molekularni biologie a prognosticke faktory crc

Prognostické a prediktivní
markery - část II
prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc.
Centrální laboratoř pro
imunoanalýzu, FN a LF UK Plzeň
Témata přednášky
Molekulární biologie
 DNA a nádory
 Parametry molekulární biologie
 Využití v diagnostice
 Využití při volbě a monitoraci léčby
Prognostické a prediktivní markery CRC
DNA
1869 - deoxyribonukleová kyselina byla popsána švýcarským
lékařem Friedrichem Miescherem (Phoebus Levene rozpoznal, že
DNA se skládá z cukrů, fosfátů a bází) neznámý význam
1943 - první důkaz o roli DNA v přenosu genetické informace
přinesl A Mac Leod a Mc Carty
DNA
1953 - odhalení její trojrozměrné struktury
Správný dvojšroubnicový model - J. D Wotston a F. Cirk - pozdější
laureáti Nobelovy ceny.
1957 - předložil Crick sérii pravidel, které se označují jako
centrální dogma molekulární biologie popisují vztahy mezi DNA,
RNA a proteiny
1958 - popsán způsob replikace DNA v buňkách
1960 - rozluštění tzv. genetického kódu
Geny jsou na
chromozomech
• Theodor Heinrich Boveri (1862 –1915) německý biolog
• Walter Stanborough Sutton (1877 - 1916) americký genetik a lékař
Boveriho-Suttonova chromozómová teorie
- Říká též, že chromozomy jsou lineární struktury s geny, které se
nacházejí na specifických místech zvaných lokusy
- Chromozomy, které jsou obsaženy ve všech dělících se buňkách a
předávají se z jedné generace na druhou, nesou genetickou
informaci
Geny jsou na chromozomech
• Thomas Hunt Morgan (1866 – 1945) americký genetik
Jeden z nejvýznamnějších genetiků historie
• Prokázal, že geny jsou umístěny na chromozómech a na základě
tohoto poznatku zformuloval Morganovy zákony dědičnosti
• Zjistil, existenci pohlavně podmíněnost genů
• 1933 Nobelova cena za fyziologii a medicínu (první za práci v oboru
genetiky)
DNA nese genetickou
informaci
• Oswald Theodore Avery (1877– 1955) americký lékař a vědec
• Jeden z prvních molekulárních biologů a věnoval se i imunologii
• 1944: Averyho-MacLeodovův-McCartyho experiment - důkaz, že
genetickým materiálem je DNA
• Původně se věřilo, že genetickou informaci nesou proteiny
.
GEN
Gen je úsek DNA se specifickou funkcí, který je
schopen utvářet při dělení buňky svoje vlastní
přesné kopie, které se přenáší do dalších generací
Starší definice - gen je úsek DNA kódující
bílkovinu. Jednotlivé geny se na DNA mohou
překrývat.
GEN
 Geny rozlišujeme na geny strukturní a regulační.
 Exony jsou funkční úseky genu, které jsou přepisovány do
mRNA a dále přepisovány při proteosynthese.
 Introny jsou ty úseky, jejichž funkce dosud nebyla zcela
objasněna, a které nejsou využívány pro tvorbu bílkovin
 Jednoduché geny - obsahují pouze exony
 Složené geny - obsahují exony i introny
Centralní dogma molekulární
biologie Crick 1957-58)
DNA
RNA
REPLIKACE TRANSKRIPCE TRANSLACE
Protein
Fenotyp
REVERZNÍ TRANSKRIPCE
Exprese genetické informace – kroky vedoucí k syntéza proteinu (nebo RNA)
podle informace v DNA
DNA
replikace
DNA
transkripce
RNA
translace
enzymy
proteiny
stavební složky organel a
struktur buňky
Každý gen má specifickou sekvenci nukleotidů. Tato sekvence určuje
stavbu RNA, popř. proteinu, které jsou daným genem kódovány.
znak
Gen
DNA
RNA
protein
Soubor veškeré genetické informace
v buňce (resp. v organismu) = genom
Lidský genom: cca 20-25 tis. genů
mimojaderný
genom mitochondrie
(u rostlin také
plastidy)
jádro
(nucleus)
jaderný genom
(obsahuje většinu
genetické
informace)
 Všechna nádorová onemocnění jsou způsobena abnormalitami
v sekvenci DNA
 Během života je DNA v lidských buňkách vystavena účinku
mutagenům a také chybám při replikaci, které způsobují změny
v sekvenci DNA buňky
 Náhodně může jedna z těchto somatických mutací změnit funkci
genů spjatých s kontrolou buněčné proliferace, diferenciace a
apoptózy
 Pokud jedinec zdědí mutaci v jedné alele kritických genů od
rodičů, nastává nádorové onemocnění dříve a s větší
pravděpodobností
 Genetické změny, způsobující expresi pozměněných
proteinů, proteinů v jiném množství, nebo těch, které
se již na tomto stupni ontogeneze neexprimují, mohou
vest k vzniku nádorového onemocnění
Imunoanalýza měří proteiny
Molekulární biologie zejména DNA, RNA
Dominantní mutace
protoonkogenů
Změny ve struktuře genu →
syntéza abnormálního genového produktu (onkoproteinu)
● bodové mutace, delece
● genové translokace – vznik zkrácených nebo fúzních genů
s abnormální funkcí
Změny ovlivňující regulaci genové exprese →
nepřiměřená produkce strukturně nezměněné formy normálního
proteinu podporující růst
● inzerce retrovirů se silnými retrovirovými promotory
● genové amplifikace – abnormální transkripci
Recesivní mutace
antionkogenů
Dvouzásahová
teorie →
 pro vývoj nádoru je nutná ztráta funkce obou alel
příslušného tumor supresorového genu
 ztráta heterozygozity
Mikro RNA
miRNA regulují až jednu třetinu lidských genů.
Geny regulované pomocí miRNA jsou nejen součástí
procesu onkogeneze, podílejí se také na nádorové
invazivitě, diseminaci nebo lékové rezistenci
Malé (24nt) a stabilní molekuly
- časný záchyt
- predikce léčby
- Prognóza onemocnění
Mikro RNA
miRNA regulují až jednu třetinu lidských genů.
Geny regulované pomocí miRNA jsou nejen součástí
procesu onkogeneze, podílejí se také na nádorové
invazivitě, diseminaci nebo lékové rezistenci
Malé (24nt) a stabilní molekuly
- časný záchyt
- predikce léčby
- Prognóza onemocnění
Techniky molekulární genetiky
používané k diagnostice
Metody přímé diagnostiky
 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism )

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electroforesis)

PTT (Protein Truncation Test)

sekvenování ds DNA
Metody nepřímé diagnostiky

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphismus)
Prognostické faktory
kolorektální karcinom
Ondřej Topolčan
Základní statistické pojmy
•
Senzitivita
–
–
•
Specificita
–
–
•
pravděpodobnost,
s jakou má pacient bez diagnostikované choroby negativní
výsledek
% správně pozitivních výsledků
pravděpodobnost,
že pacient s pozitivním výsledkem
má hledanou chorobu
% správně negativních výsledků
Cut - off
–
diskrimainční hladina mezi pozitivními a negativními
hodnotami při dané specificitě
Praha 10. května 2007
Revmatologický ústav
Kolorektální karcinom
Strategie léčby CRC podle TNM
I → operace
II → operace (v případě Nx následuje
chemoterapie)
III → operace + vždy chemoterapie
IV → resekce, nebo indukční terapie a pak
resekce, nebo pouze paliativní léčba
Klinické otázky
Předoperační hodnoty
• Skrining
ano
• Primární diagnostika nádoru ne
• Agresivita nádoru
ano/ne
• Generalizace
ano
Pooperační hodnoty
• Efekt chirurgické léčby
ano
• Korekce histologického nálezu ano
• Volba adjuvantní terapii
ano
Kolorekctální karcinom a sensitivita
nádorových markerů předoperační hodnoty
(at 95% specificity)
Folow up
•
•
•
•
Remise
Stady state
Relaps
Metastázy
ano
ano
ano
ano
Senzitivita nádorových markerů
při 95 % specificitě
Senzitivita %
Nádory GIT bez projevů generalizace (n=180)
(n=85)
Revmatologický ústav
(n=80)
(n=15)
Praha 10. května 2007
Senzitivita nádorových markerů
při 95 % specificitě
Senzitivita %
Nádory GIT s projevy generalizace (n=200)
(n=60)
Revmatologický ústav
(n=116)
(n=24)
Praha 10. května 2007
Před a pooperační median TK
100
Předoper.
80
1den
2 den
60
3 den
40
7 den
30 den
20
0
He
Be
C18 -20
C 50
C 787
Před a pooperační median TPS
600
Předoper.
1den
2 den
3 den
7 den
30 den
400
200
0
He
Be
C 18 - 20
C 50
C 787
Před a pooperační median CEA
40
35
30
25
Preoper.
1day
2 day
3 day
7 day
30 day
20
15
10
5
0
He
Be
C 18 - 20
C 50
C 787
AUC 1. soubor
Parametr
AUC
AUC
AUC
(jednotka)
0 vs 1
0 vs 2+3
0 vs 4
0.6036
0.8334
0.9982
0.5516
0.8466
0.9813
0.5852
0.6733
0.6065
0.5284
0.6053
0.7435
TPS
(IU/l)
TPA
(IU/l)
CEA
(ng/ml)
CA 19-9
(ng/ml)
• 0 benigní onem.
• 1 kolorektální karcinom a
karcinom prsu stádium I
• 2+3 kolorektální karcinom a
karcinom prsu stádium II a III
• 4 kolorektální karcinom a
karcinom prsu + meta do jater
Benigní
versus
Kolorektální karcinom a
karcinom prsu + meta do
jater
AUC 1. soubor
Parametr
AUC
(jednotka)
1+2+3 vs 4
TPS (IU/l)
0.9782
TPA (IU/l)
0.9713
CEA (ng/ml)
0.6665
CA 19-9 (ng/ml)
0.7435
• 0 benigní onem.
• 1 kolorektální karcinom a
karcinom prsu stádium I
• 2+3 kolorektální karcinom a
karcinom prsu stádium II a III
• 4 kolorektální karcinom a
karcinom prsu + meta do jater
Volba léčby
• Problematická
Monitorace léčby
• Adjuvantní
– Thymidkináza
• Chemoterapie
– Nádorové markery
Změny hladinTK,
úspěšná adjuvantní CHT
Změny hladinTK, CEA, CA 19- 9
úspěšná adjuvantní CHT
CHT
Cycle
B 1.
A 1.
B 2.
A 2.
B 3.
A 3.
TK
CEA
CA 19 -9
Median
Min -Max
Median
Min -Max
Median
Min -Max
4
20
6
28
8
35
1-6
8 -25
4 - 10
16- 40
5 -13
16 -45
1.8
1.9
1.5
1.9
1.6
1.1
1- 3
1 -2.5
0.8-2.6
1-3
0.5 -2
0.5 -2
21
19
24
20
16
19
16 -24
18 -36
20 -25
14 -25
12 -20
17 -26
Změny hladinTK,
úspěšná paliativní léčba
Změny hladinTK, CEA, CA 19- 9
úspěšná paliativní léčba
CEA
and CA 19-9 levels
Successful palliative therapy
Date
CEA
CA 19-9
31. 3. 2003
191
321
2. 4. 2003
245
350
14. 4. 2003
174
202
16. 4. 2003
181
184
28. 4. 2003
169
141
30. 4. 2003
108
181
9. 6. 2003
14
90.2
11. 6. 2003
14
78.8
Example
CHANGES IN THYMIDINEKINASE (TK) DURING
PALLIATIVE CHEMOTHERAPY
TK (U/l)
Increases of Thymidinkinase (TK) During the
Palliative Chemotherapy (6 Cycles)unfavourable prognosis
60
50
40
30
20
10
0
1th
Cycle
Before
1th
Cycle
After
2nd
Cycle
Before
2nd
Cycle
After
3rd
Cycle
Before
3rd
Cycle
After
6th
Cycle
Before
6th
Cycle
After
CEA and CA 19-9
Neuspěšná palliativní léčba
Prognóza
• DFI, PFI – ano
• OS - ano
Predikce
• Efektu léčby
– Chirurgické ano
– Onkologické ano
Screeningová vyšetření kolorektálního
karcinomu
 multitarget assay panel (MTAP) - detekci mutací v buňkách
střevní sliznice uvolněných do stolice probandů
Metody molekulární biologie
se využívají
•
•
•
•
Volba a optimalizaci léčby
Monitoraci léčby
Predikce efektu léčby
Prognóza onemocění
Prediktor účinnosti anti-EGFR moAb :
wild type genu KRAS
● K-ras (Kirstein rat sarkoma virus) 12p12.1
Proonkogen K-ras kóduje GTPázu
Nejčastěji mutace kodonu 12, 13, 61→ kontinuální aktivace
Prediktor účinnosti anti-EGFR moAb :
wild type genu BRAF
● BRAF (RAS-associated factor)
- Mutován u 5% kolorektálních karcinomů - V600E
- Je známo více než 30 mutací aktivujících BRAF
Cílená léčba – blokace EGFR
(produktu onkogenu)
EGFR (ErbB-1) receptor epidermálního růstového faktoru
- Ligandy pro epidermální růstový faktor: EGF nebo TGFα →
aktivují
monomerní molekulu → dimer → aktivace intracelulární
tyrosin kinazové activity
- Patologická aktivita: amplifikací EGFR1 nebo vysokou
polyzomií chromozómu 7 → preferenční odpověď na EGFR1
inhibici
Blokace: anti-EGFR moAb cetuximabu, panitumumab
- lečba pokročileho a metastatickeho kolorektalniho karcinomu
Prediktor účinnosti: wild type genu KRAS (vyžadován)
wild type genu BRAF (doporučen)
znalost přítomnost EGFR receptorů (doporučena)
;
Systémová paliativní chemoterapie
Stadium IV (jakekoliv T, jakekoli N, M1) + lokalně pokročile inoperabilni
onemocněni
– pro 1. linii lze rovnocenně použít cytostatika v intravenózní i perorální formě: 5-FU,
irinotekan, kapecitabin, oxaliplatinu (výjimečně raltitrexed) a biologickou léčbu.
Děkuji za pozornost!