LM DNA Kit Product Insert

Immucor Transplant Diagnostics, Inc.
550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 Spojené státy americké
Tel: +1 (203) 328-9500 nebo volání bez poplatku ve Spojených státech amerických, Kanadě a Portoriku (888) 329-0255,
Fax: +1 (203) 328-9599
WWW.IMMUCOR.COM
Dokumentace a další jazykové verze jsou k dispozici na: www.Immucor.com
PŘÍLOHA
K PRODUKTU
TYPIZAČNÍ SOUPRAVY LIFECODES HLA-SSO - kompatibilní s technologií Luminex®
Test pro diagnostiku in vitro
OBSAH
Definice symbolů ………………...………….
Reagenty podle katalogového čísla...….…
1
2
Návod k pouţití…………………………………..
A. Purifikujte genomovou DNA.……………….
4
4
Úrčené pouţití………………………………… 3
B. Amplifikace DNA (PCR)….…………..........
4
Shrnutí a vysvětlení……….…………...….… 3
Postup………………………..……………….. 3
Reagenty………………………………………
A. Identifikace…………...………….……….
B. Varování a upozornění..………………...
C. Pokyny pro uskladnění …………………
D. Purifikace a aplikace……………..……..
E. Indikace nestability………………………
3
3
3
3
3
3
Poţadavky na nástroje ….………………….
Odběr a příprava vzorků……………….……
Postup………………………..………………..
A. Dodávané materiály……………………..
B. Poţadované, ale nedodávané
materiály, reagenty a vybavení……………
3
3
4
4
4
C. Hybridizace..…………………………………
D. Proveďte analýzu vzorku
pomocí nástroje Luminex ….………………….
Výsledky ………………………………………….
Kontrola kvality ...……………………………..…
Omezení postupu …………..…………………...
Řešení problémů ………………………………...
Očekávané hodnoty …………………………….
Specifické funkční charakteristiky …………..
5
Literatura ………………………………………….
Omezená licence ………………….…………….
Pouţité obchodní značky …………..………….
Příloha A……………………..…………………….
Gelová elektroforéza …………………..………
Interpretace gelu …….…………………………
7
7
8
8
8
8
5
5
6
6
7
7
7
DEFINICE SYMBOLŮ (Označení výrobku a doplňující dokumentace)
Číslo sady
Katalogové
číslo
Teplotní
omezení
Horní teplotní
hranice
Pouţitelnost
do
Chraňte
před
světlem
Mnoţství pro X
testů
Nezmrazovat
Viz návod k
pouţití
Výrobce
Zástupce pro
Evropu
Varování viz návod k
pouţití
(exp)
Strana 1 z 8
EC REP
LC775CECS.18 (08/13)
REAGENTY PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA.
Typizační sada LC-CE LIFECODES HLA-C eRES kompatibilní s technologií Luminex
Reagent
Číslo výrobku
Plnicí objem
Uskladnění
Výrobek č. 628850-50
50
MX-C
LIFECODES HLA C Master Mix
628803
870 µl
2 aţ 8 °C
BM-CeRES
LIFECODES HLA C eRES Probe Mix ‡
628804
810 µl
2 aţ 8 °C
Chraňte před světlem
DS
Ředící roztok
628515
19,7 ml
18 aţ 30 ºC
Typizační sada LM-DPB LIFECODES HLA-DPB kompatibilní s technologií Luminex
Reagent
Výrobek č. 628910
Číslo výrobku
Plnicí objem
Uskladnění
20
MX-DPB
LIFECODES HLA DPB Master Mix
628903
420 µl
2 aţ 8 °C
BM-DPB
LIFECODES HLA DPB Probe Mix ‡
628902
360 µl
2 aţ 8 °C
Chraňte před světlem
DS
Ředící roztok
628155
9,9 ml
18 aţ 30 ºC
Typizační sada LM-DQA LIFECODES HLA-DQA kompatibilní s technologií Luminex
Reagent
Mnoţství pro 50
vzorků
Číslo výrobku
Plnicí objem
Uskladnění
Mnoţství pro 20
vzorků
Výrobek č. 628061
MX-DQA
LIFECODES HLA DQA Master Mix
628062
420 µl
2 aţ 8 °C
BM-DQA
LIFECODES HLA DQA Probe Mix ‡
628063
360 µl
2 aţ 8 °C
Chraňte před světlem
DS
Ředící roztok
628155
9,9 ml
18 aţ 30 ºC
20
Mnoţství pro 20
vzorků
‡
Směsi Probe Mix jsou citlivé na světlo: zajistěte jejich minimální vystavení světlu.
VAROVÁNÍ: Jednotlivé součásti sady nepouţívejte po překročení data exspirace.
Strana 2 z 8
LC775CECS.18 (08/13)
URČENÉ POUŢITÍ
Pouţití:Typizace DNA u alel HLA I. a II. třídy
SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ
Typizace HLA na základě amplifikace DNA pomocí metody PCR je běţný laboratorní postup. Metoda amplifikace (mnoţení) DNA pomocí polymerázové
řetězové reakce (PCR) je pouţívána k rozšíření zvolené oblasti DNA. V rámci typizace HLA je proveden následný rozbor, jehoţ cílem je stanovit vlastnosti
zmnoţené DNA. Pro účely typizace HLA je moţné pouţít několik typů technologií, jako je SSP (1), SSOP (2), RFLP (3) a reverse dot blot (4). Stejně jako
metody SSOP a reverse dot blot vyuţívají typizační soupravy LIFECODES HLA-SSO k identifikaci alel HLA přítomných ve vzorku po amplifikaci PCR sekvenčně
specifické oligonukleotidové sondy (SSO). Schopnost rozlišení různých alel přítomných v amplifikovaném vzorku PCR je dána sadou pouţitých SSO, nikoli
uplatněnou metodou. Zatímco metody reverse dot blot a SSOP pouţívají enzymy a kolorimetrické substráty vyţadující vytváření subsekvencí, metoda
LIFECODES představuje homogenní systém umoţňující mnohonásobný rozbor. To znamená, ţe všechny SSO jsou analyzovány zároveň a celý test probíhá v
jediné reakční nádobě pomocí jediného reakčního činidla.
POSTUP
Proces typizace LIFECODES HLA-SSO je zaloţen na hybridizaci jednovláknového specifického PCR produktu se sondou SSO. Amplifikace DNA pomocí PCR
vyuţívá ekvimolární dávky obou primerů (forward a reverse primer) k vytvoření dvouvláknové DNA. Pokud však dávka jednoho z primerů převýší druhý, bude
výsledkem reakce kromě dvouvláknových produktů také několik jednovláknových DNA. Během prvních cyklů amplifikace LIFECODES je vytvořena
dvouvláknová DNA. Jakmile dojde k vyčerpání limitujícího primeru, pouţije druhý primer dvouvláknový produkt jako templát pro vytvoření jednovláknové DNA.
Touto metodou dojde k vytvoření dvou i jednovláknových produktů, které se po denaturaci budou společně podílet na hybridizační reakci.
Kaţdá ze sond můţe být homologická s amplifikovanou DNA, která je jedinečná pro alelu nebo skupinu alel. Jinými slovy jsou tyto sondy vytvořeny tak, aby
kaţdá z nich hybridizovala s upřednostňovanou komplementární oblastí, která můţe a nemusí být přítomna v amplifikované DNA. K tomu navíc amplifikovaná
DNA hybridizuje s jednou nebo více sondami odpovídajícími sekvencím přítomným ve všech alelách lokusu. Typizace SSO můţe být ovlivněna typem
biologického materiálu, metodou purifikace a mnoţstvím a integritou genomové DNA. Z toho důvodu můţe signál získaný pomocí sondy slouţit jako ukazatel
úspěšnosti procesu amplifikace a hybridizace. Signál získaný pomocí konvenční sondy můţe být také pouţit k normalizaci signálu alelových sond a k úpravě
odchylek v mnoţství amplifikovaného produktu v rámci hybridizační reakce. Rozbor výsledků získaných typizací SSO lze pouţít k určení přítomnosti či
nepřítomnosti konkrétních sekvencí DNA v amplifikované DNA a k identifikaci moţných alel ve vzorku.
V případě typizace LIFECODES HLA-SSO jsou sondy vázány na mikrokuličky Luminex určené k pouţití s nástrojem Luminex. Je moţné smíchat a pomocí
nástroje Luminex provést rozbor aţ 100 různých populací mikrokuliček, neboť jednotlivé populace mikrokuliček se od sebe liší pro kaţdou populaci jedinečným
fluorescenčním znakem nebo barvou. Na různé barvy mikrokuliček lze navázat různé sondy SSO. Jednotlivé promíchané sondy lze tedy od sebe odlišit na
základě jejich spojení s konkrétní barvou mikrokuliček. Nástroj Luminex je také schopen určit mnoţství produktů PCR hybridizujících s mikrokuličkami Luminex.
Z toho důvodu je moţné pouţít signál získaný pomocí sond SSO během rozboru LIFECODES, stejně jako s jinými metodami SSOP, k označení sond s kladnou
nebo zápornou reaktivitou se vzorkem amplifikované DNA (viz Oddíl Výsledky). Budou tak získány informace potřebné k určení HLA-fenotypu vzorku.
REAGENTY
A. Identifikace
Úplný seznam výrobků a katalogových čísel viz tabulky v části Reagenty podle katalogového čísla.
B. Varování a upozornění
1.
2.
3.
4.
5.
Test pro diagnostiku in vitro.
K manipulacím před PCR a po PCR pouţijte různé pipety.
Biologické riziko: Se všemi biologickými a krevními vzorky zacházejte jako s potenciálními zdroji infekce. Při manipulaci s takovými
vzorky se řiďte obecnými bezpečnostními opatřeními.
Ředící roztok, Probe mix, Taq polymeráza a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin obsahují zdraví nebezpečné sloţky. Zabraňte
kontaktu s kůţí a s očima, likvidaci všech materiálů po pouţití provádějte v souladu s místními nařízeními a předpisy. Více informací
naleznete v Bezpečnostním listu (BL).
Výsledky získané pomocí těchto souprav nelze pouţít jako jediný základ pro učinění klinických závěrů o stavu pacienta.
C. Pokyny pro uskladnění
1.
2.
3.
Vhodné skladovací teploty naleznete na štítcích umístěných na balení jednotlivých komponent.
Probe mix a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin jsou citlivé na světlo, CHRAŇTE JE PŘED SVĚTLEM a NEZMRAZUJTE.
Komponenty nepouţívejte po překročení data exspirace.
D. Purifikace a aplikace
Viz „Odběr a příprava vzorků“
E. Indikace nestability
1.
2.
Pokud se z roztoku během přepravy nebo uskladnění vysráţely soli, před pouţitím roztoku je znovu zcela rozpusťte pomocí spirálového
pohybu při pokojové teplotě (18 aţ 30 °C).
Nepouţívejte R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin, který během přepravy nebo uskladnění prošel bodem mrazu.
POŢADAVKY NA NÁSTROJE
1.
2.
Nástroj Luminex a platforma XY (Výrobky č. 888300 a 888310)
Termocykler vybavený vyhřívaným víkem, nastavitelnou dobou náběhu a doběhu, minimálním teplotním rozsahem od 2 °C do 100 °C a přesností alespoň
+/- 0,5 °C. Je moţné, ţe podmínky pro termocyklery bude třeba změnit za účelem přizpůsobení konkrétnímu profilu. Teplotní profil získáte na telefonním
čísle technického servisu: +1 (203) 328-9500 nebo (888) 329-0255.
ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
Lidskou DNA lze purifikovat z plné krve, z buffy coat a z ústní sliznice pomocí schválených metod splňujících níţe uvedená kritéria.
DNA získaná z krve uchované v EDTA a ACD (kyselina citrónová-citrát-dextróza) byla testována a prokázala vlastnosti potřebné pro daný
rozbor. DNA získaná z krve a uchovaná v heparinu nemůţe být pro tento rozbor pouţita. Další konzervační látky nebyly testovány.
Izolovaná DNA by měla být v 10 mM TRIS, pH 8,0 - 9,0, nebo ve vodě bez obsahu nukleázy. V případě přítomnosti chelatačního činidla
jako je EDTA nesmí konečná koncentrace chelatačního činidla překročit 0,5 mM.
Přítomnost alkoholu, čistidel a solí můţe nepříznivě ovlivnit amplifikaci DNA.
Konečná koncentrace DNA by měla být 10 aţ 200 ng/µl.
Měření absorbance vzorku DNA při 260 a 280 nm by mělo dát poměr 1,65 aţ 2,0.
Vzorky DNA se mohou pouţít ihned po jejich izolaci nebo uskladnit aţ na 1 rok při teplotě –20 ºC. Vyhněte se opakovanému
zmrazování/rozmrazování, mohlo by dojít ke znehodnocení DNA.
Strana 3 z 8
LC775CECS.18 (08/13)
POSTUP
A. Dodávané materiály (Více informací viz tabulky v části Reagenty podle katalogového čísla).
•
•
Příslušná směs Master Mix (MX)
Příslušná směs/směsi Probe Mix (BM)
Ředící roztok (ŘR)
Tabulka prahových hodnot, tabulka/tabulky výsledků detekce sondy
•
•
B. Poţadované, ale nedodávané materiály, reagenty a vybavení (viz seznam nebo odpovídající typy)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
R-Phycoerythrin-konjugovaný streptavidin (SA-PE), 1mg/ml (kat. č.
628511 Lifecodes)
Luminex Sheath Fluid (1x nebo 20x, číslo v katalogu Lifecodes:
628005 nebo 628025)
Rekombinantní Taq polymeráza
Míchačka Vortex
Voda bez nukleázy, č. v katalogu Lifecodes: 757003, 20 ml)
PCR zkumavky a víčka (AB Gene® 0,2 ml Thermo Strip, č.
AB0451/G)
Termocykler (PCR), 96-jamkový systém (Costar® č. 6509)
Microseal™ film (Bio-Rad č. MSA-5001) nebo páska (Costar® č.
6524)
Termocykler (viz Poţadavky na nástroje)
Sonikační lázeň (Fisher Scientific, č. FS15 nebo FS20)
•
•
•
•
•
•
•
Mikrocentrifuga
Špičky s filtrem
Kalibrační kuličky Luminex (Cal 1, Cal 2, Con 1 a Con 2, čísla v
katalogu Lifecodes: 628006, 628007, 628008 a 628009 v daném
pořadí)
Pipetovací nástavce, vícekanálové pipety a špičky) (1-20 µl, 20-200 µl,
1000 µl))
Software umoţňující zobrazení souborů s hodnotami oddělenými
čárkami (csv)
Topný blok (Fisher Scientific Standard Heatblock, č. 13259-030)
70% isopropanol nebo 20% bělidlo (čistící přípravek)
NÁVOD K POUŢITÍ
POZNÁMKY:
Probe mix a SA-PE jsou citlivé na světlo: chraňte před světlem a nezmrazujte.
Zahřívejte kuličky při 55 ºC aţ 60 ºC po dobu alespoň 5-10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela rozpustily.
Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozpustily.
Při procesu rozpipetování dbejte zvýšené opatrnosti a pouţívejte cejchované pipety. V opačném případě můţe dojít ke ztrátám
reakční směsi a zmaření vzorku.
Všechny teploty musí být přesně dodrţeny a zachovány. I nízké výkyvy o např. +/- 0,5 °C mohou ovlivnit výsledek.
Ve stádiu hybridizace by neměly vzorky zůstávat v rozpuštěném stavu při 56 °C déle neţ 5 minut (viz oddíl Výsledky).
Doporučujeme provést rozbor amplifikovaných vzorků co nejrychleji. Pokud není moţné zpracovat vzorky pomocí nástroje
Luminex v tentýţ den, je možné uchovat amplifikovaný produkt před použitím po dobu až 3 dnů při teplotě 2-8 ºC. V
případě dlouhodobějšího uskladnění uchovávejte do okamžiku použití při teplotě –20 ºC po dobu až jednoho týdne.
Amplifikovaný produkt je možné zmrazit a rozmrazit pouze jedenkrát. Opakované zmrazování a rozmrazování způsobí
poškození amplifikovaných vzorků a v případě následného rozboru povede ke špatným výsledkům.
A. Purifikujte genomovou DNA pomocí zvolené metody; konečná koncentrace by měla být 10 aţ 200 ng/µl. V případě potřeby
doplňte vodou bez nukleázy. U všech vzorků udrţujte podobnou koncentraci.
B. Amplifikace DNA (PCR)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Nechte Master Mix ohřát na pokojovou teplotu (18 °C aţ 30 °C).
Jemně míchejte spirálovým pohybem po dobu cca 10 vteřin. Bude tak zajištěna přítomnost solí v roztoku. Umístěte na krátkou dobu
(5 aţ 10 vteřin) na mikrocentrifugu, aby se obsah dostal na dno zkumavky.
Podle Tabulky 1 níţe připravte komponenty k amplifikaci pro n+1 reakcí pomocí hodnot určených pro jednotlivé komponenty v rámci
reakce (kromě DNA). Pomocí vody bez nukleázy připravte konečný objem 50 µl na reakci. Jemně promíchejte spirálovým pohybem
a umístěte na led.
Pomocí pipety umístěte odpovídající mnoţství genomové DNA (100 aţ 300 ng) do zkumavek PCR.
Pomocí pipety umístěte amplifikační směs do PCR zkumavek obsahujících genomovou DNA. (Celkový objem amplifikační směsi a
genomové DNA by měl být 50 µl na kaţdou jednotlivou reakci.)
Zkumavky pevně uzavřete, aby nedošlo k úniku během PCR.
Umístěte vzorky do termocykleru a spusťte program, viz Tabulka 2
Tabulka 2.
Podmínky termocykleru pro účely amplifikace
Tabulka 1. Reakční komponenty pro amplifikaci
Sloţka
LIFECODES Master Mix
Genomová DNA
10-200 ng/µl
Taq polymeráza
Voda bez nukleázy
Mnoţství na reakci
PCR
15µl
Celkem ~200 ng
0,5µl (2,5U)
Aţ 50 µl konečného
objemu
Poznámka: Informace o amplifikaci vzorku naleznete v sekci Gelová elektroforéza produktu
(Příloha A).
95 ºC po dobu 5 min.
Počet cyklů: 1
95 ºC po dobu 30 vteřin
60 ºC po dobu 45 vteřin
72 ºC po dobu 45 vteřin
Počet cyklů: 8
95 ºC po dobu 30 vteřin
63 ºC po dobu 45 vteřin
72 ºC po dobu 45 vteřin
Počet cyklů: 32
72 ºC po dobu 15 min.
Počet cyklů: 1
Strana 4 z 8
LC775CECS.18 (08/13)
C. Hybridizace
•
•
Ujistěte se, ţe sloţky hybridizačního pufru v LIFECODES probe mix jsou rozpuštěny, a ţe kuličky jsou důkladně rozpuštěny.
Zapněte nástroj Luminex a platformu XY a nechte je spuštěné po dobu 30 minut na zahřátí.
1.
Zahřívejte probe mix při 55 ºC aţ 60 ºC na termálním bloku po dobu alespoň 5 -10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela
rozpustily.
Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozpustily.
Rozpipetujte 5 µl PCR pro konkrétní lokus do 96-jamkové destičky termocykleru (Costar® č. 6509).
Rozpipetujte 15 µl příslušné směsi do kaţdé jamky. Jestliţe rozpipetováváte směs do více neţ 10 jamek, jemně směs promíchejte
spirálovým pohybem po kaţdých deseti jamkách. Destičku přelepte polyethylenovou páskou (Costar® č. 6524).
Proveďte hybridizaci vzorků za následujících inkubačních podmínek:
2.
3.
4.
5.
Tabulka 3. Podmínky termocykleru
pro hybridizaci
97 ºC po dobu 5 min.
47 ºC po dobu 30 min.
56 ºC po dobu 10 min.
56 ºC HOLD
Zatímco probíhá hybridizace vzorků, připravte směs 1:200 ředící roztok/SA-PE. Smíchejte 170 µl ředícího roztoku (ŘR) a 0,85 µl 1
mg/ml SA-PE na vzorek. Doporučujeme připravit dostatečné množství směsi ředícího roztoku pro n+1 vzorků pro případ ztráty při
pipetování. (Viz Tabulka 4)
7. Směs ředícího roztoku/SA-PE uchovávejte ve tmě při pokojové teplotě, SA-PE je citlivý na světlo! Ředící roztok je moţné zahřívat na
teplotu 45 ºC po dobu 5 minut a promíchat spirálovým pohybem, aby byla zajištěna přítomnost všech komponent v roztoku. Před
vytvořením směsi musí mít ředící roztok pokojovou teplotu (18 aţ 30 °C). Připravte vše před pouţitím a zbývající dávku dejte
stranou.
Počet vzorků
Ředící roztok (ŘR)
SA-PE
1
170
µl
0,85 µl
Tabulka 4. Objemy pro přípravu
ředícího roztoku
5
850 µl
4,25 µl
10
1 700 µl
8,5 µl
20
3 400 µl
17 µl
50
8 500 µl
42,5 µl
Poznámka: NEPŘERUŠUJTE PROGRAM
HYBRIDIZACE PŘED
SEJMUTÍM DESTIČKY Z TERMOCYKLERU!
8. Při kroku 56 ºC HOLD, zatímco je destička na termocykleru, zřeďte kaţdý vzorek pomocí 170 µl předem připravené směsi ředícího
roztoku/SA-PE. Všechny vzorky je třeba naředit během 5 minut (po 10 minut trvajícím kroku HOLD při 56 °C)
9. Sejměte destičku z termocykleru a umístěte ji do nástroje Luminex.
6.
D. Proveďte analýzu vzorku pomocí nástroje Luminex*
Aby byly získané výsledky co nejlepší, rozbor vzorků pomocí nástroje Luminex proveďte ihned. Rozbor vzorků je moţné provést aţ 30
minut po naředění. Jestliţe nehodláte provést interpretaci vzorků ihned, chraňte je před světlem.
1. Nástroj Luminex zapněte 30 minut aţ 4 hodiny před zahájením rozboru vzorků.
2. Před rozborem vzorků pomocí nástroje Luminex nastavte dávkovací běh (Batch Run) určený k rozboru vzorků.
a) Zvolte Create a New Batch (Vytvořit novou dávku) z nabídky File (Soubor).
•
Např. pokud provádíte rozbor HLA-DRB, přidejte Dávku pro HLA-DRB.
•
Bude vytvořena a pojmenována šablona dávky, v tomto případě HLA-DRB.
•
Upozornění: verze šablon jsou vytvořeny pro konkrétní čísla sad a odpovídají číslům sad v soupravě.
•
Podrobný postup vytváření dávek se objeví na obrazovce vytváření dávek.
•
Při vytváření názvu dávky nepouţívejte čárky, neboť informace následující po čárce zmizí při exportu dat.
•
Více informací o vytváření dávek a multi-dávek naleznete v uţivatelské příručce Luminex IS
b) Klikněte na ikonu vysunutí, drţák destičky se vysune. Umístěte 96-jamkovou destičku se vzorky určenou pro termocykler do
termálního bloku XYP umístěného na drţáku destičky.
c) Klikněte na ikonu Zasunout. Vzorky jsou připraveny k rozboru. Před spuštěním cyklu je třeba provést napuštění.
d) Po vyjmutí vzorků z nástroje je třeba provést čištění nástroje pomocí 70% isopropanolu nebo 20% bělidla (čistícího přípravku pro
domácnost) s následným dvojím omytím. Pokud jiţ nástroj nebudete toho dne pouţívat, můţete jej nyní vypnout.
3. Po dokončení běhu budou data exportována v podobě hodnot oddělených čárkami (csv). Získané soubory mají název
‘OUTPUT.CSV’ a budou uloţeny ve sloţce s názvem dávky. Data jsou poté k dispozici k provedení typizace, jak je popsáno níţe.
*Informace o pouţívání nástroje Luminex naleznete v uţivatelské příručce Luminex, která obsahuje pokyny ke spuštění, kalibraci, údrţbě a vypnutí.
VÝSLEDKY
Typizaci vzorků lze provést následujícím způsobem:
Otevřete vytvořené soubory CSV a získaná data zpracujte pomocí běţných tabulkových procesorů, jako jsou Microsoft Excel, Lotus 123, Corel
Quattro Pro apod. Rozbor probíhá v následujících krocích:
1) Zkontrolujte, zda je počet případů pro kaţdý SSO v kaţdém vzorku alespoň 60. Tuto informaci naleznete v DataType: oddíl Výpočet v
souboru CSV.
2) Určete, ţe hodnoty pro konvenční sondy pro jednotlivé vzorky se nacházejí nad minimální hodnotou jejich mediánu intenzity
fluorescence (MFI). Minimální prahové hodnoty se liší dle konkrétních sad a je moţné je zjistit z tabulky prahových hodnot.
Upozornění:
•
Abyste získali spolehlivé výsledky, potřebujete zajistit dostatečné množství dat získaných pomocí nástroje Luminex.
•
Pro každý SSO získejte alespoň 60 případů.
Strana 5 z 8
LC775CECS.18 (08/13)
3)
4)
Odečtěte kontrolní hodnotu pozadí pro jednotlivé sondy od hodnot vzorku a získejte tak soubor dat upravený na základě kontrolních
hodnot. Kontrolní hodnoty pozadí naleznete v tabulce prahových hodnot po jednotlivé sady. Hodnoty pozadí jsou průměrné hodnoty
MFI (mediánu intenzity fluorescence) pro jednotlivé kuličky, určené ke kompenzaci šumu pozadí způsobeného proměnlivostí kuliček.
Pro kaţdý vzorek vydělte data upravená na základě pozadí pro jednotlivé sondy hodnotou upravenou na základě pozadí pro
odpovídající konvenční sondu a získejte normalizovanou sadu dat.
MFI (sonda) – MFI (kontrola pro sondu)
MFI (konvenční) – MFI (kontrola pro konvenční hodnotu)
5)
6)
Získané hodnoty pro jednotlivé sondy zaneste do pracovního listu v tabulce prahových hodnot.
Jakmile budou zaneseny všechny hodnoty, je moţné porovnat vzorec výsledků detekce sondy (tj. kombinace všech kladných a
záporných zadání pro daný vzorek) s poskytnutou tabulkou (tabulkami) obsahující detekované výsledky
Upozornění:
•
Pro každý lokus a každou směs probe mix existuje zvláštní tabulka prahových hodnot.
•
Tabulky prahových hodnot jsou určeny pro konkrétní sady, ujistěte se, že číslo sady uvedené v tabulce prahových hodnot je
shodné s číslem typizační soupravy.
•
Pokud se stane, že normalizovaná hodnota pro konkrétní sondu stoupne nad maximální prahovou hodnotu v případě záporného zadání
a pod minimální hodnotu v případě kladného zadání, bude vzorek pro tuto sondu považován za neurčitý. Vzorky musejí být typizovány
tak, že se nejprve přijme záporná hodnota a poté kladná.
•
Více informací o prahových hodnotách naleznete v oddíle OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY.
KONTROLA KVALITY
Doporučujeme provést jednu zápornou a jednu kladnou kontrolu v rámci kaţdého testu, jako je test pomocí vody a poté pomocí předem typizovaného vzorku.
Konvenční sondy SSO uvedené v tabulce prahových hodnot hybridizují s alelami příslušných lokusů. Hodnoty získané s konvenčními SSO z pozitivních kontrol
by měly mít vyšší neţ prahové hodnoty pro SSO, jak je uvedeno v pracovním listu tabulky prahových hodnot. Hodnoty získané s konvenčními SSO z kontrol
pouţívajících vodu by měly být niţší neţ prahové hodnoty pro SSO, jak je uvedeno v pracovním listu tabulky prahových hodnot.
Směsi Probe mix LIFECODES obsahují jednu nebo více konvenčních sond SSO identifikovaných v pracovních listech typizačních souprav. Tyto konvenční
sondy hybridizují se všemi alelami a chovají se jako interní kontroly slouţící k ověření amplifikace a potvrzení provedení hybridizací. Jestliţe pro tyto SSO není
dosaţeno minimální hodnoty, vzorek nemůţe zajistit správnou typizaci a testování vzorku musí být provedeno znovu.
Rozbor je třeba provést podle doporučení uvedených v příbalovém letáku a dále pomocí jiných kontrolních postupů, které jsou v souladu s místními, státními a
federálními předpisy a/nebo předpisy institutu pro akreditaci.
OMEZENÍ POSTUPU
Podmínky PCR a popsané podmínky rozboru vyţadují přesné dodrţení stanovených podmínek. Nedodrţení těchto parametrů můţe mít za následek chybný
vzorek.
Všechny nástroje musejí být kalibrovány v souladu s doporučeními výrobce a předepsanými parametry.
1)
2)
3)
4)
5)
Před pouţitím je třeba kuličky předehřát a důkladně rozpustit. Tím je zajištěna přítomnost sloţek hybridizačního pufru v roztoku.
Inkubace při 47 ºC a 56 ºC vyţaduje vysoký stupeň přesnosti (+/- 0,5 ºC). Je třeba pouţít termocykler. Teplotu v 96 jamkách destičky
termocykleru je třeba kontrolovat pomocí termočlánku (např. Bio-Rad, Model VPT-0300 apod.). Rozdíl teplot v jamkách a mezi jednotlivými
jamkami by neměl překročit +/- 0,5 ºC.
Celková doba při 56 ºC nesmí překročit 15 minut. To zahrnuje 10-minutovou inkubaci a k tomu max. 5 minut určených k naředění všech vzorků
pomocí směsi ředícího roztoku/SA-PE.
Po naředění jsou vzorky stabilní při pokojové teplotě (18 aţ 30 °C) po dobu aţ 2 hodin (je třeba je chránit před světlem). Vzhledem k tomu, ţe
zpracování plné destičky s 96 jamkami nástrojem Luminex můţe trvat aţ 1,5 hodiny, je třeba zahájit analýzu ne později neţ 30 minut od
naředění, aby bylo zajištěno, ţe poslední vzorek bude analyzován v rámci dvouhodinového limitu.
Nemíchejte komponenty z jiných souprav a sad.
Z důvodu sloţité povahy typizace HLA je nezbytné, aby kontrolu interpretace dat a typizaci provedl kvalifikovaný personál.
Strana 6 z 8
LC775CECS.18 (08/13)
ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ
PROBLÉM
Nízký počet kuliček
MOŢNÁ PŘÍČINA
Směs Probe Mix nebyla důkladně rozpuštěna
Nástroj nefunguje
správně
ŘEŠENÍ
Probe mix předehřejte, sonikujte a spirálovým
pohybem promíchejte a zkoušku opakujte.
Proveďte kalibraci nástroje. (Viz uživatelská příručka
Luminex IS.)
Odstraňte a sonikujte jehlu. Proveďte zpětný
proplach. Pokud problém přetrvává, zavolejte Immucor
Transplant Diagnostics, Inc. na číslo:
(888) 329-0255
Zkontrolujte koncentraci a čistotu DNA.
Chybná kalibrace
Cesta toku vzorku je
zablokována.
Chyba prahových
hodnot CON
Amplifikace vzorku
neproběhla, nebo jen
slabě*
Nízký obsah DNA
Soli ve směsi Master Mix se
nerozpustily
Zahřívejte Master Mix při teplotě 37 ºC po dobu 5
minut, jemně promíchejte spirálovým pohybem a
nechte krátce ustát.
Pouţívejte pouze rekombinantní Taq. Vyzkoušejte
Lifecodes č. 167075.
Spusťte tepelný profil na termocykleru a zkontrolujte,
zda parametry odpovídají předpisům.
Před pouţitím zahřívejte ředící roztok při 45 ºC po
dobu 5 minut a promíchejte spirálovým pohybem.
Skladujte při pokojové teplotě.
Vyměňte R-Phycoerythrin-konjugovaný streptavidin.
Slabá Taq polymeráza
Podmínky amplifikace nesplňují dané parametry
Nízká hodnota střední intenzity fluorescence (MFI)
Mnoţství špatných
SSO nebo vzorek
nesplňuje výsledek
typizace HLA
Amplifikace konkrétní
alely
Podmínky amplifikace nesplňují
dané parametry
Vzorek DNA byl kontaminován
DNA je částečně poškozena
Odpařování během hybridizace
Spusťte tepelný profil na termocykléru a zkontrolujte,
zda parametry odpovídají předpisům.
Znovu izolujte DNA z krevního vzorku.
Pokud nevyuţíváte celou destičku, nechte jednu řadu
po kaţdé straně vzorků prázdnou, aby bylo moţné
destičku důkladně utěsnit.
*Amplifikaci PCR je moţné ověřit pomocí gelové elektroforézy (viz Příloha A).
OČEKÁVANÉ HODNOTY
Hodnoty je moţné hodnotit jako kladné a záporné. Ve vzácných případech můţe být hodnota neurčitá. „Neurčitá hodnota“ představuje rozsah, v jehoţ rámci
nebyly sledovány ani kladné, ani záporné hodnoty. V případě, ţe vzorek obsahuje neurčité hodnoty pro konkrétní sondu SSO, je třeba vzorek typizovat sondou
jako záporný a poté jako kladný. Mohou nastat tři situace:
1. Jedna z moţností (např. kladná nebo záporná) poskytnou shodu.
2. Obě moţnosti poskytnou shodu.
•
Vzorky mohou být znovu analyzovány, nebo alely získané z obou typizací mohou být zaznamenány.
3. Ţádná z moţností neposkytne shodu.
•
V takovém případě pravděpodobně existují jiné sondy, které byly chybně přiřazeny. Takový vzorek musí být znovu analyzován a zřejmě i
znovu amplifikován.
•
Pokud vykazují více neţ dvě sondy neurčitý výsledek, vzorek musí být znovu analyzován.
•
Pokud vzorec výsledků sondy neposkytne typ HLA, musí být vzorek znovu amplifikován a analyzován. Můţe být také nezbytné znovu izolovat DNA
ze vzorku a provést novou amplifikaci a analýzu.
•
Jak je uvedeno v oddíle Omezení postupu, je nezbytné přesně dodrţovat protokol. Případné odchylky mohou mít za následek špatnou typizaci.
SPECIFICKÉ FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY
Pokud jsou typizační soupravy LIFECODES HLA SSO pouţity v souladu s postupem popsaným v příbalovém letáku, je moţné stanovit typ HLA třídy I a II ve
vzorcích DNA. Podrobné informace o konkrétních výsledcích získáte od Immucor Transplant Diagnostics, Inc. na telefonním čísle 1-888-329-0255.
LITERATURA
1.
2.
Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225
Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163
3.
4.
Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290
Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231
OMEZENÁ LICENCE
Tento výrobek není dodáván s Taq polymerázou a jeho součástí není ani licence k zahraničním patentům, kterou vlastní F. Hoffmann-La Roche Ltd. a Roche
Molecular Systems, Inc, umoţňující provádění polymerázové řetězové reakce („PCR“ ) popsané v uvedených patentech. Pokud si přejete získat více informací
o potřebě získání licencí ve vaší zemi, kontaktujte F. Hoffmann-La Roche Ltd. nebo Roche Molecular Systems, Inc. Zakoupením tohoto výrobku získáte
omezenou nepřenosnou licenci zapsanou v USA pod patentovým číslem 5,981,180, nebo její zahraniční obdobu, která je majetkem Luminex Corporation, a
která vám umoţní provádět vícenásobné rozbory klinických vzorků za účelem typizace HLA.
Strana 7 z 8
LC775CECS.18 (08/13)
Výrobce: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 Spojené státy americké.
Tel.: +1 (203) 328-9599 nebo volání bez poplatku v USA, Kanadě a Portoriku 888-329-0255, Fax: +1.203.328.9599
Autorizovaný zástupce: Emergo Europe, Molenstraat 15, 2513 BH, Den Haag, Nizozemsko Tel.: (31) (0) 70 345 8570,
Fax: (31) (0) 70 346 7299
Technický servis pro Evropu: Tel: +32/3 385 4791
Poslední revize a vydání tohoto dokumentu: Rev. 18, 2013-08-23
POUŢITÉ OBCHODNÍ ZNAČKY
AB Gene®
Costar®
Microseal™
Luminex®
AB Gene House
Corning Incorporated
Bio-Rad Laboratories, Inc.
Luminex Corporation
IDNA® Agarose
GelStar®
Cambrex Bio Science
Cambrex Bio Science
PŘÍLOHA A
Gelová elektroforéza
PCR reakce provedené prostřednictvím typizačních sad LIFECODES HLA-SSO jsou určeny k vytváření jak dvouvláknových, tak i jednovláknových produktů,
které představují dominantní produkty hybridizující s SSO. Za účelem zajištění dobré kvality či odstranění problémů můţe být nezbytné provést gelovou
elektroforézu s cílem ověření PCR reakce a přítomnosti amplifikované DNA.
Poţadované materiály (viz seznam nebo odpovídající výrobky)
•
•
•
•
•
•
Agaróza pro elektroforézu (Cambrex IDNA® Agarose č. 50170)
Elektroforézní přístroj/zdroj energie
Gelový pufr - 1X (40xTAE, Promega č. V4281)
GelStar® Nucleic Acid Gel Stain (Cambrex č. 50535)
UV transiluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. Model TM36)
Fotografický systém
Relativní migrace jednovláknových produktů závisí na koncentraci gelu a pouţitém pufru. Přibliţné migrace pro jednotlivé amplifikace jsou uvedeny níţe pro
vzorky v 2% agarovém gelu a pufru 1X TAE.
Podmínky elektroforézy
Vyjměte GelStar® Nucleic Acid Stain (Cambrex č. 50535) z mrazáku a nechte rozmrznout. Uchovávejte ve tmě.
Gel pouţitý pro tento postup musí být 2%, tj. na 200 ml gelu pouţijte 4 gramy agarózy a 200 ml 1X TAE (naředit z 40X TAE). Přidejte 10µl GelStar®
Nucleic Acid Stain, čímţ agaróza získá tekutou podobu. Při rozlévání gelu je třeba nechat dostatek prostoru pro DNA (2,5 aţ 5 cm).
UPOZORNĚNÍ: GelStar ® je potenciální karcinogen.
POZNÁMKA: Místo GelStar® Nucleic Acid Stain je moţné pouţít gely s 20 µl ethidium bromidu 10mg/ml. V gelech s ethidium bromidem bude výsledný produkt
zastoupen méně výrazně neţ v gelech s GelStar®. UPOZORNĚNÍ: Ethidium bromid je známý karcinogen.
3. Gely uloţte na tmavé místo a nechte je ztuhnout.
4. Pouţijte směs 2,5 µl kaţdého PCR produktu a 2,5 lL 2X pufru se zřejmým zbarvením na vzorek a na amplifikaci. Umístěte gel na tmavé místo při cca 160
voltech na 45 minut, nebo dokud nebude ve vzorku moţné pozorovat oddělené pásky jedno a dvouvláknového produktu (modrý bromofenol nebo jiný
marker migruje 2,5 aţ 5 cm od jamek).
5. Vyfotografujte pomocí UV transiluminátoru za pouţití ţlutého fotografického filtru GelStar® (Cambrex č. 50536).
UPOZORNĚNÍ: Při práci s GelStar® Nucleic Acid Stain nebo ethidium bromidem a při fotografování gelu pomocí UV transiluminátoru pouţívejte
ochranné pomůcky.
6. Rozbor gelu
1.
2.
HLA-C
HLA-DPB
HLA-DQA
Dvě vlákna (bp)
~476, ~447
~280
~280, ~240
Jedno vlákno (bp)
~250, ~200
~180
~180, ~160
Interpretace gelu
Amplifikace proběhla
Amplifikace neproběhla
Jamka
Dvouvláknová DNA
Jednovláknová DNA
---- (jasný výsledek)
-------- ( méně jasný výsledek)
Pásmo primeru
Strana 8 z 8
LC775CECS.18 (08/13)