Stanovení konzervačních látek v nápojích metodou kapilární a

Stanovení konzervačních látek v nápojích metodou kapilární
a čipové elektroforézy
Úvod
Konzervační látky neboli konzervanty jsou látky, které zamezují růstu mikroorganismů
v potravinách a nápojích, čímž prodlužují jejich trvanlivost a skladovatelnost. Přítomnost
mikroorganismů v potravině může mít za následek změnu vzhledu, barvy, vůně nebo chuti.
V některých případech mohou mikroorganismy vytvářet i člověku nebezpečné toxiny.
Množství použitých konzervantů je třeba důkladně monitorovat, neboť ve vysokých
koncentracích mohou mít tyto látky nepříznivé vedlejší účinky. Limity nejvyššího povoleného
množství (NPM) a nezbytně nutného množství (NM) jsou stanoveny zákonem [1]. Kromě
metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), která se stala pro stanovení
konzervačních látek takřka rutinní, lze rovněž pro tuto analýzu využít kapilární elektroforézy
(CE) nebo její miniaturizované podoby na čipu.
Elektroforetická separace využívá rozdílných elektroforetických mobilit nabitých složek
analytu vlivem vnějšího vloženého napětí [2]. Separace probíhá v základním elektrolytu,
nejčastěji pufru, jehož parametry (složení, pH a koncentraci elektrolytu) je třeba pro každou
separaci optimalizovat. Analyt je do separačního systému dávkován hydrodynamicky,
popřípadě elektrokineticky. K detekci se nejčastěji používá spektrofotometrický detektor, lze
však použít i dalších způsobů detekce jako je například vodivostní, fluorescenční nebo
hmotnostní spektrometrie.
Přístroje a chemikálie
Kapilární elektroforéza Agilent s vodivostním detektorem, křemenná kapilára (vnitřní
průměr 50 µm), křemenný čip pro elektroforézu (Obr. 1), digitální mikroskop,
hydrodynamická pumpa Nemesis, plastová injekční stříkačka o objemu 10 ml, PC pro
vyhodnocení analýz, ultrazvuková lázeň, mikrofiltr s membránou o porozitě 0,45 µm,
skleněné kádinky.
Deionizovaná voda, metanol, kyselina sorbová, p.a., kyselina benzoová p.a., kyselina
salicylová p.a., kyselina boritá p.a., vodný roztok NaOH (1 mol/l).
Obrázek 1 Čip pro elektroforézu
Pracovní postup
1. Příprava základního elektrolytu
Do kádinky navážíme množství kyseliny borité odpovídající 0,05 mol, Přidáme 250 ml
deionizované vody a pH upravíme pomocí roztoku NaOH na hodnotu.
2. Příprava vzorku
20 ml vzorku se odpipetuje do 100 ml odměrné baňky a doplní se základním
elektrolytem na výsledný objem 80 ml. Odměrná baňka se ponechá 10 minut v ultrazvukové
lázni při laboratorní teplotě. Poté se přidá 10 ml kyseliny salicylové (1 mg/ml) jako interního
standardu a baňka se doplní po rysku základním elektrolytem. Před nadávkováním do
separačního systému se vzorek přefiltruje přes mikrofiltr.
Standardní roztoky stanovovaných kyselin (ve směsi) připravíme v koncentračním
rozsahu 1-50 mg/l do 10ml odměrných baněk rozpuštěním v základním elektrolytu. Do
každého roztoku se přidá 1 ml kyseliny salicylové jako interního standardu. Každý standard
se analyzuje 2x, samotný vzorek 3x.
3. Analýza kapilární elektroforézou
Separační napětí se nastaví na + 25 kV, K detekci se použije vodivostní a
spektrofotometrický detektor. Vlnová délka se nastaví na 235 nm pro stanovení kyseliny
sorbové a benzoové. Vzorky se dávkují hydrodynamicky po dobu 3 sekund a elektrokineticky
při napětí + 5 kV po dobu 5 sekund.
4. Analýza čipovou elektroforézou
Separační mikrokanálek se pomocí systému pump hydrodynamicky celý nadávkuje
roztokem základního elektrolytu ve směru od "buffer" k "waste 2". Poté je vzorek
elektrokineticky nadávkován po dobu 5 sekund při napětí + 5 kV ve směru od elektrody
"sample" k "waste 1". Separační napětí nastavíme na + 15 kV a detekujeme bezkontaktním
vodivostním detektorem.
5. Zpracování výsledků
Identifikace stanovovaných látek se provádí srovnáním migračních časů a jejich poměrů
s migračním časem interního standardu, respektive přídavkem standardů ke vzorku.
Kvantifikace se provádí metodou absolutní kalibrace s využitím kalibrační křivky.
S využitím regresní rovnice kalibrační závislosti vypočteme obsahy obou kyselin ve
vzorku a porovnejte hodnoty limitů detekce a kvantifikace pro čipovou a kapilární
elektroforézu.
Literatura
[1] J. Davídek, Laboratorní příručka analýzy potravin. Praha, 1977.
[2] D. Heiger, High Performance Capillary Electrophoresis, An Introduction, Agilent
Technologies, Germany.