5. Chromatografie

Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Metody
y separace
p
přírodních látek
(5)
Chromatografie;
Ch
fi základní
ákl d í definice
d fi i a klasifikace
kl ifik
ruzných
ý h
metod; kapalinová chromatografie, plynová
chromatografie přístrojová technika.
chromatografie,
technika
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Chromatografie
« F(+)d »
1897
D.T.Day
-chromatografie
h
t
fi LS frontální
f
tál í
1903
M.S.Cvet
M
S Cvet
-chromatografie LS eluční
1931
A.Winterstein a E.Lederer
1941
A.J.P.Martin
A
J P M ti a R
R.L.M.Synge
LMS
-chromatografie LL eluční
1952
-A.T.James a A.J.P.Martin
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
DEFINICE CHROMATOGRAFIE
Fenomenologická definice:
Diferenciální migrace (selektivní transport) separovaných molekul (solutu)
v systému dvou fází, z nichž jedna fáze je stacionární a druhá mobilní.
Kinetická definice:
Kontinuální p
proces založený
ý na konvektivním narušování a difuzivním
obnovování rovnovážného stavu mezi koncentrací (aktivitou) solutu v
mobilní a stacionární fázi.
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Princip, teorie a aplikace
chromatografických metod
Schema přístroje pro chromatografii v kapalné fázi (LC)
Schema přístroje pro chromatografii v plynné fázi (GC)
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Komponenty přístroje pro kapalinovou chromatografii
Zásobníky rozpouštědla: -termostatovany
termostatovany zasobnik
-odplyňovač
Čerpadla:
-hydrostatický tlak
-tlak plynu
-lineární dávkovač
-peristaltické
-pístové
pístové
-rotační
Nastřikovače:
-typ stříkačka-septum
-nástřikový
ý ventil
Kolony:
-analytické
-preparativní
Detektory:
-optické
-elektrochemické
- ..............
Sběrače frakcí:
-rotační
-lineární
Záznam signálu detektoru
Zpracování experimentálních dat
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Komponenty přístroje pro plynovou chromatografii
Zásobník stlačeného plynu:
-tlakové láhve
Redukční ventil:
-regulace vstupního tlaku nosného plynu
Nastřikovače vzorku:
-stříkačka-septum
-nástřikový ventil
-splitter
-analytické
-(preparativní)
-tepelně
t
l ě vodivostní
di
t í
-FID
- ..............
Kolony:
D t kt
Detektory
Záznam signálu detektoru
Zpracování experimentálních dat
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Struktura chromatografické kolony
Plněná kolona
GC,
LC,
d=10-200 µm
d=1-20 µm
Kapilární kolona
GC,
d=20-100 µm
LC,
d=1-5 µm
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Vnitřní struktura (porozita) částic
náplně chromatografické kolony
Mikropóry a makropóry
Celkový objem naplněné kolony:
V p =V m +V i
V T =V 0 +V m + V i
V 0 =(0,35−0,5)∗V T
V i =(0,3−0,8)∗V p
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Klasifikace chromatografických systémů
Stav koexistujících fází
Chromatografické systémy:
_______________________________________
Stacionární fáze
Mobilní fáze
kapalina
plyn
(LC)
(GC)
_______________________________________
pevná
LSC
GSC
pevná+kapalná
LSLC
GSLC
kapalná
LLC
GLC
_______________________________________
Fyzikální fáze je homogenní částí systému
Chromatografická fáze může sestávat z více fyzikálních fází
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Experimentální
p
techniky:
y
Planární chromatografie
-na papíře
p p
-na tenké vrstvě
Kolonová chromatografie
Frontální chromatografie:
-vzorek je kontinuálně dávkován na
kolonu
PM
1+2+3
1+2
1
3
2+3
c
c
t
t
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Eluční chromatografie
-vzorek je nastříknut na kolonu jako pulz v malém objemu
mobilní fáze
1+2+3
1
2
3
c
t
Chromatogram tří separovaných solutů
Souřadnice c,t mohou být nahrazeny c,V; m,t; nebo m,V.
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Mechanizmy interakcí mezi soluty a stacionárními fázemi
1. Rozpouštění (absorpce, extrakce) molekul solutu ve
stacionárni fázi
2 Adsorpce
2.
Ad
molekul
l k l solutu
l t na povrchu
h stacionárni
t i á i fáze
fá
3. Chemické reakce molekul solutu ve hmotě nebo
na povrchu stacionárni fáze (acido-bazické rovnováhy,
tvorba komplexů
komplexů, výměna iontů
iontů, asociace iontových
párů, srážení, hydrofobní interakce, atd.)
4. Sterická exkluze
5 Iontová exkluze
5.
6. Bioafinita
Všechny uvedené interakce mohou být kombinovány
a určují tak typ chromatografické techniky.
y chromatografických
g
ý separací
p
je
j
Klasické mechanizmy
možné posílit současným působením fyzikálních polí.
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Metody separace
přírodních látek
(6)
Sterická exkluzní chromatografie, separační modely
a mechanizmy, sekundární interakce, inverze retence
v kritickém bodě, adsorpční chromatografie,
multidetekční systémy.
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
P i i SEC
Princip
Vt = V0 + Vm + V p
Vo
Vm
Vp
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Retenční objem je determinován dostupností části
objemu jednotlivých pórů a distribucí rozměrů pórů
celého systému.
y
VR = V0 + K SSECC *V p
K ( R, r )SEC
VR=V0 +
rmax
cp
=
c0
K
(
R
,
r
)
φ
(
r
)
dr
SEC
∫
R
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Geometrický model
separačního
č íh mechanizmu
h i
2
R
KSEC = ⎛ 1 − ⎞
⎝
r⎠
pro
R≤r
a
KSEC = 0
pro
R≥r
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Hydrodynamický model
separačního mechanizmu
⎛
2R ⎞
⎜
⎟
KSEC = k 1−
⎝ Rmax ⎠
3
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Termodynamický model
separačního mechanizmu
dG = dH − TdS
µ i = µ i° + RT ln ci
⎛ ∂G ⎞
⎟
dni
dG = ⎜
⎝ ∂ ni ⎠ T,P,n
µ im = µ is
⎛ ∂G ⎞
µi = ⎜ ⎟
⎝ ∂ ni ⎠ T,P,n
⎛ ∆µ
csi
∆ i° ⎞
= exp⎜
⎟ = KSEC
cmi
⎝ RT ⎠
j≠i
j≠i
⎛ − ∆H ° ⎞
⎛ ∆ S° ⎞
KSEC = exp⎜
⎟ exp⎜
⎟
⎝ RT ⎠
⎝ R ⎠
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
SEC je pouze separační technika. Střední hodnoty MH a DMH
musí být vypočítány z experimentálních dat
s využitím kalibrace.
Jednoduchá
kalibrace
Univerzální kalibrace
VR = f (M )
VR = f (Vh = [η ]M )
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Účinnost separačního
systému závisí na
průtoku
Difuze a konvektivní
transport
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Pro polymerizační stupeň n>30, je rozdíl mezi efektivním
rozměrem polymerních řetězců n a n+1 příliš malý.
Výsledkem je, že píky jednotlivých merů jsou
superponovány.
Rozlišení separační kolony musí
být dostatečné aby nebylo nutné
korigovat výsledek na rozmytí
zóny.
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Zpracování dat
Injection
hi
Vi
∑ hi Mi
∑ hi
Mn =
Mw = i
i
∑ hi
∑ hi / Mi
i
i
1a
⎡ ∑ hi Mia ⎤
⎥
Mv = ⎢ i
⎢ ∑ hi ⎥
⎣ i
⎦
[η] = KM a
2
h
M
∑i i
Mz = i
∑ hi Mi
i
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Sekundární interakce
Copyright
2009 by Josef Janča: No part of this text may be reproduced or transmitted
in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying,
image scanning, microfilming, and recording, or by any information storage and retrieval
system,
t
without
ith t written
itt permission
i i from
f
the
th author.
th
Sekundární interakce
1.
2
2.
3.
4.
5
5.
Adsorpce, rozdělování, srážení
Nekompatibilita
Hydrodynamické jevy
Koncentrační efekty
Elektrostatické interakce
interakce,
iontová exkluze a inkluze