Imunologie sepse

Imunologie sepse
Průcha M
Oddělení klinické biochemie, hematologie a
imunologie,
Nemocnice Na Homolce
2.LF FN v Motole
06.04.2007
Patogeneze sepse
Mikroorganismus
Makrorganismus
Mikroorganismus
G+, G-, houby, viry
Komensál x potencionálně patogenní x
obligatorně patogenní
Rozdílná virulence, rozdílný potenciál
Místo infekce
Patogeneze sepse - mediátory
Prozánětlivé
Protizánětlivé
Přehled – Dinarello et al.
2001 ACCP/SCCM/ESICM/ATS/SIS
INTERNATIONAL SEPSIS DEFINITIONS CONFERENCE
The PIRO system for Definition
and Staging Sepsis
November 2001, Washington, USA
Present
Future
Predisposition
Premorbid illness
Genetic polymorphisms
Infection
Cultures
Microbial products:
toxins, bacterial DNA
Response
SIRS, CRP
Markers of activated
inflammation: PCT, IL-6, ...
Organ dysfunctions
Scores:
SOFA, MODS, ...
Levy MM et al. Intensive Care Med (2003) 29:530.538
Apoptosis, cell stress,
hypoxia
INFEKCE
LPS
Mikrol.
TRAUMA / POPÁLENINY
IMUNOSUPRESE
Aktivace imunit. systému
Kontrola
infekce
Hyper ….
fáze
Imunoparalýza
Sepse
Nekontrolované
infekce
MODS
MOF
MOF
Prozánětlivá fáze
SIRS
CARS
Protizánětlivá fáze
LPS
Bakteriální
lipopeptidy
LBP + CD14
TLR4
CpG motiv
Bakteriální
peptidoglykany
TLR6
MYD88
TLR2
TLR2
IRAK
TRAF6
TLR9
Glykoproteiny
parazitů
NIK
DNA
IKK
1kB
NFkB
Jádro
MHC II
B7, CD40
Receptory
pro komplement
IL-1, IL-12, TNF
IL-6
Pathogen associated
molecular patterns
PAMPs (DAMPs)
Bakteriální motivy
Rozpoznány vrozenou imunitou mohou
představovat potencionální
terapeutický cíl
Není jasné zda host rozliší mezi
patogenem a komensálem
Rozpoznávací mechanismy
Receptory pro motivy a komponenty =
pattern recognition proteins (PRPs)
Toll- like receptory (1-10)
Peptidoglykan rozeznávající molekuly
nucleotide –vázající oligomerizační
doména– NOD1, NOD2
TREM-1 (triggering receptor expressed
on myeloid cells)
DAP-12
Další ligandy
Mannosu vázající lektin (MBL)
Calcium vázající lektin
Váže se na mikrobiální struktury a iniciuje
komplementovou aktivaci
Varianty kodonu 54 a 57 exonu 1 v MBL genu
(5% populace ake zvyšuje 6x riziko
meningokokového onemocnění
Hibberd et al: Lancet 1999, 353: 1049-1053
Roy et al: Lancet 2002, 359: 1569-1573
Další ligandy
Makrofágový manosový receptor
Karbohydrátová rozpoznávací molekula
Potencionální kandidátní gen pro
vnímavost k lepře
Toll-like receptory
TLR2TLR6 – peptidoglykany
TLR4 – LPS
TLR 5 – flagelin
TLR 9 – bakteriální DNA
TLR4 a sepse – neutralizace anti-TLR
protilátek chrání před letální
endotoxémií ale ne před septickým
šokem ! Rogers et al: B-1506, IACC
20003
NODs
Rodina cytosolických proteinů
Homologie s rostlinnými geny které jsou
odpovědné za resistenci vůči patogenům
24 NOD genů bylo identifikováno v lidském
genomu
NOD2 varianty – deficientní v kappaB
aktivaci
NOD2 exprese je zvyšována prozánětlivými
cytokiny
Faktory ovlivňující průběh infekce
Mikroorganismus – rozdílná virulence,
produkce exotoxinů, množství, místo infekce
Makroorganismus – komorbidita, high x low
responder, věk, pohlaví..
Genetické predispozice
Chinnaiyan et al: Am J Pathol 2001; 159:
1199-1209 (individuálnost a výlučnost orgánů
ve vztahu ke genové expresi!!)
SEPSE=IMUNODEFICIENCE
Snížení produkce Ag specifických Ab
Snížená funkčnost Ag presentujících
buněk (HLA-DR/CD14)
Snížení produkce Gama interferonu
Kompartmentalizace zánětlivé odpovědi
Koncentrační gradienty pro a
protizánětlivých cytokinů (lokalizace,
systémovost infekce)
Patogeneze sepse
Sepse jako porucha regulace
imunologických mechanismů
Sepse jako sekundární imunodeficience
Přesmyk Th1 do Th2 odpovědi
Zvýšená apoptóza imunokompetentních
buněk a jejich imunosupresivní efekt
Snížená exprese MHC II.třídy a
kostimulačních molekul
Beutler (Trauma,Sepsis,Inflammation 2004,
„By definition, sepsis reflects failure of
immune response“)
Patogeneze sepse = zánět !!!
Zánět – propojení vrozené(innate) a
získané (adaptivní) imunity
Koncepce hyperzánětlivé odpovědi
Koncepce imunoparalýzy
Nature Immunology: December
2005,(Dampening inflammation…..)
Regulace zánětlivé odpovědi
Teorie hyperzánětlivé odpovědi
CARS
Současné poznatky svědčí pro úlohu obou
jako součásti systémové zánětlivé odpovědi
Obě se vyskytují již v časných fázích sepse
(Toft et al: Acta Anaesthesiol Scand
2002,46:405-410; Tschaikowsky et al: Crit
Care Med 2002;30:1015-1023
Prognostické faktory
Slotman: Crit. Care 2002,30:1035-1045,
SMART – The Systemic Mediator Associated
Response Test
Predikce orgánového selhání u severe sepsis
and septic shock -IL-6,IL-8,G-CSF
Exprese HLA-DR – Am J Respir Crit Care
Med 2004,169, 1144-1151
Imunomodulace na ICU??
– ano denně !!
ATB
Glukokortikosteroidy
Analgetika, intravenózní anestetika
Opiáty, barbituráty, benzodiazepiny
Hypertonické roztoky
Krevní deriváty
Adrenergika
Důvody rozdílu účinnosti
imunomodulační terapie v experimentu a
klinických studiích
Nesouměřitelnost experimentálního modelu
sepse a sepse v klinické praxi
(Nasraway
Chest 2003, 123:451S-459S)
Heterogennost léčených souborů pacientů
Špatný design studie
Špatný timing terapie
Koncepce protizánětlivé léčby
MoAb – mediátory – TNF-α, IL-1ra, endotoxin
Glukokortikosteroidy
IVIG
rh APC
Eliminační metody
Ovlivnění produkci mediátorů na úrovni
genové exprese
Rizika protizánětlivé terapie
Eichacker PQ et al: Am.J.Respir.Crit.Care
Med 2002, 166:1197-1205
Protizánětlivá terapie – anti -TNF, TNF
soluble receptors, IL-1ra,PAFra,
antiprostaglandiny, antibradykin
Čím větší riziko smrti, tím lepší účinek
protizánětlivé terapie , čím menší riziko, tím
menší nebo škodlivý účinek
Terapie zaměřená na mediátory sepse
(Marshall: Nature Rev 2003, 2: 391- 405)
Škodlivý efekt:
TNF R p 75
inhibice NO L-N-monomethyl arginine
Benefit:
Neutralizace endotoxinu s polyvalentním anti-sérem nebo
MoAb HA-1A
Neutralizace endotoxinu s rekombinantním BPI(redukce
morbidity)
Neutralizace TNF MoAb
Odstranění PAF pomocí rPAF acetylhydrolasy
Rh ACP
Kortikosteroidy ve farmakologické dávce
Terapie zaměřená na mediátory sepse
(Marshall: Nature Rev 2003, 2: 391-405)
„neurčitý nebo žádný efekt“
- Neutralizace endotoxinu pomocí MOAb
- Inhibice TNF MoAb nebo solubilním receptorem p55
- Inhibice PAR receptorovým antagonistou
- Inhibice bradykininu
- Použití pentoxifyllinu
- Antitrombin III nebo TF inhibitorem
Indikace imunologických
vyšetření
Biochemie
Imunologická vyšetření
Mikrobiologická vyšetření
Endokrinologie
Zobrazovací metody
Diagnostika
Zánět – přítomen x nepřítomen
Zánět – je infekční x je neinfekční
Stav imunologické surveillance
Zánět – je autoimunitní x není
autoimunitní
Diagnostika - biochemie
Zánět infekční x neinfekční
FW,CRP, KO, základní biochemie - …….
Diagnostika - imunologie
Humorální
Buňkami zprostředkovaná – flow
cytometry
Autoprotilátky
Diagnostika - mikrobiologie
Kultivace, hemokultury
PCR
Citlivost k ATB
Diagnostika – molekulární
diagnostika
PCR – detekce cizího genomu
cytogenetika
Hematoonkologie, onkologie
Diagnostika – zobrazovací
metody
Angiografie
PET/CT
MR
PCT
Prekursor calcitoninu
Calcitonin – tyroidální hormon
Mikrobiální infekce - zvyšuje CLAC-I
genovou expresi a uvolnění PCT z
parenchymatózních orgánů (játra, plíce,
ledviny, adipocyty, svaly)
Leukocyty - ne
PCT u bakteriální infekce (sepse)
Vztah k mortalitě pacientů ( Muller et al:
Crit Care Med 2000, 28: 977-983
PCT – způsoby měření
Chemiluminiscence – LUMITest
B.R.A.H.M.S. (detekční limit 0,3-0,5ug/L
Kryptor (PCT Brahms) snížení
detekčního limitu na 0,06ug/L
Dolní hranice referenčního rozmezí
0,5ng/L
Diferenciální diagnostika infekční a
neinfekční etiologie a vztah parametrů k
prognóze pacienta
(Průcha et al: Vnitřní lékařství 2003, 49: 541548
PCT
IL-6
C-reaktivní protein
Lipopolysacharid vázající protein
PCT - první vyšetření
** 0.001
80
**
71,3
70
ng/ml
60
50
* < 0.05
40
30
20
10
9.1
2,98
0
SIRS
SEPSE
S.ŠOK
IL6 - první vyšetření
* p< 0.05
900
*
800
700
n.s.
pg/ml
600
500
400
300
200
100
0
SIRS
SEPSE
S.ŠOK
CRP - první vyšetření
mg/l
* < 0.05
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*
n.s.
SIRS
SEPSE
S.ŠOK
Diagnóza
lineární regrese
závislá proměnná - diagnóza (infekce x non
infekce)
testován efekt PCT, CRP, IL6
Výsledek: jediným prediktorem diagnózy je
PCT a tento vztah není modifikován žádným
z ostatních testovaných faktorů
vztah se neliší při vyloučení sérií
PATIENTS – PCT
SIRS, sepsis, septic shock
123 patients from ICU
involving criteria of Consensus
Conference
1991 for SIRS, sepsis and septic shock
groups 1-4(local infection, SIRS, sepsis
and septic shock)
PCT levels in groups of patients 1-4
PCT
PCT ng/ml
**
**
70
**
60
50
**
40
30
n.s.
20
10
0
Lokal.inf.
SIRS
Sepse
Septický šok
The correlation of PCT to the diagnosis
n = 407
r = 0,8249
p < 0.001
140,00
120,00
PCT
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
0,00
1,00
2,00
ACCP
3,00
***
PCT levels in patients with septick shock
Mean levels 1-3. day, su rv.vs.nonsu rv.
PCT 1. - 3. den
ng/ml
50
Přeživší
p<0,05
45
40
35
Nepřeživší
n.s.
30
25
20
*
15
10
5
0
1.den
2.den
3.den
Predictive concentration of PCT for dg. sepsis
ROC - PCT pro inf. SIRS/all
100
>3ng/ml
SE=89,5
SP=96,8
90
80
Senzitivita
70
60
50
40
30
Area under the ROC = 0,86
20
10
0
0
20
40
60
100-Specificita
80
100
PCT A TRANSPLANTACE
36 pacientů pro Tx jater, 15 pacientů po
současné Tx ledvin a pankreatu, a 5
pacientů po Tx slinivky
Různý typ imunosuprese
S a bez ATG
PCT (n g /m l)
Patients after liver trans plantation
70
60
50
40
30
20
10
0
before general
anesthesia
4 hour after
graft
reperfusion
8 hour after
graft
reperfusion
1st
2nd
3rd
4th
postoperative postoperative postoperative postoperative
day
day
day
day
ATG+ (n=20)
ATG- (n=16)
4th
p o s to p e rative
d ay
3rd
p o s to p e rative
d ay
2n d
p o s to p e rative
d ay
1s t
p o s to p e rative
d ay
8 h o u r afte r
g raft
re p e rfu s io n
4 h o u r afte r
g raft
re p e rfu s io n
b e fo re
g e n e ral
an e s th e s ia
PCT (ng /m l)
Patients after liver trans plantation with
ATG adminis tration (n=20)
300
200
100
0
4th
p o s to p e rati
ve d ay
3rd
p o s to p e rati
ve d ay
2n d
p o s to p e rati
ve d ay
1s t
p o s to p e rati
ve d ay
8 h o u r afte r
g raft
re p e rfu s io n
4 h o u r afte r
g raft
re p e rfu s io n
b e fo re
g e n e ral
an e s th e s ia
PCT (n g /m l)
Patients after liver trans plantation without ATG
adminis tration (n=16)
50
25
0
Patients after pancreas trans plantation without
ATG adminis tration (n=5)
PCT (n g /m l)
10
5
0
before general
anestesia
after graft
reperfusion
1st postoperative 2nd postoperative 3rd postoperative 4th postoperative
day
day
day
day
250
200
150
100
50
3rd
p o s to p e rati
ve d ay
1s t
p o s to p e rati
ve d ay
0
b e fo re
g e n e ral
an e s th e s ia
PCT (n g /m l)
Patients after s imultaneous kidney and
pancreas trans plantation with ATG
adminis tration (n=15)
PCT a bakteriální zánět
Nutné měřit opakovaně – dynamika je
nejdůležitější
Clin.Infect.Dis 2004:,39:206-217 (PCT
pooled sensitivity 88% (95% CI 80-93%,
CRP 75% (95% CI 62-84%)
Pooled specificity PCT – 92%, pro CRP
86%
PCT
Jeho produkce není ovlivněna podáváním
systémových kortikosteroidů
PCT a „falešná pozitivita“
Operace
Novorozenci(fyziologicky)
ARDS
Popáleniny
Rejekce štěpu
………
PCT a falešná negativita
Časná fáze infekce
Lokalizovaná infekce (abscesy)
Subakutní endokarditida
PCT AND CRP
CRP a PCT
04/2006 – více než 1000 prací
Clin.Infect.Dis 2004:39:206-217 (PCT
pooled sensitivity 88% (95% CI 80-93%,
CRP 75% (95% CI 62-84%)
Pooled specificity PCT – 92%,for CRP
86%
PCT - ZÁVĚRY
V současné době nejsensitivnější a
nejvíce specifický parametr pro
systémový zánět bakteriálního původu
Výhodný zejména u pacientů na
imunosupresivní terapii
U pacientů po transplantaci je jeho
koncentrace závislá na použité
imunosupresi
PCT
Kamínek do mozaiky při diagnostice sepse
CYTOKINY
IL-6, IL-8, IL-10, IL-12
Lekkou A et al: Clin. Diag Lab Immunology
2004, 161-167 – Cytokine production and
monocyte HLA-DR expression as predictors
of outcome for patients with community –
acquired severe infections
Oberholzer A et al: Shock 2005, 23: 488-493 Plasma cytokine measurements augment
prognostic score as indicators of outcome of
patients with severe sepsis
NATRIURETICKÉ PEPTIDY
Witthaut R et al: Intensive Care Med. 2003
1696-1702, Plasma atrial natriuretic peptide
and brain natriuretic peptide are increased in
septic shock: impact of interleukin-6 and
sepsis-associated left ventricular
dysfunction.
Morgenthaler NG et al:Critical Care 2005,
9:R37-R45 doi:10.1186/cc3015 Pro-atrial
natriuretic peptide is a prognostic marker in
sepsis, similar to the APACHE II score: an
observational study
MIKROBIOLOGIE
The presence of pathogen in biological
sample (blood, CSF, urine)
The presence of pathogen´s DNA in
biological sample (PCR real time)
Diagnostics for an individual pathogen –
herpes viruses, MRSA,….
Diagnostics simultaneously for more
pathogen´s DNA (SeptiFast)
BIOMARKERY - RECEPTORY
HLA-DR/ CD14
TREM-1
CD64/45
HLA-DR/CD14
Lekkou A et al: Clin Diag Lab
Immunology 2004, 161-167
Monocyte HLA-DR expression is an
early and constant predictive marker
for survival in severe sepsis
Angele MK, Faist E: Clinical review:
Immunodepression in the surgical
patient and increased susceptibility to
infection. Crit Care 2002, 6:298-305
CD64/CD45
Vysoce afinitní imunoglobulinový Fcγ receptor
CD64 exprese je nízká u zdravých a zvyšuje se u
bakteriálních zánětů – „related cytokine“ (IFN-α,
IL-12, G-CSF)
CD64 „upregulace“ nenahrazuje vyšetření jako
počet leu, CRP, ale poskytuje kvalitativně jinou
informaci
CD64/45
Is not falsely elevated in myeloid leukemia,
myelodysplastic syndrome, pregnancy,
megaloblastic anemia or steroid therapy
Patients of all ages and immunosuppressed
conditions are capable of CD64 upregulation
Davis BH: Expert Rev Mol Diagn
2005, 5: 193-207
Infection detection
St.lab.tests
CD64/CD45
Sensitivity
47.6%
90,5%
Specificity
92.6%
96.6%
Positive pred.value
83.3%
95%
Neg.pred.value
69.4%
92.9%
Likelihood ratio
6.43
24.46
TREM-1
Triggering receptor expressed by
myeloid cells
Family receptors expressed by myeloid
cells are encoded by a gene cluster on
human chromosome 6
TREM 1 is associated with the DAP12
adaptor and amplifies granulocytic and
monocytic inflammatory responses
during bacterial and fungal infections
TREM-1
Blocking TREM-1 function reduces
mortality in experimental models of
sepsis
Gibot s et al: Intensive Care Med 2005,
594-597. TREM-1 expression on
monocytes may prove useful in
allowing the follow-up of septic
patients during the course of the
disease
TREM-1
Richeldi L et al: Eur.Respir.J 2004, 24: 247250 Role TREM-1 in the diagnosis of lung
infections
Roldan NG et al: World Gastroenterol 2005,
7473-7479 TREM-1 on myeloid cells and
histocompatibility complex molecules in
sepsis and major abdominal surgery.
LABORATORY MONITORING
HLA-DR/CD14, CD64/45, PCT,CRP, IL-6, IL-10,
LBP
Sepsis
No of patients
Controls
49
30
Gender M/F
29/20
17/13
Age (years)
63
61
APACHE II
23
10,5
SOFA
11
4
PCT ng/ml
4.59
0.51
CRP mg/L
165.1
62.8
QuantiBrite
Most accurate method for the quantitative
measurement of expression of molecules on
the surface of cells
QuantiBrite for CD 64 and HLA-DR on
monocytes
ABC
Fig. 1. The level of monocyte HLA-DR expression and granulocyte
CD64 expression using QuantiBRITE method in SIRS group and
sepsis group. Medians in ABC units (antibodies bound per cell).
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
P < 0.0001
P < 0.0001
HLA-DR
CD64
SIRS
Se ps is
The level of monocyte HLA-DR expression and
granulocyte CD64 expression using QuantiBRITE, in
SIRS group and in sepsis group
QuantiBRITE (ABC)
mean
SD
min-max
HLA-DR/mono
36 819
8 779
19 037 - 54 435
CD64/granulo
969
305
476 - 1 548
HLA-DR/mono
11 384
6 113
2 942 - 32 452
CD64/granulo
5 191
5 342
611 - 23 516
SIRS (n=30)
Sepsis (n=49)
sepsis
SIRS
HLA-DR/mono (ABC)
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
0
2000
4000
6000
8000
10000 12000
CD64/granulo (ABC)
14000 16000
18000 20000
Correlation of CD64/ CD45
With PCT - rho=0.438, p=0.002
With IL-6 - rho=0.456, p=0.001
With LBP - rho=0.446, p=0.002
With IL-10 - rho=0.422, p=0.003
MONITOROVÁNÍ ZÁNĚTU
Diagnostika představuje potencionální
východisko pro terapii sepse
Metodologie – PCR real time
Diagnostika extra-humánního genomu
Detekce virové a bakteriální
DNA(herpetické viry –CMV, HSV, VZV,
MRSA, SEPTIFast)
Časová dostupnost – 6 hodin
SeptiFast - Kit Concept
Sample
Sample
preparation
Blood
(3 ml)
Pathogen Lysis &
DNA Extraction
PCR
Analysis
Gram (-)
Gram (+)
• Detection und Identification
of most important
gram negative bacteria
• Detection und Identification
of most important
gram positive bacteria
Fungi
• Candida
& Aspergillus fumigatus
Less than 6 hrs time to result (start sample prep report)
SeptiFast Test
Detection and Identification
of species
Detection of the 25 most important pathogens
known to cause sepsis
Identification in 20 groups relevant for decision
making
Infekce a genetika
Rozdíly u hostitele- Whitney et al: Proc Natl
Acad Sci USA 2003, 100: 1896-901(věk,
pohlaví, čas odběru a proporce buněk v KO x
leukémie a sepse)
Huang et al: prvotní exprese (18 hodin) u
dendritických buněk (166 genů) byla stejná u
různých původců – E.coli, Influenza,
C.albicans x časově pozdější genová exprese
rozdílná u těchto infekcí – jedinečné
Hypotéza I (diagnostická)
Existuje „specifická“ exprese genů
spojených se zánětem pro septické
pacienty
Její diagnostika nám pomůže tyto
pacienty najít a rozlišit od pacientů se
zánětlivou odpovědí neinfekční
etiologie
Hypotéza II (terapeutická)
Dokážeme rozlišit typ pacienta – high a low
respondera v zánětlivé odpovědi
Dokážeme rozlišit fázi imunitní odpovědi
imunosupresivní nebo imunomodulační
Tato diferenciace nám umožní cílenou
imunomodulační léčbu na několika úrovních
Prucha et al: Shock 2004, 22:29-34
Genetické polymorfismy cytokinů a
jejich receptorů
Prucha M, Matoška V: Anesteziologie a
intenzivní medicína 2005; 4-203-210
Expression profiling
Prucha et al: Shock 2004, 22: 29-33
Results: Selection of 131 genes
transformed intensity
ICU controls Prague (8)
ICU controls, Jena (18)
sev. sepsis Prague (19)
sev. sepsis Jena (31)
(CCR2.1)
(AA398902)
(AA449481)
(IGKC)
severity
only (131
genes)
(HEM1)
(CRP)
(INHBB)
(IL20RA)
severity
severity
and centre interaction
(50 genes) (3 genes)
all (3
genes)
centre
centre only interaction
(1154
(73 genes) interaction
genes)
(32 genes)
no signif.
(3971
genes)
ZÁVĚRY
Laboratorní diagnostika sepse je mozaikou
svou stavbou
Neexistuje a zřejmě se nenajde marker se
100% sensitivitou a specificitou
ZÁVĚRY
Je nezbytné zlepšit diagnostiku, abychom
zlepšili „outcome“ nemocných
Musíme monitorovat „imunologickou
surveillance „ u těchto nemocných
Musíme monitorovat pro a protizánětlivou
aktivitu u těchto nemocných
V budoucnu dokázat „změřit“ genetické
predispozice individuálního pacienta ve
smyslu intenzity zánětlivé odpovědi
ZÁVĚRY
Lepší diagnostika umožní
„personalized - tailored“ terapii těchto
nemocných
Panel v NNH - imunologie
IgG, IgM, IgA
C3,C4 složka komplementu
PCT
Exprese HLA-DR/CD14, CD64/45
IL-6,IL-10
Produkce TNF po stimulaci LPS