CD3+ 4+

Mnohobarevná cytometrie
v klinické diagnostice
Mgr. Marcela Vlková, Ph.D.
Ústav klinické imunologie a alergologie, FN u
sv. Anny v Brně
Průtoková cytometrie v
klinické laboratoři
• Relativní a absolutní počty leukocytárních
subpopulací
• Pro správnou interpretaci je potřeba mít
správně nastavené normální hodnoty ve
vyšetřovaném materiálu: plná krev, kostní
dřeň, bronchoalveolarní laváž
• Odchýlení od normálních hodnot pak může
ukazovat na určitý typ onemocnění
Denní měření kontroly
• Slouží k ověření správné přípravy vzorku
pro průtokový cytometr
• pipetování odpovídajícího množství kontrolního
vzorku a monoklonálních protilátek
• lýza, promývání
• Správné nastavení cytometru:
• Fludika, optika, lasery..
• Správné nastavení protokolu:
• voltáže, kompensace
Správné nastavení cytometru
Správné nastavení cytometru…
FL1
FL4
FL2
FL5
FL3
FL6
FL7
FL9
FL10
Vliv zpracování
vzorku a výběru a
titru monoklonálních
protilátek, správný
výběr fluorochromu
Měření jednobarevných
kompenzačích zkumavek
Kompenzace
Denní měření kontrol před
počátkem rutinního měření
• Měření Flow Check, Spherotecu...
• Měření kontrolního vzorku
Flow check
Denní měření Rainbows
Denní měření kontrolního vzorku
Měření základních lymfocytárních
subpopulací
Nejčastěji vyšetřované
lymfocytární subpopulace
MARKER
EXPRESION
FUNCTION
NORMAL VALUES
IN WHOLE BLOOD
CD3
T lymphocytes
associated with TCR
receptor, transmission
signal
58-85%
CD4
T helper lymphocytes
receptor for MHC II,
activation
30-60%
CD8
T cytotoxic lymphocytes
receptor for MHC I,
activation
15-35%
CD19
B lymphocytes
the regulator activation
7-23%
CD16/CD56
NK cells
FcR for IgG
mediator of adhesion
6-20%
HLA-DR
B lymphocytes,
monocytes,
activated T-lymphocytes
MHC II,
presentation of Ag
100% of B-lymphocytes
3-7% of T-lymphocytes
Srovnání zastoupení základních
lymfocytárních populací
v závislosti na věku
110
100
10
13
90
80
7,5
9,5
13,5
15
16,5
8
15
21,5
70
24
27
29
30
20,5
16
19
12,5
60
NK buňky
50
B lymfocyty
T lymfoccyty
40
72,5
30
61,5
63,5
65
2-5
měsíců
5-9
měsíců
9 - 15
měsíců
60
59,5
15 - 24
měsíců
2 - 5 let
66,5
65
69
20
10
0
0-2
měsíce
5 - 10 let 10 - 16 let 16 – 150
let
Stanovení absolutních počtů leukocytárních a
lymphocytárních subpopulací
Počet leukocytů
3,6-10 x109l
Lymphocyty
20-55%
Monocyty
0-10%
37-75%
Granulocyty –neutrofily, eosinofily, basofily
Příklad:
Leukocyty:
%
5 x109l
lymphocyty: 20%
absolutní počet
1,00 x109l
Efekt infekce
Bakteriální infekce
Počet leukocytů:
↑
T pomocné lym.: CD3+ 4+:
↑
Lymfocytů:
↓
Monocyty: CD14+HLA DR+ :
↓
Granulocytů:
↑
Virová infekce
Počet leukocytů:
↓
T cytotox. lym.: CD3+ 8+:
Lymfocytů:
↑
Aktivace cytotoxických T lym.:
Granulocytů:
↓
↑
CD3+CD8+HLA DR+ : ↑
CD3+CD8+CD38+ :
↑
Leukocytární subpopulace
v plné krvi
Granulocytes
Monocytes
Lymfocytes
SSC
Leukocytární subpopulace
v plné krvi
CD45
Kontrola
Pacient č.1 SK
EBV infekce
Pacient č.2 – EBV infekce
Kontrola
Pacient CLL
Zdravá kontrola
Měření základních lymfocytárních
subpopulací
Pacient
Pacient – léčba Rituximabem
Pacient věk 3 měsíce
Leu
Ly:
: 5,0x109/l
: 10%
T LYMFOCYTES
•CD3+
: 17 (58-85)%
•CD3+ 4+: 4 (30-60)%
•CD3+ 8+: 9 (15-35)%
B LYMFOCYTES
71%
• CD19+ : 62 (7-23) %
14%
NK CELLS
•CD16,56+: 11 (6-20)%
Severe combined imunodeficiency
(SCID)
Leu
Ly:
: 5,0x109/l
: 10%
T LYMFOCYTES
•CD3+
: 17 (58-85)%
•CD3+ 4+: 4 (30-60)%
•CD3+ 8+: 9 (15-35)%
B LYMFOCYTES
71%
• CD19+ : 62 (7-23) %
14%
NK CELLS
•CD16,56+: 11 (6-20)%
Pacient 1 rok
T LYMFOCYTES
22%
•CD3+
: 40 (58-85)%
4%
•CD3+ 4+: 22 (30-60)%
•CD3+ 8+: 4 (15-35)%
B LYMFOCYTES
• CD19+ : 22 (7-23) %
22%
40%
36%
40%
NK CELLS
•CD16,56+ : 36 (6-20)%
DiGeorge´s syndrome
T LYMFOCYTES
22%
•CD3+
: 40 (58-85)%
4%
•CD3+ 4+: 22 (30-60)%
•CD3+ 8+: 4 (15-35)%
B LYMFOCYTES
• CD19+ : 22 (7-23) %
22%
40%
36%
40%
NK CELLS
•CD16,56+ : 36 (6-20)%
Burst test
E.coli
fMLP
PMA
Chronic Granulomatous Disease
(autosomal recessive)
Negative control
Mother
Stimulation PMA
Patient
Stimulation PMA
Father
Stimulation PMA
Chronic Granulomatous Disease
(X-linked) Mother
Negative control
Stimulation PMA
Patient
Stimulation PMA
Father
Stimulation PMA
Cytometrické stanovení
myeloperoxidázy
Deficit myeloperoxidázy
Exprese MPO na monocytech
Healthy Control
Patient
Comparison
patient
healthy
control
Deficit myeloperoxidázy
Exprese MPO na granulocytech
Healthy Control
89%
Patient
Comparison
patient
Healthy control
Deficit MPO
Burst test - stimulace E. coli
ZDRAVÁ
KONTROLA
PACIENTKA
SROVNÁNÍ
pacientka
Počet aktivovaných
buněk: 95%
Počet aktivovaných
buněk: 89%
Stimulační index: 163
Stimulační index: 22
zdravá
kontrola
Deficit MPO
Burst test - stimulace PMA
ZDRAVÁ KONTROLA
PACIENTKA
SROVNÁNÍ
pacientka
Počet aktivovaných
buněk: 97%
Počet aktivovaných buněk:
92% a 6%
Stimulační index: 281
Stimulační index: 23 a 201
zdravá
kontrola
Děkuji za pozornost! 