ANALYTICKÁ CHEMIE VE FORENZNÍ ANALÝZE A KRIMINALISTICE

ANALYTICKÁ CHEMIE VE FORENZNÍ
ANALÝZE A KRIMINALISTICE
Ing. Veronika Škeříková, Ph.D.
Ing. Oldřich Vyhnálek, Ph.D.
DRUHY ZKOUMÁNÍ
dle 100. závazného pokynu policejného prezidenta ke kriminalistickotechnické činnosti Policie České
republiky, Hlava XII, čl. 183
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Omamné a psychotropní látky, jejich prekurzory, léčiva a výrobky farmaceutického průmyslu
Nátěrové hmoty, ředidla, ostatní výrobky průmyslu nátěrových hmot
Pohonné hmoty a maziva
Výrobky chemického průmyslu a drogistické zboží
Cizorodé toxické látky v potravinách a nápojích a ve vodě v souvislosti s objasňováním trestné
činnosti (Státní zemědělská a potravinářská inspekce)
Alkohol v krvi a moči (výjimečné případy, jinak Soudní lékařství, toxikologická pracoviště,
revizní posudky)
Druhy a kvalita lihovin s omezením na trestné činy nedovolené výroby lihu (Celní technické
laboratoře, Státní zemědělská a potravinářská inspekce),
Toxické látky používané v zemědělství a průmyslu (Státní rostlino-lékařská zpráva)
Slzotvorné a dráždivé látky
Organické hořlaviny, včetně zjištění těkavých látek
Neznámé a málo běžné látky organického původu včetně stopových množství
Organické složky povýbuchových zplodina výbušnin, střelivo, výbušniny, nástražné výbušné
systémy (Pyrotechnický odbor policejního prezidia + Krajské expozitury)
NAKLÁDÁNÍ SE VZORKEM
• Nejproblematičtější je odběr vzorku
• Vyšetřovatel si může na místo činu vzít experta a ten přejímá odpovědnost
za odběr vzorku
ale „Expert má zkoumat vzorek bez ohledu na místo činu“
• Od příjmu vzorku na expertízní pracoviště – ČSN ISO 17025, bez dalších
omezení
„Co se zanedbá na místě činu se nedá už nikdy napravit“
MIKROSKOPIE
OPTICKÁ MIKROSKOPIE
Konidiofory Aspergillus clavatus,
200x zvětšeno
OPTICKÁ MIKROSKOPIE
• optická mikroskopie umožňuje pozorovat vzorky v přirozeném stavu včetně
vlhkosti a s malými úpravami též při nižších nebo vyšších teplotách
• umožňuje pozorovat mikroskopické objekty a struktury do 1000-i
násobného zvětšení bez speciálních úprav mikroskopu a při běžné přípravě
vzorků broušením a leštěním nebo rozložených na skleněné podložce
• pozorování neleštěných povrchů v odraženém světle je u běžných
mikroskopů možné jen u malých zvětšení pokud je nerovnost povrchu
menší než hloubka ostrosti použitého objektivu
• pozorování neleštěných povrchů při větším zvětšení umožňuje konfokální
mikroskop, dosahující zvýšenou hloubku ostrosti speciální konstrukcí
optické soustavy nebo speciální software, který dosahuje zaostření snímku
objektu digitální rekonstrukcí série snímků pořízených při rozdílném
zaostření
OPTICKÁ MIKROSKOPIE
Obrazová analýza
1. Optický mikroskop s mikrofotografickým zařízením
• umožňuje pozorování mikroskopických preparátů v procházejícím i v
odraženém světle při zvětšení 1000x a při použití zoomu pak ještě větším
• k dalšímu příslušenství patří vybavení pro epifluorescenci, temné pole,
polarizované světlo a Nomarského DIC v odraženém i procházejícím světle
2. Makro soustava
• je tvořena repro stativem s osvětlovací soustavou
• na stativ je možno připevnit barevnou CCD video kameru s makro video
zoom objektivy, které umožňují vytváření dokumentačních snímků nebo
obrazů s různým zvětšením a nahrazují tak částečně stereomikroskop
3. PC s obrazovou analýzou
• obrazy z mikroskopu nebo z makrooptiky snímané barevnou TV 3 CCD
kamerou nebo černobílou CCD kamerou mohou být archivovány,
softwarově upravovány, proměřovány a dále matematicky zpracovávány.
OPTICKÁ MIKROSKOPIE
Využití v celních laboratořích
• Optický mikroskop ve spojení s obrazovou analýzou
• analýza papíru pro zjištění přítomnosti anorganického nátěru a
stanovení vlákninového složení
• Posouzení glazování keramických dlaždic
• Rozlišení dřevin podle jejich buněčné stavby
• rozlišování druhů vláken, škrobů, měří se tloušťka tenkých vrstev
apod.
• Makro soustava se používá k dokumentaci vzorků, při posuzování
heterogenních směsí, měření velikosti částic u sypkých materiálů,
při rozlišení dřevovláknitých desek apod.
• Rozsah aplikací celého systému je velký a dále se rozšiřuje podle
problémů, které vyvstávají u nově analyzovaných vzorků
OPTICKÁ MIKROSKOPIE
Mechanoskopie
- komparační mikroskop
ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP
• jedná o optický přístroj, ve kterém jsou fotony nahrazeny elektrony a
skleněné čočky elektromagnetickými čočkami
• Elektromagnetická čočka je cívka, která vytváří vhodně tvarované
magnetické pole
• jedním ze základních parametrů je jejich mezní rozlišovací schopnost
• mezní rozlišovací schopnost je úměrná vlnové délce použitého záření a
elektrony mají podstatně kratší vlnovou délku než má viditelné světlo →
elektronový mikroskop má mnohem vyšší rozlišovací schopnost a může tak
dosáhnout mnohem vyššího efektivního zvětšení (až 1 000 000×) než
světelný mikroskop
ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
•
•
•
•
•
•
Umožňující studium mikrostruktury zkoumaných objektů ve vakuu pomocí
elektronového svazku
Svazek vzniká emisí elektronů z katody jež jsou dále urychlovány k anodě
Svazek je fokusován vhodně upraveným elektrickým, magnetickým nebo
elektromagnetickým polem, aby bylo dosaženo požadovaného zvětšení
Elektronový svazek vytváří obraz interakcemi s pozorovaným preparátem
Elektrony pronikají pozorovaným preparátem a interakcemi s ním jsou odchylovány
od původního směru, jímž se pohyboval hlavní svazek
Obraz je tvořen dopadem převážně neodchýlených elektronů na zobrazovací
systém (např. stínítko z luminiscenčního materiálu) na kterém se vytvoří kruhový
obraz
Tkanina
Povrch syntetizovaného
diamantu
Diamantová zrna, cca 1 µm
ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
• TEM transmisní elektronový mikroskop – nepohyblivý svazek elektronů,
detekce elektronů prošlých vzorkem (TE) na fluorescenčním stínítku nebo
detektorem (spíše pro molekulární biologii)
• SEM rastrovací elektronový mikroskop – pohyblivý svazek, zobrazení
povrchu vzorku pomocí odražených sekundárních elektronů
ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
SPM mikroskopie skenující (rastrující) sondou (Scanning Probe Microscopy) ke zjišťování struktury povrchu s rozlišením na úrovni velikosti atomu
AFM mikroskopie atomárních sil
- mapování rozložení atomárních sil na povrchu vzorku, síly mapovány přiblížením
hrotu k povrchu → vzniká přitažlivá nebo odpudivá síla → způsobí ohnutí nosníku,
na němž je upevněn hrot → ohnutí je snímáno laserovým snímačem
- výhodou metody AFM je možnost studovat jak nevodivé, tak i vodivé vzorky
STM skenující tunelovací mikroskopie
- princip je založen na kvantové fyzice
- mezi hrotem elektrody a zkoumaným vzorkem teče proud díky tunelovém jevu i
když se hrot vzorku přímo nedotýká → při pohybu nad vzorkem se mění vzdálenost
hrotu tak, aby tunelový proud zůstával stejný
- je schopna poskytnout až atomární rozlišení, nevyžaduje náročnou přípravu
vzorku, poskytuje informace jen o povrchu
SNOM rastrovací optický mikroskop blízkého pole (scanning near-field optical
microscope)
- detektor velmi blízko k povrchu vzorku (méně než je vlnová délka světla)
ELEKTRONOVÁ MIKROSONDA
• Spojení elektronového mikroskopu a lokální elektronové analýzy
• Elektrony jsou v mikroskopu urychleny a fokusovány na vzorek
Děje při interakci elektronů se vzorkem:
- Vznik charakteristického RTG záření
- Pružné elektronové srážky
- Vznik sekundárních elektronů při nepružných srážkách
- Absorpce elektronů
- Vznik viditelného záření (katodoluminiscence)
- Difrakce RTG záření
• Prostor vzorku je evakuován
• Lze připojit různé typy XRF spektrometrů
Využití:
- Kvalitativní a kvantitativní informace o povrchu
MIKROSPEKTROFOTOMETRIE (MSF)
• srovnávací mikroskopy nedokáží rozlišit složení dvou červených barev,
které vypadají stejně, ale ve skutečnosti se mohou lišit ve složení, a
naopak spektrální metody mají tu vadu, že se jimi změří spektrum, ale jen
celého vzorku
• spojuje mikroskopické i spektroskopické metody
• čočky - elektromagnetické cívky, naleštěná ocelová zrcadla
• zdroje záření - lasery
• hlavní výhodou je možnost zkoumat vzorky do většího detailu
• lze pozorovat jen jedno vlákno a současně ho prověřit i spektrálně
• kombinace mikroskopu a jedno-paprskového absorpčního
spektrofotometru
• proměřuje se kvantitativně absorpce světla o různých λ (vymezena
optickými filtry nebo monochromátorem) v různých místech preparátu
MIKROSPEKTROFOTOMETRIE (MSF)
Software na základě spektra přesně
určí barvu vzorku a její odstín →
porovnání s databází barev a laků.
RENTGENOVÁ FLUORESCENČNÍ
SPEKTROMETRIE (XRF)
• Využití rentgenové fluorescenční spektrometrie je velmi široké
• PRO PRVKOVOU ANALÝZU !
• Tato metoda je schopna identifikovat prvky v rozsahu Al - U na vzduchu a
při použití vakua je možno identifikovat až Be.
RENTGENOVÁ FLUORESCENČNÍ
SPEKTROMETRIE (XRF)
• počátky sahají až do prvních let 20. století, první komerční prototyp
vyroben v 50. letech 20. století
Princip
- interakce rentgenového záření, emitovaného rentgenkou, se vzorkem →
dochází k vyražení elektronu z vnitřních slupek → dojde k přesunu
elektronu do vyšších energetických hladin → vyzáření sekundárního
rentgenového záření, které je charakteristické pro všechny prvky →
detekováno na detektoru
Typy přístrojů
- vlnově dispersní - dochází k separaci rtg. záření na krystalu na základě
různých vlnových délek
- energiově disperzní - dochází k detekci na základě různých energií fotonů
sekundárního rtg. záření
RENTGENOVÁ FLUORESCENČNÍ
SPEKTROMETRIE (XRF)
Energy dispersive x-ray fluorescence spectra from fossil penguin bones
Tučňák brýlový
INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE (IR)
• analytická technika určená především pro identifikaci a strukturní
charakterizaci organických sloučenin a pro stanovení anorganických látek
• infračerveným zářením je elektromagnetické záření v rozsahu vlnových
délek 0.78 – 1000 µm, což odpovídá rozsahu vlnočtů 12800 – 10 cm-1
• oblast rozdělena na blízkou (13000 - 4000 cm-1), střední (4000 - 200 cm-1) a
vzdálenou infračervenou oblast (200 - 10 cm-1)
INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE (IR)
• průchod infračerveného záření vzorkem → absorpce záření → změny
rotačně vibračních energetických stavů molekuly v závislosti na změnách
dipólového momentu molekuly
• analytickým výstupem je infračervené spektrum - grafické zobrazení
funkční závislosti energie, vyjádřené v procentech transmitance (T) nebo
jednotkách absorbance (A), na vlnové délce dopadajícího záření
• absorpční pásy mající vrcholy v intervalu 4000 – 1500 cm-1 jsou vhodné
pro identifikaci funkčních skupin (např. –OH, C=O, N-H, CH3 aj.)
• pásy v oblasti 1500 – 900 cm-1 jsou nazývané oblastí „otisku prstu“
(fingerprint region)
Oblast otisku prstu
INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE (IR)
MĚŘENÍ SPEKTER (transmisní techniky)
Plynné vzorky:
- skleněná kyveta s délkou nejméně 10 cm a okénky z alkalického
halogenidu
Kapalné vzorky:
- kyvety s tloušťkou asi 0,1 mm z NaCl
- rozpouštědla: CS2, CCl4, CHCl3
- voda nevhodná (absorbuje IR záření, vyžaduje kyvety z nerozpustného
směsného jodidu a bromidu thalného)
Pevné vzorky:
- NUJOLová technika (vzorek se rozetře s parafinovým olejem v achátové
misce na hustou suspenzi a měří se v tenké vrstvě)
- KBr tablety (vzorek ve směsi s KBr (asi 1:50-100) se pod vysokým tlakem
lisuje do tablet)
INFRAČERVENÁ MIKROSKOPIE
•
•
•
•
•
Pracuje v oblasti λ ≈ 750 – 1100 nm (blízká IR)
Požadavky na infračervenou mikroskopii:
Zdroj: běžné žárovky, halogenové žárovky
Optika: běžná skleněná nebo zrcadla
Detekce: fotografický materiál (fotomateriál senzibilovaný pro IR – např.
kryptocyanin)
• Preparáty: může být i silnější (IR penetruje snadněji než viditelné světlo),
lze ho kontrastně barvit (kryptocyanin)
IR mikroskop
FT-IR mikroskop
INFRAČERVENÁ MIKROSKOPIE
Pozměněné texty, padělky
- rozlišení psacích pomůcek, resp. inkoustů, ochranné prvky
INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE S
FURIEROVOU TRANSFORMACÍ (FT-IR)
• v místě polopropustného zrcadla se setkávají odražené paprsky a
interferencí se zesilují ty, které jsou ve fázi (pohyb zrcadla 0,1 – 50 cm/s,
mění λ zesíleného záření)
• vzdálenost mezi děličem paprsků a
nepohyblivým zrcadlem JE stejná jako
vzdálenost mezi děličem a pohyblivým zrcadlem
→ dochází mezi paprsky ke konstruktivní
interferenci → svazek paprsků dopadající na
detektor má maximální intenzitu
• vzdálenost mezi děličem paprsků a
nepohyblivým zrcadlem NENÍ stejná jako
vzdálenost mezi děličem a pohyblivým zrcadlem
→ svazky paprsků od obou zrcadel nejsou ve fázi
a interferují destruktivně → redukce intenzity
INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE S
FURIEROVOU TRANSFORMACÍ (FT-IR)
ATR (Attenuated Total Reflection)
• Založeno na principu úplného odrazu záření na fázovém rozhraní
měřeného vzorku a měřícího krystalu z materiálu o vysokém indexu lomu
• Měřený vzorek je v dokonalém kontaktu s ATR krystalem a záření proniká
částečně do analyzovaného materiálu
• Pokud měřený vzorek absorbuje záření o určité frekvenci, pak tato složka
bude v totálně odraženém světle zeslabena
• Výhody: minimální příprava vzorků, snadné čištění, pevné i kapalné vzorky
ATR (Attenuated Total Reflection)
• Interakce IR záření se vzorkem sériemi tzv. evanescentních vln
• Evanescentní vlna: záření vstupuje do vzorku (do hloubky 1-4 μm) a
změněné pak vystupuje zpět do IR paprsku → je vedeno do interferometru
ke zpracování
• Evanescentní vlna obsahuje informace o absorbovaném záření
ODRAZNÉ TECHNIKY
• pro rutinní analýzy práškových vzorků vyvinuta difúzní reflektace
• při této technice se infračervené záření přivádí na práškový vzorek, část je
absorbována, část je odražena ve formě spekulární složky a část je
rozptýlena
DRIFT
• Difúzní reflektance: spočívá ve fokusaci infračerveného paprsku na pevný
vzorek → difúzně rozptýlené záření je převedeno vhodným optickým
zařízením na detektor spektroskopu
• Difúzně reflektanční spektra jsou vyjádřena v lineárních jednotkách
Kubelka - Munk (odpovídají jednotkám absorbance ve spektru měřeného
KBr technikou)
• Spekulární a reflektanční složka záření je závislá na velikosti částic a
distribuci velikosti částic (pro reprodukovatelnost měření je důležité mlít
vzorek na velikost částic mezi 10 a 20 µm a reprodukovatelně plnit
vzorkovací kelímek
DRIFT
• vzorky měřeny v práškovém stavu ve směsi se substráty (stejné pro IR -KBr,
KCl apod.) nebo jsou měřeny v čisté formě
• Vzhled spekter bez přítomnosti substrátu není ovlivněn přítomností vody v
substrátu a nedochází k reakcím mezi substrátem a vzorkem (např.
iontová výměna)
• spektrum má velmi intenzivní pásy, relativní rozdíly v jejich intenzitách jsou
poměrně malé při dodržení konstantní velikosti částic (rozdíl ve vzhledu
DRIFT spektra může být odstraněn ředěním vzorku ve vhodné matrici např.
KBr, KCl, CsI)
• pro analýzu se uplatňují dotykové sondy, které jsou propojeny s FTIR
spektrometrem optickými vlákny
• měření probíhají převážně v blízké infračervené oblasti
RAMANOVA SPEKTROSKOPIE
• perspektivní, nedestruktivní metodou umožňující analýzu in-situ
• využívána pro identifikaci zakázaných drog, analýzu vláken,
inkoustů, výbušnin, padělaných výrobků a peněz
• Ramanova spektroskopie sleduje vibrační pohyby molekuly
• Měří se rozptyl světla
• Ramanovo spektrum je závislostí intenzity rozptýleného záření na
Ramanově posunu Δν (cm-1), což je rozdíl energie mezi laserovým
paprskem a rozptyleným zářením
• intenzita Ramanovych čar je dána změnami polarizovatelnosti
molekuly během vibračního pohybu
• absorpční pásy mající vrcholy v intervalu 4000–1500 cm-1, jsou
vhodné pro identifikaci funkčních skupin (např. –OH, C=O, N–H, CH3
aj.)
• pásy v oblasti 1500–400 cm-1 se nazývají oblastmi „otisku palce“
IR x RAMAN
ODOROLOGIE
• kriminalistický obor, který se zabývá identifikací osob nebo věcí na základě
jejich pachu
Hlavní cíl: zjištění původce určitého pachu a jeho detailní identifikace
- tělesný pach člověka - zdrojem je např. dech, pot či jiné výměšky
- látky, které jsou součástí tělesného pachu, jsou vylučovány nepřetržitě a
jejich složení je individuální
- na konkrétní charakteristiku tělesného pachu mají vliv nemoci a léky,
užívání alkoholu, kouření, jídlo, používání kosmetiky apod.
ODOROLOGIE
Subjektivní, tzv. olfaktorika:
- Provádí se biologickými prostředky (speciálně vycvičení služební psi)
- V pachové konzervě je umístěna tkanina s určitým pachem → srovnání s
konkrétním vzorkem určité osoby
- Pachová identifikace se provádí až po 24 hodinách od uložení tkaniny nebo
předmětu do konzervy (aby pach měl čas uzrát)
- Trvanlivost konzervy je minimálně 1 rok
- Africké šelmy mají čich lepší než psi → např. pokusy se lvy
Objektivní, tzv. olfaktronika:
- Provádí se technickými prostředky (nejčastěji GC)
Ze soudního hlediska je důkaz pachovou zkouškou pouze důkazem nepřímým,
resp. výsledky nemají povahu trestně-procesního důkazu.
ANALÝZA PACHU
Odběr pachu na skleněné kuličky
HS-GC/TQ-MS
Tepelná desorpce těkavých látek z nosiče → zachycení
látek na chlazenou trapovací patronu (Tenax) →
zakoncentrování látek → nástřik na kolonu → separace
látek → hmotnostní detekce (trojitý kvadrupol)
Intenzita
ANALÝZA PACHU
17/7/15
4/6/15
13/4/15
tR (min)
ANALÝZA DNA
• lze provést prakticky z každého typu lidské tkáně, i ze zdrojů, které jsou na
DNA poměrně chudé - z kostí, nehtů, vlasů, šupinek kůže atd.
• z čerstvých tkání i ze zaschlých tělních tkání (krev, jiné tělní tekutiny, …)
Mitochondriální DNA - vlasy
Jaderná DNA - mumifikované ostatky
Postup analýzy:
Vzorek → izolace DNA → sekvenace DNA → PCR → elektroforéza →
vyhodnocení elektroforegramů
IZOLACE DNA
• Nutnost uvolnit DNA z buněk a oddělit ji z nadmolekulárních struktur
Lyze buněk – rozpuštěni biomembrán a denaturace proteinů
- detergenty (rozrušení membrán)
- Lysozomy (buněčné stěny)
- Mechanická degradace
•
-
Přečištění extraktů DNA
nutné se zbavit bílkovin
proteázy
fenol a chloroform (vysrážení proteinů)
ethanol (vysrážení nukleových kyselin)
SEKVENOVÁNÍ DNA
• souhrnný termín pro biochemické metody, jimiž se zjišťuje
pořadí nukleových bází v sekvencích DNA
• přibližně 1500 restrikčních endonukleáz, které dokáží rozeznat krátké
sekvence nukleotidů (4, 6, 8) → podle rozeznané sekvence dokáží DNA v
konkrétním místě rozštěpit
• použití endonukleáz vede k fragmentaci DNA na díly, které jsou specifické
pro každého člověka
• výsledkem štěpení je směs různě velikých úseků DNA
PCR
• Polymerase Chain Reaction - Polymerázová řetězová reakce
• Zacyklované tři teplotní kroky v programovatelném termostatu –
termocykléru
• Replikace (amplifikace) chtěného DNA fragmentu
ELEKTROFORÉZA FRAGMENTŮ DNA
• elektroforéza založena na rozdílné pohyblivosti částic látky v elektrickém
poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul, jakož i na
vlastnostech prostředí
• sacharidofosfátová „páteř“ nukleových kyselin je příčinou rovnoměrného
rozloženi negativních nábojů v molekulách DNA a RNA
• fragmenty DNA se děli podle své relativní molekulové hmotnosti a velikosti
náboje
ELEKTROFORÉZA FRAGMENTŮ DNA
PAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza)
• vertikální elektroforéza
• elektroforetické médium - poly-akrylamidový gel
- denaturačni - s ureou
- nedenaturační
Barviva
- Ethidium Bromid
- fluorescenční barva (interkalační činidlo)
Barvení
- do gelu
- do pufru
- barvení po elfu
ELEKTROFORÉZA FRAGMENTŮ DNA
• Sekvenátor DNA – kapilární elektroforéza s fluorescenční detekcí
• V reálném čase probíhá najednou elektroforéza v 96-ti kapilárách
• Dávkování z mikrodestiček
Kapilára
• délka 25 – 100 cm
• vnitřní průměr 25 – 100 mm
• vnitřní povrch lze modifikovat
SPOJENÍ MS A SEPARČNÍCH TECHNIK
On-line
• umožňuje v jedné analýze zároveň
separovat i identifikovat složitou
směs látek
Off-line
• izolace látek po jejich
chromatografické separaci a
následné změření hmotnostních
spekter pro jednotlivé látky
• pracné, časově náročné, pro složité
směsi látek nebo látky ve stopové
koncentraci ve směsi nemusí být
vůbec proveditelný
SPOJENÍ MS A SEPARČNÍCH TECHNIK
Problémy spojení
• rozdíl tlaků mezi hmotnostním analyzátorem (např. kvadrupól či iontová
past 10-3 Pa) a analyzovanými látkami vstupujícími do iontového zdroje z
kolony
- atmosférický tlak 105 Pa
- rozdíl tlaků nejméně 8 řádů
• průtok mobilní fáze
- Kapilární GC – průtok plynu cca 1ml/min
- Mikrokolonová HPLC – průtok kapaliny v µl/min
- HPLC na povrchově porézních částicích – průtok v ml/min
Mobilní fáze v obrovském nadbytku → musí být odstraněn před vstupem do
vakuové části přístroje!
SPOJENÍ GC/MS
• rutinní metoda, téměř výhradně ve spojení s kapilárními kolonami (průtok
ca. 1 ml/min)
• nosný plyn s analytem se zavádí přímo do iontového zdroje ve vakuu, kde
vakuový systém odstraní přebytečný nosný plyn
• kapilára je před vstupem do iontového zdroje vyhřívána, aby nedocházelo
ke kondenzaci analytů při přechodu do vakua
• iontové zdroje: EI nebo CI
• použití EI umožňuje přímé softwarové porovnání naměřených spekter s
knihovnami spekter v počítači (stovky tisíc spekter)
• hmotnostní analyzátory: Q, IT, TOF, QqQ
SPOJENÍ LC/MS
•
technicky mnohem náročnější ve srovnání s GC/MS (18 ml vody (1 mol) = 22.4 l
plynu, tzn. 1 ml vody je po odpaření 1.2 l plynu
•
u ionizačních technik pracujících za atmosférického tlaku (ESI, APCI, APPI) se
mobilní fáze přímo účastní ionizačního procesu
•
spektra není možné porovnávat s knihovnou, protože knihovny pro HPLC/MS
spektra většinou neexistují
•
spektra se výrazně liší podle použité ionizační techniky, pracovních podmínek i
typu přístroje (platí kromě EI) - spektra je nutné interpretovat manuálně
(zkušenosti operátora, porovnání s analogickými typy látek či literaturou)
•
proteomické knihovny - laboratorní knihovny pro omezený rozsah látek (např.
skupiny zakázaných drog, pesticidů či podobně definovaná skupina známých
cílových analytů), většinou se jedná o knihovny MS/MS spekter (na rozdíl od MS
spekter u GC/EI-MS), převoditelnost knihoven mezi různými typy hmotnostních
analyzátorů může přinést problémy kvůli významným rozdílům
DERIVATIZACE
Cíl
•
•
•
•
Zlepšení separačních vlastností (GC – zvýšení těkavosti, LC – změna retence)
Zvýšení hmotnost (MS)
Detekovatelnost
Změna sloučeniny vhodnou reakcí (např. označením nebo změnou funkční
skupiny)
• Pre-/post-kolonová derivatizace
GC
- esterifikace, acetylace, methylace, silylace
- karboxylové kyseliny, alkoholy, aminokyseliny, aminy
LC, CE
- adice chromoforu nebo fluoroforu)
ANALÝZA PSACÍCH PROSTŘEDKŮ
• inkoust je směs látek (filmotvorné látky, aditiva, rozpouštědla, konzervační
prostředky, barviva)
• hlavními složkami jsou pojivo, konzervační a barvonosné látky
• typické složení inkoustu v kuličkovém peru je: 50 % rozpouštědla, 25 %
barviva, 25 % jiné látky
• ale konkrétní chemické a množstevní složení inkoustů je výrobním
tajemstvím
OMAMNÉ A PSYCHOTROPNÍ LÁTKY
Ředidla:
- glukosa
- mannitol
- Kofein
- škrob
- MgSO4.7H2O
Různé otázky:
• přítomna ano/ne
• obsah drogy
• vzájemné porovnání vzorků
• profilování
OMAMNÉ A PSYCHOTROPNÍ LÁTKY
Identifikace
- GC/MS
- FT-IR spektroskopie
- Ramanova spektroskopie
Screening drog
- TLC
- GC-NPD
- HPLC
DUSÍKOVÝ-FOSFOROVÝ DETEKTOR
(NPD)
•
•
•
•
•
kroužek z alkalických chloridů rubidia nebo cesia vyhřívaný cívkou
přes kroužek prochází nosný plyn smíchaný s vodíkem
horký kroužek emituje elektrony termionickou emisí
elektrony sbírány na anodě a představují proud pozadí
V přítomnosti dusíku nebo fosforu jsou částečně spálené dusíkové
a fosforové materiály adsorbovány na povrchu kroužku → zvýšení emise
elektronů a proudu, který se měří
OMAMNÉ A PSYCHOTROPNÍ LÁTKY
• v UK 80% bankovek v oběhu (ale 99% v Londýně) je kontaminováno drogami
(zvláště kokainem), nové bankovky jsou kontaminovány během týdnů
• v UK vzrostl počet smrtelných dopravních nehod pod vlivem drog mezi lety
1985-2000 ze 3% na 18% → součást silniční kontroly immunoassy (1 ml slin)
• v USA kontaminováno 75-92% bankovek, až 2,86 μg kokainu/bankovku
• v Japonsku nebo Číně se kokain vyskytuje "pouze" na 12 až 20 % bankovek
• množství kokainu se většinou pohybuje mezi 0,006 a 1,240 µg/bankovku
Jourdan T. H., Veitenheimer A. M., Murray C. K., Wagner J. R., Forensic Sci. 58 (2013) No. 3, 616.
OMAMNÉ A PSYCHOTROPNÍ LÁTKY
Rapid comparison of diacetylmorphine on
banknotes by tandem mass spectrometry
Karl A. Ebejer, Rapid Commun. Mass Spectrom.
2005; 19: 2137–2143
Banknote thermal desorption unit coupled to an atmospheric
pressure chemical ionisation source
KANABINOIDY
Tělní tekutiny
- 2D-GC/MS s kryofokusací
- SPE-LC/MS/MS
- PMME-GC/MS (polymer monolith microextraction GC/MS)
- MEKC
Vlasy
- LC/MS/MS
- HF-LPME-GC/MS/MS (hollow fiber-liquid phase microextraction GC/MS/MS)
Nové kanabionidy
- po derivatizaci (N-methyl-N-terc-butyldimethylsilyltrifluoroacetamid, pentafluoropropionyl anhydrid)
- GC/NCI/MS/MS
Rostlinný materiál
- HPLC/DAD, GC/MS
Kanabinové indoly
- LC/MS/MS, GC/MS, NMR
MORFINOVÉ ALKALOIDY
Heroin
- CE-MS (ESI), UHPLC-MS/MS (profilování)
Morfin, Thebain (v makovicích)
- FT-IR-ATR
Opiové alkaloidy
- Cyclodextrin modified CE po extrakci v ultrazvuku
- LC/ESI-MS/MS, SPE-LC/2D-IT-MS, SPE-UPLC/MS/MS
- (l)-(l) extrakce - GC/MS, CE/FluD, SPE-HILIC/MS/MS
- (l)-(l) extrakce - CSEI-sweep-MEKC (cation-selektive exhaustive injection
and sweeping micellar electrokinetic chromatography)
- LC/MS/MS (také v mozku post-mortem)
- ve vlasech - mikrovlnná extrakce - HPLC/DAD
Morfin a jeho metabolity ve vlasech
- SPE-GC/MS, SPME-GC/MS
KOKAIN
Analýza metabolitů kokainu
- potvrzení užívání orální, intravenozní, intranasální nebo inhalační cestou
Na oblečení
- Ramanova spektroskopie, rentgenová krystalografie
- IMIS (ion mobility increment spectrometry)
- API-MS
V biologických vzorcích
- LC/Fluorimetric Det. (zaschlé krevní stopy)
- MEPS/DART/TOF-MS (microextraction oby packed sorbent/direct analysis
in real-time/TOF-MS)
- SPE-IMS, CE/ESI-MS, SPE-LC/MS/MS
- GC/MS (V krvi a novorozeneckém mekonimu)
- MALDI, LC/MS/MS, ELISA, LC/MS/MS (ve vlasech)
AMFETAMIN A JEHO METABOLITY
Tělní tekutiny
- GC/IR, GC/MS, GC/SAL-DI-MS, GC/IT-MS, chirální GC/MS, SPE-GC/MS
- SPE-LC/MS/MS, LC/MS/MS
- SPME/IMS, 1H NMR, microELISA (na čipu)
- Mikrovlná derivatizace + GC/MS, LC/MS/MS
Lak na nehty
- GC/MS
BENZODIAZEPINY
Diazepam
- SPE v kombinaci s GC/MS, LC/MS/MS, LC/APPI-MS, HPLC/DAD
- (l)-(l) extrakce/UPLC/MS/MS, Imunoassay/LC/MS/MS
Lorazepam
- LC/MS/MS
Ketamin v nápojích
- kapilární GC/MS
γ-HYDROXYMÁSELNÁ KYSELINA
• Lék na narkolepsii
Tělní tekutiny
- DART/TOF-MS
- GC/MS (s/bez derivatizace), GC/PCI-MS
- LC/APCI-MS/MS
Butyrolacton
- GC/C/IR-MS (GC/combustion/isotope ratio mass spectrometry)
ALKOHOL
Krev
• Plynová chromatografie
• Widmarkova metoda
Moč, sliny
• Reagenční proužky
Dech
• Detekční trubičky
• Analyzátory s polovodičovými, infračervenými, elektrochemickými senzory
Widmarkova metoda
- oddestilování etanolu obsaženého v krvi → oxidaci známým nadbytkem
dichromanu draselného v kyselině sírové → jodometrická titrace nadbytku
dichromanu
- Nevýhodou její nespecifičnost (stejně se chová např. aceton, acetaldehyd,
éter, benzin, …)
ETHYLEN GLUKURONID (EtG)
•
•
•
•
Metabolit ethanolu
přetrvává v moči po stavu opilosti až po dobu pěti dnů
Testování moči na alkohol je vlastně velmi jednoduché
Výsledky se těžko falšují (nadměrné množství vody vede k podezření z
falšování)
• Pozitivní výsledek znamená to, že osoba požila alkohol v posledních 4 až 5
dnech
• Koncentrace EtG v moči neodpovídá přímo koncentraci alkoholu v krvi
Metody analýzy
• Tělní tekutiny – LC/MS, LC/MS/MS, UHPLC/MS
• Vlasy – GC/MS, HS-SPME/GC/MS/MS, GC/NCI-MS/MS, HILIC/MS/MS
TĚKAVÉ LÁTKY
„Čichači“
• Toluen v krvi – SPME-GC/MS, GC/FID
• Acetylen v krvi a moči – HS-GC/MS
• Azidy v krvi a plazmě – GC/NPD
HOŘLAVINY A VÝBUŠNINY
Předvýbuchová analýza
• detekci a identifikaci explozivních látek a jejich složek
Povýbuchová analýzá
• detekci a identifikaci povýbuchového odpadu nebo zbytků samotných
výbušnin po detonaci
Pyrotechnická slož (druh výbušniny)
- Základní složky - hořlaviny (cukr, plast, pryskyřice,…), oxidovadla
(chlorečnany, chloristany,…) , pojidla
- při explozi dochází k rychlému hoření doprovázeného různými světelnými
a zvukovými efekty.
Metody stanovení
- IMS
- SPME – GC - na akcelerátory hoření
- kapilární elektroforéza
HOŘLAVINY A VÝBUŠNINY
Akceleranty hoření
- Extrakce z popela
- Plynová chromatografie
SPE
SPME
IONTOVÁ MOBILNÍ SPEKTROMETRIE
(IMS)
Princip
- rozdílná mobilita jednotlivých molekulových fragmentů vzniklých ionizací
- základní konstrukční schéma: ionizátor, analyzátor a detektor
- vzorky analyzovány v plynném stadiu
IONTOVÁ MOBILNÍ SPEKTROMETRIE
(IMS)
Ionizátor:
- Ionizace nasávaného vzduchu radioaktivním β-zářičem (63Ni)
Analyzátor:
- separaci iontů podle jejich pohyblivosti při průletu analyzátorem
- ionty ovlivňovány elektrickým polem (gradientové, konstantní) a proudem
inertního plynu (proti směru letu iontů)
- letící nabité částice o menší hmotnosti a zakřivenější dráhou letu dopadají
na detektor dříve než těžší částice, zpomalené především odporem
inertního plynu
Detektor:
- při dopadu iontů dochází k jejich neutralizaci → vznik elektrického impulzu
→ zobrazí se jako pík ve specifickém průletovém čase → celkové spektrum
látky
Nevýhodou IMS je, že lze detekovat pouze jeden typ iontů (+/-).
ANALÝZA AUTOMOBILOVÝCH LAKŮ
• trestný čin typu „hit and run“
Automobilové laky
- syntetické akrylátové barvy (makromolekulární látky), jejichž stavební
jednotkou je ester kyseliny akrylové
- součástí laku je barva (barevný pigment), ředidlo, tužidlo
Metody stanovení
- identifikaci chemického složení - pyrolytická GC-MS (pyrolytické rozložení
vzorku, 750 °C, 10 min → GC/MS)
- určení odstínu a identifikace barvy z databáze (mikrospektrofotometrie)
KONTAKTY
Ing. Veronika Škeříková, Ph.D.
č. d. 223, budova A
e-mail: [email protected]
Ing. Oldřich Vyhnálek, Ph.D.
č. d. 146, budova A
e-mail: [email protected]