Hyphenated techniques

„Hyphenated techniques“
„multidimensional analyses“
„life science research”
Hyphenated techniques
„omics“
genomics
proteomics
organellomics
metabolomics
cellomics
Jan Preisler
312A14
[email protected]
http://bart.chemi.muni.cz
1
„Hyphenated techniques“
Hyphenated techniques
hyphen - spojit spojovníkem (dvě slova)
hyphen - spojovací čárka (spojovník)
hyphen - pomlčka
hyphen - označit čárkou
hyphen - rozdělit slovo (čárkou)
hyphen - spojovací
hyphen - rozdělovací čárka
hyphen - rozdělovací znaménko
hyphen - spojovník
hyphenate - spojit
hyphenate - rozdělit čárkou
hyphenate - spojit spojovníkem
hyphenate - rozdělit spojovníkem
Definice
“the marriage of two separate analytical techniques via appropriate
interfaces, usually with the backup of a computer tying everything
together”
Analytical Chemistry (Wiley-VCH, 1998)
“Hyphenated separation techniques refers to a combination of two
(or more) techniques to detect and separate chemicals from
solutions. Most often the other technique is some form of
chromatography. A slash is sometimes used instead of hyphen,
especially if the name of one of the methods contains a hyphen
itself.
Wikipedia (2007)
3
Hyphenated techniques
4
Hyphenated techniques
... zpravidla sestava některé separační techniky kombinovaná s
jinou separační/detekční technikou, např. MS detekcí
Současnost
• kapilární separační techniky + vysoce citlivé detekční techniky
(hmotnostní spektrometrie ESI a MALDI, elektrochemické aj.)
• kombinace vysoké selektivity a vysoké citlivosti dovoluje
jednoznačné stanovení analytů ve stopových množstvích
... specifičtější multidimenzionální analýza
... odstranění vzájemných rušení a překryvů signálu
Rozhraní (interface)
• zachování separační účinnosti
• zachování citlivosti (minimalizace ztrát analytů)
Co ještě je a co už není „hyphenated technique“?
• LC – UV @ 254 nm
záznam absorbance při zvolené l
• LC – DAD
diode array detector, záznam spektra
Aplikace
• multidimensionální analýza komplexních směsí: proteomika,
dopingové testy, toxiny, pesticidy, speciační analýza polutantů...
Více detekčních technik: „hypernated techniques“
5
6
1
Typy spojení
GC
LC
SFC
CE
TLC
GE
MS
***
***
*
**
*
***
IR
***
**
*
*
**
OES
**
**
**
*
AAS
*
**
**
Klasifikace spojení
NMR
**
Sběr eluentu
• diskrétní frakce (fraction collector)
• spojitý tok
Fluo UV/Vis
**
*
***
***
***
***
***
Režim
• on-line
• off-line
• in-line
***
***
***
Využití vzorku
• beze ztráty vzorku
• se ztrátou vzorku (splitter)
*** komerčně dostupné a v praxi používané
** komerčně dostupné, ale méně v praxi využívané
* ve výzkumném stadiu, ale komerčně nedostupné
Separátor (splitter)
• rozdělení eluentu mezi více technik
• miniaturizace, kapilární kolony
7
8
Př.: vzájemné rušení MALDI MS signálu
směsi peptidů
Spojení separace a selektivní detekce
Proč separace?
... nutnost analýzy velmi složitých vzorků, směsí mnoha analytů
0.25
AF 1-7 AIII
0.20
c(peptidů) = 1 mM
AII
AF 3-8
0.15
AI
0.10
Ion Intensity (V)
Když specifická detekce není dostatečně specifická:
• vysoká pravděpodobnost výskytu 2 nebo více analytů se stejným
spektrem
• vzájemné rušení analytů
• omezený dynamický rozsah detektoru, nemožnost současné
analýzy minoritních a majoritních složek
• odstranění nečistot
• zdroj dalších informací o analytech
AG 1-14
0.05
0.00
600
800
1000
0.25
1200
1400
AII (off scale)
1600
1800
2000
0.20
c(peptidů) = 1 mM
0.15
kromě c(AII) = 50 mM
0.10
0.05
0.00
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
m/z
9
10
Nejčastěji používané „hyphenated“ techniky
HPLC-TLC (MALDI-TOF MS)
všechny techniky spojené s MS, UV, Fluo
Př.:
• HPLC, CE – MS
• GC-MS
• GC-FTIR
• LC-GC
• GC-AES
• LC-AAS
• LC-ICP MS
• LC-elektrochemické detektory
• Probot
11
12
2
GC-AES
LC-GC
13
LC-MS
14
LC-AAS
15
16
17
18
ICP-MS
3
19
HPLC–NMR–MS analysis of a commercial dye sample. A: HPLC (UV) spectrum at
254 nm. B: Photodiode array contour plot. C: Total ion chromatogram under
negative ion electrospray conditions. D: Density plot of the negative ion
electrospray mass spectra. E: 1H NMR spectra of peaks 1, 3 and 5 of the HPLC
chromatogram in A
20
This example is for a
21
14C-labeled-blocker
dosed to a rat.
NMR and MS data for the minor hydroxyglucuronide metabolite clearly enables the
structure to be determined. In addition, the drug was dosed as the racemate, but the
NMR spectrum clearly shows that the metabolism (or excretion) was enantioselective
based on the slightly different intensities of the anomeric proton resonances of the two
diastereoisomeric glucuronides.
22
Příklad: spojení separace s MALDI MS
Typy interface pro MS
Plyn  vakuum
tryskový separátor pro obohacení ABC v nosném plynu (particle
beam)
membránové interface
kapilární kolona (místo klasické kolony se splitrem)
Off-line
- Sběr frakcí. Terčíky s hydrofilními místy (anchorchip)
- Vyříznutí a extrakce skvrny z GE
- Mikrometody používající piezoelektrické pipetory a mikroterčíky
Kapalina  vakuum
API ionizační metody (ionizace přímo z kapaliny za atmosferického
tlaku)
Průtokové sondy (FAB)
Nanesení vzorku na tuhý nosič (terčík)
pohyblivý pás (naneseni při atmosferickém tlaku – přenos,
diferenciální pumpování - ionizace)
Sběr frakcí
23
On-line
- Průtoková sonda s fritou/bez frity
- Zmlžovač pro tvorbu aerosolu
In-line
- Interface ROBIN
- Nanášení vzorku na povrch ve vakuu, moving belt interface
Off-line vs. on-line
- Oddělení separace od hmotnostní analýzy
- Možnost archivování vzorku
24
4
Automatizovaný sběr frakcí (off-line)
Průtoková sonda (on-line)
Whittal, R. M., Russon, L. M., Li, L. J. Chromatogr. A 1998, 794, 367-375.
Např.: Probot (zdroj: www.lcpackings.com)
25
Zmlžovač pro tvorbu aerosolu (on-line)
26
Moving belt interface (in-line)
• Rozhraní pro kontinuální zavádění netěkavého vzorku v těkavějším
solventu do hmotnostního spektrometru
horký N2
vyhřívací
element
štěrbiny
LC eluent
IR vyhřívání
iontový
zdroj
pohybující se polyimidový pás
k vakuovým pumpám
• McFadden W. H., Schwartz H. L. and Evans S. J. Chromatogr. 122, 389,
1976.
Fei, X., Wei, G., Murray, K. K. Anal. Chem. 1996, 68, 1143-1147.
27
ROBIN (rotating ball inlet), in-line
28
Nanášení vzorku ve vakuu (in-line)
2ND GENERATION VACUUM DEPOSITION INTERFACE
atmospheric
pressure
source chamber (p ~ 10-6 Torr)
deposition
support
repeller
target
coil
probe with
capillary
interface flange
source
coil
Mylar tape
rubber
wheel
repeller center
(tape guide)
propelled
shaft
Orsnes, H., Zenobi, R. Chem. Soc. Rev. 2001, 30, 104-112.
29
30
5
CE - MALDI/MS směsi peptidů
Multiplex: CAE – MALDI MS
MULTIPLEX MALDI/TOF MS
desorption laser beam
scanning mirror
ATMOSPHERIC
PRESSURE
tape
buffer
vials
flight tube
infusion
capillaries
interface
flange
repeller
VACUUM
(SOURCE CHAMBER)
Multiplex: CAE – MALDI MS
detector
2nd extraction grid
1st extraction grid
Off-line CE – MS
Capillary Array Electrophoresis - MALDI MS osmi proteinových digestů
UV detekce
1
2
3
4
kapalinové spojení
separace (CE)
nanášecí kapilára
myoglobin
b-lactoglobin
fetuin
5
6
b-casein
7
subatmosferická
nanášecí komora
(20 kPa)
8
broušená
špička pokrytá
PTFE
cytochrome
carbonic anhydrase
bovine serum albumin
terčík
Au-PETG
ribonuclease b
33
UV detektor: Ryvolová, M.; Preisler, J.; Krásenský, P.; Foret, F.; Hauser,
P.C.; Paull, B.; Macka, M. Anal. Chem. 2010, 82, 129-135
34
CE – UV & SALD ICP MS of Cr specií
Subatmospheric Deposition of CE Effluent
0.50
nanášecí sonda
separační kapilára
CrO42-
0.40
2.00
III(EDTA)
III(EDTA)
1.50
CrCr
0.30
0.20
A (a.u.)
kapalinové spojení
integrated ICP MS signal (a.u.) × 610
2.50
CrO42-
1.00
0.10
0.50
infúzní kapilára
0.00
0
VN
vialky s pufrem a
vzorkem
terčík MALDI
35
subatmosferická komora
30
60
time (s)
90
120
0.00
150
vzorek: 100 mM Cr3+(EDTA) a 100 mM CrO42- , BGE: 10 mM HCOOH,
kapilára: 20/26 cm, 10 kV, dávkování: Dh = 2 cm, 5 s (200 fmol),
detekce: absorbance při 214 nm/SALD ICP MS @ 53 (LOD ~ 10 fmol)
Peš, O.; Jungová, P.; Vyhnánek, R.; Vaculovič, T.; Kanický, V.; Preisler, J.
Anal. Chem. 2008, 80, 8725–8732
36
6
Terčík MALDI : multidetekční platforma
Metaloproteomická aplikace
vzorek,
separační eluent,
tkáň
Kolonové separace – hmotnostní spektrometrie
- prvková analýza: ICP MS
terčík MALDI
- molekolová analýza: elektrosprej (ESI) MS
- kolonová separace + ICP MS/ESI MS
laserem
buzená
fluorescence
MALDI MS
vzorek
ICP MS
separace
ICP MS
MALDI MS/MS
ICP MS
nebo
reakce
na terčíku
separace
ESI MS
separace
vzorek
vzorek
ESI MS
dělič toku nebo duální přístroj
Archivování/reanalýza/expozice jiným detekčním technikám
37
38
Modifikovaný terčík (destička)
Absorbance (a.u.)
Substrát
- polyethylen tereftalát glykol (PETG)
- nanovrstva Au: 5 nm pro kompatibilitu
s MALDI a SALD
1,7
1,5
1,3
1,1
0,9
0,7
0,5
0,3
0,1
-0,1
MT-1
UV
MT-2
7
8
9
10
11
12
6500
m/z
6400
MALDI MS:
MT apoformy
6300
6200
6100
6000
7
8
9
10
11
12
destička Au-PETG
se záznamem separace
před a po SALD ICP MS
111Cd SALD ICP MS
signal (a.u.)
600 000
destička Au-PETG
na terčíku MALDI
500 000
400 000
SALD ICP MS:
kovy (Cd)
300 000
200 000
Tomalová, I.; Foltynová, P.; Kanický, V.; Preisler, J.
Anal. Chem. 2014, 86, 647−654.
CE(UV)-MALDI MS/SALD ICP MS
100 000
0
7
39
8
9
10
tmig at liquid junction (min)
11
12
40
• CHCA/TFA: apoformy proteinů
• DHB/NH3: komplexy proteinu s kovy
[M-3H+2Cd]+
1000
500
[M5H+3Cd]+
[M-7H+4Cd]+
[M+H]+
1500
[M-H+Cd]+
MALDI MS
integrated SALD ICP MS signal [a.u.]*106
Detekce formem proteinů MALDI MS
1
SALD ICP MS
(111Cd)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
7
8
9
tmig[s]
10
DHB/NH3
600
400
200
0
6215.2
6145.2
800
CHCA/TFA
6241.3
Signal intensity [a.u.]
0
1000
6000
6200
6400
6600
6800
m/z
41
7