Stanovení nízkomolekulárních látek

Stanovení nízkomolekulárních látek
„ Klasické
„
metody – „chemicky“
Levné, jednoduché
„ Enzymové
metody
Specifita,
Specifita, selektivita
„ Vysoká reakční rychlost (37 oC)
oC)
„ Mírné reakční podmínky T, pH
„
⇒ automatické
automatické analyzá
analyzátory
Využití enzymů jako analytických činidel
E
S
P
P’
„
EndEnd-point (reakce musí být rychlá a citlivá)
„
Kineticky (většinou metoda konstantního času)
Rovnice MichaelisMichaelis-Mentenové:
Mentenové:
V
V . [S]
v=
Km + [S]
[S]<<Km v =
vo
V/2
V . [S]
= konst.[S]
Km
[S]
Možnost sledov
ání enzymové aktivity
sledování
„
Substrát či produkt dokážeme specificky detegovat přímo
Pokud ne, následuje druhá.. (obvykle opět enzymová)
detekční (indikátorová) reakce
„ Nejčastější indikátorové reakce
H2O2 – vzniká při reakcích oxidas (využívají k oxidaci O2)
Substrát + O2
XO
H2O2 + chromogen
Produkt + H2O2
POD
barevný produkt
V klinické diagnostice nejčastěji 44-aminoantipyrin +
subst.
subst. fenol ⇒ CHINONIMIN (červený, 555 nm)
nm)
1
Možnost sledov
ání enzymové aktivity
sledování
„
Nejčastější indikátorové reakce
Warburgův optický test 340 nm
NADH, NADPH
O
C
+
N
O
NH
NH
O
2
CH
O
2
O
P
O
OH
N
O
-
O
P
O
-
OH
CH
2
N
O
2
N
N
OH
OH
O
H
C
-2
+
N
NH
+
[H
substrátred + NAD+
2
]
2
[H
oxidoreduktasa
(dehydrogenasa)
]
O
H H
C
NH
+ H
2
+
N
produktox + NADH + H+
Stanovení glukosy
CH2OH
O
OH
Chemické metody
redukční vlastnosti monosacharidů
1.
2.
OH
OH
OH
o-toluidinová metoda
CH3
CH3
H2O
H
O
C
H C OH
NH2
N CH
H C OH
modrá (625-630 nm)
Stanovení glukosy
CH2OH
O
OH
Enzymové metody
OH
3.
glc
hexokinasa
ATP
4.
OH
OH
hexokinasová
glc-6-P
ADP
G6PD
+
NAD(P)
6-P-glukonolakton
NAD(P)H
+
H
glukosadehydrogenasová
GD
glc
NAD
+
glukonolakton
+
NADH H
2
Stanovení glukosy
CH2OH
O
OH
OH
OH
OH
glukosaoxidasová
5.
GOD
glc +
O2
glukonolakton
kys. glukonová
H2O2
amperometrie
amperometrie
POD
chinonimin
červený (555 nm)
4-aminoantipyrin + subst. fenol
Stanovení kyseliny močové
Chemická metoda
Oxidace kys.
1.
kys.fosfowolframovou Æ fosfowolframová
fosfowolframová modř
modř
(720 nm)
nm)
Enzymová metoda
Urá
2.
Urátoxidasa (urikasa)
urikasa)
OH
N
HO
N
N
N
H
O2
H2O
O
NH2
UO
HO
OH
N
NH
N
H
CO2
H2O2
OH
alantoin
kys. močová
A 293
Stanovení močoviny (BUN)
Chemické metody
Reakce s diketony a jejich oximy
1.
bisacetylmonoxim
O NOH
H3C C C CH3
O
H2N C NH2
H2O
+
H
O O
H3C C C CH3
O O
H3C C C CH3
HNO3
+
H
H3C C C CH3
2 H2O
N N
C
diazin (žlutý)
O
Dobře automatizovatelná,
automatizovatelná, ale fotosenzitibilní,
fotosenzitibilní, nestálá barva
3
Stanovení močoviny (BUN)
Enzymové metody
ureasa
2.
urea
ureasa
CO2
2 NH4
+
a) Berthelot
NH4
+
-
-
2
ClO
OH
OH
-
N
O
nitroprusid
O
indofenol (modrý)
b) GD
NH4
+
glutamátdehydrogenasa
+
α-ketoglutarát + NADH + H
Glu + NAD
+
c) ISE
Stanovení bilirubinu
1.
Obecná
Obecná metoda: kopulace s diazotovanou kys.
kys.
sulfanilovou
HOOC
COOR
N N
O
N
CH
N
H
CH2
H
N
CH
H
N
O
SO3H
Cl
H
HOOC
O
N
H
CH
COOR
N N
N
SO3H
HO3S
N N
H
H
azopigment A
⇒ acidobazický indikátor
N
CH
N
O
H
azopigment B
H+
neutrální
OH-
- fialový (~ 560 nm) – Malloy-Evelyn
- červený
- modrý (~ 600 nm) – Jendrassik-Gröf
Stanovení bilirubinu
2.
přímá spektrofotometrie – „bilirubinometr“
bilirubinometr“ – 454 nm
(+ 540 nm odeč
odečet HbO2) – neonatá
neonatální
lní diagnostika
3.
enzymaticky – bilirubinoxidasa (oxidace na biliverdin 405405-460 nm)
nm)
konjugovaný bilirubin – „přímý“
mý“, konjugovaný s kyselinou
glukuronovou
nekonjugovaný bilirubin – „nepř
nepřímý“
mý“, adsorbovaný na Alb,
nutno solubilizovat:
solubilizovat: kofeinkofein-benzoá
benzoát sodný (Jendrassik
(Jendrassik-Grö
Gröf), DMSO, moč
močovina, MetOH
⇒ kvantitativní
kvantitativní stanovení
stanovení celkové
celkového a konjugované
konjugovaného
bilirubinu
∆-bilirubin
– kovalentně
kovalentně vázaný na Alb
4
Stanovení kreatininu
1.
Jaffé
Jaffé - 1886
NO2
H3C
HN
NO2
N
O
N
H
O2N
-
O
-
O
-
OH
O2N
NO2
H3C
NO2
-
O
N
N
H
HN
červený
nespecifická (interference – askorbát, pyruvát, aceton, glc, kys. močová,
proteiny, teplota, doba stanovení)
⇒ separace kreatininu (Lloydovo činidlo, floridin, HPLC)
⇒ kinetické stanovení
2.
Enzymové
Enzymové metody
kreatininamidohydrolasa ⇒ kreatin
kreatininiminohydrolasa ⇒ N-methylhydantoin + NH3
Stanovení cholesterolu
Chemické metody
modifikace LiebermannLiebermann-Burchardovy metody
několikaná
kolikanásobná
sobná oxidace cholesterolu v prostř
prostředí
edí HAc,
HAc, H2SO4,
AcAc-anhydridu
⇒ tvorba nenasycených vazeb ⇒ cholestahexaencholestahexaen-sulfonová
sulfonová
kyselina – zelenomodré
zelenomodré zbarvení
zbarvení
Enzymové metody (celkový, volný, esterifikovaný,
esterifikovaný, HDL)
cholesterolesterasa:
cholesteroloxidasa:
+ H2O2
ChE Æ Chol + FFA
Cholesterol + O2 Æ Cholest-4-en-3-on
HDL-cholesterol: srážení LDL a VLDL
- heparin + Mg2+
- kys. fosfowolframová + Mg2+
5