In vitro

Přírodní látky jako inhibitory
nádorové angiogeneze
Kateřina Valentová
Ústav lékařské chemie a biochemie
LF UP
http://scientificliving.net/wp-content/uploads/2010/08/angiogenesis1.jpg
Angiogeneze
• Vznik nových cév ze stávajících
• Vícestupňový
proces (angiogenní kaskáda)
• Snížená angiogeneze
–
–
–
–
–
–
Poruchy hojení ran
Pomalé hojení zlomenin
Cévní mozkové příhody
Onemocnění srdce
Vředy
Neplodnost….
• Zvýšená angiogeneze
–
–
–
–
–
Revmatoidní artritida
Retinopatie → slepota
Chronický zánět
Komplikace AIDS
Růst nádorového ložiska a
metastázy….
http://www.amplab.de
Etapy angiogeneze
1.
Rozpuštění bazální membrány:
–
–
–
–
–
–
2.
Proliferace a migrace endotelií:
–
–
–
–
3.
Tvorba a uvolnění angiogenních molekul jako VEGF a ANG-2 buňkami v hypoxii
Oddělení pericytů (destabilizace cév)
Vazodilatace, protahování endotelových buněk (mechanické narušení)
Působení proteas
Zvýšení permeability stěny cévy
Uvolnění plasminogenu a fibrinogenu → plasmin a fibrin
Útvary podobné pupenům na povrchu cévy
Migrace endotelových buněk ve směru angiogenního stimulu
Proliferace endotelových buněk
Zachycení na fibrinové síti
Vlastní morfogeneze nové cévy:
–
–
–
–
Aktivace pericytů
Proliferace fibroblastů
Syntéza kolagenu po stimulaci TGF-β, EGF a PDGF
Vznik nové cévní stěny a jejího lumen
Nádorová angiogeneze
Maximální velikost nádorového ložiska bez
cévního zásobení 0,1-8 mm3
(přívod kyslíku a živin difuzí z okolní tkáně)
Hypoxie → „Angiogenní switch“
http://www.gene.com/gene/research/focusareas/oncology/angiogenesis.html
Přehled mediátorů angiogeneze
z
Klener (2010) Klin Onkol 23: 14
růstové faktory: VEGF – vaskulární endotelový, HGF – hepatální, FGF – fibroblastový, EGF – epidermální,
TGF - transformující, PDGF - odvozený od destiček, PD-EPDGF – endotelový odvozený od destiček,
MMP – metaloproteinasy matrix, IL – interleukin, IFN – interferon, TIMP – tkáňový inhibitor MMP, PAI –
inhibitor plasminového aktivátoru
Rodina
VEGF a
receptory
pro VEGF
růstové faktory:
VEGF – vaskulární
endotelový, PIGF –
placentový, NRP –
receptor pro
neuropilin
y
Klener (2010) Klin Onkol 23: 14
Signální
dráha VEGF
a možnosti
její inhibice
růstové faktory: VEGF – vaskulární
endotelový, EGF – epidermální; JAK –
Janus kinasa, STAT – převaděč signálu a
aktivátor transkripce, HIF – faktor
indukovatelný hypoxií, PI3K –
fosfatidylinositol-3-kinasa, AKT – proteinkinasa B, MAPK – mitogeny aktivovaná
proteinkinasa, RAS – GTPasa, m-TOR,
RAF – serin/threoninové kinasy
Klener (2010) Klin Onkol 23: 14
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Inhibice angiogeneze přírodními
látkami
Kávová a rozmarýnová kyselina
Apigenin, luteolin, kvercetin
Alliin, diallylsulfid (česnek, Allium sativum, Amaryllidaceae)
Allylisothiokyanát (AITC, Brassica nigra, Brassicaceae)
Kapsaicin (papriky, Capsicum sp., Solanaceae)
Kurkumin (kurkumovník, Curcuma longa, Zingiberaceae)
Epigalokatechingalát (EGCG, čaj, Camellia sinensis, Theaceae)
Gambogová kyselina (Garcinia hanburyi, Clusiaceae)
Genistein (Fabaceae)
6-Gingerol (zázvor, Zingiber officinale, Zingiberaceae)
Sanguinarin (Papaveraceae)
Sulforafan (Brassicaceae)
Silybin (Silybum marianum, Asteraceae)
Resveratrol
Paclitaxel (Taxus brevifolia, Taxaceae)
Ursolová kyselina
Vanilin (Vanilla sp., Orchidaceae)
Gupta (2010) Cancer Metastasis Rev 29:405
Epigalokatechingalát, EGCG
• In vitro, HUVEC
www.sciencedaily.com
– Inhibice migrace a tvorby tubulů (40 µmol/l)
– Apoptosa
– Inhibice signálních drah PI3K/AKT a MEK/ERK díky aktivaci
transkripčních faktorů FOXO
Shankar (2008) J Mol Sig 3:7
• In vitro, nádorové buňky
– Inhibice produkce MMP (cca 11 µmol/l)
– Inhibice produkce VEGF a VEGFR
– Proapoptotický účinek
• In vivo, myši, model karcinomu prostaty
– Snížená produkce VEGF, MMP-2 a -9, TIMP-1 a -2
Stuart (2006) Life Sci. 79:2329 (Review)
Silymarin, silybin
• In vitro, buňky lidského karcinomu prostaty
– Snížení produkce VEGF
• In vitro, endotelové buňky
http://natural-supplements-tips.com
– Snížení produkce VEGF a MMP-2
– Zastavení růstu, indukce apoptosy, inhibice tvorby tubulů, snížená invazivita a
migrace
– Zvýšení exprese VEGFR-1
• Ex vivo, slepičí chorioalantoinová membrána
– Potlačení tvorby cév (20 µmol/l)
Gažák (2007) Curr Med Chem 14:3 (Review)
• In vivo, myši, model karcinomu prostaty
–
–
–
–
–
Inhibice růstu nádoru
Potlačení progrese z neoplasie na adenokarcinom
Potlačení hustoty cév v nádoru
Inhibice invaze nádoru, absence metastáz, pokles exprese VEGF a VEGFR-2
Snížení hladin VEGF, bFGF, MMP, E-cadherin v plazmě
Singh (2008) Clin Cancer Res 14:7773
Silybin a jeho estery s kyselinou
gallovou
Silybin A
Silybin (S)
3-O-galoylsilybin (3-G)
7-O-galoylsilybin (7-G)
20-O-galoylsilybin (20-G)
23-O-galoylsilybin (23-G)
Endotelové buňky z pupeční žíly
(HUVEC)
> 10 cm
Promytí žíly
izotonickým
roztokem s
antibiotiky
Transport do
laboratoře do 20 h,
při 4 °C
Inkubace 15 minut
při 37 °C
Naplnění roztokem
kolagenasy
Promytí
Odstředění,
resuspendace v
médiu
Migrační test
T=0
ctrl
60
50
40
30
20
10
0
S
3-G
7-G
20-G
23-G
Koncentrace (µmol/l)
MIC
Silybin (S)
3-O-galoylsilybin (3-G)
7-O-galoylsilybin (7-G)
20-O-galoylsilybin (20-G)
7-G 10 µM
7-G 20 µM
23-O-galoylsilybin (23-G)
Proliferační test
Proliferace (% kontroly)
Silybin (S)
140
3-O-galoylsilybin (3-G)
120
7-O-galoylsilybin (7-G)
100
20-O-galoylsilybin (20-G)
23-O-galoylsilybin (23-G)
80
60
40
20
0
0
1
10
Koncentrace (µmol/l)
S
7-G
3-G
20-G
23-G
100
Inhibice tvorby tubulů na Matrigelu
ctrl
7-G
10 µM
Silybin (S)
40
3-O-galoylsilybin (3-G)
7-O-galoylsilybin (7-G)
20
20-O-galoylsilybin (20-G)
23-G
20-G
* 2-methoxyestradiol, pozitivní kontrola
7-G
0
S
2-ME
60
3-G
Koncentrace (µmol/l)
80
23-O-galoylsilybin (23-G)
Angiogenní index
Angiogenní index =
No s ×1 + No c × 2 + No p × 3
No t
± [0,1 nebo 2]
(Aranda & Owen, 2009)
Silybin
Angiogenní index
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0
10
20
30
Koncentrace (µmol/l)
2-ME
Inhibice tvorby tubulů
3-O-galoylsilybin
7-O-galoylsilybin
120
120
100
80
% kontroly
% kontroly
100
60
*
40
20
60
*
40
*
*
30
2-ME
20
0
0
10
20
30
0
2-ME
0
Koncentrace (µmol/l)
*
*
0
10
20
20
23-O-galoylsilybin
30
Koncentrace (µmol/l)
2-ME
% kontroly
120
100
80
60
40
20
0
10
Koncentrace (µmol/l)
20-O-galoylsilybin
% kontroly
*
80
140
120
100
80
60
40
20
0
*
*
*
0
10
20
30
Koncentrace (µmol/l)
2-ME
Děkuji
• Ivaně Oborné (Porodnicko-gynekologická
klinika FN Olomouc) za odběry pupečníků
• Vladimíru Křenovi a Radkovi Gažákovi (MBÚ
AV ČR) za testované látky
• Jitce Ulrichové a všem pracovníkům ÚLCHB
Vám za pozornost
Kyselina gallová
• Identifikována jako „jedna z účinných látek“
extraktů z plodů a listů rostlin rodu Rubus a
extraktu ze semen révy
– Angiogeneze ex vivo (disky z lidských placentárních žil,
cca 100 µmol/l)
– Inhibice proliferace a indukce apoptosy lidských buněk
karcinomu prostaty DU145 (25 a 50 µmol/l)
– Snížení životnosti, proliferace a invaze lidských buněk
glioblastomu U87, U251, potlačení angiogeneze
myších endotelových buněk z mozku in vitro (120 –
235 µmol/l)
Lu (2010) Mol Cell Pharmacol 641:102
Liu (2006) Phytoter Res 20: 806
Liu (2005) J Agric Food Chem 53: 3909
Veluri (2006) Carcinogenesis 27: 1445