nejsou rozdíly
3.1.2.b Tetracyklin
V elevaci nížinného lesa byla naměřena průměrná zóna 27,2 mm se směrodatnou odchylkou
. V mlžném lese byla vytvořena průměrná inhibiční zóna 24,6 mm s odchylkou
savaně byla naměřena průměrná hodnota 40,5 mm
průměrná zóna vypočítána hodnota 42,3 mm s odchylkou
. V alpínském trávníku byla jako
. V elevacích nížinného a mlžného
lesa byly naměřeny významně nižší hodnoty než v savaně a trávníku alpínského typu.
46
.V
3.1.2.c Chloramfenikol
V nížinném lese byla vůči Chloramfenikolu naměřena průměrná hodnota inhibiční zóny
25,6 mm
. V mlžném lese byla vypočítána jako průměrná zóna o průměru 37,6 mm s
odchylkou
. Průměrná hodnota zóny v savaně byla stanovena na 42 mm se směrodatnou
odchylkou
. V alpínském trávníku byla naměřena hodnota o velikosti 38,9 mm
.
Statisticky významný rozdíl je pozorovatelný pouze mezi elevací nížinného lesa a ostatními
elevacemi.
47
3.1.2.d Gentamicin
V nížinném lese byla naměřena průměrná inhibiční zóna vůči Gentamicinu o velikosti 12,3 mm
. V mlžném lese byla vypočítána jako průměrná hodnota 12,9 mm se směrodatnou
odchylkou
. Průměrná hodnota naměřena v savaně byla 15,2 mm s odchylkou
alpínském trávníku byla stanovena jako průměrná zóna 14,7 mm
elevacemi je pozorovatelný jen mezi nížinným lesem a savanou.
48
. V
. Významný rozdíl mezi
3.1.2.e Cefazolin
V nížinném lese byla naměřena průměrná hodnota 8,5 mm se směrodatnou odchylkou
mlžném lese byla vypočítána jako průměrná inhibiční zóna 25,9 mm
savaně byla stanovena na 19,8 mm s odchylkou
vytvořena průměrná zóna o velikosti 15,6 mm
. Průměrná hodnota v
. V trávníku alpínského typu byla
. Rozdíl mezi nížinným lesem a mlžným
lesem či nížinným lesem a savanou je statisticky významný.
49
.V
3.1.2.f Amoxicillin
V nížinném lese byla naměřena průměrná hodnota 12,5 mm se směrodatnou odchylkou
Průměrná zóna v elevaci mlžného lesa byla stanovena na 20,9 mm
. V savaně byla jako
průměrná velikost průměru zóny vypočítána hodnota 25,1 mm s odchylkou
alpínského typu byla naměřena průměrná zóna 33,1 mm
.
. V trávníku
. Z hlediska statistického je
pozorovatelný rozdíl mezi elevací nížinného lesa a savanou či nížinného lesa a alpínským
trávníkem.
50
3.1.2.g Ampicilin
V elevaci nížinného lesa byla naměřena inhibiční zóna o velikosti 8,3 mm
byla zóna stanovena na 25,8 mm se směrodatnou odchylkou
vypočítána na hodnotu 24,5 mm s odchylkou
inhibiční zóna v průměru 25,1 mm
. V mlžném lese
. Průměrná zóna byla
. V trávníku alpínského typu byla naměřena
. Významný rozdíl mezi zónami je znatelný mezi
nížinným lesem a ostatními elevacemi.
51
3.1.2.h Penicilin
Průměrná hodnota naměřená v nížinném lese byla 10,4 mm se směrodatnou odchylkou
mlžném lese byla stanovena průměrná inhibiční zóna na 20,1 mm
vytvořena průměrná zóna o velikosti 17,2 mm s odchylkou
naměřena průměrná hodnota průměru zóny 16,5 mm
a mlžného lesa je statisticky významný.
52
.V
. V savaně byla
. V alpínském trávníku byla
. Rozdíl mezi elevací nížinného lesa
3.1.3. Multirezistence vzorků
Graf ukazuje na svislé ose počet bakterií a na vodorovné ose počet antibiotik, vůči nimž byly
tyto bakterie rezistentní. Citlivost na všechna antibiotika prokázalo 49 kmenů z izolovaných 114.
17 kmenů bylo rezistentních vůči jednomu druhu antibiotik, 18 kmenů vůči dvěma druhům
antibiotik a 9 kmenů neprojevilo citlivost vůči třem druhům. Na čtyři druhy antibiotik nebylo
citlivých 13 kmenů, vůči pěti druhům bylo rezistentních 5 kmenů, proti šesti druhům antibiotik
prokázaly rezistenci 2 kmeny a jen jeden kmen byl rezistentní vůči sedmi antibiotikům.
53
3.2. Produkce sekundárních metabolitů vůči Escherichia coli,
Bacillus subtilis a Sacharomyces cerevisiae
3.2.1. Bacillus subtilis
Na tomto grafu můžeme vidět, že 42% bakterií rodu Streptomyces izolovaných z půdy nížinného
lesa, produkují antibiotické látky vůči zástupci grampozitivní bakterie. V mlžném lese bylo
nalezeno 26% producentů, v savaně necelých 15% a v trávníku alpínského typu 21%.
54
3.2.2. Escherichia coli
13% bakterií rodu Streptomyces z elevace nížinného lesa vyprodukovalo antibiotika vůči
Escherichia Coli, respektive vůči zástupci gramnegativní bakterie. Vzorky z mlžného lesa
neprokázaly žádnou aktivitu, ze savany jich produkovalo 7% a z alpínského trávníku 10%.
55
3.2.3. Sacharomyces cerevisiae
24% vzorků z nížinného lesa prokázalo aktivitu vůči Sacharomyces cerevisiae, 18% vzorků z
mlžného lesa také prokázalo fungicidní účinky, oproti tomu bakterie ze savany neprokázaly
aktivitu žádnou. Z elevace trávníků alpínského typu ukázalo aktivitu 10,5%.
56
3.3. Fungicidní aktivita určitých druhů bakterií rodu Streptomyces
vybraných ze sbírky BC ČAV
Osm druhů z námi testovaných 21 bakterií rodu Sreptomyces utvořilo vůči 11 testovaným
houbám zónu nad 18 mm- viz tabulka č.2. S těmito vzorky se provádějí další experimenty.
Tabulka č.2 – Čísla kmenů představují testované bakterie rodu Streptomyces a písmena A-K
kmeny houby rodu Fusarium.
Kmen č. A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
474
30
22
24
24
25
30
22
28
36
26
29
521
24
24
23
28
28
33
26
28
38
32
27
781
0
22
23
24
26
23
25
25
35
32
23
918
24
25
23
23
27
26
23
26
27
31
21
930
20
24
22
21
26
24
22
21
30
24
25
931
23
23
23
27
32
32
23
28
40
30
25
947
11
0
30
0
7
9
19
0
40
25
24
996
29
23
24
23
28
29
26
30
46
30
30
1008
27
24
29
36
35
32
30
20
40
28
30
1011
8
17
7
10
26
29
9
20
30
18
23
1030
23
22
22
24
26
24
23
25
33
24
27
1053
30
24
24
25
27
29
23
30
30
24
30
1061
9
16
6
14
0
17
8
6
19
13
0
1069
10
18
18
17
24
25
18
18
28
24
23
1072
0
18
10
0
18
19
20
17
26
23
21
1074
27
21
20
22
21
23
20
25
31
28
27
1075
25
23
23
24
23
24
23
26
28
26
26
1078
24
21
23
19
18
26
19
24
30
28
24
1079
24
19
22
23
26
24
21
22
32
20
26
1895
23
22
19
19
26
26
26
20
30
24
25
1897
24
24
22
21
26
26
21
25
28
24
21
57
4. Závěr
Hypotéza týkající se sopečné aktivity, tedy zda-li je zásaditost vhodnou podmínkou pro větší
výskyt bakterií rodu Streptomyces se nepotvrdila. Čím zasaditější pH jsme naměřili, tím méně
bakterií jsme nalezli, kupříkladu v nížinném lese byla naměřena hodnota 4,2 a výskyt bakterií na
gram suché půdy byl vypočten na 8,3x
a výskyt se snížil na 4,3x
, kdežto v savaně byla naměřena hodnota pH 5,5
. Snížení počtu bakterií jistě nebylo způsobeno pouze změnou pH,
ale jde o důležitý faktor, který tomuto rozdílu přispěl.
Bylo zjištěno, že u většiny antibiotik jsou nejvíce rezistentní bakterie z elevace nížinného lesa
a se zvyšující se nadmořskou výškou se zvětšovala citlivost bakterií vůči antibiotiků. Toto se
velmi názorně prokázalo u ciprofloxacinu, gentamicinu, amoxicilinu a ampicilinu. U amoxicilinu
se rezistence snižovala s rostoucí elevací - v nížinném lese bylo rezistentních 40% bakterií, zato
v elevaci alpínského trávníku pouze 6% - a ampicilinu, vůči němuž bylo rezistentních 60%
izolátů z nížinného lesa a 13% z alpínského trávníku. Tetracyklin byl ve všech případech účinný
v savaně a alpínském trávníku, v nížinném a mlžném lese se rezistence projevila.
Chloramfenikol nebyl 100% účinný pouze v nížinném lese a gentamicin v nížinném a mlžném
lese. Na cefazolin bylo přirozeně rezistentních 19 vzorků ze 114 zkoumaných kmenů bakterií z
rodu Streptomyces, v nížinném lese bylo necitlivých dokonce 60% izolátů. V nížinném lese bylo
rezistentních vůči penicilinu téměř 50% vzorků, v mlžném lese rezistence poklesla na 19% a
poté v savaně a alpínském trávníku opět narostla na 35%.
Tomuto závěru odpovídají i průměrné inhibiční zóny, které prokázaly, že v nížinném lese jsou
zóny mnohem menší, respektive rezistence mnohem vyšší. Největší zóny tvořily bakterie z
elevací savany a alpínského trávníku, kupříkladu průměrná zóna izolátu z nížinného lesa vůči
amoxicilinu byla určena na hodnotu 12,5 mm, v alpínském trávníku byla zóna mnohem větší 33,1 mm. Ze statistického hlediska můžeme říci, že zóny v nížinném lese jsou významně menší
než zóny izolátů z jiných elevací.
58
Tyto výsledky by mohly být velmi přínosné z pohledu bioprospektingu, jelikož jsme nalezli
kmeny bakterií, které jsou přirozeně rezistentní na některá antibiotika. Nejméně rezistentní
bakterie můžeme hledat v Afro-alpínském trávníku, což bylo očekávatelné vzhledem k tomu, že
tyto bakterie nemají v tomto prostředí tolik konkurence co se potravního řetězce týče. Naopak v
nížinném lese žije mnoho různých druhů bakterií, díky tomu musí být bakterie z rodu
Streptomyces odolnější, což můžeme pozorovat na zmenšování se průměrných zón. Tímto jsme
potvrdili jednu z našich hypotéz.
Od rezistence se teď přesuneme k multirezistenci, tedy odolnosti bakterií vůči více antibiotikům.
Téměř 50 kmenů, tj. 43% bylo citlivých na všechna testovaná antibiotika. S růstem počtu
rezistencí vůči antibiotikům se snižoval počet odolných kmenů - vůči všem, tedy sedmi druhům
antibiotik byl rezistentní jen jediný kmen s číslem 1636, který byl izolován v mlžném lese.
43% testovaných izolátů, což je téměř polovina, bylo citlivých na všechna antibiotika. Vzhledem
k tomu by se mělo omezit nadužívání antibiotik jak k humánním, tak zemědělským účelům,
jelikož je to velmi rychle se šířící trend a účinnost léčiv klesá.
Přejděme teď k závěrům plynoucím z výsledků testů produkce sekundárních metabolitů: Zprvu
budeme hovořit o grampozitivní bakterii Bacillus subtilis. Přes 40% kmenů z nížinného lesa
produkovalo antibiotické látky vůči této bakterii. V mlžném lese se produkce snižuje, v savaně
byla antibiotická aktivita stanovena na 15%, ale naopak se počet producentů na 21% zvýšil v
alpínském trávníku. V nížinném lese bylo 13% vzorků aktivních vůči zástupci gramnegativních
bakterií Escherichia coli, v mlžném lese jsme neobjevili žádného producenta, v savaně se
projevilo nízké procento antibioticky aktivních bakterií, v alpínském trávníku se jich objevilo
opět více. Vůči kvasince Sacharomyces cerevisiae byla aktivní čtvrtina vzorků z nížinného lesa,
o něco méně izolovaných bakterií z mlžného lesa působilo fungicidně, v savaně se producent
nenašel a v alpínském trávníku opět pozorujeme trend, kdy se počet izolátů produkujících
fungicidní látky zvýšil na 10%.
59
Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že bakterie rodu Streptomyces vykazují vyšší produkci
sekundárních metabolitů vůči grampozitivním bakteriím. Také se potvrzuje, že půdy v okolí hory
Mt. Cameroon jsou vhodným nalezištěm bakterií rodu Streptomyces, které vykazují antibiotickou
aktivitu, což by opět mohlo být významné v bioprospektingu.
Fungicidní aktivita bakterií z rodu Streptomyces vůči houbám z rodu Fusarium bude nadále
zkoumána. Nyní již však víme, že 8 z 21 testovaných mělo pozitivní výsledky, tedy že utvořilo
relativně podstatnou velikost zóny vůči houbě.
Bylo prokázáno, že bakterie rodu Streptomyces působí fungicidně vůči houbám z rodu Fusarium,
což vede k dalším pokusům, zda-li by se látka takto působící dala izolovat a používat v
zemědělství. Otázkou však zůstává, zda-li látka nebude natolik toxická nebo jinak škodlivá, že
by mohla působit zdravotní potíže i nám, lidem.
60
5. Zdroje
Aminoglykosidy. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Aminoglykosidy
Arsphenamine. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia
Foundation, 2001- [cit. 2015-02-25]. Dostupné z:http://en.wikipedia.org/wiki/Arsphenamine
BENEŠ,
Jiří.
Přehled
antibiotik
[online].
2003
[cit.
2014-11-09].
Dostupné
z:http://old.lf3.cuni.cz/studium/materialy/infekce/en_atb.pdf
Cefalosporiny. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Cefalosporiny
DEVETTER, Miloslav, soukromá přednáška, 16.10.2014.
DOLEŽAL, Jiří; DEVETTER, Miloslav, KRIŠTŮFEK, Václav, diskuse, 13.2.2015.
DOLEŽAL, Jiří. AV ČR. Altitudinal changes in vegetation structure and tree growth on Mt.
Cameroon, Western Africa. Č. Budějovice, 2015.
ELHOTTOVÁ, Dana, přednáška: Antibiotika - 70 let ve službách člověka, 18.3.2013.
Chinolony. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Ciprofloxacin#Chinolony_3._generace
Chloramfenikol. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Chloramfenikol
Peniciliny. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Peniciliny
Přehled základních skutečností rezistence vůči antibiotikům. WHO [online]. 2011
[cit. 2015-03-02]. Dostupné z:
http://www.who.cz/attachments/article/27/WHD_factsheet_every_CZE.pdf
Pseudomonas aeruginosa. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA):
Wikimedia Foundation, 2001- [cit. 2015-02-25]. Dostupné
z:http://cs.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa
ROTTENBORNOVÁ, Drahomíra. Antimikrobní terapie. In: Mikrobiologie.wz.cz [online]. [cit.
2015-02-25]. Dostupné z:http://mikrobiologie.wz.cz/03-Antimikrobni_terapie.pdf
SPÍŽEK, Jaroslav. Rezistence na antibiotika. Vesmír. 1999, roč. 78, č. 27.
z:http://casopis.vesmir.cz/clanky/clanek/id/676
61
Dostupné
ŠIMŮNEK Jan, SMOLA Jan: Antibiotika, sulfonamidy a chinolony, nepublikovaný opravený
rukopis druhého vydání.
Tetracykliny. WikiSkripta [online]. [cit. 2015-03-02]. Dostupné
z:http://www.wikiskripta.eu/index.php/Tetracyklin
62