Mikrosvět

Mikrosvět
Úvod
Mikroskopie je metod kterej dovoluje sledovat malé
objekty a detaile jejích povrchů.
Mikroskopie
Optická
Elektronová
Skenující sondou
Optická mikroskopie
zorný úhel
zvětšení zorného uhlu
osvětlení
interakce světa s povrchem
vzorku
Zorný úhel
Lidské oko nemůže vidět předměty nebo detail předmětu, jestliže
je zorný úhel menší než 1'
tgτ 
y
d
 - zorný úhel
y - velikost předmětu
d - vzdálenost předmětu
d
Význam zvětšení zorného úhlu :
oko rozezná na předmětu více podrobností
předmět se jeví více osvětlen, než při přímém pozorování
Zařízení pro zvětšení zorného uhlu
Zorný úhel je možné opticky zvětšit pomoci lupy (do 10x)
Úhlové zvětšení ():
 ´ tg ´ y y d
 
 : 
 tg a d a
d – konvenční zraková vzdálenost
(25 cm)
a – předmětová vzdálenost
Lupa je spojná čočka s malou
ohniskovou vzdáleností
Zařízení pro zvětšení zorného uhlu
dosáhl zvětšení až 270x
Právě lupa byla zakladem prvního
jednoduchého
a
jednočočkového
mikroskopů Antonina van Leeuwenhoeka
(rok 1676).
http://www.quido.cz/objevy/mikroskop.htm
Anton van Leeuwenhoek
(1632-1723)
Zařízení pro zvětšení zorného uhlu
První mikroskop pro vědecká pozorovaní
sestavil anglický fyzik a chemik Robert Hooke.
V roce 1765 zdokonalil osvětlení, vynalezl
irisovou clonu a mikroskop složil z více čoček.
Robert Hooke
(1635-1703)
Zařízení pro zvětšení zorného uhlu
Carl Zeiss
(1816-1888)
Carl Zeiss byl mechanik a podnikatel.
V roce 1846 v Jeně založil dílnu pro
jemnou mechaniku. Spolupráce s E. K.
Abbem (německým fyzikem, který se
zabýval zejména teorií optických
přístrojů) přivedla k sériové výrobě
mikroskopů.
Zařízení pro zvětšení zorného uhlu
Základem optické soustavy mikroskopu jsou dvě spojné
čočky, které se liší ohniskovou vzdáleností.
Princip zobrazování:
• Pozorovaný předmět se umístí před ohniskovou
rovinou objektivu
• Objektivem se vytvoří převracený, zvětšený a
skutečný obraz objektu
• Tento obraz se pozoruje okulárem (lupou)
• Okulár pak zobrazuje předmět v nekonečnu
Úhlové zvetšení mikroskopu:
 d

f1 f 2

d
f1
f2
optický interval mikroskopu
konvenční zraková vzdálenost
ohnisková vzdálenost objektivu
ohnisková vzdálenost okuláru
Optická mikroskopie: mikroskopické techniky
(světelná mikroskopie)
Mikroskopie světlého a tmavého pole (brightfield and darkfield microscopy)
Mikroskopie odráženého světla
(reflected light microscopy) Chycený
hmyz na listu Droserý 30x
Fluorescenční mikroskopie
(fluorescence microscopy) Buňky
ledvin křečka 1500x
Živí vodní roztoč
(brightfield microscopy)
List Drosera sp
(darkfield microscopy) 14x
Konfokální mikroskopie
(confocal microscopy)
Každý mikroskop má určité maximální zvětšení, které je pro něj charakteristické.
Nejlepší optické mikroskopy dosahují maximálního úhlového zvětšení γ~2000.
Elektronová mikroskopie
Elektronové mikroskopy pracují s proudem
elektronů ve vakuu
– Proud elektronů - záření velmi malé vlnové
délky.
Elektronové mikroskopy se dělí na dva
druhy:
 Transmisní elektronový mikroskop
(TEM – Transmission Electron Microscope)
 Rastrovací elektronový mikroskop
(SEM – Scanning Electron Microscope)
Transmisní elektronový mikroskop
Viditelný obraz se vytváří na fluorescenčním stínítku svazkem
elektronů, prošlým studovaným vzorkem.
Zdrojem proudu elektronů je kovová
katoda
Kondenzátor, soustřeďuje elektrony na
pozorovaný předmět (preparát).
Vrstva preparátu musí být velmi tenká (~1
µm) aby nepohlcovala elektrony.
Proud elektronů pak prochází další
elektronovou čočkou (objektivem) a
vytvoří první elektronový obraz.
Část tohoto obrazu se elektronovou
čočkou (projektivem) znovu zvětší.
Výsledný obraz se promítá na stínítko
nebo na fotografické desce či filmu.
Součásti elektronového mikroskopu jsou uloženy ve vakuu
Rastrovací elektronový mikroskop
Rastrovací elektronový mikroskop pracuje tak, že na preparát směrován tenký
svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna místa vzorku. Odražený
(emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz.
Napětí na katodě 1–5 kV.
Mechanická clona vybírá pouze
elektronů, které dopadnou na preparát.
část
Projekční čočka způsobí, aby zaostřený
svazek elektronů dopadl na preparát.
Preparát může být 2–3 cm tlustý a 15 cm
dlouhý a musí být kvalitně pokoven.
Zaostřený svazek elektronů musí po povrchu
preparátu rastrovat synchronně s kamerou
Příklady aplikace TEM a SEM
LiFePO4/C komposit syntetizovaný 30 hodin při 700°C
TEM obrázek
SEM obrázek
Mi C.H. et al./ J. Alloys Comp. 424 (2006) 327.
Příklady aplikace TEM a SEM
Si-Ni-C komposit (Si:Ni:C= 4:1:5)
HR-TEM obrázek
SEM obrázek
M.-S. Park et al./ Materials Chem. Phys. 100 (2006) 496.
Příklady aplikace TEM a SEM
Nanosféry koloidu zlata stabilizované COOH skupinami
poly(DVB-co-AA)
SEM obrázek
TEM obrázky
W. Liu et al./ J. Colloid Interface Sci. 304 (2006) 160.
Příklady aplikace SEM
Vlas napadený kožní plísní-dermatofitem
Pokoveno zlatem (M. Hejtmánek, V. Horn)
Buňka
(adiospora)
mikroskopické
patogenní houby (M. Hejtmánek, V. Horn)
http://biologie.upol.cz/mikroskopie/rastrovaci.htm
Elektronová mikroskopie:
výhody a nevýhody
• Výhody TEM a SEM:
– velmi velké zvětšení řádově až 1 000 000x, umožňuje pozorovat nanočástice
– velké rozlišení (0,1 nm)
– velká hloubka ostrosti (několik mm)
– poskytuje informaci nejen o topografii, ale i o materiálovém složení vzorku
• Nevýhody TEM a SEM:
– velké nároky na prostor
– vysoká pořizovací cena
• Nevýhody TEM:
– velmi tenký vzorek (~1 µm)
– preparát musí být umístěn ve vakuu, což neumožňuje pozorovat živé
organismy
Mikroskopie skenující sondou
(SPM - Scanning Probe Microscopy)
Mikroskopie skenující (rastrující) sondou je soubor
experimentálních metod určených ke stanovování
struktury povrchu se subatomárním rozlišením
ve směru kolmém k povrchu, a možností stanovení 3D
obrazu povrchu.
Mikroskopie skenující sondou
(SPM - Scanning Probe Microscopy)
Experimentální počátek metod SPM je datovan už od roku 1972
Russell Young, Fredric Scire and John
Ward s topografinerem.
Mapování povrchu ze vzdálenosti 100 nm
Rizlišení:
vertikální 3 nm
laterálně 400 nm
R. Young, J. Ward, and F. Scire, Rev. Sci. Instrum. 43, 999 (1972)
Mikroskopie skenující sondou
(SPM - Scanning Probe Microscopy)
Princip metod SPM: obraz povrchu je získáván pomocí mechanického
pohybu sondy, skenovaní a zaznamenávání interakce sonda-povrch jako funkce
polohy sondy.
R. Kubínek, M. Vůjtek, M. Mašlaň: Mikroskopie skenující sondou, ISBN 80-244-0602-0, vydatelství Univerzity Palackého v Olomouci, 2003
Vzájemné interakce
Míra, s jakou se hrot a vzorek vzájemně ovlivňují, záleží na jejích
vzájemné vzdálenosti d
d > 10 nm
zanedbatelný vliv
1 < d < 10 nm uplatňují se velmi slabé van der Waalsovy síly.
Při nízkých napětích (do 5V), nedochází k
tunelování.
0.3 < d < 1 nm výměna procházejících elektronů vede ke
vzniku přitažlivých sil (počátek chemické
vazby), pod napětím dochází k tunelování –
pracovní režim STM
d < 0.3
převládá odpudivá interakce, která plyne z
Pauliho principu.
Mikroskopie skenující sondou
vlastnosti (Výhody)
 velký rozsah zvětšení (rozlišení je nezávislé na vlnové délce objektu, ale pouze
na parametrech sondy)
 až atomární rozlišení
 zobrazení v prostoru a 3D obraz v reálném čase
 aplikace v různých prostředích (vzduch, vakuum, voda, elektrolyty) – vhodné
pro zobrazování nativních biologických vzorků
 obvykle není třeba speciálních úprav vzorku (fixace, odvodnění, vysoušení,
nanesení vodivé vrstvy - není zapotřebí žádného externího zdroje částic)
 metoda registruje zvlnění určité fyzikální vlastnosti, např. plochy konstantní
hustoty náboje
 interakce hrotu se vzorkem může být použita ke změně povrchu a vzniku
nových struktur (nanolitografie)
 vzhledem k malé velikosti SPM sondy ji lze vestavět do zařízení pro jiné typy
mikroskopických technik (světelný a elektronový mikroskop)
Mikroskopie skenující sondou
vlastnosti (Nevýhody)
 je citlivá pouze na pár povrchových vrstev (často na jednu)
 při malých zvětšeních lze zkoumat jen místo těsně pod hrotem
 je omezena lokálně a neobsahuje obraz informaci o zbytku povrchu
 obtížnost opětovného zobrazení stejného místa na vzorku (obejít lze jen
vyrytím orientační značky do vzorku).
 citlivost k vibracím a teplotním driftům
 velké množství artefaktů (falešných obrazů)
 vliv adsorbované vody na povrchu vzorku
 hodnota měřené veličiny prudce klesá se vzdáleností od povrchu (je to metoda
v blízkém poli, využívající zpětné vazby k poloze sondy)
 není obecně citlivá na chemickou podstatu atomů, určit typ atomu lze jen
z doplňujících metod a úvah
 neexistuje jednoduchá inverzní transformace, tj. z naměřených hodnot není
zpravidla možno přímo určit strukturu, lze jen porovnat s očekávanými
hodnotami z modelu
Mikroskopie skenující sondou
Jednotlivé metody
• Skenovací tunelová mikroskopie (STM) – scanning tunneling
microscope
• Mikroskopie atomární síly (AFM) - atomic force microscopy
• Mikroskopie magnetických sil (MFM) – magnetic force
microscopy
• Mikroskopie elektrostatické síly (EFM) - electrostatic force
microscopy
• Skenovací teploměrná mikroskopie (SThM) - scanning
thermal microscopy
• (Protonová) skenovací tunelová mikroskopie ((P)STM) (proton) scanning tunnelling microscopy
• ……………
Skenující tunelová mikroskopie
(STM)
• Metoda STM byla vyvinuta v laboratořích
IBM pracovníky G. Binnigem a H. Rohrerem
roku 1981, kterým za jejich objev byla v roce
1986 udělena Nobelova cena.
Gerd Binnig
• Je to jedna z mála metod, která je schopna
poskytnout až atomární rozlišení
• Výhody:
– nevyžaduje náročnou přípravu vzorku, ale poskytuje
jen informace o povrchu.
• Nevýhody:
Heinrich Rohrer
– neposkytuje okamžitý a vizuální obraz, snímání je
postupné
Skenující tunelová mikroskopie
uspořádání STM zařízení
Základem STM je kovový hrot umístěný v blízkosti vodivého povrchu vzorku.
Přiložené napětí mezí hrotem a povrchem vede ke vzniku tunelového proudu, který
poskytuje informace o povrchové struktuře vzorku. (Tunelový proud vzniká jen v
případě že hrot i vzorek jsou z vodivého materiálu, případně polovodiče)
Každý mikroskop SPM
skládá z dvou součásti:
• mechanická část
se
– stolek k upevnění vzorku
– polohovací zařízení, které
umožňuje pohyb ve třech
rozměrech
– sondy (hrot, nosník)
• elektrická část
– napájení
– zpětné vazby
– sběr signálu
– ovládání pohybu.
http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_tunneling_microscopy
Tunelový jev
Na rozdíl od isolovaných atomů,
elektrony
v
makroskopickém
vzorku
kovu
nemají
dobře
rozlišitelné energetické hladiny a
postupně naplňuji energetickou
jámu.
Nejvyšší energetická hladina, která
je obsazena elektrony, odpovídá
hladině Fermiho energie (EF).
Lokální hustota stavu (ρ) s energií
E je poměr počtu elektronů v okolí
tohoto stavu NE ke změně energie
ΔE:
http:hoffman.physics.harvard.edu
NE

E
Tunelový jev
Mezí hrotem a povrchem vzorku ve
vakuu existuje energetická bariera.
Výška této bariery je označovaná
jako Ф.
Podle klasické fyziky elektron
nemůže proniknout přes potenciální
bariéru je-li jeho energie menší než
potenciální energie bariéry.
Kvantová mechanika umožňuje
elektronu
projít
barierou
(„tunelem“), což vede ke vzniku
tunelového proudu.
Podmínkou tunelového efektu je
rozdíl hodnot EF vzorku a hrotu,
čehož lze dosáhnout pomocí
vloženého napětí.
Skenující tunelová mikroskopie
Režimy měření
 režim s konstantní výškou
– udržuje se jednou nastavená hodnota z0, měří se velikost tunelového
proudu I
– umožňuje rychlé snímání obrazu, protože není nutno pohybovat
vzorkem
– je méně přesný, neboť při velkých vzdálenostech hrotu od povrchu se
proud dostává pod dobře měřitelnou úroveň
 režim s konstantním proudem
–
–
–
–
pomocí zpětné vazby se udržuje konstantní úroveň proudu I
měří se napětí U přikládané k piezokeramickým pohybovým prvkům
je pomalejší, umožňuje však sledovat větší změny profilu povrchu
je závislý na převodním vztahu přiloženého napětí a změně rozměru
piezoprvku, což lze odstranit vnějším měřičem polohy, např. laserovým.
– je možné poškození povrchu, přejde-li hrot nad oblast s výrazně
odlišnými elektrickými vlastnostmi (např. zoxidovaná místa), aby byl
udržen nastavený proud, dojde k velkému snížení hrotu.
 režim s nákresem bariérové výšky
– měří se bariérová výška φ na základě změny vzdáleností mezí hrotem
a vzorkem při modulaci proudu pomocí zpětnovazební smyčky
– umožňuje měření heterogenních povrchů
http://www.fkp.uni-erlangen.de/methoden/stmtutor/stmpage.html
Skenující tunelová mikroskopie
Umístění vzorku a skenování
• Hrubý mechanický posuv vzorku směrem
ke hrotu (z)
• Přiložení napětí mezi hrotem a vzorkem,
aby mohl procházet proud
– je zapotřebí vodivý vzorek
• Jemným posuvem pomocí piezokeramiky
přiblíží vzorek ke hrotu tak, aby
procházející proud nabyl měřitelných
hodnot
• Získání obrazu (skenování) skokovým
posuvem ve dvou rozměrech (x, y)
po příslušné matici měřicích bodů
– zpravidla se pohybuje po řádcích a
v jednom směru
– Výstupem měření je matice prvků aij,
jejíž indexy označují polohu bodu a
příslušná hodnota je velikost měřeného
signálu.
Skenující tunelová mikroskopie
Jak vzniká obraz
 Hrot skenuje povrch vzorku ve
vzdálenosti rovné průměru
atomu. Při každé poloze hrotu
se měří tunelující proud I mezi
hrotem a povrchem.
 Měřené hodnoty I se sbírají,
vyhodnocují a zobrazují na
obrazovce v škále šedi.
 Barevná paleta může být
použita
pro
znázornění
prostorové deformace povrchu.
 Černě, škálou šedi nebo
barevně se dá zobrazit výška
nebo zakřivení povrchu.
Příklady aplikace STM
studium Pt vrstvy (Pt/C film)
Simulovaná a změřená STM topografie Pt/C filmu
F.Keilmann et al./ Phys. stat. sol. B 215, 849.
Příklady aplikace STM
studium nanotrubiček uhlíkové saze
HR-TEM obrázek nanotrubic
STM obrázky a čáry skenování povrchu
jednotlivých a slepených nanotrubic
W. Rivera et al./ J. Vac. Sci. Thechnol. B 13 (1995) 327.
Příklady aplikace STM
studium izolovaného acetylenu (C2H2)
STM obrázek (25×25A°)
C2H2 na povrchu Cu(100) s
maximální hloubkou 0.23A°.
Obrázek byl skenován při
napětí 100 mV a tunelovém
toku 10 nA.
B. C. Stipe et al./Science 280 (1998) 1782
Příklady aplikace STM
studium Ni(II) oktaethylporpyrinu.
Příklady aplikace STM
studium adsorpce porfyrinu na povrchu Cu a samo-uspořádaní
molekul adeninu na porfyrin/Cu povrchu
Mikroskopie atomární síly
AFM
• Mikroskopie AFM je založena
na
mapování
rozložení
atomární sily na povrchu
vzorku
• AFM byla navržena G.
Biningem, Quatem a Gerberem
v roce 1986
• Je to metoda, která poskytuje
atomární rozlišení a zvětšení až
5 000 000×
• AFM je široce používaná pro
zobrazení,
měření
a
manipulace v nanoměřítku
C. Hall et al./ Materials Science of Concrete VI
Mikroskopie atomární síly
uspořádání AFM zařízení
Detektor ohnutí je tvořen laserovou
diodou, vytvářecí stopu konečné
velikosti na špičce nosníku a od něj se
odráží na světelný detektor, který je
rozdělen na dvě citlivé části (duanty)
– před
měřením
se
systém
mechanicky vyváží tak, aby
energie svazku dopadající do obou
duantu byla stejná
– při měření se ohyb projeví
posunem odrazu, takže signály
v jednotlivých duantech už
nebudou stejné a z jejich poměrů
je možno určit vychýlení nosníku
V současné době využívá kvadrantní
detektor, který je rozdělen na čtyři
části a umožňuje detekovat pohyb
skvrny v dalším kolmém směru
Mikroskopie atomární síly
Příroda atomárních sil
• Síly ohýbající nosník mohou být
různé fyzikální podstaty, především
se však uplatňuje:
– přitažlivá van der Waalsova síla
mezi dvěma atomy - působí
na větší vzdálenosti
– odpudivá síla plynoucí z Pauliho
principu - působí na menší
vzdálenosti
• Celková síla může být jak odpudivá,
tak i přitažlivá v závislosti
na vzdálenosti hrotu.
Mikroskopie atomární síly
Režimy měření
• dotykový - vzdálenost hrotu a
povrchu tak malá, že výsledná síla je
odpudivá a snaží se ohýbat nosník
od povrchu
–
s konstantní výškou, kdy se
udržuje určená hodnota výšky z0 a
měří se ohnutí nosníku;
–
s konstantní silou, kdy se udržuje
konstantní ohnutí nosníku a
posunuje se vzorkem (či hrotem)
ve směru osy z.
• bezdotykový - vzdálenost mezi
hrotem a vzorkem udržována v strmé
části vzestupné závislosti van der
Waalsových sil
• poklepový - rozkmit je tak velký, že
dochází k dotyku hrotu s povrchem
Mikroskopie atomární sily
Výhody
• poskytuje 2D projekce (obraz) vzorku a 3D profil jeho povrchu
• nevyžaduje speciálních úprav vzorku
• obvykle nevyžaduje práce ve vakuu, což umožňuje analýzu
biologických objektů včetně živých buněk
Nevýhody
• relativně malá velikost obrazu (velikost skenovací plochy 150× 150
μm, max. výška 2 – 3 μm)
• kvalita obrazu je omezená zakřivením hrotu, což může vést k
projevení artefaktů
• pomalé skenování může vést k teplotním efektům – urychlení
pomoci video AFM
• hysterezi piezoelektrického materiálu ovlivňuje AFM obraz –
využití ortogonálních skenerů
Příklady aplikace AFM
studium nanostruktur uhlí
TEM a
HR-TEM obrázky
AFM obrázek
Q. Li et al./Ultrasonics
Sonochemistry 14 (2007) 225
Příklady aplikace AFM
studium povrchu bakterii Deinoccocus radiodurans
D.J Müller et al/ 178 (1996) Journal of Bacteriology, 3025.
Příklady aplikace AFM
Agregace polymerních řetězců
Jednotliví polymerní řetězce
(0,4 nm) – modré
Dvou řetězcové shluky
tloušťkou 0,8 nm – zelené
s
Agregáte polymerních řetězců
s tlouštkou vice než 2 nm.
Roiter and Minko, 2005
Příklady aplikace AFM
studium porfyrinových derivátů
Příklady aplikace AFM
studium porfyrin-elektrodových filmů
B.Duong et al./Journal of Electroanalytical Chemistry 447 (1998) 63-69.
Skenující tunelová mikroskopie
Cantilevery (hroty) – běžné
Modifikace povrchu
Příklady aplikace různých metod
studium uhlíkových nanotrubiček
HR-TEM obrázek
STM obrázek
• Histogram počtu jednotlivých
nanotrubiček podle poloměru
• Ramanova spektra jednostěnné uhlíkové
nanotrubičky měřené při různých lex
E. D. Obraztsova et al./ NanoStructured Materials 11 (1999) 295
Ramanova spektroskopie
v poznání mikrosvěta
Ramanův jev
Čandrašékhar
Venkatau Raman
Kariamanickam
Srinivasa Krishnan
 Neelastický rozptyl světla, nebo
Ramanův jev, dostal svoje jméno
podle jednoho z objevitelů tohoto jevu,
indického vědce sira C. V. Ramana
(1928, spolu s K. S. Krishnanem a
nezávislé Grigoryem Landsbergem a
Leonidem Mandelstamem). Za tento
objev získal sir C. V. Raman
Nobelovou cenu z fyziky v 1930 roce.
 První Ramanův přistroj využíval
sluneční světlo jako zdroj fotonu,
barevné filtry jako monochromátor a
lidské oko jako detektor.
Grigoryj
Landsberg
Leonid
Mandelstam
 Tato technika se stala široce
používanou po vynálezu laseru.
Ramanův jev
Podstata Ramanova jevu - rozptyl záření
- rozptýlený foton má odlišnou energii oproti dopadajícímu
hνR+
hν0
hν0
hνR
-
Ramanův jev
1
2
3
1
hν0
hν0
výchozí stav koncový
stav
Rayleighův rozptyl
2
hν0
hνR
hνS
výchozí stav koncový stav
Stokesův
Ramanův rozptyl
3
hν0
hνR+
hνS
výchozí stav koncový stav
anti-Stokesův
Ramanův rozptyl
Vztah intenzity pásů
- Možnost měření teploty vzorku
Ramanův jev
rezonanční Ramanův rozptyl
hν0
hνR-
hνS
výchozí stav koncový stav
- excitace molekuly ve viditelné oblastí (nežádoucí fluorescence)
- volba excitace vhodnou vlnovou délkou
Princip
Ramanove spektroskopii
laser
molekula
vzorku
(do ozáření)
získávaní spekter
 vzorek je excitován monochromatickým
zářením v UV, vis nebo NIR oblastí
vibrující
molekula
(po ozáření)
elastický Rayleighův rozptyl
neelastický Ramanův rozptyl
filtr
spektrum
holografická
difrakční
mřížka
detektor
 filtr odděluje intensivní Rayleighův
rozptyl, který je v 108 krát větší než
Ramanův rozptyl
 detekce signálu:
 photon-counting photomultiplier tube
(PMT)
 silicon charge-coupled device (CCD)
kamera
IČ a Ramanova spektroskopie
srovnání vlastností
Fyzikální děj
Detekce
Intenzivní pásy
Úprava vzorku
Komplikace
Vzorky
Rozlišení
- laterální
- konfokální
IČ spektroskopie
Ramanova spektroskopie
absorbance, reflektance
změna dipolového momentu
OH, NH
optimální tloušťka (transmisní)
kontakt povrchu (ATR)
absorbance skla, vody, CO2
hlavně organické látky
rozptyl
změna polarizovatelnosti
C=C, CS, SS
minimální
10 - 20 µm
žádné
Chemický obraz mapování
Rozsah měření 4000 - 700 cm-1 (MIR)
fluorescence
obvykle bez omezení
1 - 2 µm
ca. 2.5 µm
mapování a globální obraz
4000 - 50 cm-1
(Stokes a anti-Stokes)
IČ a Ramanův spektra
polyamidu (Nylon 66)
Q - normální souřadnice
Pro výskyt pásů v Ramanově spektru je nutná nenulová změna polarizovatelnosti dané vazby
(α/  Q)
Symetrické molekuly mnohem aktivnější v Ramanově spektru než asymetrické
Konfokální Ramanova
mikrospektroskopie
• Rozptýlené světlo je sbíráno jen z tenké
vrstvy O (konfokální oblasti)
• Světlo rozptýlené z vrstev nad (A) a pod
(B) vrstvou O je fokusované mimo štěrbinu
a nedostane se na detektor
štěrbina
objektiv
Konfokální Ramanova spektroskopie
• Lineární skenování Ramanových spekter
• Mapovaní 2D obrazu podle vybraného vlnočtu
N. M. Sijtsema et al./Applied Spectroscopy 52 (1998) 348
Ramanův spektrometr přímého obrazu
zvolení vlnočtu pro mapovaní
Konfokální Ramanova spektroskopie
studium filmu modifikované celulosy
Série Ramanovych spekter měřených v různých hloubkách
filmu (lex = 633 nm, 100× objektiv)
F. J. Weesner et al./Application Note 50832
Konfokální Ramanova spektroskopie
Výhody
 Možnost měření Ramanových spekter mikroskopických vzorků a struktur
 Vzorky mikroskopických řezů se analyzují přímo, ve vzduchu, v rozsáhlém
teplotním a tlakovém rozmezí, vlhké a suché, a bez destrukce vzorku
 Spektroskopická informace je komplementární FT-IR mikroskopu
 Vysoká prostorová rozlišitelnost (1 mm) s konfokálním zařízením pro
zkoumaní hloubky (2 mm)
 Možnost měření Ramanových spekter poskytuje informace o každé poloze na
povrchu vzorku
 Integrální barevný video display a možnost přímého prohlížení pozice laseru
 Mapování povrchu vzorku
 Autofokusace na nehladkém povrchu poskytuje maximální signál a
identifikuje vliv povrchového profilu
Aplikace Ramanovy mikrospektroskopie
studium lokalizace texafyrinu v nádorové tkáni
Mikroskopický
obraz
2D mapa
Ramanova
spektra
3D mapa
Aplikace Ramanovy mikrospektroskopie
studium lokalizace kurkuminu v kořenech Curcuma longa
M. Baranska et al., Analyst 129
(2004) 926 - 930
Aplikace Ramanovy mikrospektroskopie
c
b
a
PCA of Raman spectra of normal, malignant, and benign
breast tissues.a) Normal; b) Malignant; c)Benign.
M. V. P. Chowdary at al. Biopolymers, Vol. 83, 556–569 (2006)
Mean Raman spectra of breast tissues: (a) normal; (b)
malignant; (c) benign.
Otázky
1.
Popište princip zvětšení obrazu v optické mikroskopii.
2.
Charakterizujte transmisní (TEM) a rastrovací (SEM) elektronovou
mikroskopii.
3.
Charakterizujte mikroskopii skenující sondou (SPM) a uveďte její výhody
a nevýhody.
4.
Charakterizujte skenující tunelovou mikroskopii (STM): tunelový jev,
režimy měření a využití.
5.
Charakterizujte mikroskopii atomární síly (AFM): původ atomárních sil,
uspořádání AFM zařízení, režimy měření a využití.
6.
Vysvětlete vznik Ramanova spektra, vysvětlete rozdíl mezi Stokesovými a
anti-Stokesovými liniemi v Ramanově spektru.
7.
Vysvětlete rozdíl mezi normálním a rezonančním Ramanovým rozptylem.
8.
Charakterizujte konfokální Ramanovu mikroskopii: uspořádaní
konfokálního spektrometru, způsob vytváření obrazu a využití