Low Throughput HLA Typing Protocol

Immucor Transplant Diagnostics, Inc.
550 West Avenue, Stamford, CT 06902, Spojené státy americké
Tel.: +1 (203) 328-9500 nebo (888) 329-0255, Fax: +1 (203) 328-9599
WWW.IMMUCOR.COM
Dokumentace k produktu a ostatní jazykové verze jsou k dispozici na: www.Immucor.com
PŘÍBALOVÝ
LETÁK
MIA FORA™ - sada pro typizaci HLA pomocí NGS
Určeno pro diagnostiku in vitro
OBSAH
Definice symbolů………………………………….
1
Odběr a příprava vzorku……………………………
4
Činidla podle katalog. čísla………………………
2
Postup…..……………….. …………………………
5
Záměr použití………………………………………
3
A. Dodané materiály..…………………………
5
Souhrn a vysvětlení………………………….……
3
B. Požadované, ale nedodávané materiály...
5
Principy postupu………….……………………….
3
Pokyny k použití…………………………………….
5
Činidla……………………………………………...
3
Kontrola kvality……………………………………..
12
A. Identifikace………………….……………
3
Omezení postupu………………..…………………
12
B. Varování a upozornění….………………
3
Zvláštní chování……………………………………
12
C. Pokyny pro uskladnění……………..…..
4
Řešení problémů…………………………………..
14
D. Purifikace a aplikace…………………….
4
Omezení licence……………….……….…………
15
E. Indikace nestability……………………….
4
Informace o výrobci……..…………………………
15
Požadavky na nástroje….………………………..
4
Použité obchodní značky………………………….
15
Definice symbolů
Číslo šarže
Katalogové číslo
Použitelnost do
Sériové číslo
Varování
Viz pokyny k použití
Výrobce
Autorizovaný zástupce
pro Evropské
společenství
Zdravotnické zařízení pro
diagnostiku in vitro
Obsahuje
Teplotní hranice
SN
Množství pro <n>
testů
CONT
Evropská shoda
Strana 1 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA
Sada MIA FORA NGS HLA číslo SR-800-10377 obsahuje typizační sadu činidel MIA FORA NGS HLA (SR-800-10365) a sadu
magnetických kuliček (SR-800-10379).
Typizační sada činidel MIA FORA NGS HLA (SR-800-10365):
a)
Činidla PCR: obsahuje celkem devět (9) samostatných ampulek
Činidlo
b)
Číslo výrobku
1
HLA-A PCR Mix
SR‐800‐00326
2
HLA-B PCR Mix
SR‐800‐00327
3
HLA-C PCR Mix
SR‐800‐00328
4
HLA-DPA1 PCR Mix
SR‐800‐00329
5
HLA-DPB1 PCR Mix
SR‐800‐00330
6
HLA-DQA1 PCR Mix
SR‐800‐00331
7
HLA-DQB1 PCR Mix
SR‐800‐00332
8
HLA-DRB1-S PCR Mix
SR-800-00333
9
HLA-DRB1-L PCR Mix
SR-800-00334
Uskladnění
450 µl
-20 až -80°C
24
Činidla pro přípravu knihovny: obsahuje celkem (12) samostatných ampulek
Činidlo
Číslo výrobku
Objem náplně
10
Fragmentační enzym
SR-800-00335
67 µl
11
Fragmentační pufr
SR-800-00336
168 µl
12
STOP pufr
SR-800-00337
225 µl
13
Enzymový mix pro
opravu konců
SR-800-00338
34 µl
14
Pufr pro opravu konců
SR-800-00339
168 µl
SR-800-00340
17 µl
SR-800-00341
118 µl
15
16
c)
Objem náplně
Enzym pro vytvoření
poly-A konce
Pufr pro vytvoření polyA konce
17
Ligázový enzym
SR-800-00342
34 µl
18
2X ligázový pufr
SR-800-00343
917 µl
19
Mix enzym/pufr pro PCR
SR-800-00344
84 µl
20
Amplifikační primer
SR-800-00345
12 µl
21
Voda bez nukleázy
SR-800-00362
85 µl
Uskladnění
-20 až -80°C
24
Deska s adaptorem (SR-800-00349):
Popis
Č. komponentu
Deska s adaptorem
Tři vyplněné sloupce na
destičce s 96 jamkami
SR-800-00349
Objem náplně
5 µl/jamka
Uskladnění
-20 až -80°C
Sada magnetických kuliček (SR-800-10379):
a)
Magnetické kuličky: obsahují jednu (1) ampulku
Popis
Č. komponentu
Naplněná ampulka, kuličky
Agencourt® AMPure® XP
SR-800-00378
Objem náplně
5 ml
Uskladnění
2 až 8°C
Strana 2 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
ZÁMĚR POUŽITÍ
TM
Sada pro typizaci HLA pomocí NGS MIA FORA slouží k amplifikaci a sekvenování HLA genů HLA -A, -B, -C, -DRB, -1/3/4/5, DQA1, -DQB1, -DPA1 a -DPB1 na sekvenční platformě NGS IIlumina. Software MIA FORA slouží jako návod ke stanovení typu
HLA z dat získaných pomocí sady MIA FORA NGS HLA. Test je určen k použití v laboratořích způsobilých k manipulaci s DNA
pro amplifikaci a sekvenování.
SOUHRN A VYSVĚTLENÍ
Typizace PCR-amplifikovaných exonů genů HLA pomocí sekvenování je běžný laboratorní postup. Amplifikace PCR slouží
k obohacení cílových sekvencí a pro vybrané oblasti je stanovena následná typizace HLA. Ke stanovení typu HLA jsou
používány i jiné metody, jako je využití sekvenčně specifických oligonukleotidových sond (SSOP) a testy sekvenčně specifických
primerů (SSP). Systém MIA FORA pro typizaci HLA pomocí NGS je nová typizační metoda, která využívá schopnosti zachytit
všechny odpovídající oblasti lokusů HLA pomocí PCR dlouhých řetězců. Součástí sady je devět PCR master mixů obsahujících
všechny komponenty požadované k amplifikaci jednotlivých genů, včetně enzymů, pufrů, dNTP (deoxynukleotid trifosfáty) a
primerů pro PCR amplifikaci dlouhých řetězců. Amplifikovanou DNA je pak možné dále zpracovat pomocí sady MIA FORA NGS
HLA a získat knihovnu DNA pro sekvenování na sekvenční platformě Illumina. Na sekvenční platformě Illumina umožňuje sada
mnohočetně sekvenovat až 24 vzorků.
PRINCIPY POSTUPU
Typizační sada MIA FORA NGS HLA slouží ke stanovení lokusů HLA třídy I a II sekvenováním celého genu nebo exonů a
intronů nesoucích maximum informací. Typizační sada MIA FORA NGS HLA využívá PCR dlouhých řetězců k zachycení a
obohacení hlavních genů HLA, HLA -A, -B, -C, -DQA1, -DQB1, -DPA1, -DPB1 a -DRB1/3/4/5. Sada činidel pro přípravu
knihovny MIA FORA NGS generuje knihovnu z amplifikované DNA k sekvenování na sekvenční platformě Illumina. Typizační
software MIA FORA NGS HLA poskytuje sekvenci příslušných genů HLA a informace o fázi pro účely typizace HLA s vysokým
rozlišením.
ČINIDLA
A. Identifikace
Úplný seznam produktů a příslušných katalogových čísel viz tabulky v oddíle Činidla podle katalogového čísla.
B. Varování a upozornění
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Určeno pouze pro diagnostiku in vitro v Evropské unii.
Výsledky získané pomocí těchto souprav nelze použít jako jediný základ pro učinění klinických závěrů o stavu pacienta.
K manipulacím před a po PCR by měly být vyčleněny samostatné laboratoře nebo uzavřené laboratorní prostory.
K manipulacím před a po PCR používejte různé pipety.
Biologické riziko: Se všemi biologickými a krevními vzorky zacházejte jako s potenciálními zdroji infekce. Při manipulaci s
takovými vzorky se řiďte obecnými bezpečnostními opatřeními.
Nikdy nepipetujte ústy. Zabraňte kontaktu činidel a vzorků s pokožkou a sliznicemi.
Likvidaci použitých materiálů proveďte v souladu s místními předpisy pro likvidaci potenciálně nebezpečného biologického
materiálu a/nebo v souladu s příslušnými předpisy daného ústavu.
Technologie PCR je citlivá na kontaminaci, a to především z vlastních produktů. Častým zdrojem kontaminace jsou aerosoly
z amplikonů PCR generované během fáze po PCR. Proto je nutné zabránit nadměrnému stříkání a tvorbě aerosolů. Během
práce se sadou je dále nutné dodržovat standardní laboratorní opatření pro PCR, jako je otření pracovní plochy před
zpracováním či přípravou PCR vzorků čerstvě připraveným 10% bělidlem, použití ultrafialového (UV) světla v krytech a
biologicky bezpečných kabinetech mezi jednotlivými použitími, oddělení kroků před a po PCR s ohledem na čas a prostor,
použití na alikvoty rozdělených PCR činidel, uplatnění pozitivních a negativních kontrol, atd. Použití konzistentní a pečlivé
techniky ve spojení se začleněním a monitorováním kontrol zajistí ostražitý a aktivní přístup ke kontrole a monitoringu
kontaminace PCR.
Každá laboratoř schválí a uplatní své vlastní postupy čištění.
Kontaminace činidel či vzorků může mít za následek chybné výsledky. Zabraňte kontaminaci produktu během použití.
Nepoužívejte kontaminovaná činidla.
Kapaliny, které jsou součástí sady, používejte ve stavu, v jakém byly dodány. Ředění a jiné úpravy mohou mít za následek
chybné výsledky. Nemíchejte činidla z různých sad.
Nepoužívejte protékající a neoznačené ampulky.
Dříve zmrazené vzorky a činidla musejí být po rozmrazení a před zahájením testu důkladně promíchány a odstředěny.
Zabraňte tvorbě pěny a bublin ve vzorcích.
Během rozmrazování uchovávejte všechny enzymy a master mixy na ledu nebo v kryo-bloku (2-8°C).
Před amplifikací zkumavku důkladně utěsněte, abyste zabránili vypařování.
Z důvodu rozdílů ve výkonnostních mechanismech termocyklerů mohou být získány odlišné výsledky, pokud jsou dané
teplotní profily přenášeny mezi různými modely a značkami termocyklerů. V některých případech může být ohrožena
specificita reakce a citlivost, což může vést k chybné interpretaci a analýze získaných dat. Alternativní termocyklery a profily
musejí být předem schváleny uživatelem.
Jiná, než uvedená doba inkubace a teplota, mohou mít za následek chybné výsledky.
Strana 3 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
18. Odchýlení se od doporučených postupů použití může mít za následek neoptimální chování produktu. V závislosti na povaze
a závažnosti odchylky může dojít ke zmaření pokusu (vztahujícího se jak na samostatný vzorek, tak i na celý běh), anebo
k získání chybných výsledků. Bylo například zjištěno, že nedostatečné/neaktivní čištění kuliček v průběhu pokusu může mít
za následek zvýšený výskyt selhání adaptorů.
19. Doporučujeme provádět gelovou elektroforézu pro analýzu produktů amplifikace genu HLA podle velikosti. K vizualizaci
produktů PCR by měl být použit ethidium bromid nebo gel red, ostatní barviva nejsou dostatečně intenzivní.
20. Během několika postupů v rámci protokolu jsou použity magnetické kuličky. Před zahájením vymývání je důležité odstranit
etanol a nenechat přitom kuličky usušit. Povrch magnetických kuliček musí být skelný a hladký, bez viditelných stop po
kapalině. Vhodnou dobu sušení je možné stanovit empiricky pro jednotlivá laboratorní prostředí (5-10 minut).
21. Pro každé čištění kuliček použijte čerstvě naředěný 80% etanol.
22. Po každém čištění kuliček nastává bezpečné období, během kterého je možné uchovávat vzorky či knihovnu při -20°C až 4
dny.
23. Destičky PicoGreen® chraňte před světlem, abyste zabránili vybělení.
24. Fragmentační reakce nesmí v žádném případě přesáhnout dobu 20 minut a čištění kuliček musí proběhnout ihned poté, aby
byl zajištěn odpovídající rozsah velikosti fragmentu.
25. Destička s poly-A koncem musí být přenesena přímo do kroku ligace adaptoru.
26. Pokud manipulujete s destičkou při přípravě adaptoru pro ligaci, použijte vždy nové rukavice. Opatrně odstraňte film
z destičky. Zkontrolujte, zda jamky ve sloupcích 1, 2 a 3 obsahují přibližně 5 µl roztoku.
27. Amplifikovanou knihovnu je nutné purifikovat do 1 hodiny od amplifikace.
28. Postupy po amplifikaci knihovny by měly být prováděny v sekvenační místnosti nebo v AirClean PCR boxu, aby bylo
zabráněno kontaminaci spojených adaptorů DNA finálním produktem obsahujícím sekvence clusteru Illumina.
29. Příprava na kvantifikaci knihovny pomocí qPCR musí být provedena v PCR krytu za použití čerstvě připraveného ředicího
pufru, aby bylo zabráněno kontaminaci.
30. Proveďte denaturaci vzorku MiSeq® pomocí 0,2 N čerstvého hydroxidu sodného.
31. Proveďte veškerá promývání MiSeq®, tj. po provedení, průběžná a pravidelná.
C. Pokyny pro uskladnění
1.
2.
3.
Typizační sadu MIA FORA NGS HLA uchovávejte při teplotě -20ºC v mrazáku s ručním odmrazováním.
Komponenty nepoužívejte po překročení data exspirace.
Magnetické kuličky skladujte při teplotě 2 až 8°C.
D. Purifikace a aplikace
Viz „Odběr a příprava vzorku“.
E. Indikace nestability
1.
Pokud se z roztoku během přepravy nebo uskladnění vysrážely soli, před použitím roztoku je znovu zcela rozpusťte pomocí
spirálového pohybu při pokojové teplotě (18 až 30°C).
POŽADAVKY NA NÁSTROJE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Termocykler vybavený vyhřívaným víkem a nastavitelnou rampovou frekvencí, s minimálním teplotním rozsahem od 2°C do 100°C a
přesností alespoň +/- 0,5°C. Podmínky pro volbu termocykleru je nutné přizpůsobit účelu optimalizace profilů. Schválen byl
termocykler Veriti od Applied Biosystems, spuštěný ve výchozím režimu s rampovou frekvencí 3,9ºC/sek.
Vhodná fluorescenční čtečka destiček s excitačním filtrem ~ 485 nm a emisním filtrem ~535 nm pro měření koncentrace DNA,
schválena byla čtečka Victor X2, X3.
Vhodná metoda/nástroj na izolaci a purifikaci fragmentů DNA o velikosti párů bází cca 400-500. Schválen byl nástroj Pippin PrepTM.
Volitelný systém pro manipulaci s kapalinami pro poloautomatickou konstrukci knihovny. Schválen byl systém Biomek 4000.
Sekvenční platforma Illumina, schválena byla platforma MiSeq®.
Server a software MIA FORA NGS: Immucor, číslo komponentu SR-790-00017.
ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKU






Lidskou genomickou DNA je možné purifikovat z plné krve nebo z buffy coat pomocí schválených metod splňujících níže uvedené
podmínky. DNA získaná z krve uchovávané v EDTA byla testována a prokázala vlastnosti potřebné pro tento test. DNA získaná
z krve uchovávané v heparinu nemůže být pro tento pokus použita.
Izolovaná DNA by měla být v 10 mM TRIS-HCl, pH 8,0-9,0, nebo ve vodě bez obsahu nukleázy. V případě přítomnosti chelatačního
činidla jako je EDTA nesmí konečná koncentrace chelatačního činidla překročit 0,5 mM.
Konečná koncentrace DNA by měla být 5 až 15 ng/µl.
Měření absorbance vzorku DNA při 260 a 280 nm by mělo dát poměr 1,65 až 2,0.
Vzorky DNA mohou být použity ihned po jejich izolaci nebo uskladněny až 1 rok při teplotě -20ºC. Vyhněte se opakovanému
zmrazování / rozmrazování, mohlo by dojít ke znehodnocení DNA.
Alespoň 50 % vzorků genomické DNA musí mít fragmenty větší než 10 kb, aby byla zajištěna úspěšná PCR amplifikace dlouhých
řetězců.
Strana 4 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
POSTUP
A. Dodané materiály (Podrobné informace naleznete v tabulce v oddíle Činidla podle katalogového čísla)


Činidla PCR
Činidla pro přípravu knihovny, destička s adaptorem, magnetické kuličky Ampure®
B. Požadované, ale nedodávané materiály, činidla a vybavní



























Termocyklery: schválen byl termocykler ABI Veriti ®
Magnetický stojan pro vymývání malých objemů v destičkách s 96 jamkami: schválen byl Alpaqua Magnum FLX
Magnetický stojan pro magnetickou separaci mikrocentrifugačních zkumavek: schválen byl DynaMag-2 Magnet
Jeden stolní centrifuga na destičky a jeden mikrocentrifuga pro zkumavky
Pipetory, multikanálové pipetory a špičky (1-20 µl, 20-200 µl, 1000 µl)
Těsnící filmy pro PCR destičky. Schválen byl Accuseal Adhesive PCR film (E & K scientific kat. č. T796150, 4titude kat. č. 4ti-0500)
1,5 ml centrifugační zkumavky a PCR-proužek zkumavky
Laboratorní míchačka (vortex)
Tuhé vysoké polokryté destičky s 96 jamkami (E & K Scientific kat. č. EK-75012, 4titude kat. č. 4ti-0770/C)
Destička s 96 jamkami PP Black, V-dno, hluboké jamky (E & K Scientific kat. č. 21209, Greiner Bio-One kat. č. 651209)
MicroAmp® reakční destička s 96 jamkami (ThermoFisher kat. č. N8010560)
Optický těsnící film MicroAmp®, Advanced Adhesive (E & K Scientific kat. č. T796400, ThermoFisher kat. č. 4311971)
Nádoby na činidla
Bezbarvé těsnící polštářky
Alumioniová těsnicí páska
Papírky pro objektivy
Filtrované (odolné vůči aerosolu) jednorázové pipetovací špičky v rozsahu od 0,1 μl do 1000 μl
Etanol 200
10 mM Tris-HCl pH 8,0
100% Tween 20
Hydroxid sodný 1 N
Voda bez obsahu nukleázy
1,5% agaróza, bez barviva, interní normy, Pippin PrepTM, 250 bp -1,5 kb, (Sage Science,CDF1510)
PhiX Control, v3 (Illumina kat. č. FC-110-3001)
®
Činidla pro fluorescenční určení koncentrace DNA: schválena byla testovací sada Quant-iT™ Picogreen dsDNA
Sada MiSeq® V2, 300 cyklů(Illumina kat. č. MS102-2002)
Přesná metoda/sada pro kvantifikaci knihovny: schválena byla sada KAPA Library Quantification Kit
POKYNY K POUŽITÍ
Pokus je možné provést prostřednictvím manuálního protokolu popsaného níže, nebo pomocí automatizovaného protokolu za použití
manipulátoru kapalin. Podrobný popis automatizovaného protokolu provedeného pomocí Biomek 4000 a manuální protokoly jsou k dispozici u
vašeho odborného prodejce produktů Immucor.
POZNÁMKY:
• Zvýšené opatrnosti dbejte během rozpipetovávání vzorku na potřebné díly (alikvotace). Použijte kalibrované pipety. V opačném
případě hrozí ztráta činidla a selhání pokusu.
• Všechny teploty je nutné přesně dodržovat.
• Magnetické kuličky přeneste před použitím do místnosti s pokojovou teplotou.
• Amplifikované produkty je možné uchovávat až 4 dny před použitím při -20ºC. Amplifikovaný produkt je možné zmrazit a
rozmrazit pouze jedenkrát. Opakované zmrazování a rozmrazování může mít za následek poškození amplifikovaného
produktu a vést k chybným výsledkům určeným ke konstrukci knihovny.
A. Purifikace genomické DNA
Pomocí zvolené metody proveďte purifikaci genomické DNA. Vzorek DNA musí splňovat následující požadavky:

Vzorky genomické DNA musejí být získány extrakcí z plné krve nebo z buffy coat pomocí takové metody izolace DNA, která
je schopná poskytnout DNA o vysoké molekulární hmotnosti.
o

DNA musí být zředěna vodou bez obsahu nukleázy a uskladněna při teplotě -20 C a méně.

Výsledná koncentrace DNA by měla být v rozsahu 5-15 ng/µ, přičemž všechny vzorky by měly mít stejnou koncentraci.
V případě potřeby doplňte vodou bez obsahu nukleázy.

Alespoň 50 % extrahovaných fragmentů genomické DNA by mělo mít velikost 10 Kb a více, aby byla zajištěna úspěšná PCR
o odpovídající délce.
Strana 5 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
B. Amplifikace DNA (PCR)
Příprava PCR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Vyplňte soubor s čárovými kódy vzorků (soubor Windows s hodnotami oddělenými čárkou (csv soubor) obsahující názvy vzorků
a přidělené čárové kódy, jak můžete vidět na obrázku 1.
Obr. 1. Příklad souboru s čárovými kódy vzorků
V softwaru MIA FORA vytvořte soubor s čárovými kódy vzorků s názvy vzorků a čárovými kódy a poté vytvořte samotný projekt.
Název projektu budete potřebovat k označení běhu MiSeq®.
Pomocí štítků označte tři tvrdé polokryté PCR destičky s 96 jamkami.
Připravte destičku na vzorky se 100 µl genomické DNA na jednu jamku pro vzorek o koncentraci 5-15 ng/µl po naředění vodou
bez obsahu nukleázy.
Vzorek by měl být seřazen do sloupců 1, 2 a 3 na destičce s 96 jamkami, jak je znázorněno na obrázku 2. Jamka A1 s 10 mM
Tris-HCl pH 8,0 slouží pro negativní kontrolu (NTC) a neobsahuje DNA, následuje vzorek 1 v B1, vzorek 2 v C1 atd. až do
vzorku 23 v H3 (obr. 2, DESTIČKA SE VZORKY).
Rozmrazte PCR master mixy (P1-P9), promíchejte inverzí nebo krátce odstřeďte a nechte ustálit.
Odstřeďte destičku se vzorky od kroku 4 v odstředivce se stojanem na destičky po dobu 2 min tak, aby se genomická DNA
nacházela na dně jamky.
Rozdělte 15 µl PCR mixů P1-P9 do sloupců 1-9 na každé ze tří tvrdých polokrytých destiček s 96 jamkami tak, aby každá
z jamek daného sloupce obsahovala stejný PCR mix (obr. 2).
Při rozdělování buďte opatrní a zabraňte tvoření bublin v PCR master mixu.
Vzorky z destičky rozdělujte pomocí multikanálové pipety dle níže uvedeného postupu (obr. 2):
Sloupec 1 z destičky se vzorkem: 10 µl NTC a vzorky 1-7 ze sloupce 1 (A1-H1) do každého z devíti sloupců PCR destičky 1.
Sloupec 1 z destičky se vzorkem: 10 µl vzorků 8-15 ze sloupce 2 (A2-H2) do každého z devíti sloupců PCR destičky 2.
Sloupec 1 z destičky se vzorkem: 10 µl vzorků 16-23 ze sloupce 3 (A3-H3) do každého z devíti sloupců PCR destičky 3.
POZNÁMKA: vzorky je nutné promíchávat velmi jemně, aby nedošlo k tvoření bublin v PCR master mixu, viz obr. 2.
Utěsněte PCR destičky pomocí přilnavého PCR filmu. Krátce PCR destičky odstřeďte, umístěte do 3 různých termocyklerů a
spusťte program MIA FORA HLA_PCR s vyhřívaným víkem, viz. tab. 1.
BEZPEČNÉ OBDOBÍ
Produkty PCR je možné skladovat při teplotě -20ºC až 4 dny, dokud nebude zahájeno vyrovnávání genů.
Strana 6 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
Obr. 2. Uspořádání vzorků a systém PCR
Tab. 1. Podmínky termocykleru pro účely amplifikace
Cykly (15)
Spuštění
940C/30s
11.
Denaturace
940C/1:15m
Chlazení
600C/30s
Cykly (20)
Prodloužení
660C/7:30m
Denaturace
940C/1:15m
Chlazení
600C/30s
Prodloužení
660C/7:30m
Konečné prodlouž.
660C/10m
Držení
40C/∞
Nepovinné: Amplifikaci je možné ověřit pomocí několika reprezentativních vzorků na 0,8% agarózovém gelu s obsahem
ethidium bromidu nebo gel red. Elektroforéza by měla probíhat při 90 voltech po dobu 40 minut. Fragmenty PCR se mohou u
jednotlivých vzorků lišit, což je způsobeno rozdíly mezi introny. Přibližné velikosti produktů PCR jsou uvedeny v tabulce 2.
Tab. 2: Velikosti produktů amplifikace
Lokus HLA
Velikost (kb)
HLA-A
3,2
HLA-B
4,1
HLA-C
4,4
HLA-DPA
5,0
HLA-DPB
5,2
HLA-DQA
5,8
HLA-DQB
6,3
HLA-DRB1
0,9
HLA-DRB2
5,6
C. Vyrovnávání a slučování produktů PCR
Koncentrace jednotlivých produktů PCR může být stanovena pomocí vhodného fluorescenčního činidla pro kvantifikaci DNA, jako je
PicoGreen®.
V závislosti na fluorescenčním měření jsou produkty PCR ze všech devíti PCR reakcí pro jednotlivé vzorky vyrovnávány a slučovány
v souladu s výstupem ze SironaQuantTM, k dispozici v systému MIA FORA NGS HLA. Sloučené vzorky jsou poté čištěny v rámci
přípravy na fragmentaci.
Strana 7 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
Vyrovnávání a slučování
Obr. 3. Příprava pokusu PicoGreen®
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Proveďte kvantifikaci produktů PCR pomocí činidla PicoGreen®: Uveďte činidlo Bring PicoGreen® na pokojovou teplotu
a rozřeďte pomocí pufru 1X TE (50 µl PicoGreen®+ 7450 µl 1xTE). Promíchejte a chraňte před světlem až do použití.
Poznámka: Pokud pro PCR kvantifikaci použijete jiná činidla, respektujte postup uvedený v příslušném příbalovém
letáku.
Připravte sériově ředěné standardy v mikrocentrifugačních zkumavkách pomocí 100 ng/µl kontroly dodané se sadou
PicoGreen®. Rozdělte 20 µl každého standardu do PicoGreen® jamek A10-E12 destičky 1 (černé, plně kryté měřicí
destičky) podle obr. 3. Přeneste 20 µl pufru 1xTE do jamek F10, F11, F12 destičky PicoGreen® 1 podle obr. 3.
Přidejte 20 µl naředěného PicoGreen® do každé jamky všech tří destiček PicoGreen®, včetně jamek standardu na
destičce 1 podle obr. 3.
Přidejte 19 µl pufru 1xTE do tří destiček PicoGreen® ve stejném formátu jako destičky PCR. Přidejte 1 µl PCR produktu
do tří destiček PicoGreen®, aby rozložení odpovídalo původním PCR destičkám a bylo získáno ředění 1:20 PCR
produktů. Konečný objem je 40 µl ve všech měřených jamkách.
Odstřeďte destičku a inkubujte při pokojové teplotě po dobu alespoň 5 minut. Během inkubace chraňte destičky před
světlem.
Změřte fluorescenci s filtrem s excitací ~ 485 nm/emise ~535 nm, 0,1 s (Victor X3)
Výsledný soubor uložte podle níže uvedeného stanoveného názvosloví: (Pozn: Pro Windows použijte Text Tab
Delimited, pro MacOS: formátovaný text Windows).
Projekt_deska č._SLOUPEC1_datum.txt (např. ProjektX_01_SLOUPEC1_123115.txt)
Projekt_deska č._SLOUPEC2_datum.txt (např. ProjektX_02_SLOUPEC2_123115.txt)
Projekt_deska č._SLOUPEC3_datum.txt (např. ProjektX_03_SLOUPEC3_123115.txt)
Spusťte vyrovnávací program SironaQuant v softwaru MIA FORA. Doporučená hodnota je mezi 0,0035 a 0,0009 pmol.
Promíchejte PCR destičky a umístěte štítek na novou destičku pro následující krok, označenou „Projekt_sloučené
PCR_datum“.
Před sloučením rozřeďte produkty PCR z každého lokusu pufrem 10 mM Tris HCl pH 8,0 podle výstupu SironaQuant.
Sjednoťte produkty PCR ze všech 9 PCR reakcí pro jednotlivé vzorky přenesením objemů uvedených ve výstupu
SironaQuant.
Utěsněte destičky a uskladněte je při -20ºC, pokud nehodláte ihned zahájit proces čištění.
Uveďte magnetické kuličky na pokojovou teplotu a spirálovým pohybem promíchejte směs kuliček, aby se všechny
rovnoměrně rozpustily.
Přidejte 55 µl kuliček do každé jamky sjednocených vzorků. Důkladně promíchejte DNA a kuličky opakovaným
pipetováním (alespoň 10x).
Inkubujte směs kuliček DNA při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Na 5 minut přeneste destičku na magnet.
Opatrně odstraňte supernatant, aniž byste narušili kuličky, zatímco je destička na magnetu.
Nechte destičku na magnetu pro účely promývací etanolové fáze. Přidejte 200 µl čerstvě naředěného 80% etanolu do
každé jamky a inkubujte 30 sekund, poté opatrně odstraňte etanol.
Ještě dvakrát proveďte promývání etanolem (celkem 3 promývání). Po třetím promývání odstraňte všechny stopy
etanolu.
Sejměte destičku z magnetu a nechte kuličky usušit na vzduchu. Magnetické kuličky by měly mít skleněný povrch bez
stop po kapalině. Vhodný čas sušení lze vypočítat empiricky v každém laboratorním prostředí (5-10 minut).
Do každé jamky přidejte 35 µl 10 mM Tris-HCl pH 8,0 o pokojové teplotě. Důkladně promíchejte pipetováním a inkubujte
5 minut.
Umístěte destičku na magnet a inkubujte 5 minut, dokud nebude roztok čirý.
S destičkou stále na magnetu přeneste 30 µl eluátu do nové PCR destičky s 96 jamkami označené:
Projekt_vyrovnané_promyté_datum.
Strana 8 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
BEZPEČNÉ OBDOBÍ
Sloučené a promyté vzorky je možné skladovat při -20ºC až 4 dny, dokud nebudou použity k fragmentaci.
D. Konstrukce sekvenční knihovny
a. Fragmentace
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Předtím, než přikročíte k bodu 8, nastavte laboratorní časovač na 20 minut.
Rozdělte 20 ul stop pufru ze zkumavky 12 do všech jamek ve sloupci 11 nové destičky s 96 jamkami označené jako
fragmentační destička. Destičku nechte na ledu až do kroku 8.
Připravte fragmentační master mix přenesením 134 µl ze zkumavky 11 (fragmentační pufr) do zkumavky 10
(fragmentační enzym). Důkladně promíchejte krouživým pohybem a krátce odstřeďte.
Rozpipetujte 23 µl fragmentačního master mixu připraveného během kroku 3 do každé jamky ve sloupci 12 a vytvořte
sloupec se „zásobou“ master mixu.
Ze sloupce 12 přeneste 6 µl fragmentačního master mixu do každé jamky ve sloupcích 1, 2 a 3 fragmentační destičky.
Přeneste 14 µl vzorku ze sloupce 1 sloučené destičky s promytými kuličkami z předchozí sekce
(Projekt_vyrovnané_promyté_datum) do sloupce 1 fragmentační destičky. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů (5x).
Přeneste 14 µl vzorku ze sloupce 2 sloučené destičky s očištěnými kuličkami z předchozí sekce
(Projekt_vyrovnané_promyté_datum) do sloupce 2 fragmentační destičky. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů (5x).
Přeneste 14 µl vzorku ze sloupce 3 sloučené destičky s očištěnými kuličkami z předchozí sekce
(Projekt_vyrovnané_promyté_datum) do sloupce 3 fragmentační destičky. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů (5x).
Přeneste fragmentační destičku na rovnou plochu, SPUSŤTE ČASOVAČ a inkubujte při pokojové teplotě po 20 minut.
Délka reakce nesmí v žádném případě překročit 20 minut.
Po 20 minutách inkubace ihned přeneste 5 µl STOP pufru ze sloupce 11 do sloupců 1, 2 a 3 a důkladně promíchejte
pipetováním nahoru a dolů (5x) po každém přidání.
Rozpipetujte 200 µl magnetických kuliček ohřátých na pokojovou teplotu do všech jamek sloupce 10 fragmentační
destičky se vzorkem, nebo do čisté PCR-proužek zkumavky.
Ze sloupce 10 přidejte 40 µl magnetických kuliček do všech jamek s fragmentovanou DNA a pomalu promíchejte
pipetováním nahoru a dolů (10x). Inkubujte směs kuliček DNA při pokojové teplotě po dobu 10 minut.
Přeneste destičku na 5 minut na magnet, aby se kuličky nalepily na stěny jamek, a pomocí pipety opatrně odstraňte
supernatant.
Destičku nechte na magnetu pro promývání etanolem. Každou jamku propláchněte 200 µl 80% etanolu, inkubujte 30
sekund a opatrně odstraňte tekutinu pomocí multikanálové pipety, aniž by došlo k narušení kuliček.
Opakujte krok promývání etanolem, celkem tedy proběhnou 2 promývání.
Sejměte destičku z magnetu a nechte uschnout na vzduchu, aby se odpařil nadbytečný etanol a povrch magnetických
kuliček získal skleněný vzhled.
Sejměte destičku z magnetu. Ke kuličkám přidejte 20 µl 10 mM Tris-HCl pufru pH 0,8 zahřátého na pokojovou teplotu,
promíchejte pipetováním a inkubujte 5 minut mimo magnet.
Umístěte destičku na magnet a inkubujte 5 minut.
Přeneste 15 µl eluátu do nové tvrdé PCR destičky s 96 jamkami označené Projekt_fragmentované_promyté_datum a
destičku utěsněte. Vzorky jsou nyní připraveny ke koncové opravě.
BEZPEČNÉ OBDOBÍ
Fragmentované a pročištěné vzorky je možné skladovat při teplotě -20°C až do zahájení koncové opravy. Při teplotě -20°C je možné
bezpečně skladovat pevně utěsněné a důkladně promyté destičky až 4 dny.
b. Oprava konců
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Znovu označte předem fragmentovanou a očištěnou destičku „Projekt_oprava konců_datum“.
Připravte master mix pro opravu konců přidáním 136 µl ze zkumavky 14 (pufr pro opravu konců) do zkumavky 13
(enzym pro opravu konců), promíchejte spirálovým pohybem, krátce odstřeďte a umístěte zkumavku na led.
Rozpipetujte 18,5 µl master mixu pro opravu konců připraveného během kroku 1 do sloupce 12 destičky pro opravu
konců, označené jako „Projekt_oprava konců_datum“, a vytvořte tak „zásobní“ sloupec.
Ze sloupce 12 přeneste 5 µl End Repair master mixu do sloupců 1, 2 a 3 vyrovnané, fragmentované a promyté DNA
označené „Projekt_fragmentované_promyté_datum“, připravené v předchozí části, a promíchejte pipetováním (5x).
Utěsněte destičku přilnavým PCR filmem a krátce odstřeďte, aby se veškerá kapalina dostala na dno jamky.
Umístěte destičku pro opravu konců, označenou jako „Projekt_oprava konců_datum“ do termocykleru a spusťte
program opravy konců MIA FORA, jak je znázorněno v tabulce 3.
Destičku uchovejte při teplotě -20°C až do přikročení k přidání poly-A konce.
Strana 9 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
Tab. 3: Program termocykleru pro opravu konců
Oprava konců MIA FORA
20°C po 30 min
70°C po 10 min
4°C ∞ držení
c. Přidání poly-A konce
1.
2.
3.
4.
5.
Připravte master mix pro přidání poly-A konce přidáním 85 µl ze zkumavky 16 (pufr pro přidání poly-A konce) do
zkumavky 15 (enzym pro přidání poly-A konce), promíchejte spirálovým pohybem, krátce odstřeďte a umístěte
zkumavku na led.
Rozpipetujte 12 µl master mixu pro přidání poly-A konce připraveného během kroku 1 do sloupce 11 na destičce s
opravenými konci a vytvořte „zásobní“ sloupec.
Ze sloupce 11 přeneste 3 µl master mixu pro přidání poly-A konce do všech jamek ve sloupcích 1, 2 a 3 na destičce
s opravenými konci označené „Projekt_oprava konců_datum“ z předchozí sekce a promíchejte pipetováním nahoru a
dolů (5x). Destičku označte „Projekt_poly-A konec_datum“
Umístěte destičku do termocykleru a spusťte program MIA FORA pro přidání poly-A konců podle tabulky.
IHNED PŘEJDĚTE K LIGACI ADAPTORU (do 30 minut).
Tab. 4: Program termocykleru pro přidání poly-A konců
MIA FORA poly-A
37°C po 30 min
75°C po 20 min
4°C ∞ držení
d. Ligace adaptoru
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
K manipulaci s destičkou s adaptorem použijte nové rukavice. Před odstraněním těsnícího filmu destičku krátce
protřepte. Opatrně sejměte film z destičky s adaptorem. Zkontrolujte, zda jamky ve sloupcích 1, 2 a 3 obsahují cca 5 µl
roztoku.
Připravte ligázový master mix přidáním 850 µl ze zkumavky 18 (ligázový pufr) do zkumavky 17 (ligázový enzym),
promíchejte spirálovým pohybem, krátce odstřeďte a umístěte zkumavku na led.
Rozpipetujte 95 µl ligázového master mixu připraveného během kroku 2 do sloupce 10 destičky pro přidání poly-A konce
označené „Projekt_poly-A konec_datum“ z předchozí části a vytvořte „zásobní“ sloupec. Destičku označte
„Projekt_ligace_datum“.
Ze sloupce 10 přeneste 26 µl ligázového master mixu do všech jamek ve sloupcích 1, 2 a 3 destičky pro přidání poly-A
konce a promíchejte pipetováním nahoru a dolů (alespoň 5x).
Přeneste 2,5 µl adaptoru do příslušných jamek na ligační destičce.
Důkladně promíchejte a utěsněte destičku PCR filmem. Krátce odstřeďte.
Umístěte ligační destičku do termocykleru a spusťte ligační program MIA FORA podle tabulky 5.
Tab. 5: Program termocykleru pro ligaci adaptoru
Ligace MIA FORA
25°C po 30 min
65°C po 10 min
4°C ∞držení
e. Sjednocení produktů ligace adaptoru
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Doplňte 20 µl z každé jamky na destičce „Projekt_ligace_datum“ z předchozí sekce do jedné 1,5 ml zkumavky typu
Eppendorf. Zkumavku označte „Projekt-datum-sjednoceno“.
Přidejte 865 µl magnetických kuliček do mikrocentrifugační zkumavky označené „Projekt-datum-sjednoceno“. Důkladně
promíchejte spirálovým pohybem. Inkubujte po dobu 10 minut.
Umístěte zkumavku na magnetický stojan, dokud nebude roztok zcela čirý, tj. 5-8 min. Odstraňte supernatant.
Nechte zkumavku na magnetu a přidejte 1 ml 80% etanolu a inkubujte 30 sekund. Odstraňte 80% etanol, aniž byste
narušili uchycené kuličky.
Opakujte čištění etanolem (krok 4), celkem tedy proběhnou 2 promývání. Odstraňte ze zkumavky co největší možné
množství etanolu.
Sejměte zkumavku z magnetického stojanu a nechte kuličky usušit na vzduchu po dobu 5-10 minut, dokud povrch
magnetických kuliček nezíská skleněný povrch.
Kuličky znovu umístěte do 63 µl 10 mM Tris-HCl pH 8,0 o pokojové teplotě. Spirálovým pohybem promíchejte a inkubujte
5 minut.
Umístěte zkumavku na magnet, dokud roztok nezíská čirý vzhled, a přeneste 60 µl eluátu obsahujícího vyčištěné vzorky
adaptoru po ligaci do čisté mikrocentrifugační zkumavky.
Strana 10 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
BEZPEČNÉ OBDOBÍ
Sloučené a pročištěné vzorky adaptoru po ligaci (knihovna) je možné skladovat při -20°C až do přistoupení k výběru velikosti po dobu
až 4 dny.
f. Výběr velikosti a amplifikace knihovny po výběru velikosti (Pippin PrepTM)
POZN.: Amplifikovaná knihovna by měla být pročištěna 1 hodinu od amplifikace.
1.
2.
3.
4.
5.
Pomocí odpovídající metody proveďte výběr velikosti v knihově a izolujte fragmenty, cca 400-500 párů bází. Pokud
použijete jiný produkt, než Pippin Prep, dodržujte příslušný návod.
Smíchejte 30 µl z knihovny s 10 µl odpovídajícího markeru a umístěte do jednoho pruhu kazety Pippin.
Vytvořte a spusťte program pro výběr knihovny s velikostí fragmentů v rozmezí 400-500 bp.
Rozmrazte amplifikační moduly ze sady (knihovny), zkumavky 19, 20 a 21, a proveďte následující postup na ledu v
PCR-proužek zkumavce 0,2 ml:
Smíchejte 25 µl amplifikační směsi ze zkumavky 19, 2 µ primerů ze zkumavky 20, 18 µl vody bez nukleázy ze zkumavky
21 a 5 µl eluátu vybrané velikosti.
Jemně promíchejte a nechte ustálit. Umístěte do termocykleru a amplifikujte s PCR knihovnou MIA FORA podle tabulky
číslo 6.
Tab. 6: PCR knihovna MIA FORA
Cyklus (1)
Počáteční držení
980C/30s
Cykly (12)
Denaturace
980C/15s
Chlazení
650C/30s
Cyklus (1)
Prodloužení
720C/30 s
Konečné prodl.
720C/5m
Držení
40C/∞
E. Příprava sekvenování pro MiSeq®
POZNÁMKA: Všechny kroky po amplifikaci provádějte ve vyhraněné části laboratoře a pokud možno použijte PCR kryt,
abyste zabránili kontaminaci pracovní plochy a sekvenačních činidel.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Přeneste 50 µl amplifikované knihovny do mikrocentrifugační zkumavky. Přidejte do knihovny 50 µl magnetických kuliček
ohřátých na pokojovou teplotu. Důkladně promíchejte a inkubujte 10 minut.
Po 10 minutách umístěte zkumavku do magnetického stojanu, dokud nezíská roztok čirý vzhled, cca 5-8 min. Odstraňte
supernatant.
Stále na magnetickém stojanu přidejte 200 µl 80% etanolu a inkubujte 30 sekund. Odstraňte 80% etanol, aniž byste narušili
kuličky.
Opakujte promývání etanolem (krok 3), celkem proveďte 2 promývání. Odstraňte ze zkumavky tolik etanolu, kolik můžete.
Sejměte zkumavku z magnetického stojanu a nechte kuličky oschnout na vzduchu po dobu 5-10 minut, dokud povrch kuliček
nezíská skleněný vzhled.
Znovu rozpusťte kuličky v 17 µl 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Promíchejte spirálovým pohybem a inkubujte 5 minut.
Umístěte zkumavku na magnet, dokud nebude roztok čirý, a přemístěte 15 µl eluátu obsahujícího vyčištěnou amplifikovanou
sekvenační knihovnu do čisté mikrocentrifugační zkumavky.
BEZPEČNÉ OBDOBÍ
Promyté vzorky mohou být uschovány při teplotě -20ºC až po dobu 4 dnů.
Stanovte koncentraci knihovny pomocí metod schopných poskytnout přesné měření koncentrace DNA. Immucor doporučuje
metody qPCR, které jsou schopné odhadnout koncentraci knihovny.
9. Amplifikovaná knihovna musí mít koncentraci alespoň 10 nM. Distribuce velikosti může být stanovena pomocí elektroforézy
agarózového gelu či jiného systému kapilární elektroforézy za účelem ověření velikosti výsledných knihoven.
10. Rozřeďte knihovnu na 4 nM a poté připravte 12 pM denaturované knihovny k sekvenování. V případě potřeby může být do
knihovny přidána kontrola s 5% PhiX.
11. Umístěte denaturovanou knihovnu do kazety a spusťte sekvenovací systém MiSeq®.
12. Postupujte podle pokynů MiSeq® pro sekvenování knihovny pomocí cyklu V2 300 sady MiSeq®. Ujistěte se, že název
souboru v listu vzorků MiSeq® odpovídá názvu projektu vygenerovanému během přípravy na PCR.
8.
F. Analýza dat
Soubory fastq vygenerované pomocí nástroje MiSeq® by měly být analyzovány prostřednictvím softwaru MIA FORA
k vygenerování typu HLA. List se vzorky a příslušnými názvy a čárovými kódy, včetně příslušných souborů fastq, by měl být
nahrán do projektového souboru softwaru MIA FORA. Při používání softwaru MIA FORA dodržujte návod pro uživatele softwaru.
VÝSLEDKY
1. Amplifikace PCR:
2.
Analýza agarózového gelu by neměla vykázat žádný produkt v negativní (NTC) kontrole pro platný běh. Agarózový gel
amplifikovaných produktů může vykazovat nejednotnosti ve velikosti, způsobené rozdíly v intronických sekvencích. Přibližné
velikosti proužků naleznete v tabulce 2.
Příprava knihovny:
Strana 11 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
3.
Sada by měla vygenerovat knihovnu, jakmile bude hladina vstupní DNA v SironaQuant v rozsahu 0,0009 a 0,0035 pmol.
Konečná koncentrace knihovny by měla být alespoň 10 nM a měla by být přesně kvantifikována před sekvenováním.
Knihovny by měly být před denaturací naředěny na 4 nM.
Shlukování (clustering) v sadách MiSeq® V2 se může různit v závislosti na přesnosti kvantifikace. Běžná hustota clusterů
2
v knihovnách 12 pM se nachází v rozmezí 600-800 K/mm .
Je nezbytně nutné provést přesnou kvantifikaci knihovny. Všechny produkty vzniklé po ligaci adaptoru musejí být umístěny
do PCR krytu nebo do zvláštního prostoru, a všechna ředící činidla musejí být vždy čerstvě připravena, aby bylo zabráněno
kontaminaci.
Typ HLA je vygenerován prostřednictvím softwaru MIA FORA NGS a je uveden ve zprávě. Dodržujte pokyny uvedené
v návodu pro uživatele softwaru MIA FORA pro analýzu typu HLA.
KONTROLA KVALITY
Pro každý test doporučujeme použít jednu negativní kontrolu a jednu známou (volitelnou) kontrolu, např. čistou vodu a předem stanovený
vzorek. Zvýšené opatrnosti je třeba dbát při odstraňování těsnících filmů z destiček, destičky je před otevřením nutné protřepat. Pro každý
nový krok je nutné použít nový těsnící film. Použité pipetovací špičky je nutné umístit do vhodných nádob a zlikvidovat. Příprava na PCR musí
proběhnout v místnosti vyčleněné pro postupy před PCR, mimo prostor, ve kterém probíhá manipulace s amplifikovanými produkty. Veškerá
genomická DNA musí být ředěna vodou bez nukleázy. Po výběru velikosti a amplifikaci DNA je nutné provádět manipulace s amplifikovanou
knihovnou v odděleném prostoru, nejlépe v PCR krytu, a pomocí oddělené sady pipet. Při všech postupech je třeba dbát zvýšené opatrnosti a
zabránit kontaminaci pracovních ploch s amplifikovanými knihovnami. Pokus by měl proběhnout v souladu s postupy doporučenými v tomto
příbalovém letáku a pomocí jiných postupů kontroly kvality, které jsou v souladu s místními, státními a federálními požadavky, anebo
s požadavky akreditačních úřadů.
OMEZENÍ POSTUPU
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
PCR a pokus popsaný v tomto příbalovém letáku vyžadují přesně kontrolované podmínky. Odchýlení se od ověřených parametrů
může mít za následek znehodnocení produktu.
Je-li alespoň 50% původních fragmentů DNA menších než 10 kb, nemusí být vytvořeno dostatečné množství PCR s dlouhými
vzdálenostmi.
Je-li konečná koncentrace knihovny nižší než 10 nM, nemusí být generovány přesné výsledky sekvenování.
Kvůli nedostatku pokrytí v intronové oblasti budou pozorovány nejasnosti ve 4. poli.
Přísady PCR mixu mohou narušit běžné netoxické alternativy ethidium bromidu používané při elektroforéze agarózového gelu a
mohou mít za následek slabou intenzitu proužků.
Zelené agarózové gely SYBR® nefungují s PCR produkty. K vizualizaci PCR produktů by měl být použit ethidium bromid nebo
GelRed™.
DPB1 primer neamplifikuje exon 1 a exon 5. Z toho důvodu nebude sekvenován žádný známý polymorfismus v těchto exonech a ve
zprávě bude uveden jako nejasný.
Nedostatek genomických referenčních sekvencí pro DPB1 a nízké hladiny polymorfismu v intronu 2 (mezi exony 2 a 3) komplikuje
provedení analýzy fázování pro heterozygotní vzorky. To může vést k nejasnosti v genotypu, kterou nelze vyřešit.
Forward primery pro DPB1 se překrývají s prvními základnami na exonu 2. Z toho důvodu nebude polymorfismus v těchto sekvencích
identifikován sekvenováním.
DRB lokusy jsou amplifikovány jako dva fragmenty – jeden amplifikuje exon 1 a druhý amplifikuje exony 2 až 6. Intron 1 není
amplifikován v celém svém rozsahu. Fázování celého lokusu proto není možné pro DRB1/3/4/5 a a případné polymorfismy přítomné v
Intronu 1 budou mít za následek nejasnosti ve 4. poli.
Reverzní primer pro DRB exony 2 až 6 se překrývá s 3’-koncem exonu 6 a z toho důvodu nebude v těchto sekvencích polymorfismus
determinován sekvenováním.
Ve většině případů produkty amplifikace exonu 1 DRB1,3,4,5 špatně mapují exon 1 ze známých referenčních sekvencí DRB5.
Z tohoto důvodu nebude pravděpodobně generován kontig pro exon 1 pro DRB5. Vzhledem k tomu, že nejsou známy žádné
polymorfismy exonu 1 pro DRB5, situace nevede k žádné dvojznačnosti v typizaci HLA pro DRB5.
Z důvodu složité povahy typizace HLA je nezbytné, aby kontrolu interpretace dat a typizaci provedl kvalifikovaný personál.
ZVLÁŠTNÍ CHOVÁNÍ
Klinické studie byly provedeny ve třech laboratořích s cílem vyhodnocení výkonu typizační sady MIA FORA NGS HLA. Výsledek pokusu byl
porovnán s předchozí typizací, ve které byla tam, kde to bylo možné, uplatněna typizace sekvenací (SBT) s vysokým rozlišením, a tam, kde
to možné nebylo, typizace s nízkým rozlišením. Vzorky byly vybrány testovacími laboratořemi tak, aby zastupovaly různé sady typů HLA,
které se vyskytují v běžných postupech. Ve třech laboratořích bylo testováno celkem 206 vzorků ve 3 bězích, pro každý byly použity dvě sady
činidel. Typizace HLA byla provedena pro lokusy HLA-A, -B, -C, DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1 a -DRB 1/3/4/5. Celkem bylo v rámci těchto
206 vzorků vyhodnoceno 3 692 alel. Výsledky prokázaly, že typy HLA získané testováním pomocí MIA FORA bez přetestování neúspěšných
a neodpovídajících lokusů, představovaly 99,34 %. Po přetestování neúspěšných a neodpovídajících lokusů byla celková shoda 99,74 %.
Laboratoř
Počet vzorků
Tab. 8: Shrnutí celkové shody
Počet testovaných lokusů Počet alel k rozboru shody
Shoda po novém testování
Lab. 1
68
748
1223
1220 (99,75 %)
Lab. 2
Lab. 3
69
69
759
759
1064
1241
1063 (99,91 %)*
1236 (99,59 %)
*V této laboratoři neproběhlo přetestování. Jeden lokus DQB1 vykazoval nedostatečné údaje.
Strana 12 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
Lokusy HLA
Tab. 9: Shrnutí klinických testů podle jednotlivých lokusů
Výchozí shoda
Shoda po novém testování**
HLA-A
100,00 %
100,00 %
HLA-B
99,76 %
99,76 %
HLA-C
99,51 %
100,00 %
DPA1
99,72 %
100,00 %
DPB1
99,44 %
99,72 %
DQA1
99,26 %
100,00 %
DQB1
98,48 %
99,27 %
DRB1
98,54 %
99,03 %
DRB3/4/5
99,43 %
100,00 %
Celkem
99,34 %
99,74 %
**Součástí přetestování byly případy označené ke kontrole, které nemohly být
vyřešeny manuální inspekcí údajů. Přetestovány byly také případy, které nebylo
možné realizovat z důvodu nedostatečných údajů (11/1854 amplifikací).
Pozn.: Podrobné informace o chování získáte na čísle 1-888-329-0255 společnosti Immucor Transplant Diagnostics, Inc.
Strana 13 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ
MOŽNÁ PŘÍČINA
PROBLÉM
Nepřítomnost proužků
na gelu po amplifikaci
PCR
Kvalita či kvantita DNA
Poměr OD 260/280 menší než 1,65
Proveďte nové čištění DNA a zbavte se nečistot.
Fragmentovaná DNA
Nejméně 50 % DNA musí být větší než
10 Kb
Proveďte novou extrakci DNA ze vzorku.
DNA naředěná Tris-HCl nebo TE
Vzorky řeďte vodou.
Nízká koncentrace DNA v šabloně s
Ujistěte se, že je koncentrace DNA 50-150 ng/reakci.
V agarózovém gelu byly použity
alternativy ethidium bromidu
Výpadek amplifikace
Vícečetné nebo
skvrnité proužky po
PCR amplifikaci
Rampová frekvence
Podmínky termocykleru
Teplota
Kvalita DNA
Vybělené snímky s činidlem
PicoGreen®
Nízké hodnoty
fluorescence pro
všechny lokusy
Činidlo PicoGreen®
Pipetovací nástroj
KAPA PCR
Pokud jsou proužky na agarózovém gelu z důvodu oslabené
fluorescence způsobené složením PCR mixu příliš slabé,
použijte ethidium bromid.
Opakujte PCR za použití zbytků činidel (potřebná dávka pro
o
4 vzorky). Zbytky činidel uskladněné při 2-8 C jsou stabilní
jeden týden.
Ujistěte se, že použité rampové frekvence odpovídají
hodnotám uvedeným v protokolu.
Proveďte kalibraci PCR stroje a zkontrolujte výkon strojů.
Ujistěte se, že je DNA naředěna vodou a není
kontaminována.
Dodržujte pokyny výrobce. Činidlo nesmí být vystaveno
světlu.
Nesprávné ředění činidla
Nařeďte činidlo PicoGreen® podle pokynů.
Nesprávné ředění standardů
Nařeďte standardy podle pokynů.
Konzultujte oddíl řešení problémů Sage Science a
vyhodnoťte, zda výkon nástroje odpovídá specifikacím.
Zkontrolujte profil promývání a ujistěte
se, že promývání proběhlo bez chyb
Nesprávný výběr
velikosti DNA
ŘEŠENÍ
Nesprávná kalibrace nástroje
Použijte 2 µl 1 kb plus ladder (ThermoFisher) s cvičným
protokolem se 400-600 páry bází. Použijte 15 µl naředěného
produktu na agarózovém gelu a zobrazte ředění fragmentu
500 bp.
Opakované použití pipetovací kazety
Pipetovací kazeta může být použita jen jednou.
Způsobeno jednou krajní hodnotou
Proveďte analýzu bez krajní hodnoty.
2
qPCR R < 0,95
Kontaminace činidel
Etanol nebyl zcela odstraněn
Nevhodně uskladněné kuličky
Čistota magnetických kuliček
Etanol nebyl čerstvě připraven
Přesušené kuličky
Nízká koncentrace
amplifikované
knihovny
Použita nesprávná koncentrace Tris-HCl
Zkontrolujte ředění před a po získání
produktů ligace adaptoru
Pippin Prep neředí DNA
Amplifikovaný produkt ztracen během
čištění kuliček
Problémy při fragmentaci
Chyba ve fragmentaci během
ligace
Clustering MiSeq®
menší než bylo
očekáváno
Nesprávná kvantifikace
knihovny
Kapa qPCR
Činidla Illumina
Problém s flow cell, nástrojem či
činidlem
Opakujte KAPA PCR s čerstvými standardy.
Etanol odstraňte, když jsou destičky na magnetickém
stojanu. Odstraňte všechny stopy etanolu, zejména po
konečném promývání.
Kuličky uchovávejte při teplotě 2 až 8°C – NEZMRAZUJTE
Před každým použitím je třeba připravit čerstvý 80% Etanol
Doba sušení může záviset na okolní teplotě a vlhkosti.
Důkladně kuličky sledujte a zabraňte jejich přeschnutí,
protokol upravte podle potřeby.
Ujistěte se, že koncentrace pufru Tris-HCl je 10 mM a pH 8,0
Amplifikujte 1 µl vyčištěné sloučené knihovny před pippin
s polovinou činidel pro amplifikaci knihovny. Použijte
amplifikované produkty (purifikace není nutná) na 2%
agaróze a stanovte přítomnost či nepřítomnost skvrn na
fragmentu.
Proveďte novou amplifikaci 5 µl ředění. Pokud je knihovna
>25 nM, může být produkt vizualizován pomocí 5 µl na
agarózovém gelu.
Purifikujte 20 µl 2-3 ligovaných vzorků a NTC pomocí
protokolu s 36 µl kuliček. Propláchněte produkt v 10 µl a
zkontrolujte fragmentaci na 2% agarózovém gelu. Pokud
nedojde k fragmentaci, volejte technickou podporu, kde se
dozvíte, jak problém odstranit.
Respektujte pokyny výrobce, respektujte stanovené ředění a
zkontrolujte, zda je křivka standardu správná a hodnoty Ct se
nacházejí v lineárním rozmezí křivky standardu.
Kontaktujte technickou podporu IIlumina, kde zjistíte, jak
odstranit problémy s činidlem a nástrojem.
Strana 14 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)
OMEZENÍ LICENCE
DŮLEŽITÉ – ČTĚTE POZORNĚ: Tato licenční smlouva o užívání značky („Smlouva“) je právní smlouva uzavřená mezi vámi (dále jen „Držitel licence“) a
společností Immucor Transplant Diagnostics, Inc. („Immucor“) (samostatně „Strana“ a společně „Strany“), o používání činidel uvedených v tomto dokumentu
(„Činidla“). Použitím činidel souhlasí držitel licence s dodržováním podmínek uvedených v tomto dokumentu.
1. Použití činidel držitelem licence. Immucor poskytuje uživateli licence neexkluzivní, nepřenosné právo používat pouze poskytnuté množství činidel výhradně v
souladu s postupy stanovenými v přiloženém štítku a s výhradou omezení uvedených v tomto dokumentu. Na držitele licence není převedeno vlastnické právo
na činidla. Immucor si ponechává veškerá práva, která nejsou výslovně udělena v tomto dokumentu, žádné licence zde nejsou uděleny.
2. Vyloučené použití. Držiteli licence není uděleno povolení k jinému použití činidel, než je použití uvedené v oddíle 1 této smlouvy. Konkrétně není uživateli
licence podle této smlouvy uděleno žádné povolení k používání činidel pro účely přenosu, prodeje, zveřejnění či jinému umožnění přístupu k činidlům nebo
produktu Mia Fora třetí straně. Držitel licence nemá právo vytvářet deriváty činidel, ani udělit povolení třetí straně k přípravě či prodeji derivátů činitel. Držitel
licence bere na vědomí, že některá činidla a jejich použití podléhají patentům třetích stran a licence na jejich použití byla udělena společnosti Immucor. Držitel
licence nesmí použít činidla jiným způsobem, než který je uveden v tomto dokumentu.
3. Zneužití činidel a náhrada škody. V rozsahu stanoveném zákonem bude držitel licence hájit společnosti Immucor, její pobočky, manažery, ředitele, vedoucí
pracovníky, zaměstnance, sponzory a jednatele (souhrnně „Odškodněné strany“) proti vystavení veškeré odpovědnosti, ztrátám, škodám, stížnostem a výdajům,
včetně poplatků za právní zastoupení (souhrnně „Odškodněné ztráty“), vyplývající z této smlouvy, včetně a bez omezení odškodněných ztrát vyplývajících z
jakéhokoli použití licence jménem držitele. Držitel licence bude hájit zájmy odškodněných stran proti všem odškodněným ztrátám vyplývajícím z této smlouvy a
majícím vztah k porušení této smlouvy, a nároky třetí strany v případě, že držitel licence nebo použití činidel držitelem licence porušuje nebo zcizuje patenty,
autorská práva, ochranné známky, obchodní tajemství či jiné duševní vlastnictví této třetí strany.
4. Tato smlouva se vztahuje výhradně na činidla. Veškeré použití softwaru Mia Fora je předmětem platné Licenční smlouvy uzavřené s koncovým uživatelem.
Tato smlouva bude vykládána a prosazována v souladu s právními předpisy státu New York ve Spojených státech amerických. V případě, že kupující není
ochoten přistoupit na podmínky této smlouvy, je společnost Immucor ochotna přistoupit na vrácení produktu.
INFORMACE O VÝROBCI
Výrobce: Immucor, 35 Technology Drive, Suite 100, Warren, NJ 07059. Spojené státy americké
Tel.: +1 (908) 226-8200, Fax: +1 (908) 226-0800
Autorizovaný zástupce: lmmucor Medizinische Diagnostik GmbH, Adam-Opei-Strasse 26 A 63322 Rodermark, NĚMECKO
Tel.: +49-607 4-84200, Fax: +49-607 4-842099
Technický servis pro Evropu: Tel.: +32 (0)3 385 47 91
Poslední revize a vydání tohoto dokumentu: Rev. 1, 08. červen 2016
POUŽITÉ OBCHODNÍ ZNAČKY
MIA FORA a SIRONAQUANT jsou obchodní značky Sirona Genomics, Inc.
Agencourt a Ampure jsou registrované obchodní značky Beckman Coulter, Inc.
Všechny ostatní obchodní značky jsou majetkem příslušných vlastníků.
Strana 15 ze 15
Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena.
LC1618CECS.1 (06/16)