2004-2015

Transkript

2004-2015

Ing. Miriam Hošková
Název: Bakteriální produkce povrchově aktivních látek a jejich biologická aktivita
Školitel: prof. Ing. Alena Čejková, CSc.
Studijní program: Biochemie a biotechnologie
Studijní obor: Biotechnologie
SOUHRN
Rhamnolipidy, povrchově aktivní látky biologického původu, jsou pro svou nízkou toxicitu a
biologickou odbouratelnost „zelenou“ alternativou syntetických surfaktantů v mnoha aplikacích.
Jejich využití v průmyslovém měřítku však brání především ekonomická náročnost jejich produkce,
která souvisí zejména s nízkou účinností stávajících produkčních systémů. V této práci byla
zkoumána produkce rhamnolipidů třemi bakteriálními kmeny Pseudomonas aeruginosa NRRL B59188, Enterobacter asburiae NRRL B-59189 a Acinetobacter calcoaceticus NRRL B-59191. Byly
navrženy vhodné kultivační podmínky pro maximalizaci produkce se zvláštním zaměřením na výběr
zdroje uhlíku, neboť ten je klíčovou složkou kultivačního média. Dále byla provedena ucelená
fyzikálně-chemická charakterizace produkovaných rhamnolipidových směsí – jejich složení, kritická
micelární koncentrace a biologická aktivita, konkrétně vliv na růst vybraných mikroorganismů,
hydrofobitu jejich buněčného povrchu a ovlivnění schopnosti adheze na pevné povrchy.
Ing. MiriamHošková
Title: Microbialproduction of surface active compounds and their biological activity
Supervisor: prof. Ing. Alena Čejková, CSc.
Study programme: Biochemistry and Biotechnology
Subprogramme: Biotechnology
SUMMARY
Rhamnolipids are microbially produced surface active agents which can often be applied as a ‘green’
alternative to synthetic surfactants. However, low effectivity and resultant high cost of current
production systems prevents their use on an industrial scale. This study investigates the production of
rhamnolipids using three bacterial strains: Pseudomonas aeruginosa NRRL B-59188, Enterobacter
asburiae NRRL B-59189 and Acinetobacter calcoaceticus NRRL B-59191. Firstly, in order to
maximise yield, appropriate cultivation conditions are designed, with special attention paid to the
choice of carbon source due to its key role in the cultivation medium. Secondly, the following
physico -chemical characterisation of the obtained rhamnolipid compounds is performed:
composition; critical micelle concentration and organic activity, more specifically, the influence on
the growth of selected microorganisms, and on cell surface hydrophobicity and adhesion to solid
surfaces.
Ing. Gita Procházková
Název: Povrchové interakce jednobuněčných řas a jejich biotechnologické využití
Školitel: doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D.
SOUHRN
V této disertační práci jsou představeny nové přínosy z oblasti sklízení jednobuněčných řas spolu
s vývojem dvou nových agens, které jsou získané z levných surovin a vykazují vysokou efektivitu
pro separaci řasové biomasy. Dále byly u řasových buněk a obou agens provedeny studie
povrchových interakcí a fyzikálně-chemické charakterizace za různých podmínek s cílem stanovit
klíčové faktory napomáhající či naopak interferující s procesem sklízení. Z celého souboru
separačních procesů, které jsou běžně používány pro získání biomasy, byly pro tuto práci vybrány
techniky magnetické separace a flokulace pro sklízení sladkovodní zelené řasy Chlorella
vulgaris.
Oproti běžným metodám sklízení poskytuje magnetická separace buněk mnoho výhod. V rámci
předložené práce byly úspěšně popsány mechanismy determinující uchycení či odpoutání buněk
od magnetický agens, a to jak na základě pokusů in vitro, tak i pomocí predikcí z koloidních
(XDLVO) modelů. Pro tyto účely bylo potřeba aplikovat definované magnetické kuličky, které
nesly iontově výměnné funkční skupiny (DEAE-diethylaminoethyl či PEI-polyethylenimin) a
kontaktovaly buňky C. vulgaris za různých modelových podmínek.
První nové agens vhodné pro sklízení řas je prezentované v této práci ve formě suspenze
magnetických mikročástic oxidů železa (aj. iron oxide magnetic microparticles,
IOMMs), které byly připravené použitím mikrovlnného ohřevu. Bylo prokázáno, že IOMMs jsou
vhodné pro magnetickou separaci buněk C. vulgaris za různých podmínek (modelových,
kultivačních, či variabilních hodnot pH), přičemž usazení zmagnetizovaných buněk proběhlo
během několika minut. Dále byla zjištěna závislost efektivity sklízení nejen na hodnotách pH a
množství přidaných IOMMs, ale také na složení kultivačního média.
Druhé agens bylo vyvinuto z odpadních pivovarských kvasinek (Saccharomyces pastorianus) za
účelem sklízet C. vulgaris metodou flokulace. Flokulace je technikou velmi rozšířenou a typicky
se používá u vysoce zředěných řasových suspenzí jako prekoncentrační krok před použitím
energeticky náročného procesu jakým je např. centrifugace či filtrace. Efektivita sklízení
modifikovaných odpadních kvasinek (aj. modified spent yeast, MSY) byla testována za různých
podmínek a opět byla zjištěna závislost na hodnotách pH, množství přidaného agens a složení
kultivačního média. Výsledky získané použitím IOMMs a MSY byly porovnány s výsledky
jiných agens, které jsou uvedené v odborné literatuře.
Ing. Gita Procházková
Title: Microalgal surface interactions and their biotechnological applications
Supervisor: doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D.
Study programme: Biochemistry and biotechnology
SUMMARY
New contributions to conventional microalgal harvesting procedures are presented in this
dissertation together with the development of two, novel, cost-effective and highly efficient
harvesting agents. Additionally, surface interaction studies and physicochemical characterizations
of the microalgal cells and harvesting agents were performed in order to determine the key factors
aiding/interfering with harvesting the biomass. In the presented work, magnetic cell separation
and flocculation were chosen from among the cell separation procedures to harvest freshwater
green microalga Chlorella vulgaris under various conditions.
Magnetic harvesting of microalgal biomass provides many advantages compared to conventional
methods. By using well defined magnetic beads (MBs) carrying ion exchange functional groups
(DEAE-diethylaminoethyl and PEI-polyethylenimine), which contacted C. vulgaris under various
model conditions, the mechanisms leading to cell-magnetic agent attachment/detachment were
successfully described using real experiments in test tubes and predictions made by colloidal
adhesion (XDLVO) model.
The first, novel harvesting agent is presented in the form of a suspension of inexpensive iron
oxide magnetic microparticles (IOMMs) prepared by microwave treatment. IOMMs proved
successful in magnetically harvesting C. vulgaris cells under various conditions (model
environment, culture media, different pH) in a matter of minutes. Furthermore, it was observed
that harvesting efficiencies were dependent not only on the pH and amount of IOMMs, but also
on culture medium composition.
The second harvesting agent presented in this work was developed from spent brewer’s yeast
(Saccharomyces pastorianus) in order to harvest C. vulgaris via flocculation, i.e. a widespread
method typically applied as a pre-concentration step of highly diluted microalgal suspensions
before using energy demanding processes (such as centrifugation or filtration). The harvesting
efficiency of the modified spent yeast (MSY) was tested under different conditions and once
more the dependency on the pH, amount of agent and culture medium composition was observed.
The results obtained with IOMMs and MSY were compared to other agents reported in literature
for harvesting microalgae.
Ing. Juraj Szőköl
Název: Analýza genů pro degradaci aromatických polutantů u Rhodococcus erythropolis
Školitel: Ing. Miroslav Pátek, CSc.
SOUHRN
Tato disertační práce se zabývala studiem základních mechanismů regulace transkripce genů
kódujících fenolhydroxylasu u kmene R. erythropolis CCM2595. Enzym je kódován souborem
genů skládajících se z dvou strukturních genů pheA2 a pheA1, které jsou uspořádány za sebou, a
regulačního genu pheR, který je přepisován v opačném směru. Gen pheA1 kóduje velkou
podjednotku fenolhydroxylasy a gen pheA2 její malou podjednotku. Gen pheR kóduje
transkripční regulační protein typu AraC. Některé experimenty byly, pro porovnání, udělány i u
kmene R. jostii RHA1. Genom tohoto kmene obsahuje dva shluky homologních genů kódujících
fenolhydroxylasu se shodným uspořádáním genů.
U kmene R. eryhtropolis CCM2595 byl proveden knock-out strukturních genů pheA2A1.
Připravený kmen nebyl schopen růst na fenolu jako jediném zdroji uhlíku a energie, což
dokazuje, že geny u tohoto kmene kódují jedinou fenolhydroxylasu. Měřením specifické
enzymové aktivity fenolhyfroxylasy v buňkách narostlých na různých substrátech se zjistilo, že
syntéza enzymu je indukována fenolem a potlačována v přítomnosti sukcinátu. Mezigenové
oblasti pheR-pheA2, nesoucí promotory a regulační sekvence, byly v obou orientacích klonovány
do promoter-probe vektoru pEPR1 s reportérovým genem gfpuv. Měřením aktivity promotorů na
různých substrátech bylo zjištěno, že fenol indukuje všechny studované promotory. Sukcinát
reprimuje promotory PpheR a PpheA2 z R. erythropolis a klastru II z R. jostii. Glukosa částečně
reprimuje aktivitu obou promotorů souboru II u R. jostii. Aromatické látky jako benzoát, phydroxybenzoát ani protokatechát neindukují aktivitu promotoru ani ji nepotlačují v přítomnosti
induktoru. Indukce syntézy fenolhydroxylasy fenolem a represe iniciace transkripce sukcinátem
byly potvrzené i technikou qPCR Technikou DNA-afinitní chromatografie byla prokázána vazba
globálního regulačního proteinu typu CRP na mezigenovou oblast pheR-pheA2 u všech
studovaných klastrů. Stejnou metodou byl z R. eryhropolis izolován i regulátor typu AraC. Byl
testován růst kmenů R. erythropolis CCM2595 a odvozených kmenů se zvýšenou dózi genů pro
fenolhydroxylasu a degradační dráhy katecholu na fenolu jako jediném zdroji uhlíku a energie a
porovnána s růstem R. jostii RHA1 za stejných podmínek.
Ing. Juraj Szőköl
Title: Analysis of genes coding for enzymes involved in degradation of aromatic pollutants
in Rhodococcus erythropolis
Supervisor: Ing. Miroslav Pátek, CSc.
Study programme: Biochemie a biotechnologie
Subprogramme: Biotechnologie
SUMMARY
The thesis deals with the study of basic mechanisms involved in the regulation of transcription of
the genes coding for phenolhydroxylase in the strain R. erythropolis CCM2595. The enzyme
cluster is composed of two structural genes pheA2 and pheA1, coding for small and large subunit
of the enzyme, and divergently transcribed gene pheR coding for regulator of AraC family.
Genome of the strain R. jostii RHA1 revealed presence of two homologous clusters coding for
phenolhydroxylase with the same gene arrangement. Some of the experiments were performed
with both strains simultaneously.
The pheA2A1 genes were knocked out in the strain R. erythropolis CCM2595. The strain was
unable to grow on phenol as a sole source of carbon and energy giving a proof of presence only
one gene cluster coding for the enzyme. The enzyme activity measurement revealed that
synthesis of the enzyme is induced by phenol and suppressed by succinate. The intergenic region
pheA2-pheR, carrying promoters and regulatory sequences, were cloned in promoter probe vector
pEPR1 in both orientations. The vector carries promoterless reporter gene gfpuv. The promoter
activity measurement revealed that phenol induces all promoters. Succinate was shown to cause
repression of promoters PpheA2 and PpheR of R. erythropolis and cluster II of R. jostii. Activity
of both promoters of cluster II of R. jostii was partially repressed by glucose. The aromatic
compounds benzoate, p-hydroxybenzoate and protocatechuate were shown to neither induce nor
repress activity of any promoter under study. The induction of promoter activity by phenol in R.
erythropolis was confirmed also by qPCR measurement. DNA-affinity chromatography was used
to prove binding of global regulator protein of CRP family to inergenic region of all gene
clusters. The same technique was used to find AraC-type transcriptional regulator to bind to the
intergenic region of R. erythropolis CCM2595. The strains of wild types of R. erythropolis
CCM2595 and R. jostii RHA1 alongside with the strains with improved ability of phenol and
catechol degradation, respectively, were cultivated on phenol as sole source of carbon and
energy.
Ing. Lukáš Jelínek
Název: Nové způsoby zvýšení koloidní stability piva
Školitel: Prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc.
SOUHRN
V této práci budou představeny dva nové stabilizační mechanismy, sloužící k odstranění
zákalotvorných prekursorů (polyfenolů či prolaminů) z piva. Přípravek BEERPAP®, je nový typ
polyamidového sorbentu sloužící k cílenému odstranění
zákalotvorných polyfenolů, přičemž obsah ostatních látek (zejména fenolových monomerních
antioxidantů) by jeho použitím ovlivněn být neměl. Tento stabilizační materiál se skládá ze dvou
základních složek, a to z křemelinového jádra, které je potažené aktivní vrstvou polyamidu 6.
Použití prostředku BEERPAP® v pivovarském provozu je shodné s použitím stabilizátorů na bázi
PVPP. V této práci byly porovnány sorpční vlastnosti těchto dvou materiálů (v modelových i
provozních podmínkách) a na molekulové úrovni byla popsána povaha vazeb mezi fenolovými
látkami a polyamidovými sorbenty pomocí metody FTIR. Pro tento účel byla vybrána skupina
fenolových látek, které se největší měrou podílejí na vzniku protein-polyfenolového zákalu
(flavan-3-oly) a dále pak skupina monomerních fenolových kyselin (deriváty kyselin benzoové a
skořicové), které jsou přímo spojovány s antioxidačními vlastnostmi piva.
V další části této práce byla představena možnost využití odpadních chmelových
materiálů (zbytek po výrobě CO2 extraktu a zbytek po přípravě chmelových pelet T45), coby
alternativního srážecího stabilizátoru. Tyto materiály jsou bohatým zdrojem zákalotvorných
flavan-3-olů, které mohou při správném použití přispět k vysrážení zákalotvorných prolaminů z
piva. Nespornou výhodou chmelových zbytků je téměř nulový obsah hořkých a aromatických
látek, ovlivňujících výsledný senzorický profil piva. V rámci této práce byly u zmíněných
chmelových zbytků provedeny analýzy obsahu α-hořkých kyselin, silic, celkových polyfenolů,
profilu fenolových monomerů a antioxidačních vlastností. Na základě jejich výsledků byla
naplánována příprava várek, u nichž byly tyto materiály použity v kombinaci s aromatickou
chmelovou odrůdou s vysokým obsahem polyfenolů během chmelovaru. U mladin byl sledován
obsah zákalotvorných polyfenolů a prolaminů během hlavního kvašení a dokvášení. Tyto obsahy
byly dále konfrontovány s výsledky získanými u vzorku standardní mladiny chmelené pouze
CO2 extraktem (bez chmelových polyfenolů). U hotových piv byla rovněž provedena analýza
základních senzorických parametrů (hořkost a barva), aby bylo zjištěno, do jaké míry je použité
chmelové materiály ovlivňují.
Ing. Lukáš Jelínek
Title: New ways to improve the colloidal stability of beer
Supervisor: Prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc.
SUMMARY
Two new methods for beer colloidal stabilization, based on the removal of haze-active
precursors (polyphenols and prolamins), are presented in this work.
BEERPAP® is a new type of polyamide sorbent used for the directed removal of
hazeactive polyphenols from beer, while its impact on the content of other substances (mainly
phenolic antioxidants) is minimal. This sorbent consists of two basic components (layers) – a
diatomaceous earth core coated with an active layer of polyamide 6. Use of this technology in
brewing is similar to the use of commercially produced stabilisation materials based on PVPP.
The aim of this study was to compare the sorption properties of the two materials (BEERPAP®
and PVPP) in a model and under industrial conditions, and to describe the nature of the bonding
between phenolic compounds and the polyamide sorbent at the molecular level (using FTIR
analysis). For this purpose, a group of phenolic compounds that are primarily associated with the
formation of a protein-polyphenol haze (flavan-3-ols), and a group of monomeric phenolic acids
(benzoic acid derivatives and cinnamic acid) that are directly associated with the antioxidant
properties of beer, were chosen.
In the second part of this work, the possibility of using waste hop materials (the residue from the
production of a CO2 extract, and the residue from the production of T45 lupulin-enriched hop
pellets), as an alternative stabilization method is described. Both materials are a rich source of
haze active flavan-3-ols, which could contribute to the precipitation of haze-active prolamins in
beer. The great advantage of using hop residues is the almost complete absence of bitter and
aromatic substances that would otherwise affect the final flavour profile of the beer. In this work,
the hop residues were analysed for their content of α-bitter acids, essential oils, total polyphenols,
phenolic monomers and antioxidant properties. Based on the results of these analyses, brewing
trials were planned and hop materials were used in combination with aromatic hop varieties
containing high levels of polyphenols during wort boiling. The content of haze-active precursors
was monitored from bitter wort to final beer. The level of these compounds was also compared
with results obtained in the standard sample of bitter wort hopped only with CO2 extract (not
containing any hop polyphenols). Basic sensory parameters (bitterness and colour) were also
analysed in the final beer.
Ing. Ljuba Zídková
Název: Biodegradace monoaromátů v reálných matricích bakterií Rhodococcus erythropolis
Školitel: prof. Ing. Alena Čejková, CSc.
SOUHRN
V rámci vsádkových a kontinuálních laboratorních testů byla nejprve na vzorcích
kontaminovaných odpadních či podzemních vod a zemin zjišťována účinnosti biodegradace
pomocí bakterie Rhodococcus erythropolis CCM 2595 v porovnání s autochtonními
mikroorganismy. Pro porovnání byl testován rovněž druhý účinný degradér xenobiotik, bakterie
Rhodococcus jostii RHA1. Vzorky obsahovaly alifatické ropné uhlovodíky, polycyklické
aromatické uhlovodíky, fenoly a další minoritně zastoupené kontaminanty.
V průběhu testů byla prokázána biodegradace fenolu, anthracenu a naftalenu testovanými kmeny.
Na základě výsledků vsádkových a kontinuálních laboratorních testů byla jako nejvhodnější
lokalita pro navazující testy vybrána Spolchemie. V odpadní vodě z této lokality byla
porovnávána účinnost biodegradace fenolu pomocí 7 rekombinantních kmenů R. erythropolis s
původním kmenem R. erythropolis CCM 2595 a s autochtonními mikroorganismy. Nejlepších
výsledků bylo dosaženo ve variantě inokulované kmenem RE CCM 2595 (pSRK30B) nesoucím
geny KmR, catABC, pheR, pheA2A1 s inaktivací genu pro represor catR na plasmidu. Během 327
h bylo v této variantě degradováno veškeré vsádkové množství fenolu odpovídající počáteční
koncentraci 650 mg/l. V rámci těchto testů byla rovněž ověřována stabilita vložených plasmidů
jejich izolací v době ukončení kultivace. Výsledky dokládají přítomnost shodných nebo
modifikovaných plasmidů i po 14-ti denní kultivaci v testované odpadní vodě.
Na základě výsledků laboratorních testů s rekombinantními kmeny bylo dále provedeno
poloprovozní testování biodegradace fenolu v odpadní vodě z téže lokality v 1m3 bioreaktoru. K
inokulaci byla použita směs všech 7 rekombinantních kmenů. Nejvyšší biodegradační rychlost
(1350 mg/l.den) v režimu fed-batch byla zaznamenána v biodegradační fázi při vstupní
koncentraci fenolu 600 mg/l. V kontinuálním režimu a při organické zátěži (OL) 86 mg/l.den
pracoval bioreaktor s účinností 100 %, při OL 516 mg/l.den s účinností 87 % a při OL 600
mg/l.den s účinností 70 %. V rámci fed-batch i kontinuálního poloprovozního testu tedy
probíhala účinná biodegradace fenolu. Inokulované rekombinantní bakterie R. erythropolis
ovšem nebyly v době ukončení testů v bioreaktoru identifikovány. Z odpadní vody byli naproti
tomu v závěru kontinuálního testu izolováni 4 jiní účinní degradéři fenolu.
Tato práce byla provedena ve spolupráci se společností Dekonta, a.s. v rámci výzkumného
projektu Aromagen (2B08062) spolufinancovaného Ministerstvem školství mládeže a
tělovýchovy ČR.
Ing. Ljuba Zídková
Title: Biodegradation of monoaromatic compounds using Rhodococcus erythropolis in
real contaminated samples
Supervisor: prof. Ing. Alena Čejková, CSc.
Study programme: Biochemistry a Biotechnology
Study field: Biotechnology
SUMMARY
The biodegradation efficiency of Rhodococcus erythropolis CCM 2595 in comparison to
autochthonous microorganisms was tested in batch and continuous experiments using
contaminated samples of wastewaters, groundwaters and soils. Rhodococcus jostii RHA1
wastested as well to compare results of biodegradation with other effficient xenobiotic degrader.
Samples contained aliphatic hydrocarbons, polycyclic aromatic hydrocarbons, phenolic
compounds and other minority components. In the framework of these experiments
biodegradation of phenol, anthracene and naphthalene by tested strains was proven. Spolchemie
was selected as the most suitable site for following testing on the basis of results from above
mentioned batch and continuous experiments. The Spolchemie wastewater was used for
comparison of the phenol biodegradation efficiency of the wild strain R. erythropolis CCM 2595,
its 7 recombinant derivatives, and autochthonous microorganisms. The best results were achieved
in the variant inoculated by RE CCM 2595 (pSRK30B) strain carrying catABC, pheR, pheA2A1
genes (inserted into the coding region of the repressor catR gene, which was thus disrupted) and
KmR gene. The total amount of phenol (650 mg/l) was degraded in 327 h. The stability of all
inserted plasmids was also found at the end of the cultivation. The results showed the presence of
identical or modified plasmids even after14-day cultivation.
On the basis of the achieved results of the phenol biodegradation using recombinant bacteria in
the laboratory scale a pilot-scale testing (1m3 bioreactor) was carried out in the same wastewater.
The bioreactor was inoculated by a mixture of all 7 tested recombinant strains. The highest
degradation rate (1350 mg/l.day) was achieved during a biodegradation phase in a fed-batch
cultivation for initial phenol concentration 600 mg/l. Efficiency of 100% was observed during
continuous cultivation for organic load (OL) 86 mg/l.day, efficiency of 87% for OL 516
mg/l.day, and 70% for OL 600 mg/l.day. The effective phenol removal was observed in a pilotscale testing. However, recombinant strains R. erythropolis CCM 2595 were not detected in the
bioreactor. On the contrary, 4 other efficient phenol degraders were isolated from the wastewater
at the end of the pilot-scale continuous cultivation.
The dissertation was created in cooperation with Dekonta in the framework of the research
project Aromagen (2B08062) co-financed by the Ministry of Education, Youth and Sports of the
Czech Republic.
Ing. Olga Schreiberová
Název: Biotechnologický potenciál a adhezivní schopnosti buněčných obalů bakterie rodu
Rhodococcus
Školitel: prof. Ing. Jan Masák, CSc.
SOUHRN
Problematika využití mikroorganismů v biotechnologiích je velmi zkoumaným tématem. V tomto
kontextu je rod Rhodococcus jedním z nejvíce studovaných a existuje již řada procesů, v nichž
našel své uplatnění. V rámci této práce jsme se soustředili na studium využití zástupců tohoto
rodu při aplikacích v bioremediačních technologiích, a to při odbourávání častého polutantu
životního prostředí – fenolu. Byly navrženy vhodné kultivační systémy a při laboratorních
podmínkách byly zjištěny degradační charakteristiky vybraných kmenů. Velká pozornost byla
rovněž věnována studiu atypických buněčných obalů rodu Rhodococcus a byly hledány
souvislosti mezi kultivačními podmínkami a složením buněčných obalů, které jsou významné pro
adhezi buněk. Významnou část práce rovněž tvoří poznatky týkající se biosyntetického
potenciálu tohoto rodu, kdy byly pomocí řízené prekurzorové biosyntézy získány potenciálně
farmaceuticky významné produkty.
Ing. Olga Schreiberová
Název: Biotechnological potential and adhesive capabilities of cell envelopes of the bacterial
genus Rhodococcus
Supervisor: prof. Ing. Jan Masák, CSc.
Study programme: Biochemistry a Biotechnology
Study field: Biotechnology
SUMMARY
The use of microorganisms in biotechnology is a highly researched topic. In this context, the
genus Rhodococcus is one of the most studied and there is a great number of processes in which
found an employment. This work is focused on the application of this genus in bioremediation
technologies and the elimination of frequent environmental pollutant phenol. Appropriate culture
systems were designed and degradation characteristics of selected strains in laboratory conditions
were determined. Great attention was also devoted to the study of the atypical cell envelope
composition and links between cultivation conditions and cell envelopes composition, that is
important for cell adhesion, were sought. An important part of the work consists of findings
concerning biosynthetic potential of this genus, in which were by precursor biosynthesis obtained
potentially pharmaceutically important products.
Ing. Petr Košin
Název: Vliv jakostních znaků piva na spotřebitele
Školitel: doc. Ing. Jan Šavel, CSc.
SOUHRN
Teoretická část disertační práce pojednává o roli řízení jakosti v průmyslové výrobě a
jednotlivých kvalitativních znacích piva, se zaměřením na jejich vnímání zákazníkem, způsobech
objektivního měření a technologických možnostech jejich řízení.
Praktická část disertační práce se zabývá třemi oblastmi jakosti piva: vlastnostmi pivní pěny,
vlivem způsobu čepování a plastových sudů na kvalitu piva a novými možnostmi určení
senzorické stability piva.
Zákazníci považovali pěnu za kvalitní, dokud se na povrchu piva neobjevila lysinka. S tímto
vnímání kvality pěny přímo souvisela nalévací zkouška a nová metoda stanovení pěnivé
schopnosti matrice. Naopak výsledky nejvyužívanější metody NIBEM s dobou do
objevení lysinky téměř nesouvisely, protože tryskou NIBEM vzniká nepřirozeně jemná pěna.
Stabilita pěny souvisela s obsahem bílkovin tuzemských piv jen velice volně, protože obsah
bílkovin v pivech byl pro vytvoření stabilní pěny přebytečný. Stabilita pěny byla omezována
vyšším obsahem látek srážející pěnu, jako jsou lipidy. Pěnivá schopnost matrice
pomohla identifikovat místa výroby, kde se pivo obohacovalo o látky snižující stabilitu pěny.
Všichni členové degustační komise odlišili pivo čepované na tři zátahy od piva čepovaného na
jeden zátah, které mělo výraznější říz, intenzivnější a hrubší hořkost a intenzivnější příchuť po
přidaném diacetylu. Objektivně byl hlavní rozdíl mezi pivy v obsahu zbytkového CO 2, který v
pivu čepovaném na třikrát v závislosti na teplotě poklesl až o polovinu oproti původnímu
množství, zatímco u piva čepovaného na jeden zátah se nezměnil. Ztrátu CO2 bylo možné
odhadnout pomocí navržené rovnice z poměru mezi objemem vytvořené pěny a celkovým
objemem piva před nalitím.
Senzorická stabilita piva se určila degustačním hodnocením velkého množství šarží různě starého
piva v jednom čase a statistickým zpracováním dat. Pro objektivní stanovení rychlosti
senzorického stárnutí se zavedlo automatizované stanovení furfuralu, které sice nereagovalo na
zatížení piva kyslíkem, ale citlivě rozpoznalo tepelnou zátěž piva jak při skladování, tak při
varu mladiny.
Ing. Petr Košin
Title: Consumer perception of beer qualitative characteristics
Supervisor: doc. Ing. Jan Šavel, CSc.
Study programme: Biochemistry and Biotechnology Subprogramme: Biotechnology
SUMMARY
The theoretical part of the dissertation deals with the role of quality management in industrial
production and individual quality characteristics of beer, focused on their perception by
customers, the way of objective evaluation and technological potential of
managing these qualitative characteristics during beer production.
The experimental part of the dissertation addresses three fields of beer quality: the characteristics
of beer foam, the influence of tapping technique and plastic barrels on beer quality and new
methods for sensorial stability assessment.
Customers considered foam as of high quality until bald patches appeared on the beer surface.
This perception of foam quality was best reflected by the pouring test and a newly developed
measurement of matrix foaming potential. Contrarily the most spread NIBEM method was
minimally related to the time of a bald patch appearance, because unnaturally
dense foam is created during NIBEM measurement.
Foam stability only weakly correlated to the protein content of commercial beer samples because
there was an excessive amount of protein in beer for foam creation. Foam stability of commercial
samples was limited by the content of foam destabilizing material, such as lipids. Matrix foaming
potential measurement was able to find production steps where beer was enriched by foam
destabilizing substances.
All members of the tasting panel were able to distinguish beer tapped with three draughts from
beer tapped with one draught, which had more intense prickling taste with more intense and
harsher bitterness. The main objective difference between samples was in the CO2 content of beer
in the glass. Beer tapped with three draughts had about half the original CO2, depending also on
the temperature of beer. The CO2 loss could be estimated by the proposed equation from the ratio
of volume of foam and beer before tapping.
Sensorial stability was assessed by sensory evaluation of a large number of batches at one time
and statistical treatment of the data. An automated measurement of furfural in beer was
established for an objective evaluation of sensorial deterioration. Although the method did not
respond to oxygen content of beer during aging, it could sensitively recognize thermal load on
beer during storage or wort boiling.
Ing. Vratislav Novák
Název: Degradace směsi par styrenu a acetonu biofiltrací
Školitel: Prof. Ing. Jan Páca, DrSc.
SOUHRN
Styren představuje důležitou průmyslovou chemikálii se širokým využitím. Ve výrobnách
sklolaminátových skořepin se používá jako disperzní prostředí pro polyesterové pryskyřice.
Součástí produkčního procesu je mytí lisovacích forem acetonem, přičemž vzniká velké množství
odpadního vzduchu, které je možné vyčistit s využitím biofiltrace. A právě efektivita
odbourávání těchto látek v biotrickling filtru a biofiltru je předmětem této práce.
Před zahájením biologických experimentů v biotrickling filtru byla provedena série testů, která
poskytla cenné informace o jeho hydromechanických vlastnostech. Bylo zjištěno, že ani jedna z
hydrodynamických charakteristik (zádrž kapaliny, doba homogenizace, střední doba prodlení)
není závislá na velikosti fiktivní rychlosti vzduchu. Toto neplatí pro velikost
průtoku kapaliny, mezi nímž a sledovanými veličinami platí nepřímá úměrnost.
Hned po adaptační fázi následoval experiment, který zahrnoval pouze styren a měl pomoci
objasnit vliv EBRT na průběh biodegradace. Pozorování ukázala, že biotrickling filtr dosáhnul
nižšího, zato stabilního eliminačního výkonu ve srovnání s biofiltrem. V další části experimentu
byla sledována dynamika návratu na výchozí pomínky.
Stěžejní část práce byla zaměřena na studium biodegradace směsi acetonu a styrenu. Vedle
výkonových parametrů byla sledována interakce mezi oběma složkami. Bylo zjištěno, že
přítomnost acetonu ve vzduchu významně ovlivňuje efektivitu biodegrace styrenu, ale pouze při
vyšších hodnotách celkové organické zátěže. Když se poměr koncentrací obrátil, efektivita
biodegradace acetonu nebyla ovlivněna vůbec. Jev byl pozorován u obou
bioreaktorů, ale v případě biotrickling filtru byl o poznání silnější.
U obou bioreaktorů byly provedeny opakované koncentrační zátěže, které prokázaly schopnost
dlouhodobé adaptace na danou směs acetonu a styrenu. Při vyšším zatížení biotrickling filtru
acetonem byl pozorován určitý pokles biodegradačního výkonu ve srovnání s biofiltrem. Patrně
bylo dosaženo inhibiční koncentrace ve vodné fázi, protože neomezená rozpustnost acetonu
umožnila jeho akumulaci.
Ing. Vratislav Novák
Title: Degradation of Styrene and Acetone Mixture Using Biofiltration
Supervisor: Prof. Ing. Jan Páca, DrSc.
SUMMARY
Styrene represents widely used industrial chemical. In fiberglass shell manufacturing plants, it is
used as a dispersion medium for polyester resins. Cleaning press molds with acetone is a part of
the production process, giving rise to large quantities of exhaust air, which can be cleaned via
biofiltration. And the removal effectiveness of these substances in the biotrickling filter and
biofilter is the subject of this work.
Before starting biological experiments, a series of tests was carried out providing valuable
information about the hydromechanical properties of biotrickling filter. It was found that none of
the hydrodynamic characteristics (liquid holdup, mixing time, mean residence time) is not
dependent the influence of EBRT on biodegradation effectiveness. Observations showed that the
biotrickling filter had reached a lower, but steady elimination performance in comparison to the
biofilter. In the next part of the experiment, return dynamics of loading characteristics was
monitored.
The main part of the work was focused on the study of biodegradation of acetone and styrene
mixture. Besides the performance parameters, interaction between the components was observed.
It was found that the presence of acetone in the air greatly affects styrene biodegradation
efficiency, but only at higher values of total organic loading. When the concentration ratio
reversed, the elimination efficiency of acetone was not affected at all. The phenomenon was
observed in both bioreactors, but in the case of biotrickling filter it was much more pronounced.
Reapeted loadings were carried out in both bioreactors which proved to develop longterm
adaptation to the mixture. At higher load of acetone, biotrickling filter showed a decrease in
performance compared to the biofilter. Probably inhibitory concentration in the aqueous phase
had been reached due to unlimited water solubility of acetone, thus allowing its accumulation.
Ing. Radek Lehnert
Název: Aplikace imobilizovaných kvasinkových
nealkoholického piva
Školitel: Doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D.
buněk
při
kontinuální
výrobě
SOUHRN
V práci byla zkoumána tvorba a přeměna nejdůležitějších senzoricky aktivních látek probíhající v
modelovém mediu při jeho kontinuální fermentaci s biomasou Saccharomyces cerevisiae
imobilizovanou na částicích mláta (nosič) v gaslift reaktoru. Vznik a přeměna senzoricky
aktivních látek byla studována nejprve v závislosti na dodávkách kyslíku, následně byl zkoumán
vliv průměrné doby zdržení a teploty fermentace za optimalizovaných dodávek kyslíku. K
nastavení přesného dávkování kyslíku byl stanoven objemový koeficient přestupu kyslíku (kLa),
tzv. gassing out metodou. Hodnota kLa pro provozní koncentraci nosiče (13,8 g.l-1) činila 0,98 ±
0,12 h-1. Modelové medium obsahovalo kromě živin také aldehydy (hexanal, 2-methylpropanal,
3-methylbutanal a furfural) v množství 100 – 200 µg.l-1. Svým složením modelové medium
napodobovalo složení mladiny s výhodou neměnného složení v průběhu dlouhodobých
experimentů. Výsledky ukázaly, že dodávky kyslíku jsou důležitým parametrem k řízení tvorby
(ethanol, vyšší alkoholy, estery, acetaldehyd a vicinální diketony) a redukce (aldehydy)
senzoricky aktivních látek v kontinuálním gaslift reaktoru s imobilizovanou biomasou. Při
optimálních dodávkách kyslíku bylo možné získat modelový produkt, který se svými
analytickými parametry blížil komerčně dostupným nealkoholickým pivům vyráběným klasickou
vsádkovou limitovanou fermentací. Bylo rovněž zjištěno, že rostoucí průměrná doba zdržení a
vyšší teplota vedly k vyššímu prokvašení a tím i k vyšší tvorbě senzoricky aktivních látek, avšak
při vyšších průměrných dobách zdržení docházelo k ztrátám esterů stripováním hnacím plynem.
Parametry optimalizovaného procesu (8°C, průměrná doba zdržení 6,5 h, dodávka kyslíku do
gaslift reaktoru ca. 1 mg.l-1.h-1) byly po vhodně zvolených kompromisech přeneseny na
fermentaci reálných mladin, výsledné produkty byly podrobeny senzorickému hodnocení a jejich
složení bylo porovnáno s komerčně dostupnými nealkoholickými pivy vyráběnými vsádkovou
fermentací. Výsledný optimalizovaný produkt byl svým složením i senzoricky srovnatelný s
komerčními vzorky a z hlediska produktivity těžil z výhod kontinuální fermentace. Použitím
vhodného nosiče (částice mláta) lze zvýraznit ekonomickou rentabilitu kontinuálního procesu
fermentace nealkoholického piva. Proto byly odhadnuty výrobní náklady nosiče použitého v této
práci.
Ing. Radek Lehnert
Title: Application of immobilized yeast cells in continuous alcohol-free beer
Supervisor: Assoc. Prof. Tomáš Brányik, Ph.D.
SUMMARY
The influence of process parameters such as oxygen supply, temperature and residence time on
the formation and conversion of the most important flavour compounds during continuous,
alcohol-free beer fermentation was studied in a model medium. Fermentation experiments were
carried out in a continuously operating gas-lift reactor (GLR) with brewing yeast Saccharomyces
cerevisiae immobilized onto spent grains. In order to achieve an accurate oxygen supply, the
volumetric oxygen mass transfer coefficient (kLa) was determined using the so called gassing-out
method. The kLa value obtained for the concentration of carrier used during fermentation
experiments (13,8 g.L-1) in GLR was 0,98 ± 0,12 h-1. Besides nutrients, the model medium
contained also aldehydes (hexanal, 2methylpropanal, 3-methylbutanal, and furfural) in
concentrations between 100-200 µg.L-1. The model medium mimicked real brewery wort with the
advantage of a constant composition in the long-term experiments. The results suggest that
oxygen supply is an influential tool for controlling the degree of formation (ethanol, higher
alcohols, esters, acetaldehyde and vicinal diketones) and reduction (aldehydes) of flavour active
compounds in a continuously operated GLR with immobilized biocatalyst. Under optimal oxygen
supply it was possible to obtain a model product with a composition approaching that of
commercial alcohol-free beers produced by traditional limited fermentation in batch. It was also
found that increased residence time and fermentation temperature leads to higher degree of
fermentation and thus to higher formation and/or conversion of flavour active compounds.
However, increased residence times decreased the levels of esters due to their stripping by
driving gas. Subsequently, the optimized process parameters (oxygen supply 1 mg.L-1h-1,
residence time 6.5 h and temperature 8°C) were, after a suitably chosen compromise, used to
produce real alcohol-free beers. The final products were compared with batch fermented alcoholfree beers using the methods of instrumental and sensorial analysis. The continuously fermented
alcohol-free beers were found comparable with commercial products with the benefit of short
production time in flavour of continuous process. Using a suitable carrier (spent grain particles)
can enhance the profitability of continuous alcohol-free beer fermentation.
Therefore the production costs of the carrier used in this work were estimated.
Ing. Petr Hyka
Název: Studium fyziologického stavu mikrobiální kultury pomocí průtokového cytometru
Školitel: Prof. Karel Melzoch, PhD a Prof. Dr. Karin Kovar
SOUHRN
Výrazného zvýšení produktivity je možné dosáhnout navržením vhodného bioprocesu a
kultivačních podmínek odpovídajících metabolickým schopnostem jednotlivých buněk. Nalezení
nejlepší kombinace vyžaduje spolehlivé metody, které umožní formulovat základní principy,
které vedou ke zvýšení produktivity. Metody kombinující barvení buněk fluorescenčními barvivy
a stanovení počtu obarvených buněk pomocí průtokové cytometrie jsou účinným nástrojem pro
porovnání fyziologického stavu různých (rekombinantních) kmenů a ke studiu heterogenity
jednodruhové populace v bioreaktoru. Vybrané metody studia změn morfologie a fyziologického
stavu jednotlivých buněk se osvědčily i v případech, kdy jiné konvenční metody jako je analýza
výměny plynů selhávají. Předkládané metody byly optimalizovány pro stanovení složení biomasy
a životaschopnosti buněk jednobuněčných zelených řas Chlorella vulgaris a různých
rekombinantních kmenů metylotrofní kvasinky Pichia pastoris. Porovnány byly kmeny P.
pastoris Mut+ kultivované na substrátu obsahujícím směs metanolu a glukózy, které do
mimobuněčného prostoru produkují "problematickou" molekulu (prasečí trypsinogen) nebo
"neškodnou" molekulu (křenová peroxidáza). V důsledku kombinace následujících tří vlivů bylo
pozorováno narušení životaschopnosti buněk: produkce rekombinantního proteinu, vysoká
koncentrace biomasy (vyšší než 80 g l-1) a nízké pH 4 (obvykle používané k zabránění
proteolýze). Přežívání buněk se zvýšilo, pokud byl některý z těchto stresových faktorů vyloučen.
Kromě toho bylo přežívání sníženo v důsledku mimobuněčné akumulace metanolu. Rozsah
fyziologické odezvy byl odlišný při různých kombinacích produkovaného rekombinantního
proteinu a použitého promotoru (tj. alkohol oxidázy 1, AOX1, nebo syntetického promotoru d6*
lišící se silou a způsobem regulace). Výsledky této studie mohou představovat užitečnou zpětnou
vazbu, která může přispět k racionálnímu návrhu rekombinantních kmenů kvasinek rodu Pichia.
Metody průtokové cytometrie zavedené v této práci umožní nové postupy pro optimalizaci
bioprocesů stejně jako cílenou selekci buněk určitých vlastností. Průtokový cytometer v
kombinaci s třídící jednotkou je účinným nástrojem pro přípravu axenických kultur
jednobuněčných řas. Následkem nižší životaschopnosti buněk, kdy je část z celkové biomasy
metabolicky neaktivní, jsou specifické rychlosti růstu biomasy, tvorby produktu a spotřeby
substrátu (vztažené pouze na metabolicky aktivní biomasu) výrazně vyšší než hodnoty vztažené
na celkovou biomasu v bioreaktoru. Informace o průběžném fyziologickém stavu jednotlivých
buněk může být proto použita při kontrole růstu metabolicky aktivních buněk. Tento nový způsob
řízení procesu, který zohledňuje viabilitu buněčné populace, může být s výhodou využit zejména
v procesech, při kterých je maximální tvorby produktu nebo jeho vhodné kvality dosaženo pouze
v úzkém rozmezí optimální specifické růstové rychlosti. Tato strategie vede ke zvýšení
produktivity a minimalizaci rizika předávkování limitujícího substrátu.
Ing. Petr Hyka
Title: Study of the physiological state of microbial cultures using flow-cytometry methods
Supervisor: Prof. Karel Melzoch, PhD and Prof. Dr. Karin Kovar
SUMMARY
A considerable potential for enhancing the performance of bioprocesses lies in matching the
process design to the metabolic capabilities of cells. To succeed in finding the best match,
reliable measures are needed which allow the basic principles for targeted performance
enhancement to be understood. Methods that combine staining with fluorescent dyes and
enumeration of stained cells by flow cytometry were shown to be a powerful tool for comparing
the physiological states of cultures of different (recombinant) strains and studying population
heterogeneity in single-species bioreactor cultures. Selected methods were established to
determine differences in both the morphology and physiological states of individual cells, even
where these changes could not be detected by conventional methods such as off-gas analyses. In
particular, methods for determination of biomass composition and cell viability were optimised
for use with the green microalga Chlorella vulgaris as well as with different recombinant strains
of the methylotrophic Pichia pastoris yeast.
P. pastoris Mut+ strains consuming mixtures of methanol and glucose while extracellularly
producing a ‘problematic’ reporter (porcine trypsinogen), or a ‘harmless’ reporter (horseradish
peroxidase), were compared. Impaired cell viabilities were observed due to a combined effect of
production of recombinant protein, cell densities higher than 80 g l-1 and low pH 4, usually
applied to counter proteolysis. Viability improved when any one of these stress factors was
excluded. However, viability was further reduced when methanol accumulated extracellularly. In
addition, the magnitude of the physiological response varied with different combinations of
protein (reporter) built and promoter used (i.e. the alcohol oxidase 1, AOX1 or d6* synthetic
promoters which are both differently strong and regulated). Due to the vast number of options for
strain design, such findings give essential feedback for the rational design of Pichia strains.
The flow-cytometry-based methods established also provide new concepts for the optimisation of
bioprocesses as well as enable the selection of cells by targeted characteristics. For the latter, a
flow-cytometry device combined with a sorter was shown to be effective and efficient for the
preparation of axenic microalgal cultures. When culture viability decreased and thus a part of the
total biomass was not metabolically active, the specific rates of biomass growth, product
formation and carbon substrate utilisation were significantly higher when determined in relation
to viable biomass than to the total biomass in the bioreactor. Information on the physiology of
individual cells might be further used to control actual growth performance of the metabolically
active cells. For systems in which maximum product formation or suitable product quality can be
achieved within a narrow range of optimum specific growth rates, a novel control strategy which
takes cell viability into account is essential to attaining targeted productivity and minimising the
risk of limiting substrate overdosing
Ing. Juraj Bolyó
Název: Imobilizace biomateriálů metodou sol-gel.
Školitel: Ing. Gabriela Kuncová, CSc.
SOUHRN
Vliv imobilizace na kvasinky zachycené do polymerních matric připravených metodou sol-gel
byl sledován dvěma způsoby: 1) při přechodu z aerobních podmínek na anaerobní (AA přechod),
2) z pohledu časo-prostorové dynamiky tvorby a šíření glykolytických vln u buněk kvasinek
během metabolizmu glykolýzy.
Buňky byly enkapsulovány do transparentních gelů: agarosy, křemičitého gelu a
křemičito/alginátového gelu.
Vliv imobilizace na kvasinky byl vyhodnocován ze změny intenzity fluorescence NAD(P)H
(Nikotinamid adenin dinukleotid (fosfát)). K popisu difuse kyslíku přes polymerní matrice během
změny z aerobních na anaerobní podmínky, při které zároveň dochází k změně koncentrace
NAD(P)H, bylo vyvinuto optické on-line monitorovaní koncentrace kyslíku. Koncentrace kyslíku
byla měřena pomocí komplexu kovu zachyceného ve filmu křemičitoorganického polymeru
ORMOCER®. Citlivost filmu na kyslík byla závislá na složení komplexu a stoupala v pořadí
[Ru(Phen)3] < [Ru(BaPhen)] ≤ [Ru(bpp)3] << [PdTPPC]. Závislost Stern-Volmerovy konstanty
na teplotě byla nejméně závislá pro [Ru(BaPhen)].
Rychlost prostupu kyslíku vrstvou polymerní matrice (tloušťky 0,4 mm) bez buněk, měřená jako
rychlost změny koncentrace kyslíku při AA přechodu byla vyšší u křemičitého než u křemičito–
alginátového gelu.
Relativní změna intenzity fluorescence NAD(P)H způsobená přechodem z aerobního do
anaerobního stavu byla vyšší u buněk imobilizovaných do vrstvy křemičitého gelu než u buněk v
křemičito/alginátové matrici. Rovněž bylo ukázáno, že buňky ve vrstvě křemičitého gelu
spotřebovávají více kyslíku. Začátek prudkého nárůstu intenzity fluorescence NAD(P)H
imobilizovaných buněk nastával při koncentraci kyslíku 0,783 ppm.
Vůbec poprvé byly zaznamenány glykolytické oscilace synchronní populace kvasinek, které byly
imobilizovány do třech polymerních matric (agaróza, křemičitý a křemičito/alginátový gel)
Časová dynamika sledována jako perioda a počet oscilačních cyklů byla podobná pro všechny tři
typy gelových matric s obsahem živých buněk (perioda 50-54 s, počet cyklů 1315) ale časoprostorová dynamika ukázala rozdíly ve tvaru glykolytických vln, rychlosti a směru šíření vln.
Rychlost šíření vln v křemičito/alginátové matrici byla téměř dvojnásobná oproti agarózové a
křemičité matrici. Směr šíření vln byl u agarózového a křemičitého gelu od středu směrem k
okraji vrstev, zatím co u křemičito/alginátového gelu byla opačná, tj. od okraje vrstvy směrem do
středu vrstvy.
Naměřené glykolytické oscilace byly srovnány s výsledky převzatého matematického modelu
skládajícího se z 25 rovnic popisujících glykolýzu a dvou rovnic pro difuzi v matrici.
Lineární difuzní koeficienty matric byly odhadnuty na základě šíření vln. V prvním přiblížení
matematický model vystihl naměřený průběh glykolytických oscilací u volných buněk a buněk
imobilizovaných do agarosového a křemičitého gelu ale v případě křemičito/alginátové vrstvy se
výsledek experimentu od matematického modelu výrazně liší.
Ing. Juraj Bolyó
Title: Immobilisation of biomaterials via sol-gel process.
Supervisor: Ing. Gabriela Kuncová, CSc.
SUMMARY
Effects of immobilisation on yeast entrapped in polymer matrices prepared by the solgel method
were investigated in two ways: 1) the transition from aerobic to anaerobic (AA) conditions, 2) in
terms of spatio-temporal dynamics of glycolytic and dispersive waves of yeast cells during the
metabolism of glycolysis. Cells were encapsulated in transparent gels: agarose, silica gel and
silica/alginate gel.
Effects of immobilisation on yeast were evaluated from changes in the fluorescence intensity of
NAD(P)H (Nicotineamide adenine dinucleotide (phosphate)). A new optical method for online
monitoring of oxygen concentration was developed to describe the diffusion of oxygen through
the polymer matrix during the change of AA . The oxygen concentration was measured using a
metal complex immobilised in a silicon-organic polymer film (ORMOCER®). The sensitivity of
this film to oxygen was dependent on the consumption of the complex with anincreasing order:
[Ru(Phen)3] < [Ru(BaPhen)] ≤ [Ru(bpp)3] << [PdTPPC]. The dependence of the Stern-Volmer
constant on temperature is related to [Ru(BaPhen)]. Oxygen transmission rates of the polymer
matrix layer (thickness 0.4 mm) without cells, as measured by the rate of change of oxygen
concentration in the AA transition were higher in silica than in silica/alginate gel.
Relative changes in the fluorescence intensity of NAD(P)H caused by the transition of AA
conditions were higher in cells immobilised on a layer of silica gel than with silica/alginate gel. It
was also shown that cells in a layer of silica gel consume more oxygen. The start of a sharp
increase in the fluorescence intensity of NAD(P)H from immobilised cells occured when the
oxygen concentration exceeded 0.783 ppm.
This was the first time that immobilised glycolytic oscillations of synchronous populations of
yeast were recorded using three polymer matrices (agarose, silica and silica/alginate gel).
Temporal dynamics monitoring of period and number of oscillation cycles were similar for all
three types of gel matrices containing living cells (period with 50-54, cycles 13-15), but the timespace dynamics showed differences in the shape of glycolytic waves, speed and direction of wave
propagation. Speeds of wave propagation in silica/alginate matrix were nearly double the agarose
and silica matrix. The direction of wave propagation in agarose and silica gel was from the center
towards the edge of the layers, while in the silica/alginate gel this was reversed, i.e. from the
layer edges toward the center layer.
Actual glycolytic oscillations were compared with theoretical simulations from a mathematical
model consisting of twenty-five equations describing glycolysis and two equations for diffusion
in the matrix. Linear diffusion coefficients of matrices were estimated on the basis of wave
propagation. The first simulations from the mathematical model were able to predict the actual
course of glycolytic oscillations in free cells and cells immobilised in agarose and silica gel. In
the case of silica/alginate gel the actual results of experiments differ significantly from simulation
using the mathematical model.
Ing. Tereza Hudcová
Název: Mechanismy biologické degradace nitroaromatických sloučenin
SOUHRN
Práce se zabývá aerobní biodegradací 2,4-dinitrotoluenu (2,4-DNT) a jeho směsí s 2,6dinitrotoluenem
(2,6-DNT) v simulované odpadní vodě v náplňových bioreaktorech v kontinuálním a batch
uspořádání s imobilizovanou mikrobiální populací. Směsná populace získaná z půdy dlouhodobě
kontaminované nitroaromatickými látkami podniku Explosia Pardubice, s.r.o. (ČR) byla použita
pro adaptaci a následnou biodegradaci 2,4-DNT. Adaptace probíhala dlouhodobě v submerzní
kultuře na třepačkách za aerobních podmínek. Po několika měsících byla směsná populace
úspěšně adaptována a byla použita jako inokulum pro imobilizaci v prvních dvou náplňových
reaktorech s náplňovým materiálem expandovanou břidlicí a perlitem. V dalších fázích
experimentů byly postupně sestaveny a zprovozněny ještě další 3 náplňové bioreaktory (PBR),
kde jako nosič sloužila expandovaná břidlice, perlit a polyuretanová pěna. Jednotlivé reaktory
byly provozovány 2 - 3 roky a byly zatěžovány různými způsoby. Buď byla zvyšována vstupní
koncentrace polutantu v odpadní vodě za konstantní doby zdržení (experimenty provedeny s 2,4DNT i ve směsi s 2,6-DNT) nebo bylo zvýšení organického zatížení dosaženo změnou průtokové
rychlosti simulované odpadní vody při konstantní vstupní koncetraci polutantů. Ze získaných dat
byla vyhodnocována degradační rychlost a degradační účinnost pro různé způsoby organického
zatížení systému.
Výsledky naznačují, že ze dvou testovaných izomerů je danou směsnou populací za aerobních
podmínek degradován samostatně nebo ve směsi v vysokou účinností pouze 2,4-DNT. 2,6-DNT
se v průběhu celé práce jevil jako nejobtížněji degradovatelný isomer citlivý na zvyšující se
organickou zátěž, maximální rychlost degradace dosažená u tohoto izomeru byla 40-krát nižší v
porovnání s 2,4DNT. Část práce byla věnována souběžné biodegradaci směsi 2,4-DNT s 4nitrotoluenem (4-NT). V jednotlivých PBR inokulovaných směsnou mikrobní populací o
známém složení bylo sledováno složení biofilmu v průběhu dlouhodobého provozu. Složení
biofilmu bylo v průběhu experimentů kvalitativně téměř neměnné. Měnil se především počet
přítomných mikoorganismů v závislosti na různém způsobu zatěžování systému a přítomném
kontaminantu. Majoritními členeny konsorcia byli zástupci rodu Pseudomonas, s prokázanou
schopností degradace 2,4-DNT v submerzním uspořádání, avšak s rychlostí degradace 50-krát
nižší ve srovnání se směsnou populací.
Práce prokázala možnost využití biodegradačních technologií pro účinnou aerobní degradaci
testovaných nitroaromatických látek, a to submerzní i imobilizovanou směsnou populací.
Ing. Tereza Hudcová
Title: Mechanisms of microbial degradation of nitroaromatic compounds
Study subprogramme: Biotechnology
SUMMARY
The study was focused on aerobic biodegradation of 2,4-dinitrotoluene (2,4-DNT) and its
mixtures from simulated wastewater. The biodegradation was operated in both batch mode and in
continuous long term mode with immobilized cells as a biocatalyst in the packed bed reactor. A
mixed culture isolated from aged nitroaromatic contaminated soil from Explosia Company,
(Pardubice, Czech Rep.) was used for adaptation and subsequent biodegradation of 2,4-DNT and
its isomer 2,6-dinitrotoluene (2,6-DNT). The adaptation was conducted for a several months in
500 ml shake flasks containing basal salt medium (BSM) at room temperature under aerobic
conditions. Nitrotoluenes served as a sole source of carbon, nitrogen and energy. After several
months, the mixed culture was successfully adapted to toxic nitrotoluenes as a substrate and the
inoculum was subsequently immobilized in a PBR. In the second stage of the experiments 3
packed bed reactors (PBRs) were subsequently constructed with expanded slate, perlite and
polyurethane foam as packed materials and operated in the up-flow mode. The reactors were in
operation for 2-3 years. The performed loading tests comprised both the loading by increasing
concentration of the pollutants in the inlet wastewater and by varying different wastewater flow
rate. The degradation rates and efficiencies of the DNTs isomers were both evaluated
individually and in their mixtures.
The results demonstrated that both isomers were degraded simultaneously and completely in
presence of oxygen. The nitro group position on the benzene ring influenced the degradation rate
of the individual DNT isomers at higher loading rates. The degradation of 2,6-DNT was shown to
be the most sensitive to the increasing load and its degradation rate was 40 times lower than 2,4DNT. Next part of this study was focused on the simultaneous biodegradation of the mixture of
2,4-DNT and 4nitrotoluene (4-NT) under different loading conditions. The identification of the
individual strains in the biofilm was performed during the course of this study to verify
variability of biofilm composition. Only quantity of the individual strains varied depending on
the varied loading conditions and on the organic compound present. Pseudomonas bacteria were
majority members of consortium. Pure bacterial strains were able to degrade 2,4-DNT bud with
50 times lower rate than mixed culture. The study proved the possibility of application of
biodegradation technologies for effective aerobic degradation of tested nitroaromatic compounds
using submerged or immobilized cells.
Ing. Renata Rychtáriková
Název: Antimikrobiální účinky imobilizovaných porfyrinů
Školitel: Ing. Gabriela Kuncová, CSc.
SOUHRN
V první části práce je popsána mikrobiologická metoda s použitím obrazové analýzy pro
kvantitativní vyhodnocení nárůstu mikroorganizmů na organokřemičitém nosiči s
imobilizovanými porfyriny po ozáření viditelným světlem. Jako testovací mikroorganizmy se
osvědčily vyselektované kmeny Lactobacillus helveticus CH-1 (bílé kolonie na tmavém agaru
MRS), Rhodococcus sp. (růžové kolonie na světlém agaru LB), Bacillus amyloliquefaciens 3129
(amylázová aktivita) a geneticky upravená Escherichia coli BL21(DE3) s vloženým plazmidem
pDsRed1N1 tvořící růžový fluorescenční protein.
V další části je uvedena příprava 6 základních typů nosičů s imobilizovanými porfyriny Jedná se
o filmy a vrstvy připravené z 1,2-bis(triethoxysilyl)ethanu (BTE) s 1,5,10,15tetrafenylporfyrinem (TPP), resp. 1,5,10,15-tetrakis(N-methylpyridinium-4yl)porfyrinem
(TMPyP), dále 1,6-bis(triethoxysilyl)hexanu (BTH), 1,8-bis(triethoxysilyl)oktanu (BTO) s TPP;
tetramethoxysilanu (TMOS) a tetrakis(2-hydroxyethoxy)silanu (THES) s TMPyP a ethoxidu
titaničitého s 5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenyl)porfyrinem (TPPS).
Do polydimethylsiloxanu (PDMS) byl zachycen porfyrin TPP. Uvedené porfyriny byly do těchto
matric zachyceny entrapmentem. Ten byl použit i pro zakotvení TPMyP, 1,5,10,15tetrakis(Nmethylpyridinium-2-yl)porfyrinu
(TMPyP2)
a
5,10,15,20-tetrakis(4trimethylammoniofenyl)porfyrinu (TTMAPP) na polyhydroxymethyl-siloxan (PHOMS).
U všech materiálů byly zjištěny jejich optické (absorbance a fluorescence) a texturní vlastnosti
(porozita) a použity k posouzení změn ve schopnosti zachycených porfyrinů generovat reaktivní
kyslíkové částice po ozáření viditelným světlem a tím vykazovat mikrobicidní účinnost.
Bylo zjištěno, že porfyriny TPP a TMPyP zachycené do porézních matric z BTE, BTH, BTO,
TMOS a THES a 5,10,15,20-tetrakis(4-trimethylammoniofenyl)porfyrin v PHOMS byly
mikrobicidně účinné, zatímco neporézní PDMS-TPP znatelný fotobaktericidní účinek
nevykazoval. Porfyrin TPPS působil fotomikrobicidně během svého řízeného uvolňování z
matrice TiO2 do prostředí.
Ing. Renata Rychtáriková
Title: Antimicrobial effects of immobilized porphyrins
Supervisor: Ing. Gabriela Kuncová, CSc.
SUMMARY
In the first part of the present dissertation, a novel microbiological method using visual image
analysis has been worked out for quantitative evaluation of bacterial growth on a porphyrinorganosilica after light illumination. Bacterial strains of Lactobacillus helveticus CH-1 (white
colonies in MRS agar), Rhodococus sp. (pink colonies in LB agar), Bacillus amyloliquefaciens
3129 (amylase activity), and GMO Escherichia coli BL21(DE3) (pink fluorescent colonies in LB
agar) have been found suitable for this purpose.
In the next part, a series of hybrid porphyrin-silica materials are described that were prepared by
entrapment of porphyrins to silica polymers obtained by the use of the following organosilicon
precursors: 1,2-bis(triethoxysilyl)ethane (BTE) for 1,5,10,15-tetraphenylporphyrin (TPP) or
1,5,10,15-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)porphyrin (TMPyP); 1,6bis(triethoxysilyl)hexane
(BTH) and 1,8-bis(triethoxysilyl)octane (BTO) for TPP; tetramethoxysilane (TMOS) and
tetrakis(hydroxyethoxy)silane (THES) for TMPyP, polydimethylsiloxane (PDMS) for TPP, and
finally poly(hydroxymethlysiloxane) (PHOMS) for TPP, TMPyP, 1,5,10,15-tetrakis(Nmethylpyridinium-2-yl)porphyrin
(TMPyP2),
and
5,10,15,20-tetrakis(4trimethylammoniophenyl)-porphyrin (TTMAPP). Of other precursors, titanium(IV) ethoxide was
used to immobilize 5,10,15,20-tetrakis(4sulfonatophenyl)porphyrin (TPPS).
All the materials were characterized by the absorption and fluorescence spectra and by their
texture. These characteristics were used to account for observed changes in the ability of
immobilized porphyrins to generate singlet oxygen and kill microorganisms after their
illumination with visible light.
It was found that TPP and TMPyP entrapped in porous matrices from BTE, BTH, BTO, TMOS,
and THES, along with TTMAPP in PHOMS showed antimicrobial properties, while TPP in
nonporous PDMS was inefficient. TPPS showed phototoxicity during its controlled release from
TiO2 hydrogels.
Ing. Michal Kuřec
Název: Kvasničný biofilm – jeho tvorba a kontrola v průběhu kontinuální výroby
nealkoholického piva
Školitel: doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D.
Studijní program: Biochemie a Biotechnologie Studijní obor: Biotechnologie
SOUHRN
Jednou z průmyslově důležitých kvalitativních vlastností kvasinek je jejich schopnost
interagovat s jinými povrchy. Mezi tyto interakce kvasničných povrchů patří u pivovarských
kvasinek flokulace, u některých vinných kvasinek tvorba shluků a také to může být tvorba
biofilmu na různých pevných površích (imobilizace na pevné povrchy). Cílem této práce bylo
ověřit, zda je možné pomocí fyzikálně-chemických adhezních modelů (klasická DLVO teorie,
termodynamický přístup a rozšířená DLVO teorie) vybrat vhodný kmen kvasinek schopný
kolonizovat pevné povrchy. Role fyzikálně-chemických povrchových vlastností při adhezi
kvasinek byla hodnocena na základě porovnání spočítaných předpovědí dle výše zmíněných
teorií s reálnými adhezními experimenty tří různých průmyslových kmenů kvasnic
(Saccharomyces cerevisiae) na částice mláta v kontinuálním gas-lift reaktoru. Největší shody
mezi předpovědí a reálnou adhezí kvasinek na částice mláta bylo dosaženo použitím rozšířené
DLVO (XDLVO) teorie, která je ze všech tří teorií nejkomplexnější. I přes tuto komplexnost
nebere teorie XDLVO v úvahu specifické biochemické interakce. Z tohoto důvodu byla pomocí
metody qRT-PCR kvantifikována exprese adhezních FLO genů pro jednotlivé kmeny kvasinek.
Prezentovaný přístup poskytuje nástroje pro výběr adhezivního kmene kvasinek a jeho následné
přiřazení k pevnému povrchu (nosiči) s vhodnými povrchovými vlastnostmi. Tento přístup tak
umožňuje navrhnout vhodné imobilizované biokatalyzátory pro řadu různých biotechnologických
procesů.
Následně byla také vyvinuta nová metoda pro sledování kvality imobilizovaného kvasničného
biofilmu. Tato metoda, u které bylo prokázáno, že je vhodná pro stanovení průměrného stáří
kvasničné populace, využívá kombinace průtokové cytometrie s barvením buněčných jizev a
fluorescenční mikroskopií. Metoda byla prakticky použita při dlouhodobém kvašení
nealkoholického piva v kontinuálně pracujícím gas-lift reaktoru a umožnila rychlé sledování a
předpověď stáří buněčné imobilizované populace.
Dříve získané znalosti o tvorbě a kontrole kvasničného biofilmu byly použity k demonstraci
produkce nealkoholického piva v systému kontinuálního kvašení s pivovarskými kvasinkami
imobilizovanými na částice mláta. Na základě jeho schopnosti ochotně tvořit biofilm to byl kmen
č. 96, který byl vybrán pro kontinuální experimenty. Výsledky ukázaly, že kontinuálně vyrobené
nealkoholické pivo bylo z hlediska obsahu těkavých látek lepší než pivo vyrobené klasickým
vsádkovým způsobem a srovnatelné s komerčními nealkoholickými pivy.
Ing. Michal Kuřec
Title: Yeast biofilm – its formation and control during continuous alcohol-free beer
production
Supervisor: doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D.
Study program: Biochemistry and Biotechnology
SUMMARY
One of the industrially important qualities of yeast is their ability to provide technologically
significant surface interactions such as flocculation (brewing yeast), mat formation (some wine
yeast) and yeast biofilm formation (immobilization to supports). The goal of this work was to
verify the possibility to predict and subsequently select yeast strains, capable to colonize solid
supports, by using physicochemical adhesion models (classical DLVO theory, thermodynamic
approach, and extended DLVO theory). The role of physicochemical surface properties in the
yeast adhesion was evaluated by comparing the computed predictions with experimental adhesion
tests of three different industrial yeast strains (Saccharomyces cerevisiae) onto spent grain
particles in a continuous gas-lift reactor. The best agreement between forecast and observation of
the yeast adhesion to spent grains was achieved with the extended DLVO (XDLVO) theory, the
most complex adhesion model applied in this study. Despite its relative comprehensiveness, the
XDLVO theory does not take into account specific biochemical interactions. Consequently,
additional understanding of the yeast adhesion mechanism was obtained by means of quantifying
(qRT-PCR) the expression of adhesion FLO genes. The presented approach provides tools to
select adhesive yeast strains and match them with solid supports of convenient surface properties
in order to design immobilized biocatalysts exploitable in biotechnological processes.
Thereafter a new method suitable to track the quality of the previously formed yeast biofilm was
developed. It was shown to be suitable for the determination of the average age of a yeast
population using the combination of flow cytometry, bud scar staining and fluorescence
microscopy. The method was practically applied during long-term alcohol-free beer fermentation
in continuously working gas-lift reactor and allowed a rapid monitoring and prediction of
immobilized biomass ageing.
The previously acquired knowledge on yeast biofilm formation and quality control was used to
demonstrate the production of alcohol-free beer (AFB) in a continuous fermentation system with
brewing yeast immobilized on spent grain particles. Based on its promptness to form biofilm it
was the strain 96, which was chosen for continuous experiments. The results showed that the
AFB produced continuously was in terms of its volatile content better than the AFB produced in
batch mode and comparable with commercial AFBs.
Ing. Adam Brož
Název: Vliv jakostních znaků surovin na požadované parametry piva
Školitel: doc. Ing. Jan Šavel, CSc.
SOUHRN
V teoretické části práce shrnuje dosavadní poznatky o kontrole pivovarských surovin konvečními
a instrumentálními metodami. Pozornost je věnována stanovení znaků ovlivňujících
ekonomickou bilanci výroby, technologické chování a kvalitu hotového piva. Popsáno je použití
konvenčních a moderních instrumentálních metod zajišťujících běžné a speciální rozbory
surovin.
Z moderních instrumentálních metod je blíže popsána infračervená spektroskopie v blízké oblasti
spektra, jejíž aplikaci pro kontrolu sladu a chmele se věnuje experimentální část práce. Po shrnutí
literárních poznatků byla ověřena a zavedena tato rychlá instrumentální metoda do rutinní
kontroly sladu a chmele v laboratoři průmyslového pivovaru. Kontrola se navázala na sběr a
uchovávání dat v laboratorním databázovém systému a propojila s výrobní evidenční databází,
čímž se zajistila sledovatelnost celého výrobního procesu od surovin až po hotové pivo.
Dlouhodobě tento systém zajišťuje sledování vlivu kvality surovin na hotové pivo.
Blízká červená spektroskopie se ukázala jako použitelná metoda pro předpověď důležitých
ukazatelů jakosti sladu, jako jsou obsah extraktu, bílkoviny, relativní extrakt při 45 °C,
Kolbachovo číslo, friabilita, rozpustný dusík, β-glukany ve sladině, viskozita sladiny, diastatická
mohutnost, barva sladiny, sacharidový extrakt a dosažitené prokvašení. Zajímavou korelaci
ukázala spektra s potenciálem sladu pro přepěňování piva. V případě chmele je možné metodu
použít pro stanovení α-kyselin, β-kyselin, kohumulonu a kolupulonu. Při dodržení vyvinutého
algoritmu aktualizací a udržování kalibračních modelů je možné všechny tyto znaky předpovídat
s uspokojivou přesností z jediného spektra, což představuje značnou časovou a personální úsporu.
Dalším použitím metody infračervené spektroskopie bylo sledování průběhu hlavního kvašení,
kdy jednoduchým měřením spektra bylo možné předpovídat měnící se ukazatele v průběhu
hlavního kvašení, jako jsou obsah extraktu, alkoholu, relativní hustota a prokvašení. Při použití
infračervené spektroskopie pro analýzu hotového piva byla kromě možné předpovědi obsahu
alkoholu, extraktu, energetické hodnoty, bílkovin, polyfenolů a isosloučenin nově nalezena
korelace spekter s pěnivou schopností piva představující zajímavé uplatnění této metody.
Ing. Adam Brož
Title: Impact of raw materials` qualitative characteristics on required parameters of beer
Supervisor: doc. Ing. Jan Šavel, CSc.
SUMMARY
The theoretical part of this work summarizes current knowledge about brewer´s raw material
quality control with conventional and instrumental analytical methods. Focus is given on
determination of qualitative characteristics which influence the economy of production,
technological behaviour and finished beer quality. The usage of conventional and modern
instrumental methods for routine and special analyses of raw materials is described.
One of the modern methods – near infrared spectroscopy – is described in depth and used for
quality control of malt and hops in the experimental part of the work. This rapid instrumental
method has been proved, validated and implemented into routine qualitative laboratory control of
malt and hops in an industrial brewery. The analytical data followed into laboratory databases to
be collected and stored. Communication with the production database provided traceability of
complete manufacturing process from raw materials up to finished beer. This system allowed to
judge the influence of raw materials on finished beer quality in long-term view.
Near infrared spectroscopy is a useful method for the prediction of important qualitative
characteristics of malt such as extract, protein, relative extract 45 °C, Kolbach index, friability,
soluble nitrogen, β-glucan, wort viscosity, diastatic power, wort color, carbohydrate extract and
final attenuation. The spectra also showed very interesting correlation with gushing potential of
malt. In case of hops, α-acids and β-acids as well as cohumulone and colupulone can be
determined with this method. Maintenance procedure for calibration models has been developed
which makes it possible to predict all the above mentioned characteristics with acceptable
accuracy only from one spectrum measurement which saves time and personal cost.
Monitoring of primary fermentation process in cylindroconical vessels was another application of
near infrared spectroscopy. The course of fermentation has been monitored by the prediction of
alcohol, extract, relative density and degree of fermentation measured from one spectrum.
Near infrared spectroscopy used for finished beer analysis showed possible determination of
alcohol, extract, calories, proteins, polyphenols and isobitter acids. Newly discovered
correlation between spectra and foam beer potential is new interesting use of this method.
Ing. David Kubáč
Název: Mikrobiální enzymy transformující dusíkaté látky a jejich aplikace v organické
chemii
Školitel: Ing. Ludmila Martínková, PhD.
SOUHRN:
Enzymy transformující nitrily (nitrilasy, nitrilhydratasy, amidasy) jsou užitečné pro přípravu
speciálních chemikálií. Výroba akrylamidu a nikotinamidu transformací příslušných nitrilů
(akrylonitrilu, 3-kyanopyridinu) patří k nejúspěšnějším aplikacím enzymů tohoto typu. Nedávno
publikovaná literatura však ukazuje, že potenciál těchto biokatalyzátorů je mnohem větší. Jejich
výběr a oblasti možného použití se rozšiřují díky použití metod jako vyhledávání homologních
genů v databasích nebo exprese metagenomové DNA a díky možnosti zlepšovat enzymy pomocí
molekulárně biologických metod a imobilizací.
Cílem této práce bylo vyhledat nové enzymy metabolismu nitrilů a ukázat perspektivní oblasti
jejich využití. Jako metody pro adaptaci těchto enzymů pro použití v biokatalýze byly použity
imobilizace v membránových reaktorech, na chromatografických kolonách a v zesítěných
agregátech enzymů (“cross-linked enzyme aggregates”, CLEAs). Imobilizované enzymy
(CLEAs) byly připraveny s fungálními nitrilasami z Fusarium solani O1, Fusarium oxysporum
CCF1414, Fusarium oxysporum CCF483, Penicillium multicolor CCF2244 a Aspergillus niger
K10 a s bakteriální nitrilasou z Rhodococcus rhodochrous PA-34. Směsné imobilizované
preparáty měly nitrilhydratasovou a amidasovou aktivitu (enzymy z kmene Rhodococcus
erythropolis A4) nebo aldoximdehydratasovou a nitrilasovou aktivitu (enzymy z P. multicolor
CCF 2244). Pro srážení enzymů z buněčného extraktu byl použit síran amonný a jako zesíťovací
činidlo dextranpolyaldehyd. Za těchto podmínek bylo v imobilizovaných preparátech získáno až
99 % původní aktivity.
Stabilizační účinek imobilizace byl pozorován u nitrilas z kmenů F. oxysporum CCF 1414, F.
oxysporum CCF 483 a P. multicolor CCF 2244. U těchto enzymů se imobilizací zvýšila
optimální reakční teplota. Preparáty CLEAs připravené z nitrilasy z F. solani O1 byly použity
pro kontinuální biotransformace 4-kyanopyridinu na kyselinu isonikotinovou a 3kyanopyridinu
na kyselinu nikotinovou. Použití bienzymatického systému s nitrilasovou a amidasovou aktivitou
vedlo ke zvýšení čistoty produktu (kyseliny isonikotinové).
Dva z enzymů zkoumaných v této práci byly purifikovány, tj. nitrilasa z Fusarium solani
IMI196840 a rekombinantní nitrilasa z Penicillium marneffei ATCC18224. Gen pro druhý z
těchto enzymů byly nalezen v databázi a připraven synteticky, při čemž zastoupení bazí bylo
optimalizováno z ohledem na jejich frekvenci v heterologním hostiteli Escherichia coli. Oba
enzymy byly aromatické nitrilasy s vysokou specifickou aktivitou k benzonitrilu.
Částečně purifikovaná nitrilhydratasa z R. erythropolis A4 byla použita pro přípravu 3-oxo-, 3hydroxy-, 3-acyloxy- and 2-methylenamidů z příslušných nitrilů. Celé buňky téhož organismu
transformovaly jednu z kyanoskupin dikyanopyridinů za vzniku kyanamidů nebo kyanokyselin a
katalyzovaly též chemoselektivní konverzi nitrilové skupiny v kyanodeoxykonduritolech, jejichž
struktura (přítomnost hydroxyskupin) téměř vylučuje použití běžných chemických metod
hydrolýzy nitrilů.
Ing. David Kubáč
Title: Microbial enzymes transforming nitrogen compounds and their application in
organic chemistry
Supervisor: Ing. Ludmila Martínková, PhD.
SUMMARY
The nitrile-transforming and nitrile-forming enzymes (nitrilases, nitrile hydratases, amidases,
aldoxime dehydratases) represent important tools for the preparation of fine chemicals. The
nitrile hydratase-catalyzed productions of acrylamide and nicotinamide via transformations of
acrylonitrile and 3-cyanopyridine respectively belong to the most successful applications of
enzymes of this type. Recent literature, however, has demonstrated much bigger potential of
these biocatalysts. Their spectrum and areas of potential use have been extended due to use of
methods such as genome mining or metagenomic DNA expression, and due to enzyme
improvement by molecular biology methods and by immobilization.
This aim of this work was to search for new enzymes of nitrile metabolism and to demonstrate
prospective areas of their use. Adaptation of the enzymes for biocatalytic use was pursued by
immobilization in membrane reactors, on chromatographic columns and in cross-linked enzyme
aggregates (CLEAs). The latter immobilizates were prepared with fungal nitrilases from
Fusarium solani O1, Fusarium oxysporum CCF1414, Fusarium oxysporum CCF483, Penicillium
multicolor CCF2244 and Aspergillus niger K10, and a bacterial nitrilase from Rhodococcus
rhodochrous PA-34. Mixed immobilized preparations exhibited nitrile hydratase/amidase
activities (enzymes from Rhodococcus erythropolis A4) or aldoxime dehydratase and nitrilase
activities (enzymes from P. multicolor). Ammonium sulfate was used for enzyme precipitation
from cell-free extracts and the cross-linking agent was dextran polyaldehyde. The activity
recovery was up to 99 % under these conditions. Stabilization effect of immobilization was
observed with nitrilases from F. oxysporum CCF 1414, F. oxysporum CCF 483 and P. multicolor
CCF 2244. The reaction optima of these enzymes were shifted towards higher temperatures.
CLEAs of nitrilase from F. solani O1 were used for continuous biotransformations of 4cyanopyridine and 3-cyanopyridine into isonicotinic and nicotinic acid, respectively. The use of
the bienzymatic system including nitrilase and amidase led to an increase in purity of the product
(isonicotinic acid).
Two of the enzymes studied in this work were purified, namely aromatic nitrilases from Fusarium
solani IMI196840 and Penicillium marneffei ATCC18224 produced by wild-type and
heterologous producer, respectively. The gene coding the latter enzyme was found by genome
mining and synthesized, its codon frequency being adapted to that in the heterologous producer
Escherichia coli. The enzymes were aromatic nitrilases with high specific activities for
benzonitrile.
The semi-purified nitrile hydratase from R. erythropolis A4 was used to prepare 3-oxo-,
3hydroxy-, 3-acyloxy- and 2-methylene amides from the corresponding nitriles. Whole cells of
the same organism selectively transformed a single cyano group in dicyanopyridines to give
cyano amides or cyano acids, and also catalyzed a chemoselective conversion of the nitrile group
in cyano deoxyconduritols, the structure of which (presence of hydroxy groups) almost excludes
the use of common chemical methods for nitrile hydrolysis
Ing. Jaroslav Šnajdr
Název: Saprotrofní houby v půdě: Produkce extracelulárních enzymů a degradace opadu
Školitel: RNDr. Petr Baldrian, PhD.
SOUHRN
Houby a bakterie jsou hlavními mikroorganismy podílejícími se na rozkladu rostlinného opadu v
lesním ekosystému. Především jejich enzymy se výrazně podílejí na rozkladu rostlinného opadu a
jeho přeměně na humusovou složku půdy. Saprotrofní basidiomycety, především skupina
označovaná jako houby rozkládající opad, jsou schopny produkovat široké spektrum
extracelulárních enzymů, včetně ligninolytických, a tvoří hlavní skupinu mikroorganismů v
horních vrstvách půdy, zodpovědnou za rozklad lignocelulózy. V této práci byly sledovány
aktivity enzymů podílejících se na rozkladu lignocelulózy v přirozeném prostředí půdy dubového
(Quercus petraea) lesa, jejich prostorová variability a distribuce a jejich role při rozkladu
dubového (Quercus petraea) opadu. Výsledky této studie ukázaly, že enzymové aktivity v lesní
půdě jsou prostorově značně rozdílné. Aktivity enzymů jsou zejména ovlivněny množstvím
organického substrátu, skladbou mikroorganismů a klimatickými podmínkami. Ukázalo se, že
aktivita je více závislá na aktuální vlhkosti půdy než na teplotě. Nejvíce extracelulárních enzymů
se nachází v horní organické vrstvě, přičemž aktivity enzymů klesají se vzrůstající hloubkou
půdy. To je dáno především tím, že houby, zodpovědné za produkci ligninolytických enzymů v
půdě, rostou především v horních vrstvách, ale jsou schopny prorůstat i do větších hloubek a
spolupodílet se na rozkladu organických látek v těchto vrstvách, především huminových látek.
Při bližším pohledu na rozklad dubového opadu zjistíme, že tento proces je postupný, ovlivněný
především okamžitou skladbou mikrobiálního společenstva, jež se během degradace mění. S tím
souvisí i skladba a produkce extracelulárních enzymů. Houby jsou dominantní v počáteční fázi
degradace, ale bakteriální komunita postupně narůstá až je dosaženo rovnováhy, kdy se poměr
hub a bakterií dále nemění. Četnost aktinobakterií dosahuje svého maxima zhruba po jednom
roce, v období, kdy do horní vrstvy půdy jsou dodány nové zdroje živin ve formě nového opadu a
starý opad, již částečně rozložený, se postupně začleňuje do humusové vrstvy. Oproti očekávaní
je celulóza odbourávána rychleji než hemicelulóza. Z tohoto důvodu hemicelulóza tvoří hlavní
polysacharidickou složku humusové vrstvy. Schopnosti rozkladu a transformace ligninu a
huminových látek byly testovány na několika kmenech saprotrofních basidiomycet. Ukázalo se,
že rychlost jejich rozkladu je značně druhově specifická. Ačkoliv produkce enzymů těchto
basidiomycetů v nesterilních podmínkách je vyšší, celková účinnost rozkladu je nižší, což může
být způsobeno interakcemi s dalšími půdními mikroorganismy. Zdá se, že částečná transformace
ligninu může probíhat i v nepřítomnosti ligninolytických enzymů. Tato transformace je ovlivněná
celou řadou biotických a abiotických činitelů, jež nejsou v současné době zcela známy.
Ing. Jaroslav Šnajdr
Title: Saprotrophic fungi in soil: Production of extracellular enzymes and degradation of
litter
Supervisor: RNDr. Petr Baldrian, PhD.
SUMMARY
Fungi and bacteria are key agents in plant litter decomposition in forest ecosystems. Their
enzymes play essential role in nutrient mineralization and their action contributes to the
formation of organic-rich humic soil horizon. Litter decomposing fungi (LDF) are a group of
fungi which are able to product large spectrum of extracellular enzymes, including ligninolytic
enzymes, and are the main group of microorganisms in upper layers of soil responsible for the
degradation of lignocellulose and transformaton of its products. The main aims of this thesis were
to monitor activities of enzymes degrading lignocellulose polymers in the oak forest soil, their
spatial distribution and variability and the effect on oak (Quercus petraea) litter decomposition.
The results of this study show that enzyme activities in Q. petraea forest soil are highly spatially
heterogeneous. Enzyme activities are mainly influenced by the quality of organic matter,
composition of microbial communities and climatic conditions, where actual moisture has highly
effect on the enzyme activities than temperature. Most of enzymatic activity is localized in the
litter horizon and upper part of the organic horizon and all activities decrease with soil depth.
This effect is induced mainly by litter decomposing fungi, as the dominant producers of
extracellular ligninolytic enzymes in the soil. These fungi preferentially colonize upper parts of
the soil but are also able to grow into deeper soil where they can participate in the degradation of
organic compounds occurring in these horizons, especially humic compounds. Looking more
closely at degradation of oak litter, it shows up that it is a sequential process where structure of
microbial communities changes during litter decomposition. Production and spectrum of enzymes
are affected by the actual diversity of microbes. Fungi dominate during the initial phase of litter
decomposition, while bacteria begin to increase in later phase but in final the late phases of
decomposition the ratio between fungi and bacteria remains relatively constant. Abundance of
actinobacteria reaches its maxima in the period of a new litterfall when new nutrients appear and
the old, transformed litter slowly passes into the organic soil horizon. Contrary to the theoretical
expectations, cellulose is utilized faster than hemicelluloses. As a consequence, hemicelluloloses
represent the dominant polysaccharidic carbon in the organic horizon. Pure cultures of
saprotrophic basidiomycetes demonstrate the abilities of these organisms to degrade and
transform lignin and humic compounds. The result show that decomposition rates may
considerably differ from species to species. Although the total production of enzymes in a nonsterile environment is higher in the presence of saprotrophic basidiomycetes, the transformation
process is slowed as a consequence of interspecific interactions. Lignin is thus probably also
transformed in the absence of ligninolytic enzymes and the transformation is influenced by other,
biotic or abiotic, factors which are not yet fully understood.
Ing. Irena Brányiková
Název: Přeměna odpadního CO2 na řasovou biomasu využitelnou v potravinářství a výrobě
biopaliv
Školitel: RNDr. Vilém Zachleder, CSc.
SOUHRN
Se záměrem fixovat CO2 a zároveň snížit náklady na produkci biomasy, byly pro kultivaci řas
použity následující zdroje odpadního CO2: 1) spaliny pocházející ze spalovny komunálního
odpadu, 2) spaliny z kogenerační jednotky a 3) bioplyn z anaerobní fermentace lihovarských
výpalků. Všechny tři zdroje byly vhodné pro kultivaci řas, růstová rychlost byla stejná nebo
dokonce vyšší než u kontrolních řasových kultur aerovaných směsí čistých plynů.
Nejdůležitějším výsledkem však bylo, že toxikologické analýzy biomasy získané s použitím
reálných spalin (jak ze spalovny, tak z kogenerace) potvrdily splnění všech legislativních
požadavků EU na obsah kontaminujících látek v potravinách. I přesto by byla uplatnitelnost
biomasy pocházející ze spalin na potravinářském trhu pravděpodobně velmi obtížná, tudíž další
úsilí bylo směrováno na úpravu složení řasové biomasy tak, aby byla použitelná jako surovina
pro výrobu biopaliv. Bylo zjištěno, že vybraný kmen Chlorella vulgaris je vysoce produktivním
zdrojem škrobu, který by mohl nahradit škrobnaté zemědělské plodiny využívané na výrobu
bioetanolu. Většina experimentů probíhala v laboratorních fotobioreaktorech, kde, při správném
zásahu během kultivace, bylo dosaženo obsahu škrobu 70 % suché hmoty. S využitím hladovění
na síru, jako postupu nejvhodnějšího pro větší měřítka, byl proveden poloprovozní experiment ve
venkovním solárním fotobioreaktoru umístěném v ČR, během něhož bylo dosaženo obsahu 50 %
hm škrobu v sušině.
Ing. Irena Brányiková
Title: Conversion of waste CO2 into microalgal biomass suitable for food and biofuels
production
Supervisor: RNDr. Vilém Zachleder, CSc.
SUMMARY
In order to bioremediate CO2 and decrease the biomass production costs simultaneously, the
following sources of waste CO2 were used for cultivation of the microalga Chlorella vulgaris: 1)
flue gas originating from a municipal waste incinerator (MWI), 2) flue gas from cogeneration
unit and 3) biogas from anaerobic digestion of distillery stillage. All three sources were suitable
for culturing the microalgae, the growth rate was the same or even higher comparing to control
cultures sparged by mixtures of pure gases. The most important finding was that, the
toxicological analysis proved that the biomass produced using both MWI and cogeneration flue
gas was compliant with all the foodstuff legislation requirements on contaminants levels of the
EU. Despite this fact, the marketability of the “flue gas biomass” on the food market would be
probably very difficult. Thus the following effort was directed towards to the modification of
biomass composition, in order to be useful as a biofuel resource. It was found out, that the
selected strain of microalga Chlorella vulgaris is a highly productive source of starch, which
could substitute starch-rich terrestrial plants in bioethanol production. The experiments carried
out in laboratory-scale photobioreactors, resulted in increase of starch content up to 70 % of dry
weight under optimal conditions. During a pilot-scale experiment in an outdoor solar
photobioreactor located in the Czech Republic, starch level of biomass reached 50 % of dry
weight. In this case, sulphur starvation was applied as the most appropriate treatment in scale-up
cultivation of starch enriched biomass.
Ing. Dana Gabrovská
Název: Stanovení prolaminů v pivovarských surovinách a potravinách Školitel: Doc. Ing.
Pavel Dostálek, CSc.
Souhrn
Disertační práce byla věnována několika oblastem aktuální problematiky kvality bezlepkových
potravin a ostatních potravin na domácím trhu z hlediska bezpečnosti konzumace těchto
potravin pacienty s celiakií a má několik částí. Část práce byla věnována analytickým metodám
stanovení nežádoucích prolaminů v potravinách, ve sladech, v průběhu pivovarského procesu a
ve vzorcích komerčních piv. Byl zorganizován mezinárodní kruhový test nové ELISA soupravy
vyvinuté firmou Immunotech a Beckman Coulter Company. Dále byla pozornost zaměřena na
kvalitu deklarovaných bezlepkových potravin a ostatních běžných potravin. Sledování
bezlepkové diety u pacientů s celiakií bylo částí disertační práce, která ukázala, že dodržování
bezlepkové diety je na velmi dobré úrovni. Při výběru potravin pro bezlepkovou dietu má velký
význam informovanost a pečlivost pacientů nebo osob, které o pacienty pečují.
Bylo analyzováno celkem 544 komerčních potravinářských výrobků. Tyto výrobky zahrnovaly
jednak potraviny deklarované jako bezlepkové a jednak běžné potraviny. Byly nalezeny dva
vzorky s vyšším obsahem nežádoucích prolaminů, než povoluje legislativa pro bezlepkové
potraviny. Tyto potraviny nebyly deklarované jako bezlepkové a obsahovaly jako složku
pšeničné klíčky (tyčinky Clara). Dalším vzorkem byla Směs na pohankové palačinky s obsahem
nežádoucích prolaminů 8,99 mg/100 g. Další část práce byla zaměřena na otázku obsahu
nežádoucích prolaminů v pivovarských surovinách a produktech. Bylo provedeno stanovení
nežádoucích prolaminů ve sladech, v průběhu pivovarského procesu a ve vzorcích komerčních
piv. Obsah nežádoucích prolaminů se v průběhu pivovarského procesu snižuje o několik řádů.
Komerční piva vyrobená z ječného sladu a analyzovaná kompetitivní metodou ELISA určenou
přímo pro stanovení peptidových fragmentů v pivech byly také nalezeny hodnoty vyhovující
stávající legislativě. Nejvyšší hodnota nežádoucích prolaminů byla nalezena u piva Radegast
premium (2,66 mg/l00 ml).
Sledování bezlepkové diety u pacientů s celiakií bylo částí disertační práce, která ukázala, že
dodržování bezlepkové diety je na velmi dobré úrovni. Nejvyšší denní příjem nežádoucích
prolaminů byl 5,5 mg na den.
Ing. Dana Gabrovská
Title: Determination of prolamins in brewing raw materials and food
Supervisor: Doc. Ing. Pavel Dostálek, CSc.
Summary
This doctoral thesis is devoted to some contemporary issues related to the quality of gluten-free
foods and other foods sold in the domestic market. The safety of these foods for consumers
suffering of celiac disease is stressed. The thesis has several parts. One of them is devoted to the
analytical methods of determining adverse prolamins in foods, malts, in the materials sampled
during the brewing process and in commercially available beers. An international collaborative
study of a new ELISA kit developed by the companies Immunotech and Beckman Coulter was
organized. Attention was also paid to the quality of foods declared as gluten-free and to other
common food products. Another part of the thesis is devoted to the monitoring of gluten-free diet
in celiac patients. It shows a very good level of adherence to the gluten-free diet. The awareness
and conscientiousness of the patients, or the persons taking care of these, is of the paramount
importance for the selection of foods comprising the gluten-free diet.
Altogether 544 commercial food products were analyzed. These products included both foods
declared as gluten-free and common foods. Two samples were found to contain more of adverse
prolamins than approved by legislation governing gluten-free foods. These foods were not
declared as gluten-free. One of them contained wheat sprouts (“Clara” bars). Another sample, a
buckwheat pancake mix, also revealed higher content of adverse prolamins (8.99 mg/100g). The
next section of the doctoral thesis was focused on the determination of adverse prolamins in
brewing raw materials and products. Adverse prolamins were determined in malts, in processed
materials in the course of brewing, and in the samples of commercial beers. The content of
adverse prolamins dropped by several orders of magnitude during the brewing procedure.
Commercial beers made from barley malt were analysed by competitive ELISA kits intended
specifically for the determination of peptide fragments in beers and hydrolysed starches. The
determined values of peptide fragments complied with existing legislation. The highest value of
adverse prolamins was found in the beer “Radegast Premium” (2.66 mg/100 ml).
The monitoring of gluten-free diet in patients suffering from coeliac disease also forms part of
the thesis. The results showed high adherence to gluten-free diet. The highest value of daily
gliadin intake found amounted to 5.5 mg.
Ing. Ondřej Misiaczek
Název: Biologická degradace par směsí lakařských rozpouštědel ve zkrápěném reaktoru a
biofiltru
SOUHRN
Cílem této disertační práce bylo sestavení a zprovoznění trickling filtru, otestování jeho
hydrodynamické charakteristiky, ověření vhodnosti jeho použití pro odstraňování směsi těkavých
organických polutantů z odpadních plynů vznikajících při výrobě organických rozpouštědel a
jejich používání v lakařském průmyslu.
Byla studována degradace par směsi hydrofilních a hydrofobních rozpouštědel – aceton,
methylethylketon, methyl-isobutylketon, octan butylnatý, toluen a xylen. Byly provedeny
zátěžové charakteristiky změnou vstupní koncentrace hydrofobních a hydrofilních složek směsi.
Pro porovnání provozních podmínek byly souběžně provedeny přibližně stejné experimenty s
totožnou směsí rozpouštědel v biofiltru. Dále bylo provedeno několik experimentů zaměřených
na dynamické chování biotrickling filtru při skokových změnách zátěže a teoretické doby zdržení
a při náběhu po periodách hladovění a přerušení provozu.
Při degradaci této směsi rozpouštědel dochází k provozním problémům spojeným s degenerací
přítomné mikrobní populace a dále s nadměrným nárůstem biomasy. Z porovnání vyplývá, že
biotrickling filtr se jeví jako vhodnější zařízení pro degradaci dané směsi a je schopen dosahovat
vyšších eliminačních kapacit.
Ing. Ondřej Misiaczek
Title: Paint Solvent Mixture Vapors Biotreatment in Trickle Bed Reactor and a Biofilter
SUMMARY
The objectives of the study regarding a biotrickling filter were as follows: A put in operation of
the reactor system, a measurement of its hydrodynamic characteristics and performance
characteristics during painting solvents vapor biofiltration.
The study was focused on a removal of the complex mixture of hydrophilic and hydrophobic
solvents – acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, n-butyl acetate, toluene and
xylenes. The loading tests comprised the loading by increasing concentration of both hydrophilic
and hydrophobic components of the mixture. Similar experiments simultaneously were carried
out in a biofilter for a comparison. The dynamic response of the biotrickling filter during step
changes in loading and empty bed retention time and a startup after periods of starvation and nonuse was tested, too.
Degrading a mixture of hydrophilic and hydrophobic solvents operation troubles resulting in a
decline of the removal efficiency of the biocatalyst and a clogging effect were observed.
Biotrickling filter proved to be more suitable for elimination of the tested mixture and was able to
reach higher elimination capacities then biofilter.
Ing. Alena Macenauerová
Název: Mikrobní degradace mononitrofenolových sloučenin
SOUHRN
Práce se zabývá aerobní biodegradací mononitrofenolů (MNF) a jejich směsí v simulované
odpadní vodě v kontinuálních náplňových bioreaktorech s imobilizovanou mikrobiální populací.
Směsná populace získaná z půdy dlouhodobě kontaminované TNT podniku Explosia Pardubice,
s.r.o. (ČR) byla použita pro adaptaci a následnou biodegradaci MNF a fenolu. Adaptace probíhala
dlouhodobě v submerzním uspořádání na třepačkách za aerobních podmínek. Jako zdroj uhlíku a
energie sloužily pouze přítomné MNF.
Po několika měsících byla směsná populace úspěšně adaptována na přítomnost všech tří MNF a
mohla být použita jako inokulum pro imobilizaci kontinuální náplňové kolony.
Ve druhé fázi experimentů byly postupně sestaveny a zprovozněny 3 průtočné náplňové
bioreaktory (PBR), kde jako nosič sloužila expandovaná břidlice. V průběhu práce byly postupně
provedeny experimenty, v nichž byl systém zatěžován různým způsobem. Buď byla zvyšována
vstupní koncentrace polutantu v odpadní vodě za konstantní doby zdržení (experimenty
provedeny s jednotlivými MNF i s jejich směsí) nebo bylo zvýšení organického zatížení dosaženo
změnou průtokové rychlosti simulované odpadní vody při konstantní Sin MNF (provedeno ve
směsi). Ze získaných dat byla vyhodnocována degradační rychlost a degradační účinnost pro
různé způsoby organického zatížení systému.
Výsledky naznačují, že všechny tři MNF byly v přítomnosti kyslíku degradovány samostatně
nebo ve směsi, avšak s rozdílnou degradační účinností. 2NF se v průběhu celé práce jevil jako
nejobtížněji degradovatelný isomer citlivý na zvyšující se organickou zátěž.
Část práce byla věnována souběžné biodegradaci směsi 3NF nebo 2NF s fenolem. Při konstantní
době zdržení byl systém zatěžován rostoucí vstupní koncentrací jednoho z přítomných polutantů.
V jednotlivých PBR bylo sledováno složení biofilmu v průběhu dlouhodobého provozu, kdy
zařízení bylo inokulováno směsnou mikrobní populací o známém složení. Složení biofilmu bylo
značně proměnlivé v závislosti na různém způsobu zatěžování systému a přítomném
kontaminantu.
Ing. Alena Macenauerová
Title: Microbial degradation of mononitrophenolic compounds
SUMMARY
The study was focused on aerobic biodegradation of mononitrophenols (MNPs) and their
mixtures from simulated wastewater in a continuously and long-term operated packed bed reactor
with immobilized cells as a biocatalyst.
A mixed culture enriched from aged TNT-contaminated soil from Explosia Company,
(Pardubice, Czech Rep.) was used for adaptation and subsequent biodegradation of MNP and
phenol. The adaptation was conducted for a several months in 500 ml shake flasks containing
basal salt medium (BSM) at 28°C under aerobic conditions. Nitrophenols served as a sole source
of carbon and energy. After several months the mixed culture was successfully adapted to toxic
MNF as a substrate and the inoculum was used for the following immobilization of a PBR.
In the second stage of the experiments 3, packed bed reactors (PBRs) were subsequently
constructed with expanded slate as packing material and worked in the up-flow manner. The
performed loading tests comprised both the loading by increasing concentration of the pollutants
in the inlet wastewater and also different wastewater flow rate. The degradation rates and
efficiencies of the MNP isomers individually and in their mixtures were evaluated.
The results demonstrated that all three MNP isomers were degraded simultaneously and
completely in presence of oxygen. The nitro group position on the benzene ring influenced the
degradation rate of the individual MNP isomers at higher loading rates. The degradation of 2NP
was shown to be the most sensitive to increasing loading.
Next part of this study was focused on the simultaneous biodegradation of the mixture of 3nitrophenol or 2-nitrophenol and phenol under different loading conditions.
The identification of the individual strains in the biofilm was performed during the course of this
study to verify variability of biofilm composition in dependence of different loading conditions
and present organic compound.
Ing. Kateřina Lapišová
Název: Aplikace membránových separačních
potravinářského průmyslu a zemědělství
Školitel: Prof. Ing. Karel Melzoch, CSc.
technik
při
zpracování
odpadů
z
SOUHRN
Předložená disertační práce se zabývá zpracováním lihovarských výpalků s využitím
membránových separačních procesů. Získaný permeát by bylo možné znovupoužít jako
částečnou náhradu technologické vody při přípravě zápary. Koncentrovaná část výpalků (retentát)
by pak mohla být použita jako hnojivo nebo po zahuštění a usušení krmivo hospodářských zvířat.
Separační experimenty byly realizovány na poloprovozní stanici ARNO 600 - BIO osazené
keramickými membránami s velikostí pórů z oblasti mikrofiltrace až nanofiltrace (0,2 µm - 5
kDa). Byl posuzován celkový čas separace, procento odstranění analytů, pokles filtračního
výkonu na jednotlivých membránách a jejich zanášení.
Byla provedena optimalizace procesu snížením počtu separačních stupňů při dosažení stejné
separační účinnosti. Z původního testování pěti membrán v sérii byly navrženy dvoustupňové
separační experimenty. Uspořádání membrán a podmínky experimentů měly klíčový vliv na
průběh celého separačního procesu.
Nejlepších výsledků bylo dosaženo u sérií, kde byly sledované analyty odstraněny z více než 70
procent. Jednalo se zejména o série, kde byla jako první v kaskádě zařazena mikrofiltrační
membrána s velikostí pórů 0,2 µm následována membránou ultrafiltrační.
Hodnocen byl také vliv vstupních výpalků (obilných, bramborových) na průběh separace a
zanášení membrán. Membrány byly celkově velmi zatěžovány, což se projevilo v silné
koncentrační polarizaci a jejich následném zanášení. Pokles toku membránou byl v případě
separace obilných výpalků výrazný zejména na prvním separačním stupni, v případě separace
bramborových výpalků pak až na druhém separačním stupni.
Značná část práce se zabývá regenerací membrán. Cílem bylo najít vhodný způsob a optimální
podmínky jejich regenerace. Byla ověřována možnost využití regenerace membrán přímo v
membránovém modulu nebo po jejich vyjmutí v horké lázni (80 °C).
Testovány byly různé chemikálie (např. hydroxid sodný, kyselina dusičná, peroxid vodíku). Jako
nejvýhodnější se ukázal 4 procentní roztok hydroxidu sodného. Jeho účinnost závisela více na
teplotě regenerační lázně než na vlastní koncentraci. Po jeho použití bylo ve většině případů
možné obnovit membránový tok na původní hodnoty.
Ing. Kateřina Lapišová
Title: Application of membrane separation techniques for the treatment of food and
agricultural waste
Supervisor: Prof. Ing. Karel Melzoch, CSc.
Study programe: Biochemistry and biotechnology
Subprograme: Biotechnology
SUMMARY
The thesis deals with distillery stillage treatment and application of membrane separation
techniques. The permeate after separation should be reused as technological water in the next
fermentation. The concentrated part (retentate) should be used as fertilizer or animal feed after
drying.
The separation of distillery stillage was tested in the pilot plant ARNO 600 - BIO by three channel ceramic membranes with the pore diameter ranging from microfiltration to nanofiltration
(0.2 µm - 5 kDa) in various separation arrangements. The process was evaluated from the point
of view of the total separation time, % of analytes removal, the decline of the filtration effort
made on the ceramic membranes and fouling effect.
The optimization of the process was done by reducing the number of separation steps from five to
two membrane arrangement. The two step membrane arrangement is more convenient due to the
reduction of operational costs at the same separation efficiency. The membrane alignment and
separation conditions were pivotal to the membrane separation process.
The finest results were achieved in the arrangement of series using 0.2 µm membrane as a first
step supplemented by an ultrafiltration membrane, where the reduction of analytes extended 70
%. The character of the separation material had a big impact to the separation and membrane
fouling. The membranes were very sensitive to the concentration polarization and fouling effect.
Flux decline was predominantly larger on the first membrane of grain stillage treatment, while in
the potato stillage treatment it was the second membrane.
Part of the thesis deals with the membrane regeneration. The aim was to find a proper method
and optimal conditions for regeneration. Two different cleaning strategies were tested: inside the
module by recirculation of cleaning solution or outside the module submersing the membranes in
a solution of cleaning agent at an initial high temperature.
Different chemicals were tested (sodium hydroxide, nitric acid, hydrogen peroxide). The
effective cleaning agent was 4 % sodium hydroxide at high temperature of 80 °C. The efficiency
of sodium hydroxide depends more on the cleaning temperature than on the concentration.
Ing. Tereza Krulikovská
Název: Srovnání metod chemické analýzy s metodami analýzy obrazu při studiu populací
eukaryotních buněk
Školitel: Dr. Ing. Petra Patáková
SOUHRN
Hlavním cílem disertační práce bylo zavedení metody analýzy obrazu do mikrobiologické praxe
a prověření jejího přínosu pro řešení složitějších problémů. Tato práce může být rozdělena do tří
kapitol:
•
Studium fyziologického stavu kmenů Saccharomyces cerevisiae s posílenou sorpcí
těžkých kovů
Znečištění životního prostředí těžkými kovy je velkým problémem dneška. Možnost sorpce
těžkých kovů pomocí mikrobiálních buněk je v současné době intenzivně studována. Velká
pozornost je věnována kvasince Saccharomyces cerevisiae. V této práci byl sledován vliv
genetické modifikace posilující sorpci těžkých kovů na velikost buněk a buněčnou adhezi na
povrch pevného nosiče. Výsledky získané pomocí metody analýzy obrazu byly porovnány s
parametry charakterizujícími růst daného mikroorganismu (koncentrace biomasy, počet buněk,
rychlost růstu, hydrofobita buněk). Zjištěné výsledky ukazují, že genetická modifikace vedoucí k
posílení sorpce těžkých kovů má významný vliv na růst kmenů na médiu s fruktosou, popř.
manosou jako jediným zdrojem uhlíku a energie. Vnesení α-aglutinové kotvy na buněčný povrch
vedlo k posílení schopnosti adheze kmene na povrch silikonového (hydrofóbního) a skleněného
(hydrofilního) nosiče. Výsledky analýzy obrazu podpořily a doplnily závěry zjištěné na základě
měření klasických parametrů.
•
Studium syntézy karotenoidních pigmentů rodem Rhodotorula
Karotenoidy představují skupinu strukturně odlišných přírodních pigmentů, majících celou řadu
rozličných vlastností, díky nimž nalezly uplatnění v mnoha průmyslových odvětvích
(potravinářství, zemědělství, kosmetický a farmaceutický průmysl). Karotenoidní pigmenty se u
mikrobních buněk nalézají v intracelulárním prostoru, jsou rozpustné v tucích a tudíž nikdy
nedifundují do živného prostředí. Pro jejich úspěšnou izolaci je nezbytná dezintegrace buněčných
stěn a jejich následná extrakce do organického rozpouštědla. Tato práce je zaměřena na
porovnání metod izolace karotenoidních pigmentů z buněk kvasinek Rhodotorula glutinis a
Rhodotorula mucilaginosa. Celkem bylo testováno sedm metod. Mírou účinnosti dané metody
byla zvolena koncentrace β-karotenu, která byla stanovena spektrofotometricky při vlnové délce
455 nm. Na základě našich výsledků bylo zjištěno, že nejvhodnější metodou dezintegrace buněk
rodu Rhodotorula je metoda s DMSO s následnou extrakcí pigmentů do acetonu. Současně byla v
této práci byla nalezena vhodná metoda pro kvantifikaci pigmentů. Byla potvrzena korelace mezi
obsahem karotenoidních pigmentů a barvou buněčné suspenze.
•
Růst rodu Rhodotorula na pevném substrátu
Byl sledován růst obrovských kolonií kvasinek rodu Rhodotorula na povrchu pevného substrátu v
přítomnosti stresového faktoru. Metodou analýzy obrazu byla sledována změna velikost průměru
kolonie a výsledky byly zpracovány pomocí modelu se smíšenými efekty (v softwaru S-PLUS).
Výsledky potvrdily existenci dvoufázové kinetiky. U R. mucilaginosa byla zjištěna vyšší hodnota
růstové rychlosti oproti R. glutinis za všech testovaných podmínek. U kvasinky Rhodotorula
glutinis byly naměřeny přibližně stejné hodnoty růstové rychlosti, kdežto u R. mucilaginsa se
rychlost růstu měnila s obsahem soli v médiu.
Ing. Tereza Krulikovská
Title: Comparison of chemical analysis methods with image analysis during the research of
eukaryotic cells populations
Supervisor: Dr. Ing. Petra Patáková
SUMMARY
The aim of the work was an implementation of the image analysis method into routine
microbiology methods and comparison of results with classically determined parameters. The
experimental work may be divided into three parts:
•
The study of Physiological State of Saccharomyces cerevesiae Strains with Enhanced
Heavy Metal Biosorption Capability
Heavy metal pollution has become one of the most serious environmental problems today.
Biosorption, using microbial cells for heavy metal removal, has been extensively investigated
during the last decades. Saccharomyces cerevisiae has received increasing attention. During an
experimental work the effects of genetic modification enhancing heavy metal sorption on cell
size and cell adhesion were determined (image analysis). Obtained results were compared with
biomass concentration, number of cells, growth rate and cell hydrophobicity. The results
indicated that the genetic modification has significant effect on cell growth ability on medium
with fructose and mannose as sole carbon sources. The higher value of cell hydrophobicity of
strain with α-aglutinin anchor on the cell surface corresponded to higher colonization ability of
both hydrophilic and hydrophobic carriers. The image analysis results supported and
supplemented results of “classically” determined parameters.
•
Carotenoid Pigment Production of Rhodotorula Yeasts
Carotenoids are the most widespread naturally occurring non-water soluble dyes. They are widely
distributed in plants and microorganisms Microbial carotenoids are difficult to extract because of
their embedding into a compact cell matrix and prominent sensitivity to degradation. During the
experimental work the most appropriate method of carotenoid pigment isolation from
Rhodotorula glutinis and Rhodotorula mucilaginosa yeasts was found. Seven methods of cell
disruption and carotenoids isolation were tested. Only chemical cell disruption methods were
examined. The most appropriate method was chosen according to results obtained by
spectrophotometry (at 455nm). It was found out that the best method of carotenoids isolation
from Rhodotorula yeasts is the method utilizing DMSO as an agent for cell disruption followed
by organic solvent extraction. The method for carotenoid pigment quantification was also found.
The correlation between cell suspension colour and carotenoid pigment concentration was found
(image analysis).
•
Evaluation of Rhodotorula Growth on Solid Substrate
Growth of Rhodotorula glutinis and Rhodotorula mucilaginosa was studied under optimal and
stress cultivation conditions at 10 and 20°C for 14 days. The method of image analysis was used
to determine the size of colonies. The linear mixed effects model implemented in S-PLUS
program was used to analyze data. Two-phase kinetics was confirmed and the mean growth rates
in the second linear phase under various stress conditions and the mean time after which a colony
reaches a specific diameter were estimated. The results indicated that R. mucilaginosa had a
higher growth rate than R. glutinis under all cultivation conditions. The highest growth rate was
observed during cultivation of R. mucilaginosa in media with 2% of NaCl at 20°C. The
covariance structures of the models describing solid surface cultivation growth of the two yeasts
under specific cultivation conditions were slightly different. While all specimens of R. glutinis
under the same treatment showed practically the same growth rate, the growth rate of R.
mucilaginosa specimens varied and the most pronounced difference was observed at the highest
NaCl concentration.
Ing. Lucie Piterková
Název: Studium populací termofilních a mezofilních bakterií rodu Bacillus metodami
molekulární biologie
Studijní program: Biochemie a biotechnologie Studijní obor: Biotechnologie
SOUHRN
Spolehlivá, rychlá a relativně finančně nenáročná identifikace mikroorganismů je nutná ve všech
biotechnologických laboratořích, které se všeobecně chtějí zabývat studiem mikrobiálních
populací, ať už z environmentálního nebo technologického pohledu. Odhalení struktury populace,
popř. přítomnosti specifických druhů, je stěžejní otázkou pro každý takový výzkum. V současné
době jsou dostupné různé mikrobiologické nebo biochemické systémy, nicméně jejich použití je
většinou časově nebo finančně velmi nákladné, proto je věnována velká pozornost zejména
molekulárně-biologickým metodám.
Jako modelový organismus pro všechny experimenty byl v našem případě zvolen všudypřítomný
bakteriální rod Bacillus, resp. jeho mezofilní a termofilní zástupci. Mezi metody, které byly
vybrány a optimalizovány v rámci disertační práce patří zejména amplifikace a následné štěpení
vybraných úseků bakteriálních genů pro 16S rRNA a 23S rRNA, včetně přepisovaného
mezerníku (ITS) mezi nimi. Geny pro funkční ribozomální RNA jsou přítomny u všech bakterií,
jsou strukturálně i funkčně zachovalé a mají dostatečnou velikost. Díky těmto vlastnostem se
staly nejvyhledávanějším nástrojem pro identifikaci prokaryot. Vedle těchto genů jsme se
zaměřili přímo i na analýzu ITS segmentů mezi nimi a na analýzu genomické DNA pomocí tzv.
náhodné PCR (RAPD). Součástí studie byl i test metod izolace DNA, kdy byly použity klasické
protokoly i komerční kity. Zajímala nás výtěžnost jednotlivých metod, jejich technická náročnost
a cena izolace.
Všechny testované metody izolace DNA poskytly, z daného množství bakteriální kultury, námi
požadovanou koncentraci DNA 80 ng/µl. Požadovanou čistotu ≥ 1,7 jsme získali jen s použitím
komerčních kitů. Restrikční analýza 16S rDNA, 23S rDNA a ITS-23S rDNA ukázala u
zvolených bakterií specifický vzor, který odpovídal výsledkům získaným elektronickým
štěpením příslušných sekvencí nalezených v genové bance. Metody RAPD a amplifikace ITS se
nám podařilo optimalizovat, ale jejich výsledky, zejména díky složité interpretaci, nedokázaly
konkurovat rozlišovací schopnosti restrikční analýzy. Jako první jsme aplikovali metodu RAPD
rozšířenou o denaturační reakci na DNA bakterií a získané výsledky ukazují na velký potenciál
této aplikace, která nabízí jak rychlou tak přesnou identifikaci.
Ing. Lucie Piterková
Title: Molecular biology approach to study of mesophilic and thermophilic Bacillus
populations
SUMMARY
Reliable, rapid and relatively inexpensive method for identification of microorganism is a very
need of all biotechnology laboratories which are involved in microbiological population research,
regarding either environmental or technological approach. One of the crucial tasks in these
studies is to determine the population composition or to reveal the presence of special
microbiological species. Microbiological and biochemical based identification systems are
currently available but the analysis are very tedious and expensive, so that is why the attention is
paid mostly to the molecular-biology methodology.
As the model organism was chosen for all our experiments ubiquitously present Bacillus spp., or
more precisely its mesophilic and thermophilic representatives. There are several molecularbiological methods which could meet our requirements for rapid, reliable and cheap
identification. We chose three of them to optimize and establish in our laboratory (amplification
and further restriction with restriction endonuclease of genes for 16S, 23S and
ITS-23S rRNA; amplification of internal transcribed segments (ITS) and analysis of genomic
DNA by arbitrary PCR method (RAPD)). Characterization of genes for ribosomal functional
RNA molecules became gold standard for identification of prokaryot because these genes are
conserved in their sequence, functionality and length. The part of our studies was also the test of
protocols and kits for DNA isolation. We were interested in the final yield, technical demands
and price of isolation.
All protocols and commercial kits allowed gaining required DNA concentration 80 ng/µl but the
required purity of DNA ≥ 1,7 was achieved only with commercial kits. We reached valuable
results from 16S and 23S rDNA restriction analysis, where gained profiles corresponded to data
obtained from computing cutting of relevant sequences form Gene bank. Unfortunately the ITS
and RAPD methods did not show, mainly due to the complicated interpretation of gained
profiles, such discrimination power. To our knowledge, this is the first case, where recently
established method of McRAPD (melting curves of RAPD) was applied on bacterial samples.
Our results suggested great potential of this application in the field of rapid and reliable
identification.
Ing. Markéta Dvořáková
Název: Stanovení fenolových látek a jejich antioxidační kapacity v ječmeni, sladu a pivu
Školitel: Doc. Ing. Pavel Dostálek, CSc.
Studijní program: Biochemie a biotechnologie Studijní obor: Biotechnologie
SOUHRN
V této disertační práci bylo analyzováno deset různých odrůd ječmene a jejich odpovídajících
sladů. Vzorky byly analyzovány několika způsoby, nejprve byly stanoveny jednotlivé frakce a to
volné, esterifikované a vázané polyfenoly. Největší podíl na obsahu celkových polyfenolů měla
frakce vázaná. Katechin a kyselina ferulová, stanovené pomocí HPLC-DAD, byly nejvíce
zastoupené fenolové sloučeniny jak ve volné, tak ve vázané formě. Antioxidační kapacita
jednotlivých frakcí byla měřena metodou DPPH a FRP.
Dále byla aplikována extrakce horkou vodou, abychom se přiblížili co nejvíce
pivovarské technologii. Vzorky byly analyzovány z hlediska antioxidační kapacity a obsahu
jednotlivých polyfenolů. Pro měření antioxidační kapacity byly porovnány následující metody
DPPH, FRAP a ITT. Dále byl studován vliv použití hnojiv během růstu ječmene, což se ukázalo
jako nesignifikantní, závislé především na odrůdě ječmene. Obsah celkových polyfenolů, měřený
metodou Folin-Ciocalteu, byl pozitivně korelován se všemi použitými metodami pro měření
antioxidační kapacity. Volné polyfenoly byly stanoveny metodou HPLC s elektrochemickou
detekcí. Nejvíce zastoupeným volným polyfenolem byla kyselina ferulová.
Další část této práce byla zaměřena na stanovení monomerních a oligomerních
flavan-3-olů metodou HPLC-UV-ESI-MS. Pro stanovení celkových flavan-3-olů byla použita
vanilínová metoda, pro stanovení celkových polyfenolů již zmíněná metoda Folin-Ciocalteu a pro
měření antioxidační kapacity byly aplikovány metody DPPH a FRP. Katechin a prodelfinidin B3
byly stanoveny jako hlavní monomerní a dimerní flavan-3-oly. Prodelfinidin B3 nejvíce přispívá
k antioxidační kapacitě jak ječmene, tak i sladu.
Součástí této práce je i analýza vzorků českých piv. Pro toto stanovení byla použita metoda
extrakce na pevnou fázi (SPE) následovaná metoudou HPLC-DAD. V pivu byly stanovovány
následující polyfenoly: kyseliny galová, protokatechová, kávová, p-kumarová, ferulová a
salicylová, katechin, epikatechin a kvercetrin, které se podílejí na koloidní a senzorické stabilitě
piva. Bylo testováno 6 různých SPE náplní s různými druhy eluce. Dále je prezentován obsah
jednotlivých i celkových polypfenolů v českých pivech.
Ing. Markéta Dvořáková
Title: Determination of phenolic compounds and their antioxidant capacity in barley, malt
and beer
SUMMARY
In present study the ten different barley cultivars and their corresponding malts were used to
obtain different fractions. The contribution of bound phenolics to the total polyphenol content
was significantly higher than that of free and esterified fractions. Catechin and ferulic acid,
quantified by HPLC-DAD, were the most abundant phenolics in the free and bound fractions,
respectively. The antioxidant activities of phenolic fractions were investigated using the radical
scavenging assay (DPPH) and the ferricyanide reducing power (FRP).
Further the hot water extracts of barley cultivars and corresponding malts were analyzed. The
ferric reducing antioxidant power (FRAP) and radical scavenging activity (ABTS) and indicator
time test (ITT) were compared. The influence of fertilization on barley antioxidant capacity was
studied. The results obtained suggest that impact of fertilization is not evident and depends
significantly on barley genotype. The total polyphenol content, as measured according to FolinCiocalteu’s method was positively correlated with all antioxidant methods used. Free phenolic
compounds were measured by HPLC with CoulArray detector. The dominant phenolic
compound was ferulic acid.
The pattern of the monomeric and oligomeric flavan-3-ols for 10 barley varieties and the
corresponding malts were identified and quantified using high-performance liquid
chromatography ultraviolet detection-electrospray ion trap mass spectrometry. The
FolinCiocalteau and the vanillin spectrophotometric assays were used for the assessment of the
total polyphenol and total flavan-3-ol content respectively, and the antioxidant activity was
determined by DPPH and FRP. Catechin and prodelphinidin B3 were respectively the major
monomeric and dimeric flavan-3-ols. Moreover, prodelphinidin B3 was shown to be the main
contributor for the radical scavenging activity both for barley and malt.
An analytical method based on solid-phase extraction (SPE) and followed by HPLCDAD was
used for determination of free gallic, protocatechuic, caffeic, p-coumaric, ferulic and salicylic
acid and (+)-catechin, (-)-epicatechin and quercetin in beer. These phenolic compounds
participate on colloidal and sensory stability of beer. The six different SPE cartridges were tested
and three types of elution were used. The polyphenol content in various types of Czech beer is
presented.
Ing. Lucie Siříšťová
Název: Profily mastných kyselin termofilních bakterií
SOUHRN
Disertační práce studuje složení mastných kyselin (MK) obsažených v komplexu povrchových
struktur buněk termofilních populací. Modelovými organismy bylo 8 kmenů gramnegativního
taxonu reprezentovaného rody Thermus a Meiothermus a 7 kmenů grampozitivního taxonu
reprezentovaného rody Geobacillus a Alicyclobacillus. Vybrané kmeny gramnegativního taxonu
byly kultivovány v rozsahu kultivačních teplot 40 – 80°C, pro grampozitivní taxon byl rozsah
teplot 35 – 75°C.
MK byly z buněčné populace uvolněny alkalickou hydrolýzou, po té byly převedeny na příslušné
metylestery MK a analyzovány plynovou chromatografií. Obsah MK byl vyjádřen jednak v
procentech celkových MK a též jako koncentrace v sušině biomasy. Práce se věnuje validačním
kritériím zavedené metody a statistickému zpracování naměřených dat vícerozměrnými
průzkumnými technikami.
Jedním z cílů práce bylo srovnání testovaných kmenů z hlediska složení a obsahu MK. Zároveň
bylo testováno, zda by analýza MK mohla být využita jako alternativní identifikační metoda
právě u termofilních bakterií. V případě rodů Thermus, Meiothermus a Geobacillus majoritní
skupinu MK představovaly kyseliny s větveným řetězcem v polohách izo a anteizo, přičemž izo
kyseliny převažovaly nad anteizo kyselinami. Větvené MK byly zastoupeny u rodů Thermus a
Meiothermus v množství větším než 80 % a u rodu Geobacillus 70 – 80 % celkových MK. U
rodu Alicyclobacillus pak dominovaly ω-cyklické MK 68 – 81 % celkových MK, větvené MK
byly zastoupeny v rozsahu 10 – 25 % celkových MK.
Dalším cílem práce bylo sledovat závislosti obsahu jednotlivých MK na kultivační teplotě. Zde
byl nalezen významný rozdíl v adaptaci na teplotu prostředí mezi vývojově vzdálenými rody,
přičemž jednu skupinu představovaly rody Thermus a Meiothermus a druhou skupinu rody
Geobacillus a Alicyclobacillus. Společné rysy u všech testovaných kmenů se týkaly závislosti izo
kyselin na kultivační teplotě, jejich převahy nad anteizo MK za všech použitých teplot a
minimálních obsahů nenasycených MK. Řada odlišností nejen mezi těmito dvěma skupinami, ale
též mezi jednotlivými kmeny uvnitř skupin vedly k předpokladu, že rozdílné mikroorganismy
mohou využívat rozdílné mechanismy adaptace na vysokou teplotou prostředí.
Ing. Lucie Siříšťová
Title: Fatty Acid Profiles of Thermophilic Bacteria
SUMMARY
The thesis deals with the composition of fatty acids (FA) in cell envelopes of thermophilic
bacteria. Eight thermophilic strains of the Gram-negative taxon represented by genera Thermus
and Meiothermus and 7 thermophilic strains of the Gram-positive taxon represented by genera
Geobacillus and Alicyclobacillus were used as model microorganisms. The selected strains of the
Gram-negative taxon were cultivated in the temperature range 40 – 80°C while the Gram-positive
strains were cultivated in the temperature range 35 – 75°C.
FAs were released from lyophilised cells by alkaline hydrolysis and then transformed into fatty
acid methyl esters before being analysed by gas chromatography. The FA composition was
expressed both as percentages of whole FAs and mass concentration units. The work is also
dedicated to validation criteria of the established method and to statistical data processing by
multidimensional techniques.
The results can be divided into two parts. The first part deals with the comparison of tested
strains from the point of view of FA composition. Another goal was to find out if FA analysis
could be used as an alternative identification method in the case of thermophilic bacteria. FAs
with branched chain in a position iso or anteiso were the dominant FAs in the case of genera
Thermus, Meiothermus and Geobacillus, whereas iso FAs were prevailing over anteiso FAs. The
branched chain FAs were found in an amount higher than 80 % of whole FAs for genera Thermus
and Meiothermus. In the case of genus Geobacillus the amount of branched chain
FAs was in the range 70 – 80 % of whole FAs. The major FAs in the case of genus
Alicyclobacillus were the ω-cyclic FAs (68 – 81 % of whole FAs), while the branched chain FAs
were contained in the range 10 – 25 % of whole FAs.
The second part of results deals with the dependence of the particular FA content on cultivation
temperature. Considerable differences in adaptation to elevated temperature were found between
evolutionary distant genera (Thermus and Meiothermus versus Geobacillus and Alicyclobacillus).
The iso FA dependence on cultivation temperature, their predominance over anteiso FAs at all
tested temperatures and unsaturated FA occurrence were the features that all four genera had in
common.
The number of differences found between the two genera as well as among the individual strains
led to an assumption that different microbes probably follow different adaptation strategies to
elevated temperatures.
Ing. Stanislav Ferzik
Název: Vliv vnějších faktorů na růst termofilních mikroorganismů a studium jejich
degradačního potenciálu
SOUHRN
Jednou z nejvíce sledovaných problematik je především degradace odpadů z průmyslových
výrob, a to především díky jejich stále se zvyšující produkci. To se týká také zpracování odpadů z
průmyslové výroby kvasného lihu, jehož produkce se stále zvyšuje z důvodu díky využívání
bioetanolu jako aditiva do paliv, jakožto obnovitelného energetického zdroje. Tato zvyšující se
výroba bioetanolu samozřejmě vede k vyšším produkcím odpadních látek spojených s jeho
výrobou.
Nejdůležitějším odpadem výroby biolihu jsou bezpochyby lihovarské výpalky, které díky svému
poměrně vysokému zbytkovému obsahu organických látek představují nejvyšší ekologickou
zátěž z odpadů při výrobě bioetanolu. Na jeden litr vyprodukovaného kvasného lihu tak může
připadat až 20 litrů výpalků s možným obsahem organických látek okolo 100 g CHSK/l.
Pro odstranění této organické zátěže lze použít mnoho možných postupů degradace. Tato
disertační práce je zaměřena především na prostudováním aerobní degradace kapalné fáze
žitných lihovarských výpalků za pomocí směsné termofilní bakteriální populace izolované z
čističky odpadních vod v Bystřici pod Hostýnem, značené jako „Kal Bystřice“. Zkoumány byly
především vlivy kultivačních parametrů na průběh degradace žitných výpalků.
V teoretické části práce je stručně uvedena problematika termofilních mikroorganismů včetně
jejich průmyslového využití a dále stručné informace o lihovarských výpalcích.
V experimentální části následuje výčet použitých metodik kultivace a analýz použitých pro
hodnocení procesu degradace výpalků.
Ve výsledkové a diskusní části byla prezentována data získaná při studiu vlivů kultivačních
parametrů vždy roztříděna a komentována v menších celcích u jednotlivých studovaných
parametrů. Studovány byly možnosti optimalizace kultivačních podmínek pro maximální
degradaci CHSK, vlivy kultivační teploty, přídavku živin a způsobu vedení kultivace. Dále byla
studována možnost řízení procesu degradace výpalků pomocí regulace kultivace dávkováním
substrátu a také porovnáván proces aerobní termofilní degradace výpalků s anaerobní metodou a
jejich případná kombinace.
Během aerobních degradace výpalků bylo dosaženo přibližně 90% redukce organické hmoty
výpalků vyjádřené jako CHSK. Tato data jsou srovnatelná s analogickými procesy degradace
aerobním či anaerobním způsobem. Přesto však byl prokázán u zde prezentované metody aerobní
termofilní degradace výpalků potenciál vyšších organických zátěží (okolo 50 kg CHSK/m3·d)
než jsou data publikovaná v literatuře.
Ing. Stanislav Ferzik
Title: The influence of external parameters to the thermophilic microorganism growth and
study of their degradation potential
SUMMARY
The treatment of the wastes is one of the most serious problems studied nowadays, due to the
increasing production of them. The need of renewable energy sources usage leads to the higher
production of bioethanol for fuel purposes. The higher fermentation production of ethanol of
course results in the higher production of waste streams connected with this process.
Stillage also termed distillery slops etc. are the main problematic waste of ethanol production and
exhibits a considerable organic carbon pollution potential of the fermentation wastewaters. Up to
20 liters of stillage may be generated for each litre of ethanol produced and the pollution potential
of stillage can exceed a chemical oxygen demand (COD) of 100 gO2/L.
There are lots of possibilities to digest the organic content of this wastewater stream directly or
after some pre-treatments. This work is focused on study of aerobic treatment of skimmed thin
phase of grain distillery slops by mixed thermophilic bacterial culture from municipal wastewater
treatment plant in Bystřice pod Hostýnem. This is mainly focused on influence of the cultivation
parameters to the degradation potential of the chosen thermophilic microorganisms.
In the theoretical part of this work were briefly commented basic methods of wastewater
treatments with the direction at usage of thermophilic processes, other possibilities of
degradations of waste streams, some useful information about thermophilic organisms and also
basic information about distillery slops.
In experimental part were named used methods of cultivation and analyses. Then continued result
part with discussions, where were presented data of influences to degradation potential of
thermophilic aerobic culture by cultivation conditions. Results were commented in couple series
of experiments divided to the chapters linked to the studied parameters.
There was studied the cultivation condition optimization, influences of temperature, nutrients
addition and type of cultivation. Then continued the studies focused on possibilities of process
direction by the substrate dosage regulation and also the comparison of the process with other
digestion treatments and their combinations.
By aerobic thermophilic treatment of stillage was achieved degradation potential of about 90%
COD reduction. This process achieved similar treatment efficiencies like analogous anaerobic
treatments, but permits much higher organic loadings (around 50 kg COD/m3·d) then other
treatment process presented in literature.
Ing. Pavel Hofta
Název: Studium antioxidačních vlastností chmelových složek
Školitel: Doc. Ing. Pavel Dostálek, CSc.
SOUHRN
Předkládaná disertační práce se zabývá celkovou antioxidační kapacitou chmele, antioxidační
aktivitou vybraných polyfenolových látek a celkovou antioxidační kapacitou krevní plazmy po
vypití piva. Dále je v práci stanoven pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie obsah
vybraných polyfenolových látek a xanthohumolu chmele. Součástí této práce je i optimalizace
metodiky na stanovení isohořkých látek piva a stanovení celkových polyfenolů chmele.
V první části disertační práce byly změřeny a porovnány hodnoty celkové antioxidační kapacity
(TAC) českých odrůd chmele pomocí spektrofotometrické metody ABTS a FRAP. Nejvyšších
hodnot TAC dosahovala aromatická odrůda Žatecký poloraný červeňák (v práci označená
Saazer), naopak nejnižších hodnot TAC dosáhla nová hybridní odrůda Harmonie. Obě metody
zjišťování TAC ve chmelech poskytovaly téměř stejné výsledky, naměřené hodnoty korelovaly s
nalezenými obsahy celkových polyfenolů v jednotlivých odrůdách chmele.
Byla zkoumána antioxidační aktivita vybraných 27 polyfenolových látek chmele a piva pomocí
spektrofotometrické metody ABTS a FRAP. Nejvyšší antioxidační aktivita byla naměřena u
kyseliny gallové, kvercetinu, kyseliny ellagové a kyseliny gentisové. Naopak neměřitelná
antioxidační aktivita byla zjištěna např. u kyseliny trans-skořicové nebo salicylové. Mezi oběma
metodami byly zjištěny rozdílné hodnoty antioxidační aktivity u několika látek.
Ve studii na 12 dobrovolnících se zkoumala celková antioxidační kapacita krevní plazmy po
vypití piva typu světlý ležák, nealkoholického piva a syntetického nápoje bez obsahu polyfenolů
s 4,4 %obj. alkoholu a 5 %hm. glukosy. Bylo zjištěno, že po vypití jednoho piva typu ležák
vzroste celková antioxidační kapacita krevní plazmy během hodiny po vypití o 5,3 % pokud byla
použita metoda ABTS a o 11,4 % pokud byla použita metoda FRAP. Nealkoholické pivo zvýšilo
celkovou antioxidační kapacitu krevní plazmy během hodiny po vypití o 5,4 % pokud byla
použita metoda FRAP. Syntetický nápoj neměl na hladiny antioxidantů v krevní plazmě žádný
vliv.
V této práci byla popsána metodika na stanovení vybraných polyfenolových látek chmele pomocí
vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detekcí diodového pole (HPLC-PDA). V českých
odrůdách chmele byly nejvíce zastoupeny rutin, katechin, epikatechin a kyselina ferulová.
Xanthohumol byl stanoven technikou HPLC s UV detekcí ve všech českých odrůdách chmele.
Nejvíce xanthohumolu bylo nalezeno ve vysokoobsažné odrůdě Agnus. Studován byl také úbytek
xanthohumolu během skladování.
Dále byla v práci popsána optimalizovaná LC-MS metoda na separaci všech známých isoαhořkých kyselin piva, pomocí níž se podařilo poprvé identifikovat oba stereoisomery
isoposthumulonu v pivu. Trans-isoposthumulon byl identifikován i ve standardu DCHA-Iso. Ve
skladovaném roztoku standardu DCHA-Iso byly nalezeny dva zatím neznámé rozkladné
produkty.
V závěru práce byl zkoumán obsah celkových polyfenolů ve vzorcích českých odrůd chmele
pomocí metody dle EBC a podle Folin-Ciocalteau. Obě metody dávaly téměř stejné výsledky.
Nejvíce celkových polyfenolů obsahovala jemná aromatická odrůda Saazer, dále pak Sládek,
Premiant, Agnus, Bor a Harmonie.
Klíčová slova: Celková antioxidační kapacita, Humulus lupulus, chmel, pivo, polyfenoly, krevní
plazma, HPLC, ABTS, FRAP, iso-α-hořké kyseliny, isoposthumulon, xanthohumol.
Ing. Pavel Hofta
Title: The study of antioxidant properties of hop compounds
SUMMARY
The aim of this dissertation thesis is the total antioxidation capacity of hop, antioxidation activity
of selected polyphenolic substances and total antioxidation capacity of blood plasma following
beer intake. Further, content of selected polyphenolic compouds and of xanthohumol from hop
were determinated by high performance liquid chromatography (HPLC). Optimization of
methods for determination of isobitter compouds of hop and determination of the total content of
hop polyphenols constitute of this work.
In the first part of this paper, the total antioxidation capacity (TAC) levels of Czech hop varieties
were measured and compared by the ABTS and the FRAP spectrophotometric methods. The
highest TAC values were reached by fine aroma variety Žatecký poloraný červeňák (in this paper
marked as Saazer), whereas the lowest TAC values were reached by variety Harmonie. Both
methods of TAC determination in hop give nearly same results. Measured values correlated with
contents of total polyfenols found in individual hop varieties.
The antioxidation activity in 27 selected polyphenolic substances from hop and beer were tested
with the ABTS and the FRAP spectrophotometric methods. The highest antioxidation activity
was found in the gallic acid, quercetin, ellagic acid, gentisic acid. Whilst very low antioxidation
activity was found e.g. in trans-cinnamic acid or in salicylic acid. The different antioxidation
activity levels in some polyphenols were found by these methods.
The total antioxidation capacity (TAC) of blood plasma were tested after the intake of light lager
beer, non-alcoholic beer and synthetic drink without polyphenols, containing 4.4 % v/v alcohol
and 5 % w/w glucose on 12 volunteers. It was found that TAC of blood plasma increased about
5.3 % during one hour after the drinking one lager beer when the ABTS method was used, and
resp. about 11.4 % when the FRAP was used. Non-alcoholic beer increased TAC of blood plasma
about 5.4 % during one hour after the drinking when the FRAP method was used. Synthetic drink
had no impact on antioxidants levels in blood plasma.
High performance liquid chromatography method with diode array detection (HPLC-PDA) for
determination of selected polyphenolic compounds of hop was described in this study. Rutin,
catechin, epicatechin and ferulic acid were most represented polyphenols in Czech varieties of
hop.
Xantohumol content was determinated by HPLC technique with UV detection in Czech hop
cultivars. The highest content of xantohumol was found in high-alpha variety Agnus. The
decrease of xanthohumol content during storage was also studied.
The optimised method of liquid chromatography with mass spectrometer detection (LC-MS) for
separation of all known iso-α-bitter acid of beer was described. Employing this method, it was
both isoposthumulone stereoisomers in beer were identified for the first time. Transisoposthumulone was identified even in DCHA-Iso standard. Two not yet known degradation
products were found in stored DCHA-Iso standard solution.
The total content of polyphenols was studied in samples of Czech hop cultivars within the study.
Two methods were used: method by European Brewery Convention (EBC) and method by Folin-
Ciocalteau. Both methods give nearly same results. The highest content of total polyphenols
contained fine variety Saazer, then Sládek, Premiant, Agnus, Bor and Harmonie.
Key words: Total antioxidant capacity, Humulus lupulus, hop, beer, polyphenol, blood plasma,
HPLC, ABTS, FRAP, iso-α-bitter acid, isoposthumulone, xanthohumol.
Mgr. Vladimír Nápravník
Název: Implementace moderních trendů vzdělávání v biotechnologiích
Školitel: Doc. Ing. Karel Melzoch, CSc.
SOUHRN
V současné době univerzity procházejí obdobím změn. Faktory přispívající k těmto změnám jsou:
ekonomický tlak zvyšujících se nákladů, požadavky trnu na absolventy, kteří by měli být schopni
fungovat v podmínkách informační společnosti, a větší rozmanitost a různorodost studentů, kteří
pokračují ve vyšším vzdělání. Odpovědí mnoha institucí na tyto změny je rozvoj distančního
vzdělávání prostřednictvím e-learningu. Distanční vzdělávání je vzdělávací technologie, která je
založena na maximálním využití všech možných technických podpor a tutorského vedení, které
umožní studujícímu studovat samostatně, ve svém volném čase a tempem, které odpovídá jeho
aktuálním časovým možnostem. Využívá všech distančních komunikačních prostředků, kterými
lze učivo prezentovat.
Náplní předkládané disertační práce bylo vytvoření on-line kurzu s biotechnologickým
zaměřením a porovnání prezenčního a distančního typu výuky. Byl spuštěn pilotní běh kurzu
„Výroba sladu pro pivovarské účely“, kterého se zúčastnili studenti Ústavu kvasné chemie a
bioinženýrství Fakulty potravinářské a biochemické technologie Vysoké školy
chemickotechnologické v Praze a studenti Katedry chemie Fakulty pedagogické Západočeské
univerzity v Plzni. Na závěr kurzu studenti vyplnili evaluační dotazník. Studenti hodnotili průběh
kurzu, jeho obsahovou a technickou stránku, srovnávali prezenční a distanční formu výuky. V
práci je uveden přehled vysokých škol s výukou chemie. Bylo zjišťováno, do jaké míry se
jednotlivé školy věnují biotechnologickým oborům. Dále je uvedeno, které školy (univerzity)
využívají e-learningové systémy a zda jsou využity i pro studium biotechnologických výrob.
Výsledky ukázaly, že rozsah výuky biotechnologických výrob je rozdílný i na stejných typech
škol. Distančního vzdělávání v chemických oborech je využíváno velmi málo. Kurzy s
biotechnologickým zaměřením v nabídkách vysokých škol prakticky chybí. Pilotní běh on-line
kurzu proběhl úspěšně. Přestože se většina zúčastněných studentů setkala s distančním
vzděláváním poprvé, považovali kurz za zajímavý a v některých studentech vyvolal zájem o další
případné e-learningové studium. Vytvořený kurz je zařazen v nabídce on-line kurzů Západočeské
univerzity v Plzni.
Klíčová slova: distanční vzdělávání; e-learning; on-line kurz; biotechnologie; sladařství.
Mgr. Vladimír Nápravník
Title: The Implementation of Modern Trends in Education of Biotechnology
Supervisor: Doc. Ing. Karel Melzoch, CSc.
SUMMARY
Nowadays the universities are coming through a period of changes. The factors contributing to
these changes are particularly: economic pressure of increasing costs; market demand for
graduates who should be able to work in conditions of IT society; large variety and diversity of
students continuing in next education. Response of many institutions to these changes is
development of distance education by e-learning. The distance education is a technology of
education which is based on maximal exploitation of all possible technical supports and tutors
leadership. It helps students study independently. They can study in their own free time. They can
choose their own timing, which corresponds to their current time possibilities. The distance
education uses all distance communication means usable for presentation of the subject matter.
Subject of this introducing thesis is to develop an on-line course with a view of biotechnology
and a comparison of regular and distance type of studying. A pilot run of the course “Production
of malt for brewer’s objects” was started. This course was participated by
Students of Department of Fermentation Chemistry and Bioengineering, Faculty of Food and
Biochemical Technology, Institute of Chemical Technology in Prague and students of
Department of Chemistry at the Pedagogical Faculty of the University of West Bohemia in
Pilsen. The students completed an evaluation questionnaire at the end of the course. They
evaluated the course, its subject and technical aspects. They compared the regular and distance
type of studying. A review of universities where chemistry is taught is stated in this thesis too. It
was found to what degree the individual schools inscribe biotechnological branches. Further is
stated which universities exploited e-learning systems and if they are used for studying
biotechnological productions.
The Results showed that the extent of education in biotechnology productions is different at the
identical type of universities. The distance education is not often used in the chemical sphere. The
courses with biotechnological view are practically missing in the offers of universities. The pilot
run of the on-line course went ahead successfully. Most of the students who met the distance
education in this project did so for the first time. Yet they regarded it as very interesting for them.
According to some students the course has raised their interest in further appropriate e-learning
studies. The course thus produced is now included in the offer of on-line courses at The
University of West Bohemia in Pilsen.
Keywords: distance education; e-learning; on-line course; boitechnology; malting.
Ing. Barbora Branská
Název: Využití optických metod ke studiu fenotypové diverzity a dynamiky mikrobiálních
populací v průběhu biotechnologického procesu
Školitel: Doc. Ing. Karel Melzoch, CSc.
SOUHRN
Disertační práce se věnuje možnostem využití průtokové cytometrie a mikroskopie ve spojení s
obrazovou analýzou k měření morfologických a fyziologických změn u technologicky
významných mikroorganismů. Pro vybrané modelové mikroorganismy Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris, Thermus aquaticus, Thermus ruber a Thermus sp. byly testovány
jednotlivé fluorescenční sondy z hlediska jejich vhodnosti ke stanovení viability a následujících
buněčných charakteristik: membránové integrity pomocí ethidium bromidu (EB), propidium
jodidu (PI) a Sytox green, transmembránového potenciálu pomocí rhodaminu 123 (Rh123), 3,3'diethyloxacarbocyanin jodidu (DiOC2(3)) a bis-oxonolu (BOX), intracelulární esterázové aktivity
fluorogenními enzymovými substráty fluorescein diacetátem (FDA) a karboxyfluoresceinem
diacetátem (CFDA) a intracelulárního obsahu nukleových kyselin a proteinů značených
propidium jodidem, resp. fluorescein isothiokyanátem (FITC).
Pro uvedené fluorescenční sondy byly nalezeny optimální podmínky značení, vymezeny
aplikační intervaly a s ohledem na jejich interakce s buňkami byly k dalšímu měření vybrány: PI,
DiOC2(3), BOX, FDA, CFDA pro rod Thermus a FITC, které byly využity ke stanovení
morfologie a fyziologie modelových mikroorganismů v závislosti na stáří buněčné populace a
kultivačních podmínkách. Pro rod Thermus byl proveden celkový screening vlivu kultivační
teploty v rozsahu 50-80°C na růstovou dynamiku, morfologické a fyziologické vlastnosti buněk.
Zatímco u kvasinek byly v průběhu kultivací pozorovány jen velmi malé výkyvy sledovaných
parametrů, bakteriální buňky vykazovaly daleko vyšší fenotypovou diverzitu v závislosti na fázi
růstu a kultivační teplotě. Bylo zjištěno, že fluorescenční sondy jsou schopné indikovat změny v
populaci termofilních mikroorganismů ještě dříve, než se projeví ve změně růstových
charakteristik mikrobní populace jako celku. Na základě toho bylo poukázáno na možnosti
využití průtokové cytometrie, velmi rychlé a přesné metody umožňující analýzu heterogenní
populace na úrovni jednotlivých buněk, k monitorování a řízení kultivačních procesů. Přesto, že
je tato práce zaměřena pouze na velmi úzké spektrum z široké škály možností optických a
fluorescenčních technik, ukazuje jak na jejich nesporné výhody a praktické aplikace, tak i jejich
limity.
Ing. Barbora Branská
Title: Application of Optical Methods for Studies of Phenotypic Diversity and Dynamics of
Microbial Populations During Biotechnological Process
Supervisor: Doc. Ing. Karel Melzoch, CSc.
SUMMARY
Presented work is focused on application possibilities of a flow cytometry, microscopy and image
analysis in connection to fluorescent staining for a determination of morphological and
physiological changes in cells. Comparative studies were carried out with the chosen model
microorganisms Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Thermus aquaticus, Thermus ruber,
Thermus sp. and for particular fluorescent probes with respect to their ability to distinguish viable
and dead cells and to assess the following cell characteristics: membrane integrity using ethidium
bromide (EB), propidium iodide (PI) and Sytox green, transmembrane potential employing
Rhodamine 123, 3,3'-diethyloxacarbocyanine iodide (DiOC2(3)) and bis-oxonol (BOX),
intracellular esterase activity applying fluorogenic enzyme substrates fluorescein diacetate (FDA)
and carboxyfluorescein diacetate (CFDA), and finally intracellular nucleic acid and protein
content by propidium iodide, resp. fluorescein isothiocyanate (FITC) staining.
Optimal staining conditions were defined for all the listed probes, simultaneously their
application ranges were determined considering the interactions with cells and based on this, six
of them were chosen (PI, DiOC2(3), BOX, FDA, CFDA for genus Thermus and FITC) as
appropriate for the detection of physiological changes in the mentioned microorganisms.
Subsequently, optical methods were applied to growth dynamics, morphology and physiology
monitoring of cells grown under different conditions. Screening of temperature influence on
Thermus growth capacity and phenotypic diversity was performed at 50°C to 80°C. While
observed physiological parameters of the yeast cells varied insignificantly along their growth
curve, in cultures of thermophilic bacteria, sharp drops were noted even under optimal growth
conditions. It was found out that the fluorescent probes are capable to predate growth
characteristics in population of thermophilic bacteria even before they occurred in microbial
population as the whole unit. Based on this, flow cytometry, rapid method enabling analysis on
the single cell level was introduced as a powerful tool for biotechnological process control.
Despite, the fact that the study covers only a small range of the many optical and fluorescent
techniques available, it shows both their indisputable advantages and their practical applications
and limits.
Ing. Radka Šnajdrová
Název: Příprava a aplikace „2. generace“ biokatalyzátorů v Baeyer-Villigerově oxidaci
Školitelé: Doc. Ing. Alena Čejková, CSc. a Ao. Uni Prof. Dr DI Marko D. Mihovilovic
Studijní program: Biochemie a Biotechnologie
Studijni obor: Biotechnologie
SOUHRN
Chirální laktony jsou velmi důležitými prekurzory v organické syntéze zejména od té doby, kdy
je celá řada těchto produktů dostupná díky enantioselektivní Baeyer-Villigerově oxidaci.
Takovéto produkty oxidace mohou sloužit jako stavební bloky pro přípravu přírodních látek
anebo látek s biologickým účinkem.
Za tímto účelem byly využity Baeyer-Villigerovy monooxygenázy (BVMO), jelikož tyto enzymy
vykazující různou substrátovou specificitu a enantioselektivitu. Jejich přínosem je, že mohou
vytvořit i několik chiralních center v jediném reakčním kroku. V této předkládané práci byly
využity rekombinantní celobuněčné systémy, které zaručí produkci požadovaného enzymu v
dostatečném množství.
Paralelně byly syntetizovány ketony s norbornanovým jádrem a substituované ruznými
funkčními skupinami. Takovéto prekurzory byly dále oxidovány pomocí rekombinantních kmenů
E. coli exprimující BVMO. Biotransformace umožnily v mnoha připadech přístup k oboum
antipodálním laktonům s vysokým enantioselektivním výtěžkem.
Zájem byl také soustředěn na substrátový profil několika nově identifikovaných BVMO různého
bakteriálního původu. Nedávný progres v oblasti determinace struktury založené na krystalografii
nabízí proniknutí do podstaty prostorových a elekronických požadavků aktivního centra
monooxygenáz. Zároveň tak umožní predikci úspěšné biooxidace, případně i její
stereopreferenci.
V průběhu určování substrátového profilu nových BVMO byl objeven rekombinantní kmen s
jedinečnými katalytickými vlastnostmi. Tento celobuněčný sytém představuje první
BaeyerVilligerovu monooxygenázu, která umožňuje efektivní kinetickou resoluci bi- a
tricyklických ketonů s vysokou regioselektivitou.
Různé možnosti pro regeneraci kofaktorů monooxygenáz byly taktéž zvažovány během realizace
předkládané práce. Byl vyvinut biokatalyzátor, který je schopen regenerovat kofaktor v průběhu
oxidační reakce. Takovýto systém by se mohl uplatnit v průmyslových aplikacích, jelikož by
odpadly vysoké náklady, které jsou zpravidla nutné pro kvantitativní průběh reakce katalyzované
NAD(P)H-dependentními enzymy.
Ing. Radka Šnajdrová
Title: Asymmetric Baeyer-Villiger Oxidations Using “2nd Generation” Biocatalysts
Supervisors: Doc. Ing. Alena Čejková, CSc. and Ao Uni Prof. Dr DI Marko D. Mihovilovic
SUMMARY
Chiral lactones are important building blocks in organic synthesis since a broad range of
interesting products is accessible via enantioselective Baeyer-Villiger oxidation from simple
ketones. Such product lactones can serve as versatile building blocks in natural product and
bioactive compound synthesis.
For this purpose Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) were utilized, since these enzymes
exhibit different substrate specificity and enantioselectivity. Their advantage is that they can
generate several chiral centers in a single biotransformation step upon desymmetrization
reactions. In order to simplify possible applications by preparative chemists, recombinant wholecell systems, which produce the required enzyme in substantial quantities, were utilized.
Much effort has been also directed towards substrate profiling using a set of representative
precursors with newly identified BVMOs of various microbial origins. Together with recent
progress in structure determination based on x-ray crystallography, this offers insight into spatial
and electronic requirements of substrates within the active sites of such monooxygenases, and
enables predictions for successful biooxidation and its stereopreference.
In parallel, a variety of substituted ketones implementing a norbornane structural motif and
bearing different functional groups was synthesized in order to enlarge an existing substrate
library. Such precursors were further oxidized using engineered strains of E. coli overexpressing
BVMOs. In several cases biotransformations were carried out with high enantioselectivity giving
access to both antipodal lactones.
During substrate profiling of newly identified BVMOs, an engineered strain with unique
biocatalytic behavior was uncovered. This whole-cell system represents the first BaeyerVilliger
oxidation biocatalyst that effectively resolves racemic bi- or tricyclic fused ketones bearing a
cyclobutanone motif in highly regioselective manner.
Various cofactor recycling options were also considered during this study. As an outcome a selfsufficient biocatalyst was developed, which can carry out cofactor regeneration concomitant to
the oxygenation reaction and, consequently, is metabolically independent. Such a system can be
very useful for industrial application, since operational cost necessary for cofactor recycling
would decrease dramatically.
Ing. Marcel Karabín
Název: Studium přeměn sladových a chmelových polyfenolů ve vztahu k jejich
antioxidačním účinkům v pivovarském procesu
Školitel: Ing. Pavel Dostálek, CSc.
SOUHRN
Polyfenolové látky jsou v současné době v popředí zájmu pivovarských odborníků na celém světě
a to nejenom díky svým protektivním účinkům na lidský organismus, ale především kvůli svému
významu v pivovarské technologii, kde se jim přisuzuje významná role v procesech oxidačněredukčních změn, majících za následek potlačení vzniku senzoricky nežádoucích karbonylových
sloučenin.
Tato práce se zabývá stanovením polyfenolových látek, jejich obsahem v základních
pivovarských surovinách – chmelu a sladu, změnami jejich obsahu v procesu výroby piva a
jejich vlivem na genezi karbonylových sloučenin.
V práci bylo použito řady moderních analytických postupů, které se dnes při stanovení těchto
látek využívají, včetně HPLC s detekcí pomocí detektoru diodového pole a GC/MS.
Pomocí těchto metod bylo zjištěno, že obsah polyfenolových látek ve chmelech je značně závislý
na odrůdě, místu a způsobu pěstování. Nicméně byla prokázána specifičnost Žateckého
poloraného červeňáku a dalších domácích odrůd týkající se obsahu polyfenolových látek a
antioxidačních vlastností z nich připravených vodných výluhů.
Byla prokázána použitelnost dvou metod stanovení antioxidačních vlastností pivovarských
materiálů a zjištěna úplná korelace jejich výsledků na hladině významnosti 99%.
Za použití zmíněných metod byl sledován obsah polyfenolů a antioxidační vlastnosti v průběhu
celé pivovarské technologie a potvrzen předpoklad, že antioxidační vlastnosti jsou významně
závislé na změnách obsahu polyfenolových složek.
Význam chmelových polyfenolů pro snížení tvorby karbonylových sloučenin během výroby piva
i během skladování, byl potvrzen analýzami pokusných várek se sníženým obsahem chmelových
polyfenolů, který měl za následek významné zvýšení obsahů většiny zvolených karbonylových
sloučenin, jak v meziproduktech při výrobě várek, tak i v hotovém pivu čerstvém i skladovaném.
Klíčová slova: chmel, pivo, antioxidanty, polyfenoly, karbonylové sloučeniny
Ing. Marcel Karabín
Title: The study of malt and hop polyphenols changes in relation to their antioxidant effects
in brewing process
Supervisor: Ing. Pavel Dostálek, CSc.
SUMMARY
Nowadays, polyphenolic compounds are in the forefront of interest of brewing experts in the
whole world. Besides their protective effect on human health, they are of great interest mainly
due to their technological importance, where an important role in oxido-reducing changes is
attributed to them, such as the suppression of the formation of organoleptically undesirable
carbonyl compounds.
This work deals with the determination of polyphenolic compounds, their content in brewing raw
materials (malt and hop), changes of their concentration during the brewing process and with
their influence on the genesis of carbonyl compounds.
Several modern analytical approaches were used to determine these compounds, including HPLC
with diode array detector and GC/MS.
By means of these methods it was found that the content of polyphenol compounds in hops
depends significantly on the variety, place and way of cultivation. However, it was proved the
uniqueness of Saaz hop and other Czech origin varieties as regards their polyphenol content and
antioxidant properties of their water extracts.
The applicability of two different method of determination of the antioxidant capacity of brewing
raw materials was proved and their mutual correlation at the level of significance 99% was found.
Using these methods, the content of polyphenols and antioxidant capacities were followed in the
course of the whole brewing process and it was proved the hypothesis that the antioxidant
characteristics significantly varied upon the content of polyphenolic compounds.
The significance of hop polyphenols for decreased formation of carbonyl compounds during both
beer production and storage was proved by analysing experimental brews with decreased hop
polyphenol content, since it was observed to result in significantly decreased concentration of the
majority of selected carbonyl compounds both in intermediate products during wort brewing and
in fresh and aged beer.
Keywords: hop, beer, antioxidants, polyphenols, carbonyl compounds
Ing. Jan Novák
Název: Studium zmen kvasinky Saccharomyces cerevisiae v pivovarském procesu
prutokovou cytometrií
Školitel: Prof. Ing. Gabriela Basařová, DrSc.
SOUHRN
Předkládaná práce na téma: Studium změn kvasinky Saccharomyces cerevisiae v pivovarském
procesu průtokovou cytometrií, se zabývala výzkumem možností aplikace fluorescenčních barviv
a sond ve spojeni s fluorescenčně optickou metodou průtokovou cytometrií ke studiu změn
kvasinek Saccharomyces cervisiae, v pivovarském procesu byly rozděleny do několika částí a to:
propagace pivovarských kvasinek, hlavní kvašení, ošetřování a skladování kvasinek.
V první části disertační práce byly za laboratorních podmínek stanoveny specifické růstové
rychlosti tří testovaných kmenů pivovarských kvasinek za různých teplot a maximální růstová
rychlost za teplosty 28st.C, která je pro pivovarské kvasinky považována za optimální. Sledované
kmeny se z hlediska maximální růstové rychlosti významně nelišily. Čtvrtprovozní pokusy byly
zaměřeny na porovnání aerobní a anaerobní propagace kvasinek. Bylo zjištěno, že během aerobní
propagace dochází k odchylkám v průběhu buněčného cyklu, vyšší kumulaci glykogenu v
porovnání s anaerobní propagací a také k rychlejší tvorbě a odbourávání celkových buněčných
bílkovin. Aerobní systém byl výrazně efektivnější z hlediska nárůstu biomasy a produktivity
systému, avšek bylo pozorováno snížení flokulačních schopností po aerobní propagaci u kmene
č. 95 Navazující část předkládané práce se zabývala posouzením vlivu geometrie kvasné nádoby
a koncentrace původní mladiny na fyziologické vlastnosti pivovarských kvasinek a porovnáním
chování tří testovaných kmenů za různých teplost vedení hlavního kvašení. Bylo zjištěno, že
testované kmeny inklinovaly k vyšší koncentraci rozptýlených buněk, nižším hodnotám viability
a posunům v průběhu buněčného cyklu během hlavního kvašení vedeném v modelu
cylindokonického tanku proti kvašení v otevřených vkasných nádobách. Srovnáním dvou teplot
hlavního kvašení bylo zjištěno, že rozdíly mezi třemi testovanými kmeny narůstají s rostoucí
teplotou hlavního kvašení. Za vyšší teploty docházelo k rychlejšímu a výraznějšímu nárůstu
počtu buněk v G2/M fázi buněčnéo cyklu. Prudký pokles buněk v G2 a M fázi resp. Prudký
nárůst buněk v G1 fázi se překrýval s obdobím maximální rychlosti zkvašování maltosy kmenem
č. 95. Během kvašení při teplotě 13st.C se obsah glykogenu u tří testovaných kmenů na konci
kvašení zvýšil oproti kvašení při teplotě 9stC, potvrdil se tím positivní vliv rostoucí teploty na
syntézu glykogenu pivovarskými kvasinkami.
Poslední skupina modelových experimentů se zabývala vlivem ošetřovacích a skladovacím
postupů na fyziologický stav pivovarských kvasinek a stanovením rozdílů geneticky kodovaných
vlastností tří testovaných kmenů během skladování. Bylo odzkoušeno, že pomocí průtokové
cytometrie lze kvantifikovat míru znečištění pivovarských kvasnic a efektivitu promývacích
postupů. Nový způsob redukce bakteriální kontaminace aktivovaným chloristanem sodným se
oproti praníkyselinou fosforečnou ukázal jako šetrnější z hlediska zachování dobrého
fyziologického stavu a viability kvasnic avšek méně efektivní z hlediska odstranění kontaminace.
Během dlouhodobého skladování kvasinek byl zjištěn pozitivní vlik míchání a přídavku
dihydrogenfosforečnanu draselného do skladovacího roztoku v množství 2%hm. Na zachování
viability, esterasové aktivity a obsahu fyziologicky váznamných látek v kvasinkách.Na základě
provedených experimentů je možno fluorescenčně optické barvíci techniky a analýzu kvasinek na
průtokovém citometru hodnotit jako velice pokročilou metodu plně vyhovující k výzkumu a
popisu široké škly změn pivovarských kvasinek během kvasného procesu.
Ing. Jan Novák
Title: Study of changes of yeast Saccharomyces cerevisiae in brewery processes by flow
cytometry
Supervisor: Prof. Ing. Gabriela Basařová, DrSc.
SUMMARY
Presented work on the topic: “Study of changes of yeast Saccharomyces cerevisiae in brewery
processes by flow cytometry” was aimed on research and application of fluorescent dyes, probes
and flow cytometry methods in study of changes Saccharomyces cerevisiae under conditions
simulating brewery processes. Experimental work modeling brewery processes was divided into
three parts as follows: brewery yeast propagation, main fermentation, storage and handling of
brewery yeast. Specific growth rates of three tested lager strains depending on growth
temperature and maximal growth rate under optimal temperature 28 ºC in laboratory scale were
determined in first part of presented work. There were not founded significant differences
between tested strains from the point of view of maximal growth rate. Pilot plant experiments
simulating brewery yeast propagation were concerned on comparison of aerobic and anaerobic
system of brewery yeast propagation. Propagation under aerobic was more biomass growtheffective and the productivity of aerobic system was notably higher compare to anaerobic system.
One of tested strains showed the loose of flocculation ability after aerobic propagation.Next part
of presented work was aimed on the examination of fermentation vesel geometry and wort
original gravity influence on brewery yeast physiology and on comparison of three tested strains
during pilot plant experiments simulating main fermentation under different temperatures. Tested
strains tended to higher concentrations of dispersed cells, košer rates of viable cells after main
fermentation performed in the model of cylindro conical tank compare to open fermenting vessel.
Shifts in cell cycle were observed both in different fermenting vessels and different
concentrations of used worts. Under pilot plat main fermentations conditions was observed trend
that genetically coded differences between tested strains are growing with growing temperature
of main fermentation. Higher temperature of main fermentation was leaded to faster and higher
growth of G2/M phase cells in first hours of fermentation. Rapid decrease of G2/M cells in later
phases of main fermentations was in correlation with period of maximal maltose utilization, e.g.
strain n. 95 showed slowest decreases in G2/M phase cells and slowest maltose utilization rate as
well. Higher fermentation temperature was leading to higher glycogen concentrations in
harvested yeast; this trend was confirmed for all three tested strains.
Last group of model experiments were targeting the yeast handling and storage procedures and its
influences on brewery yeast physiology. Yeast physiology state was examined by flow cytometry
methods and genetically coded strain differences were determined under different storage
conditions. Range of yeast slurry pollution was determined by flow cytometry as well as
efficiency of yeast washing procedures. New non-acid washing way for reduction of bacterial
contamination tested in this work, was significantly better from the point of view of yeast vitality
and viability, nevertheless this method didn’t show same efficiency of bacterial contamination
reduction as phosphoric acid washing. Positive effect of adding of potassium dihydrogen
phosphate to the storage liquid and continuous agitating during storage was determined during
long term storage experiments. Described positive conditions were leading to higher viability and
vitality of tested yeast after storage. Based on performed experiments and work results is possible
fluorescent optical methods and brewery yeast analyses by flow cytometry appreciate as very
good tool of brewery yeast changes analyses in experimental work as well as new quality
assurance tool in breweries.
Ing. Martin Veselý
Název: Vývoj a využití genových manipulací u kmene Rhodococcus erythropolis
degradujícího fenol
Školitel: Doc. Ing. Alena Čejková, CSc.
SOUHRN
V práci je studován kmen Rhodococcus erythropolis CCM2595, který degraduje některé
aromatické sloučeniny (fenol, naftalen, katechol, p-nitrofenol, p-chlorofenol) a svými vlastnostmi
vyhovuje požadavkům kladeným na mikroorganismus použitelný v biotechnologických
procesech. Pro použití genových manipulací v tomto kmeni byly zavedeny a optimalizovány
metody genetických přenosů (transformace a konjugace) s použitím plazmidové DNA. Na
základě plazmidového replikonu pSR1 z příbuzné aktinomycety Corynebacterium glutamicum
byly zkonstruovány vektory pro klonování genů a analýzu promotorů R. erythropolis.
Ve studovaném kmeni byla prokázána exprese klonovaného genu gpfuv pro zelený fluoreskující
protein (GFP), který tak může být použit jako nový marker umožňující sledování buněk R.
erythropolis. Varianta tohoto genu (rsgfp) byla použita jako reportérový gen pro konstrukci
promoter probe vektoru pPRE11. Jeho funkce byla testována vložením různě silných promotorů
z C. glutamicum a měřením intenzity fluorescence.
Byla zavedena metoda inzerce nereplikativního vektoru pK18mobsacB do chromosomu R.
erythropolis prostřednictvím homologní rekombinace a ověřena možnost pozitivní selekce
dvojitých rekombinantů pomocí genu sacB, zajišťujícího produkci podmíněně letálního enzymu
levansacharasy. U kmene R. erythropolis CCM2595 byla určena kompletní sekvence genu pro
16S rRNA (GenBank AJ620506), která potvrdila správnost jeho taxonomického zařazení.
Metodou plasmid rescue byl izolován kompletní operon kódující enzymy účastnící se ketoadipátové dráhy pro degradaci katecholu. Byla určena nukleotidová sekvence tohoto operonu
(GenBank AJ605581), který je tvořen geny catA (kódující katechol-1,2-dioxygenasu), catB
(kódující mukonátcykloisomerasu), catC (kódující mukonolakton- -isomerasu) a příslušným
regulačním genem catR. Operon catRABC, byl klonován v nově sestrojeném vektoru pSRK21 a
funkce genu catA byla potvrzena heterologní expresí katechol-1,2-dioxygenasy v E. coli. Bylo
zjištěno, že induktorem tohoto enzymu je u R. erythropolis fenol, zatímco katechol a cis,cismukonát indukci nezpůsobují. Exprese genu catA nebyla reprimována glukosou, zatímco
sukcinát způsoboval silnou katabolickou represi.
Ing. Martin Veselý
Title: Development and use of gene manipulations in phenol-degrading Rhodococcus
erythropolis
Supervisor: Doc. Ing. Alena Čejková, CSc.
SUMMARY
Gram-positive bacterium Rhodococcus erythropolis CCM2595 is capable of degrading a wide
range of aromatic compounds (phenol, naphthalene, catechol, p-nitrophenol, pchlorophenol). For
its characteristics, this microorganism is highly suitable for use in biotechnology. Efficient
utilization of its biodegradative potential is still hampered by the lack of knowledge of its
genetics and by a limited choice of tools for genetic manipulation. For this reason, the methods of
genetic transfer (transformation, conjugation) were developed and optimized in R. erythropolis
CCM2595. The stable vectors for cloning of the genes and analysis of the promoters were
constructed on the basis of the cryptic plasmid pSR1 from the related Corynebacterium
glutamicum.
The expression of the gene for green fluorescent protein (GFP) was proved in R. erythropolis
strain. Protein GFP can thus be used as a detection marker for R. erythropolis cells. A variant of
this gene (rsgfp) was used as a reporter for the construction of the promoter probe vector
pPRE11. Its function was tested by cloning several strong promoters from C. glutamicum and by
evaluating the intensity of fluorescence.
The method for insertion of non-replicative vector pK18mobsacB into the chromosome of R.
erythropolis was established. The possibility of positive selection of recombinants with second
recombination event via the counter-selectable marker (sacB gene) was also proved. This method
allows unmarked manipulations (deletions, insertions, mutations and replacements) within the R.
erythropolis chromosome and construction of new modified plasmid-less strains. The complete
sequence of 16S rRNA (GenBank AJ620506) from R. erythropolis CCM2595 was determined
which confirmed its taxonomical assignment.
The complete operon coding for enzymes of catechol degradation pathway ( -ketoadipate
pathway) was isolated (by the plasmid rescue method), sequenced and cloned in a newly
constructed vector pSRK21. The operon consists of the genes catA (catechol
1,2dioxygenase), catB (muconate cycloisomerase), catC (muconolactone -isomerase) and catR
(gene for the respective transcriptional regulator).The function of the catA gene (coding for
catechol 1,2-dioxygenase) was confirmed by the heterologous expression of catechol 1,2dioxygenase in E. coli. It was found, that phenol acts as an inducer of this enzyme in R.
erythropolis. On the other hand, catechol and cis,cis-muconate do not promote the induction.
Expression of the catA gene was not repressed by glucose whereas succinate caused strong
catabolic repression.
Ing. Eva Klapková
Název: Aplikace biotrickling filtru v procesu degradace hydrofobních a hydrofilních
těkavých látek
SOUHRN
Cílem této disertační práce bylo sestavení a zprovoznění trickling filtru, otestování jeho
hydrodynamické charakteristiky, ověření vhodnosti jeho použití pro odstraňování těkavých
organických polutantů z odpadních plynů vznikajících při výrobě organických rozpouštědel a
především pro odstraňování směsi hydrofilních a hydrofobních rozpouštědel používaných v
lakařském průmyslu.
Byla studována degradace par toluenu, xylenu, směsi toluen, xylen a směsi hydrofilních a
hydrofobních rozpouštědel – methylethylketon, methyl-isobutylketon, octan butylnatý, toluen a
xylen. Byly provedeny zátěžové charakteristiky a to jak změnou vstupní koncentrace tak i
změnou průtoku vzduchu. Byl zkoumán vliv velikosti náplně (Pallovy kroužky) na degradační
účinnost. Dále byl sledován vliv minerálních živin na účinnost degradace a především byl
otestován dlouhodobý provoz trickling filtru, kdy jako cirkulační médium byla používána pouze
vodovodní voda. Pro porovnání provozních podmínek byly souběžně provedeny přibližně stejné
experimenty se směsí hydrofilních a hydrofobních rozpouštědel v biofiltru. Při degradaci této
směsi rozpouštědel dochází k provozním problémům spojených s degenerací přítomné mikrobní
populace a dále s nadměrným nárůstem biomasy. Z porovnání je zřejmé, že biofiltr se jeví jako
vhodnější zařízení pro degradaci dané směsi a je schopen dosahovat vyšších eliminačních
kapacit. Dále byl sledován vliv rychlosti cirkulující kapalné fáze na degradační vlastnosti
trickling filtru při degradaci toluenu a směsi toluen a methylethylketon.
U jednotlivých zařízení bylo sledováno složení biofilmu po dlouhodobém provozu, kdy zařízení
bylo inokulováno směsnou mikrobní populací o známém složení. Také byly zjišťovány počty
mikroorganismů a připraveny vzorky pro skenovací elektronovou mikroskopii. Složení biofilmu
po dlouhodobém provozu bylo značně proměnlivé, došlo k vymizení některých bakteriálních
kmenů, ale vždy byly v biofilmu identifikovány plísně a kvasinky.
Ing. Eva Klapková
Title: Degradation of hydrophobic and hydrophilic volatile compounds in a biotrickling
filter
SUMMARY
The objectives of the study regarding a biotrickling filter were as follows: A put in operation of
the reactor system, a measurement of its hydrodynamic characteristics and performance
characteristics during painting solvents vapor biofiltration.
The study was focused on a removal of toluene and xylenes vapors individually and in a mixture
and on a removal of the complex mixture of hydrophilic and hydrophobic solvents – methyl ethyl
ketone, methyl isobutyl ketone, n-butyl acetate, toluene and xylenes. The loading tests comprised
both the loading by increasing concentration of the pollutants in the inlet air and by changing the
inlet ait flow rate. The impact of the particle size of the packing (Pall rings) and that of a presence
of mineral nutrients in a circulating medium on the removal efficiency was studied. Also the
effect of a long-term operation with tap water as a circulating medium on the removal efficiency
was tested. Similar experiments simultaneously were carried out in a biofilter for a comparison.
Degrading a mixture of hydrophilic and hydrophobic solvents operation troubles resulting in a
decline of the removal efficiency of the biocatalyst and a clogging effect were observed. The
biofilter proved to give better results in removing this complex solvent mixture in comparison to
the biotrickling filter.
The effect of the flow rate of the circulating medium on a degradation of toluene and a mixture of
toluene and methyl ethyl ketone was tested, too.
Using a defined mixed microbial culture for the inoculation biofilm composition changes during
a long-term reactor performance also were tested. A microscopic observation of the biofilm
structure using scanning electron microscopy was applied.
Ing. Jiří Bárta
Název: Aerobní biodegradace nitrotoluenů v různých typech reaktorů
Školitel: Prof. Ing. Jan Páca DrSc.
SOUHRN
Byla testována schopnost vybraných bakteriálních kmenů účinně degradovat vybrané
mononitrotolueny (2-nitrotoluen, 3-nitrotoluen, 4-nitrotoluen) a dinitrotolueny (2,4dinitrotoluen a
2,6-dinitrotoluen). Testy probíhaly s bakteriálními kmeny Pseudomonas putida, Pseudomonas
sp., Sphingobacterium multivorum, Sphingomonas sp., Kluyvera cryocrescens, Comamonas
testosteroni, Rhodococcus sp. a Stenotrophomonas maltophilia. Výsledné hodnoty byly
porovnány s degradační schopností směsné populace Pardubice izolované z kontaminované půdy
v podniku Synthesia a.s., Pardubice. Byl také sledován nárůst buněk měřením optické density,
dále byla sledována hodnota konečného pH. Byl také testován vliv přítomnosti NO3- iontů, které
bývají přítomny v různých množstvích v odpadních vodách z muničních továren.
Výsledky ukázaly, že nejlepším degradérem mononitrotoluenů byl rod Pseudomonas, dalšími
degradéry byly druhy Stenotrophomonas malthophilia, Rhodococcus sp. a Comamonas
testosteroni. Jednoznačně nejlepších degradačních výsledků bylo dosahováno se směsnou
populací Pardubice.
U dvou zmiňovaných dinitrotoluenů byly navíc otestovány dvě uměle konstruované směsné
populace (3 kmenné a 5 kmenné konsorcia). Bylo prokázáno, že degradační účinnost stoupá v
této řadě: 3 kmenné konsorcium › 5 kmenné konsorcium › směsná populace Pardubice.
Se směsnou populací Pardubice byly určeny biokinetické parametry pro všechny testované
mononitrotolueny (v přítomnosti a bez přítomnosti NO3-).
Byly sestaveny kontinuálně pracující bioreaktory se třemi různými náplněmi (šamotové ostřivo,
expandovaná břidlice a poraver). V nich byla testována degradační schopnost směsných populací
účinně degradovat mononitrotolueny a dinitrotolueny. Jako nejlépe vyhovující materiál se jeví
expandovaná břidlice, nejhorších výsledků bylo dosahováno s šamotovým ostřivem.
Ing. Jiří Bárta
Title: Aerobic biodegradation of nitrotoluenes in different reactors
Supervisor : Prof. Ing. Jan Páca DrSc.
Study programme : Biochemistry and Biotechnology
Subprogramme : Biotechnology
SUMMARY
In this study a biodegradation ability of several bacteria was tested. Pseudomonas putida,
Pseudomonas sp., Sphingobacterium multivorum, Sphingomonas sp., Kluyvera cryocrescens,
Comamonas testosteroni, Rhodococcus sp. and Stenotrophomonas maltophilia were testeted to
satisfactory degrade mononitrotoluenes (2-nitrotoluene, 3nitrotoluene and 4-nitrotoluene) and
dinitrotoluenes (2,4-dinitrotoluene and 2,6dinitrotoluene). Values from these experiments were
compared with that one achieved with mixed culture Pardubice isolated from the contaminated
soil in Synthesia a.s., Pardubice. Optical density and pH of the medium was also measured.
Because of the NO3- presence in contaminated water out coming from munition plants, the effect
of NO3- addition was also tested.
Results showed that the best bacterium able to degrade nitrotoluenes is Pseudomonas putida. But
other bacteria as Stenotrophomonas maltophilia, Rhodococcus sp. a Comamonas testosteroni
showed promising results. The best results at all showed the mixed culture Pardubice.
For experiments with dinitrotoluenes two synthetic mixed cultures were constructed (3 strains
consortia and 5 strains consortia). It was proved that the degradation efficiency is increasing in
row: 3 strains consortia › 5 strains consortia › mixed culture Pardubice.
The biokinetic parameters were determined with all mononitrotoluenes (with and without NO3addition) with the mixed culture Pardubice.
Continuously operated bioreactors with different packing materials (fire-clay, expanded slate and
poraver) were constructed. Different loading characteristics with mononitrotoluenes and
dinitrotoluenes were measured. The expanded slate was determined as the best packing material
for degrading both mononitrotoluenes and dinitrotoluenes. In the other hand fire-clay was the
worst packing material.
Ing. Marcela Hradská
Název: Produkce pyranosa-2-oxidasy rekombinantním kmenem Escherichia coli v
bioreaktoru
Školitel: RNDr. Pavel Kyslík, CSc.
SOUHRN
Složení kultivačního média pro rekombinantní kmen Escherichia coli BL21(DE3)(pSE33) bylo
optimalizováno metodou experimentálního designu. Produkce rekombinantní pyranosa-2-oxidasy
z basidiomycéty Trametes ochracea klonované na mnohakopiovém plasmidu byla zvýšena 10x v
jednorázových třepaných kultivacích rekombinantního mikroorganismu. Levná laktosa byla
použita jako komponenta média a zároveň jako induktor exprese genu p2o, který byl pod
kontrolou promotoru ptrc. Expresní systém byl detailněji studován ve
vsádkových a
přítokovaných kultivacích v bioreaktoru se záměrem zvýšit hladinu exprese aktivního
rekombinantního proteinu a minimalizovat tvorbu inkluzních tělísek. Ve vsádkových kultivacích
byla stanovena nejvyšší hodnota specifické aktivity pyranosa-2-oxidasy (0,92 U/mgpr) za
podmínek limitace kyslíkem a při kultivační teplotě 25°C. Nejvyšší produktivita pyranosa-2oxidasy (320 U/(l.h)) byla stanovena v průběhu přítokovaných kultivací s vysokým nárůstem
biomasy za použití strategie exponencionálního přídavku živného roztoku.
V průběhu přítokovaných kultivací byla do média opakovaně přidávána laktosa.
Konečná koncentrace biomasy dosáhla hodnoty 33 g/l. Porovnání produktivity pyranosa2oxidasy mezi jednorázovou třepanou kultivací na neoptimalizovaném médiu a přítokovanou
kultivací na optimálním médiu s exponenciálním přídavkem živného roztoku ukázalo, že se
hodnota produktivity enzymu zvýšila 110x. Rekombinantní pyranosa-2oxidasa zůstává v
cytoplasmě a její aktivní forma tvoří 9% celkových rozpustných proteinů buňky. Sledované
fyzikální vlastnosti a kinetické parametry purifikované rekombinantní pyranosa-2-oxidasy jsou
podobné vlastnostem původního enzymu izolovaného z hostilského kmene Trametes ochracea.
Ing. Marcela Hradská
Title: Production of pyranose 2-oxidase by recombinant strain Escherichia coli in
bioreactor
Supervisor: RNDr. Pavel Kyslík, CSc.
SUMMARY
The composition of the culture medium for recombinant strain Escherichia coli
BL21(DE3)(pSE33) was optimized by using of method of experimental design. Expression of a
recombinant pyranose 2-oxidase from basidiomycete Trametes ochracea cloned into multiple
copy number plasmid has been increased 10-fold in shaking flask culture recombinant strain.
Inexpensive lactose was used as a medium component as well as inducer of exprssion of the gene
p2o, which is under the control of a trc promotor. The expression system was studied in detail in
batch and fed-batch cultivations with the aim to improve the expression level of active
recombinant protein and to minimize the formation of inclusion bodies. In batch cultivations, the
highest specific activity of pyranose 2-oxidase (0,92 U/mgpr) was measured in oxygen-limited
cultures grown at 25°C. The highest productivity of pyranose 2-oxidase (320 U/(l.h)) has been
determined in a fed-batch process with a feed-forward exponencial feeding strategy.
During the fed-batch process, lactose was added repeatedly to the culture. A final biomass
concentration of 33 g/l was obtained. Compared to shaking flask cultures in non-optimized
culture media, the productivity of pyranose 2-oxidase has been improved by a factor of 110 using
the fed-batch strategy and optimized culture medium. Recombinant pyranose 2-oxidase was
expressed in the cytoplasm with 9% of the total soluble protein being active pyranose 2-oxidase.
In terms of physical and kinetic properties, the purified recombinant pyranose 2-oxidase was
found to be similar to pyranose 2-oxidase isolated from its original host Trametes ochracea.
Ing. Zdena Čermáková
Název: Optimalizace mikrobiální produkce kyseliny mléčné
Školitel: Prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc.
SOUHRN
Tato práce byla nedílnou součástí komplexního řešení projektu „Optimalizace mikrobní produkce
kyseliny mléčné“ v programu EU EUREKA Σ 1870 Biolactate, který byl financován MŠMT ČR
a zabývala se především vyhledáním a testováním kmenů mléčných bakterií vhodných pro
budoucí průmyslové využití při produkci kyseliny mléčné v rámci ČR. Součástí této práce je
rovněž aplikace těchto kmenů při produkci okyselených mladin v pivovarském průmyslu.
Na základě screeningových studií provedených na Ústavu Kvasné chemie a bioinženýrství
VŠCHT Praha byly vytipovány tři kmeny pro další studium ve vsádkových a kontinuálních
kulturách. Ve vsádkových kultivacích byl sledován vliv rozpuštěného kyslíku, složení média a
kultivační teploty na chování kmenů Streptococcus salivarius 786, Lb. plantarum L10 a Lb.
rhamnosus 1828, tak abychom získali optimální podmínky pro produkci L(+) kyseliny mléčné.
Kmen Lb. plantarum L10 a Lb. rhamnosus 1828 byly podrobeny kontinuální kultivacím, kde byl
ze stejného hlediska studován vliv zřeďovací rychlosti. Na základě výsledků z obou typů
kultivací byl jako nejvhodnější pro převod do vyššího měřítka shledán kmen Lb. plantarum L10 a
to i přes nízké zastoupení L(+) izomeru kyseliny mléčné. Kmen Lb. rhamnosus 1828 sice
prokázal stabilně vysoký podíl L(+) izomeru kyseliny mléčné, nicméně současnou produkcí
extracelulární polymerní látky bohužel značně komplikoval vlastní techniku kultivací a
především izolační část.
V části práce, která byla věnována aplikaci mléčných bakterií pro biologické okyselování mladin
byl studována míra utilizace jednotlivých cukerných složek mladiny a dále inhibiční vliv hořkých
látek chmele na růst mléčných bakterií. Okyselené mladiny byly prokvašeny a byl sledován vliv
pH na obsah senzoricky aktivních látek piva, přičemž již počáteční pH 5,0 mladiny před
prokvašením ukázalo vliv na rychlejší odbourávání diacetylu.
Ing. Zden Čermáková
Title: Optimization of the microbial production of lactic acid
Supervisor: Prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc.
SUMMARY
This work was the part of the complex project „Optimization of the microbial production of lactic
acid“ in the frame of EU project EUREKA Σ 1870 Biolactate, supported by Czech Ministry of
Education. The work was focused on screening and testing of lactic acid bacteria (LAB) strains
suitable for industrial use in lactic acid production. Part of the work is also dedicated to
application of LAB strains within brewing industry for bioacidification of worts.
Based on the screening studies carried out on Dept. of Fermentation Chemistry and
Bioengineering, ICT Prague, three LAB strains was selected for further studies in batch and
continuous cultures. Response of Streptococcus salivarius 786, Lb. rhamnosus 1828 and Lb.
plantarum L10 on varying cultivation conditions such as dissolved oxygen concentration,
composition of cultivation media and cultivation temperature was studied in batch cultivations, to
achieve optimal conditions for L(+) lactic acid production. Lb. plantarum L10 a Lb. rhamnosus
1828 strains were also tested in continuous cultivations to study influence of dilution rate on
lactic acid production parametres. The first mentioned strain was found to be suitable for scaled
up experiments, even though the L(+) lactic acid content was not favourable. In the opposite, the
Lb. rhamnosus 1828 strain showed stable production of high content of L(+) lactic acid,
nevertheless, the simultaneous production of an extracellular polymeric substance caused serious
complications during the izolation of the lactic acid.
In the part of the work concerned with introduction of lactic acid to the brewing process using
LAB strains for bioacidification of worts, the capability to utilize particular sugars of wort was
studied. Moreover, the inhibition of bacterial growth by hop bitter acids was investigated. The
influence of wort initial pH value before first stage fermentation on the content of senzorically
active substances of beer was tested. Among other positive results, the decrease in pH to 5,0
resulted in more rapid degradation of diacetyle.
Ing. Eliška Komárková
Název: Fyziologické změny Candida tropicalis a Comamonas testosteroni populace během
degradace fenolových směsí
SOUHRN
Fenol a fenolické látky často kontaminují vodu půdu. Tyto látky vznikají jako odpadní produkt v
mnoha různých průmyslových procesech. Jsou to látky často toxické a představují reálný problém
z hlediska životního prostředí. Technologie využívané k řešení těchto problému , zahrnují celou
radu procesu . Jednou z možností je biologický rozklad těchto látek s pomocí mikroorganismu .
Detailní poznání fyziologie používaných kmenu je jednou z podmínek jejich úspešného využití.
Cílem naší práce bylo prozkoumat vliv nutričního stresu v průběhu degradace fenolu a katecholu
na fyziologii vybraných kmenu . Byl sledován eukaryotní kmen Candida tropicalis Ct2 a
prokaryotní kmen Comamonas testosteroni F9B. Oba kmeny jsou schopny využívat fenol jako
jediný zdroj uhlíku a energie. Za podmínek vysokého přísunu kyslíku je Candida tropicalis
schopna nejen degradovat fenol vyšší podmínek nižší dodávky kyslíku se projevuje typický
inhibiční efekt při stejné koncentraci fenolu.
Candida tropicalis je také schopna degradovat fenol i za podmínek limitace zdroji dusíku,
fosforu i stopových prvku . Tato degradace probíhá na úkor vnitřních buněčných rezerv a
umožňuje populaci lépe reagovat na výkyvy vnějšího prostředí. Vyčerpání těchto rezerv má za
následek nerovnováhu v aktivitě klíčových enzymu , akumulaci katecholu v médiu a následně
vznik hnědočerných produktu které inhibují další proces oxidace fenolu. Tato inhibice je vratná a
po jejich odstranění z média (za současného doplnění živin) dochází k obnově procesu degradace
fenolu.
Comamonas testosteroni F9B byl vybrán na základe svých širokých biodegradačních schopností.
Oproti výše zmíněné kvasince, testovaný kmen Comamonas testosteroni F9B byl schopen
degradovat fenol bez přítomnosti minerálních živin na úkor vnitrních rezerv pouze krátce. Po
vyčerpání živin z média došlo k zastavení procesu oxidace fenolu, ale nebyla pozorována tvorba
metabolitu inhibujících tento proces. Rozdílná reakce obou kmenu je dána rozdílnou organizací
biodegradační dráhy. To vysvětluje též necitlivost kmene Comamonas testosteroni F9B vuc i
inhibičním produktu metabolismu Candida tropicalis Ct2.
Ing. Eliška Komárková
Title: Physiological Changes of Candida tropicalis and Comamonas testosteroni Populations
During a Degradation of Phenolic Compounds
SUMMARY
Phenolic compounds, which contaminate soil and ground water, represent a widespread problem
in industrialized countries. Toxic compounds present a serious environmental problem. Phenolrelated environmental problems could be solved by various technologies, including
biodegradation. Successful strain application is facilitate with physiology knowledge.
Aim of our study was to explore effect of the starvation stress on biodegradation of phenol and
catechol. Eucaryotic strain Candida tropicalis Ct2 and procaryotic strain Comamonas
testosteroni F9B were studied. Both strains are able to use phenol as thein sole carbon and energy
source. An excess of oxygen not only results in higher qS values, but also enables the cells to be
more resistant to higher phenol concentrations. Under oxygen limitation phenol degradation rate
shows typical inhibitory kinetics.
Candida tropicalis is able to degrade phenol under starvation stress (nitrogen, phosphorous and
micronutrients). Cells use their internal reserves. Cells may better react to the environmental
changes. Imbalance of key enzymes activity, catechol accumulation an blackbrown metabolites
formation is a consequence of the nutrient exhaustion. Metabolites have an inhibition effect on
the phenol degradation process. This inhibition is reversible.
Comamonas testosteroni F9B is strain with broad degradation ability. This procaryotic strain is
able to use its internal reserves for the biodegradation process for a short time under starvation
stress. Comamonas testosteroni F9B uses a different metabolic pathway for the phenol
degradation process than C. tropicalis. Neither catechol accumulation, nor the formation of
black-brown metabolites was detected. Metabolites accumulated by Candida tropicalis did not
affect phenol degradation by Comamonas testosteroni.
Ing. Ariana Fialová
Název: Fysiologické aspekty biodegradací
Školitel: Doc. Ing. Alena Čejková, CSc.
SOUHRN
Vysoká a nadále se zvyšující intenzita a rozsah průmyslové a zemědělské činnosti ve dvacátém a
jednadvacátém století má vedlejší negativní efekty, jakým je kromě jiného kontaminace životního
prostředí, půd, vod a vzduchu chemickými látkami. S cílem zmenšit či odstranit rizika, spojená s
působením toxických polutantů na přírodní ekosystémy, je vyvíjena a aplikována celá řada
sanačních technologií. Nynější bioremediační metody, oproti tradičním fyzikálně chemickým,
nabízejí relativně nízké náklady, a také možnost úplné mineralizace mnohých toxických
sloučenin. Bioremediace představuje technologii využívající živé mikroorganismy nebo jejich
komponenty ke snížení koncentrace, k částečné biodegradaci nebo úplné mineralizaci polutantů v
kontaminovaných půdách a vodách.
Odstraňování škodlivin biologickou, šetrnou a efektivní cestou je podmíněno mimo jiné
konkrétními podmínkami v dané lokalitě, biodegradačním potenciálem použité mikrobní
populace a jeho evoluce a možností kontroly daných parametrů ve prospěch účinného procesu
dekontaminace. Jedná se zejména o otázku biologické dostupnosti polutantu a nutrietů a o
biodegradační dráhy, jakými daná mikrobní populace polutant rozkládá. Je třeba hledat možnosti,
jak rozšířit a urychlit již existující biodegradační schopnosti a při praktické aplikaci mít možnost
účinného monitorování, kontroly a měření efektivity celého sanačního procesu na základě
poznání a pochopení výše zmíněných skutečností.
Předložená práce se zabývá rozšířením současných znalostí některých dílčích aspektů
bioremediačních technologií se zaměřením na biologickou a biochemickou stránku dané
problematiky. Fyziologické aspekty biodegradací, jako je bližší charakterizace biodegradačních a
enzymových mechanismů, jsou nezbytným předpokladem úspěšného nasazení mikroorganismů
ve funkci degradérů škodlivin.
Jako modelová skupina polutantů byla pro svou vysokou toxicitu, baktericidní účinky a značnou
rozšířenost vybrána skupina aromatických látek na bázi fenolu, jejichž zdrojem je, kromě
přirozených (fytomasa, dendromasa), lidská činnost (samotná výroba fenolu, petrochemický
průmysl, havarijní úniky ropných látek, farmaceutický průmysl, kožedělný a dřevozpracující
průmysl apod.).
Pro studium fyziologických aspektů biodegradací byli vybráni dva zástupci mikrobní říše:
nepatogenní půdní mikroorganismy, schopné utilizovat fenol a některé jeho deriváty jako jediné
zdroje uhlíku a energie: kvasinka Candida maltosa a bakterie Rhodococcus erythropolis
CCM2595. Pro oba mikroorganismy byly vybrány kultivační podmínky vhodné pro aktivní
biodegradační proces, vybrány vhodné screeningové metody a měřící metodiky, provedeny
biodegradační testy se škálou polutantů a jejich směsí, byly stanoveny vybrané enzymové aktivity
figurující v biodegradační dráze látek na bázi fenolu. Ty byly blíže charakterizovány a použity
jako jeden z prostředků modulace biodegradačního procesu, byla provedena a vyhodnocena
adaptace bakteriální i kvasinkové populace, jakožto nástroje zvyšujícího toleranci
mikroorganismů k vysokým koncentracím škodlivin, a byly sledovány vlivy přídavku
humínových kyselin na účinnost procesu v různých kultivačních uspořádáních.
Cílem dané práce je srovnání biodegradační a enzymové aktivity kvasinky a bakterie, jakožto
úspěšných představitelů degradérů látek na bázi fenolu. Práce se snaží poznat mechanismy
kontroly, rozsahu a rychlosti biodegradace. Dosažené výsledky a poznatky lze uplatnit nejen v
dalším studiu biodegradačního potenciálu a vlastností dané kvasinkové a bakteriální populace, ať
už pro účely základního výzkumu nebo biotransformačního využití např. ve farmacii, ale
především jako podkladu pro využití Candida maltosa a Rhodococcus erythropolis v reálném
bioremediačním procesu.
Ing. Ariana Fialová
Title: Physiological aspects of biodegradation
Supervisor: Doc. Ing. Alena Čejková, CSc.
SUMMARY
High and further increasing intensity and extent of industry and agriculture in the 20th and 21st
century has negative side effects, i.a. contamination of the environment, soil, water and air with
chemical substances. With the aim of decreasing or eliminating risks, which are bound with
impacts of toxic pollutants on natural ecosystems, there are bioremediation technologies
developed and applied. Recent biodegradation methods, in contrast with traditional physicalchemical ones, offer relatively low costs and also possibility of the total mineralization of
numerous toxic substances. Bioremediation presents a technology usány living microorganisms
or their components to decrease the concentration, partial biodegradation or mineralization of
pollutants in contaminated water or soil.
Contaminants removal by means of biological, gentle and effective way depends i.a. on
conditions on site, on the biodegradation potential of the used microbial population and its
evolution and on the possibility to control the given parameters to ensure effective
decontamination procedure. The crucial factors are biological availability of both pollutants and
nutrients and biodegradation pathways involved in the microbial metabolism. It is necessary to
search for possibilities, how to extend and quicken already existing biodegradation abilities, and
during applications to proceed effective monitoring, control and evaluation of the whole
bioremediation procedure, based on understanding above mentioned facts.
This thesis tries to extend recent knowledge of some aspects of bioremediation technology with
the stress on biological and biochemical part of the problem. Physiological aspects of
biodegradations (like closer characteristics of biodegradation and enzyme mechanism), present
the necessary assumption of a successful application of microbial degraders. As a model group of
pollutants were chosen aromatic substances based on phenol,due to their high toxicity,
bactericidal effects and frequent appearance in the industrial waste.Their source is both of a
natural origin (phytomass, dendromass) as well as of the anthropogenic origin (phenol production
itself, petrochemical industry, accidents – oil spills,drugs industry, wood manufacture etc.).
For the study of physiological aspects of biodegradations were chosen two nonpathogenic strains:
yeast Candida maltosa and bacteria Rhodococcus erythropolis CCM2595. For both strains were
chosen cultivation conditions optimal for active biodegradation process and adequate screening
and measurement techniques. There were proceeded biodegradation tests with variety of
pollutants and their mixtures and were determined selected enzyme activities important in the
phenol degradation pathway. These activities were closer characterized and used as one of the
tools for biodegradation process evaluation and modulation. Both strains were adapted on higher
phenol concentrations; adaptation increased the microbial resistance towards high contaminants
concentration. Further was observed positive effect of humic substances on the process and
phenol hydroxylase oscillations.
The target of this thesis is the comparison of biodegradation and enzyme activity of the tested
yeast and bacteria. That means determination of possibilities and limitations for the potential
application of the microbial degraders into the decontamination procedure.
The research in the thesis tries to recognize and understand control mechanisms, the extent and
speed of the biodegradation process with.
The reached results and knowledge may be useful not only for following studies on
biodegradation potential of the given yeast and bacteria (for basic research or biotransformation)
but above all as a background for applying Candida maltosa and Rhodococcus erythropolis CCM
2595 into a real decontamination procedure.
Ing. Jan Enge
Název: Stanovení těžkých kovů v nápojích elektrochemicky
Školitel: Ing. Pavel Dostálek, CSc
SOUHRN
Pro stanovení těžkých kovů v nápojích byla zvolena metoda galvanostatické rozpouštěcí
chronopotenciometrie (GSCP), kterou lze na porézní elektrodě ze skelného uhlíku se rtuťovým
filmem paralelně stanovit kovy zinek, kadmium, olovo a měď. Stanoveny byly obsahy těchto
kovů v balených vodách a minerálních vodách přírodních i ochucených, v limonádách a džusech,
vínu a destilátech. Vzorky byly analyzovány přímo po zředění a úpravě pH.
Při přímém stanovení v pivu byla výtěžnost kadmia a mědi nízká. Zinek a olovo nebylo možné
díky komplexnosti matrice stanovit. Navíc vlivem složek piva docházelo k rychlé deaktivaci
elektrody. Vzhledem k nemožnosti přímého stanovení byly testovány různé způsoby úpravy
vzorku pro eliminaci vlivu matrice piva. Byl proveden rozklad na suché cestě, rozklad na mokré
cestě, zachycení kovů na ionexu a mikrovlnný rozklad. Vzorky po úpravě byly analyzovány
metodou hmotnostní spektrometrie v indukčně vázaném plazmatu (ICP-MS) a výtěžnosti
jednotlivých rozkladů byly porovnávány s přímým stanovením metodou ICP-MS (bez rozkladu,
pouze po odplynění, zředění demineralizovanou vodou 1:1 a přídavku vnitřního standardu.In a Bi
20 μg.l-1).
Při rozkladu na suché cestě došlo ke ztrátám zinku, kadmia a mědi a ke kontaminaci olovem. Při
rozkladu na mokré cestě byla s dobrou přesností stanovena měď, ale kadmium a olovo nebylo
možné stanovit pro vysoký detekční limit a zinek pro spektrální interference. V případě použití
ionexu nedošlo ke kvantitativnímu navázání kovů na ionex a došlo k výrazné ztrátě prvků. Tento
pokus potvrdil silnou vazbu prvků na složky matrice piva, která byla rovněž zjištěna při přímé
analýze piva metodou GSCP. Při mikrovlnném rozkladu bylo dosaženo dobré přesnosti pro
stanovení mědi. Výtěžnost zinku a olova byla ovlivněna kontaminací vzorků, koncentrace kadmia
byla pod mezí detekce. Tento postup byl nejvhodnější pro vzorky, které mají vyšší koncentrace
kovů a správnost stanovení není tak výrazně ovlivněna případnou kontaminací.
Jediná z použitých metod pro stanovení prvků v pivu, kterou lze považovat za správnou, byla
vzhledem k velmi nízkým skutečným koncentracím prvků přímá analýza metodou ICP-MS. Při
této metodě bylo maximálně zabráněno kontaminaci a poskytla nejpřesnější a nejsprávnější
výsledky.
Byla potvrzena vysoká citlivost velký lineární rozsah a robustnost metody GSCP pro stanovení
vybraných prvků ve vodných roztocích. Při sledování vlivu matrice byl zjištěn velký vliv
polyfenolů na snížení výtěžnosti zinku a olova. Správnost metody GSCP pro stanovení olova ve
víně byla potvrzena analýzou referenčního materiálu v rámci projektu IMEP 16 – olovo ve víně.
Metodou GSCP byly stanoveny mediány, minima a maxima těžkých kovů v běžně dostupných
nápojích na českém trhu; ve vodách a minerálních vodách pro zinek 28,66 (<0,93-56,05) μg.l-1,
kadmium 0,65 (<0,39-1,26) μg.l-1, olovo 2,16 (<0,73-8,80) μg.l-1 a měď 2,60 (<0,98-4,97) μg.l-1;
v ochucených vodách pro zinek 19,60 (8,61-47,53) μg.l-1, kadmium <0,39 μg.l-1, olovo 1,82
(<0,73-28,92) μg.l-1 a měď 22,83 (<0,98-39,86) μg.l1; v limonádách a džusech pro zinek 16,48
(<0,93-131,49) μg.l-1, kadmium 1,98 (<0,393,31) μg.l-1, olovo 7,50 (<0,73-36,76) μg.l-1 a měď
9,86 (<0,98-24,09) μg.l-1; ve víně pro kadmium <0,45 μg.l-1, olovo 0,50 (<0,10-0,50) μg.l-1 a měď
45,60 (43,33-101,38) μg.l-1, zinek nebyl stanoven; v destilátech zinek 56,56 (<1,72-109,10) μg.l1
, kadmium 1,04 (<0,42-4,82) μg.l-1, olovo 4,40 (0,57-13,23) μg.l-1 a měď 18,48 (2,77-52,55)
μg.l-1.
Koncentrace těžkých kovů v pivu byly stanoveny metodou ICP-MS přímo bez mineralizace
vzorku pro zinek 5,65 (<0,01-18,99) μg.l-1, kadmium 0,21 (0,05-0,36) μg.l1, olovo 0,27 (0,080,61) μg.l-1 a měď 38,12 (17,90-79,81) μg.l-1.
Koncentrace olova v balených vodách a v ochucených balených vodách byly srovnatelné s
publikovanými hodnotami. Většina koncentrací těžkých kovů stanovených v limonádách a
džusech byla na spodní hranici hodnot publikovaných jinými autory, stejně jako koncentrace
těžkých kovů ve vínech a v destilátech.
Při srovnání stanovených koncentrací kovů v pivu s dostupnými údaji v literatuře byly naměřeny
zatím nejnižší hodnoty. Hodnoty uváděné ve starší literatuře byly řádově vyšší zřejmě kvůli
vyšším detekčním limitům a kontaminaci při rozkladu vzorků.
Dominantním zdrojem zinku pro pivovarský proces byl slad (zhruba stejný obsah jako v ječmeni)
Podobný obsah zinku jako v mlátě byl v přírodním chmelu - granulích (extrakty obsahovaly
podstatně méně těžkých kovů). V odpadech byl zinek nejvíce zastoupen v mlátě. Obsah kadmia
při sladování klesl na polovinu. Hlavním zdrojem kadmia byl slad, ale vyšší obsah byl ve
chmelových granulích. V odpadech byl nejvyšší obsah kadmia v mlátě. U olova byly nalezeny
nejvyšší koncentrace ve chmelu a to o 2 řády vyšší než ve sladu. V odpadech byly nejvyšší
koncentrace olova v mlátě a v mladinových kalech. Obsah mědi ve chmelu vysoko překročil
koncentrace ostatních kovů. Byl dokonce o řád vyšší než obsah olova. Velká část mědi byla z
pivovarského procesu odstraněna v mlátě, ale ještě větší obsah byl v mladinových kalech.
Počáteční technologické procesy pivovarské výroby rmutování, chmelovar a hlavní kvašení vedly
k výraznému poklesu koncentrace těžkých kovů, které do procesů vstoupily ze surovin a z
technologického zařízení. Největší část těchto kovů byla odstraněna v odpadech pivovarské
výroby zejména v mlátě a v horkých a studených mladinových kalech. Další část kovů byla při
kvašení absorbována a adsorbována kvasinkami. Z hlediska zvyšování koncentrace těžkých kovů,
hlavně olova, v závěrečných operacích výroby piva byly jako nejkritičtější identifikovány
procesy filtrace a stáčení. Přesto byla koncentrace olova ve stočeném pivu blízko meze detekce a
o 2 řády pod povoleným limitem. Kadmium bylo během výroby zcela eliminováno. Zinek a měď,
které jsou stopovými prvky, se pohybovaly v nízkých koncentracích na hranici detekčního limitu
metod hluboko pod koncentracemi povolenými legislativou. U zinku činil rozdíl stanovené
koncentrace a povoleného limitu 4 řády a u mědi 3 řády.
Ing. Jan Enge
Title: The Determination of Heavy Metals in Beverages Electrochemically
Supervisor: Ing. Pavel Dostálek, CSc.
SUMMARY
The galvanostatic stripping chronopotentiometry method (GSCP), which is suitable for
simultaneous determination of metals zinc, cadmium, lead and copper on a porous electrode from
glassy carbon with a mercury film was selected for determination of heavy metals in beverages.
These metals were determined in bottled water and mineral water natural and flavoured, in
lemonades and juices, wine and spirits. Samples were analysed directly after dilution and pH
modification.
The yield of cadmium and copper by direct determination was low. Zinc and lead was not
possible to be determined due to the matrix complexity. In addition all the influence of beer
components caused fast deactivation of the electrode. Because of the impossibility of direct
determination various ways of sample preparation for beer matrix impact elimination were tested.
A dry decomposition, a wet decomposition, a metal fixation on ionex and a microwave
decomposition were done. Samples after preparation were analysed by the inductively coupled
plasma–mass spectrometry method (ICP-MS) and yields of individual decompositions were
compared to direct determination by the ICP-MS method (without decomposition, after
degassing, deionised water dilution 1:1 and internal standard In a Bi 20 μg.l-1 addition).
During the dry decomposition there were zinc, cadmium and copper losses and lead
contamination. During the wet decomposition, copper was determined with good accuracy but
cadmium and lead were not possible to determine for a high detection limit and zinc for spectral
interferences. While using the ionex there was not quantitative metal fixation and significant
metal losses occurred. This trial confirmed strong metal affinity to beer matrix components,
which was also detected by direct beer analysis by the GSCP method. During the microwave
decomposition a good accuracy for copper determination was acquired. The zinc and lead yield
was influenced by samples contamination. The cadmium concentration was below detection
limit. This procedure was most suitable for other beer production samples, which contained a
higher concentration of metals and correctness of determination was not so significantly
influenced by possible contamination.
Regarding the very low real element concentration in beer, the only method used for heavy
metals determination, which can be considered right, was a direct analysis by the ICP-MS
method. This method ensured the maximal avoiding of contamination and therefore provided the
most accurate and most correct results.
A high sensitivity, a large linear range and robustness of the GSCP method for determination of
selected elements in water solutions were confirmed. A high impact of polyphenols on zinc and
lead yield reducing was found during the matrix influence determination. The correctness of the
GSCP method for lead determination in wine was confirmed by reference material analysis
within the IMEP 16 – Lead in Wine project.
By the GSCP method medians and ranges of heavy metals concentrations were determined in
common beverages on the Czech market; in waters and mineral waters for zinc 28,66 (<0,93-
56,05) μg.l-1, cadmium 0,65 (<0,39-1,26) μg.l-1, lead 2,16 (<0,738,80) μg.l-1 and copper 2,60
(<0,98-4,97) μg.l-1; in flavoured mineral waters for zinc 19,60 (8,61-47,53) μg.l-1, cadmium
<0,39 μg.l-1, lead 1,82 (<0,73-28,92) μg.l-1 and copper 22,83 (<0,98-39,86) μg.l-1; in lemonades
and juices for zinc 16,48 (<0,93131,49) μg.l-1, cadmium 1,98 (<0,39-3,31) μg.l-1, lead 7,50
(<0,73-36,76) μg.l-1 and copper 9,86 (<0,98-24,09) μg.l-1; in wine for cadmium <0,45, lead 0,50
(<0,10-0,50) μg.l-1 and copper 45,60 (43,33-101,38) μg.l-1, zinc was not determined; in spirits for
zinc 56,56 (<1,72-109,10) μg.l-1, cadmium 1,04 (<0,42-4,82) μg.l-1, lead 4,40 (0,57-13,23) μg.l-1
and copper 18,48 (2,77-52,55) μg.l-1.
Heavy metal concentrations in beer were determined by the ICP-MS directly without sample
decomposition for zinc 5,65 (<0,01-18,99) μg.l-1, cadmium 0,21 (0,05-0,36) μg.l1, lead 0,27
(0,08-0,61) μg.l-1 and copper 38,12 (17,90-79,81) μg.l-1.
The lead concentrations in bottled waters and in flavoured bottled waters were comparable to
published values. Most of the heavy metal concentrations determined in lemonades and juices
were at the lower limit of the values published by other authors, as well as concentrations of
heavy metals in wines and spirits.
The heavy metals concentrations determined in beer were the lowest so far in comparison to
those published in literature. The values published in older literature sources were higher by
numeral order, apparently due to higher detection limits and contamination during sample
decomposition.
Malt was the dominant source of zinc in brewing process (approximately the same content as in
barley). Similar zinc content as in malt was in the natural hop – pellets (far lower heavy metals
content was in extracts). In waste, the highest zinc content was in spent-grain. The cadmium
content was decreased to ½ during malting. Main source of cadmium was malt, but higher
cadmium content was in hop pellets. In waste, the highest content of cadmium was in spent-grain.
The highest lead content was found in hop. It was higher by two numeral orders than in malt. In
waste, the highest lead content was in spent-grain and in wort trub. The copper content in hop
was far higher than other metals’ content. It was even by one numeral order higher than the lead
content. A big part of the copper was separated in spent-grain, but a still higher content was in
wort trub.
In the initial technological processes of brewing production mashing, wort boiling and primary
fermentation, a significant reduction of heavy metal concentration, which entered the processes
from raw materials and technological equipment, was reached. The greatest part of these metals
was removed in waste of brewing process, mostly in spent grain and in hot and cold wort trub.
Further part of metals was absorbed and adsorbed by yeast. Processes of filtration and packaging
were identified to be the most critical concerning the increase of heavy metals, mainly lead,
concentration in final operation of beer production. However, the lead concentration in bottled
beer was near the detection limit and two numeral orders below the legal limit. Cadmium is
totally eliminated during production. Zinc and copper, which are trace elements, were in a range
of low concentrations near the detection limit and deep below the legal limit. The difference was
four numeral orders for zinc and three numeral orders for copper.
Ing. Martin Halecký
Název: Biodegradace styrenu, acetonu a benzínu v odpadních plynech
SOUHRN
Byla studována degradace par styrenu, acetonu s benzínu v biofiltrech. Výsledky ze zátěžových
testů při podmínkách ustáleného stavu a studie dynamického chování biofiltrů poskytly, spolu s
mikrobiologickými testy, komplexní představu o chování biofiltrů. Z provedených zátěží
změnami vstupní koncentrace polutantu a průtoku vzduchu byly získány údaje o maximální
eliminační kapacitě při různých podmínkách provozu (vstupní koncentrace, doba zdržení a
teplota) a vlivu vstupní koncentrace a doby zdržení v loži reaktoru na účinnost odstraňování
různých druhů polutantů. Vliv doby zdržení na degradační účinnost je výrazný především u
alifatických uhlovodíků, mnohem méně u aromatických uhlovodíků.
Biofiltry degradující styren a aceton dosahovali velmi vysoké eliminační kapacity (desítky g.m 3 -1
.h ). Alifatické uhlovodíky jsou naproti tomu mnohem obtížněji degradovatelné. Především v
přítomnosti vyšších koncentrací aromatických uhlovodíků je dosahováno velmi nízkých hodnot
eliminační kapacity (jednotky g.m-3.h-1). Eliminační kapacita iso- a cyklo-alkanů byla o řád nižší
než n-alkanů.
Sledován byl i vliv minerálních živin na účinnost degradace. Za podmínek limitace minerálními
živinami bylo dosahováno pouze 20 – 35 % eliminační kapacity, oproti provozu s dodávkou
komplexního minerálního média. Dále byl potvrzen velký vliv náplňového materiálu a historie
biofiltru na provozní parametry reaktoru.
U biofiltrů degradujících páry styrenu a benzínu bylo sledováno složení biofilmu a počty
mikroorganismů při dlouhodobém provozu. Na složení biofilmu měla značný vliv jak použitá
náplň, tak složení inokulační populace. Složení biofilmu je v delších časových úsecích značně
proměnlivé. Mění se jednak druhové zastoupení a jednak zastoupení jednotlivých skupin
mikroorganismů (G- a G+ bakterie, kvasinky, plísně). Počty buněk v náplni biofiltrů (CFM) byly
dlouhodobě stabilní s kolísáním většinou nepřesahující jeden řád. Na snímcích ze SEM byl
pozorován heterogenní biofilm a výrazná produkce exobiopolymerů.
Ing. Martin Halecký
Title: Biodegradation of Styrene, Acetone and Gasoline in Waste Gases
SUMMARY
A degradation of acetone, styrene and gasoline vapors was studied in biofilters. The results of
loading tests under steady-state conditions, studies of the reactor dynamics and microbial
analyses of the biofilm resulted in the overall characteristics of the biofiltr behavior. The maximal
elimination capacities were evaluated under various performance conditions. Impacts of the inlet
concentration and empty bed residence time in the reactor bed on the degradation activity for
different kinds of pollutants were measured and evaluated. The effect of empty bed residence
time on the removal efficiency is significant degrading aliphatic hydrocarbons bud not so much
pronounced with aromatic hydrocarbons.
The high elimination capacities were achieved in case of styrene and acetone degradation.
Aliphatic hydrocarbons are much more recalcitrant. There very low elimination capacities are
reached especially in presence of the higher concentrations of aromatic hydrocarbons. The
elimination capacity of iso- and cyclo-alkanes was one order magnitude lower then that of nalkanes.
Also the effect of nutrients on degradation efficiency was studied. The elimination capacity under
conditions of nutrient limitation reached just 20 – 35 % of the value without this limitation. The
performance characteristic is also strongly affected by the packing material and the biofilter
history. Changes in the biofilm composition and cell numbers during a long-term biodegradation
of styrene and gasoline vapors in biofilter were detected.
The biofilm composition was affected by both the packing material used and the inoculum
composition. The biofilm composition also changes during long-term biofilter operations. The
changes are on the genus level and in a quantity of the prokaryotic and eukaryotic cells. The cell
numbers in the biofilmu show a long-term stability with variations not exceeding one order
magnitude. The scanning electron microscope photos show the biofilm heterogeneity and the
high extracellular polymer production.
Ing. Štěpánka Vejsadová
Název: Analýza mutací v rozpoznávací podjednotce HsdS restrikčně modifikačního enzymu
EcoR124I ovlivňující vazbu podjednotek
Školitel: Doc. Ing. Jan Masák, CSc
SOUHRN
Restrikčně–modifikační (R-M) systémy Typu I jsou složené ze tří podjednotek. Klíčovou úlohu v
komplexním enzymu má podjednotka HsdS, která rozpoznává specifické vazebné místo na DNA.
Součástí struktury HsdS jsou konzervované domény, které jsou pravděpodobně odpovědné za
vazbu s ostatními podjednotkami. Náplní předkládané disertační práce byla analýza mutací v
oblasti centrální konzervované domény podjednotky HsdS enzymu EcoR124I, které mohou
ovlivňovat vzájemnou vazbu podjednotek.
Testování restrikčního fenotypu 56ti mutant umožnilo odlišit potenciální DNA-vazebné mutanty
od mutant neschopných vazby s ostatními podjednotkami. Zúžený soubor 49ti mutant byl
kvantitativně testován na restrikční a modifikační fenotyp. Dále jsme analyzovali expresi genů
hsdS u mutant s r-m- fenotypem, abychom prokázali, že ztráta restrikční a modifikační funkce je
skutečně způsobena exprimovanou mutantní podjednotkou HsdS a nikoliv sníženou nebo zcela
potlačenou expresí. U mutant s potvrzenou expresí genu hsdS byla provedena analýza schopnosti
podjednotky HsdS se vázat s podjednotkou HsdM. V případě vazby byla mutantní podjednotka
detekována v cytoplazmatické frakci jako součást komplexní MTasy.
Z mutant s jednou bodovou mutací byly vybrány dva zástupci s „neklasickým“ fenotypem (rm+) se záměnou Leu175Pro a Lys184Asn. Navíc jsme testovali jednu mutantu s “klasickým“
fenotypem (r- m-) se záměnou Pro218Ser.
Mutantní MTasy exprimované z připravených rekombinantních plasmidů byly purifikovány a
byly zjišťovány jejich methylační a restrikční funkce, interakce s DNA a ATPasová aktivita.
Mutanta se záměnou Leu175Pro byla schopná methylovat DNA, u ostatních dvou mutant
methylace neprobíhala. Restrikční aktivita mutantních enzymů rekonstituovaných v nadbytku
podjednotky HsdR prokázala, že pouze mutanta se záměnou Leu175Pro byla schopná restrikce
DNA.
V dalším kroku jsem sledovali zda ztráta restrikční i methylační funkce není způsobena
neschopností mutant se vázat na DNA. Vazba mutantních MTas s DNA (protein:DNA = 1:1; 2:1)
byla velmi nízká; při vyšších koncentracích (protein: DNA = 4:1; 6:1) byla pozorována silnější
vazba u všech tří mutant. Mutantní MTasy vazbou s podjednotkou HsdR tvořily komplex
R2M2S1 pouze při velkém nadbytku podjednotky HsdR. Stabilita komplexu a síla vazby enzymu
na DNA byla určována z disociace komplexu R2M2S1 na volnou podjednotku HsdR a komplex
R1M2S1. Mutanty s „neklasickým“ fenotypem tvořily komplex R2M2S1, zatímco mutanta se
záměnou Pro218Ser tvořila komplex R1M2S1. Výsledky analýzy ukázaly, že komplex R2M2S1
mutant s „neklasickým“ fenotypem byl velmi nestabilní, jelikož disocioval na komplex R1M2S1
již v prvních krocích ředění. Síla vazby mutantních enzymů na DNA byla ve srovnání se
standardním enzymem slabší.
Sledování ATPasové aktivity v mutantních kmenech ukázalo, že všechny mutanty jsou schopné
hydrolyzovat ATP; množství vytvořeného anorganického fosfátu (Pi) jako produktu reakce bylo
závislé na koncentraci podjednotky HsdR.
5
Získané výsledky ukázaly, že aminokyseliny leucin, lysin a prolin v oblasti centrální
konzervované domény podjednotky HsdS specifity R124I hrají významnou roli ve vazbě HsdS a
HsdM, popřípadě HsdR podjednotky, neboť záměny těchto aminokyselin výrazně ovlivnily
vzájemnou vazbu podjednotek a důsledkem toho i vazbu enzymu na DNA.
6
Ing. Štěpánka Vejsadová
Title: Analysis of the mutations in the HsdS recognition subunit of the R-M system
EcoR124I altering subunit assembly
Supervisor: Doc. Ing. Jan Masák, CSc
SUMMARY
Type I restriction-modification (R-M) systems are composed of three subunits. HsdS subunit
plays a key role in the complex enzyme since it recognizes the specific binding site on DNA. The
conserved domains within the structure of the HsdS subunit are probably responsible for binding
with other subunits. The aim of this thesis was to analyze mutations in the central conserved
domain of the HsdS subunit of the enzyme EcoR124I, which can alter subunit assembly.
An analysis of restriction phenotypes of 56 mutants made it possible to distinguish potential
DNA-binding mutants from mutants defective in the subunit assembly. Selected 49 mutants were
quantitatively analyzed for their restriction and modification phenotypes. To verify that the loss
of restriction and modification functions is caused by the mutant HsdS subunit and is not due to
a reduced or fully suppressed gene expression, we analyzed the expression of the hsdS genes of
the mutants with r- m- phenotypes. In the case of binding, the mutant subunit was found in
cytoplasmatic fraction as part of a complex MTase.
Out of mutants with one point mutation, two mutants with the changes Leu175Pro and Lys184Asn
with “non-classical” phenotype (r-m+) were selected for further analysis. In addition, we tested
one mutant (Pro218Ser) with “classical” phenotype (r-m-).
Mutant MTases expressed from recombinant plasmids were purified and analyzed for their
methylation and restriction functions, interactions with DNA and ATPase activity. The mutant
with the change Leu175Pro was able to methylate the DNA; the methylation activity did not
proceed in the two other mutants. The analysis of restriction activity of the mutant enzymes
reconstituted in the access of the HsdR subunit showed that only the mutant with the change
Leu175Pro was able to restrict the DNA.
To investigate if the loss of the restriction and methylation functions was due to lowered DNA
binding affinity of the mutant enzymes, we analysed the binding properties of mutant MTases
and REases. The binding of the mutant MTases to the DNA (protein:DNA = 1:1; 2:1) was very
low; stronger binding of all three mutants was observed by higher concentrations of the MTases
(protein:DNA = 4:1; 6:1). HsdR subunit binding to the mutant MTases resulted in formation of
the R2M2S1 complexes only. The stability of the complex and the binding affinity of the enzyme
to the DNA was analyzed by a dissociation of the complex R2M2S1 to free HsdR subunit and
R1M2S1 complex. The mutants with “non-classical” phenotype formed the R2M2S1 complex
while the mutant with the change Pro218Ser formed the R1M2S1 complex. Our results showed that
the R2M2S1 complex of the mutants with “non-classical” phenotype was very unstable, since it
dissociated to the R2M2S1 complex in the first steps of dilution. The binding affinity of the
mutant enzymes to the DNA was lower as compared to the binding affinity of the standard
enzyme.
7
Analysis of the ATPase activity showed, that all mutants were able to hydrolyze ATP; the
amount of the produced inorganic phosphate (Pi) as the product of the reaction was dependent on
the concentration of the HsdR subunit.
The results obtained in this thesis showed that amino acids, leucine, lysine and proline in the
central conserved domain of the HsdS subunit of the specifity R124I, play an important role in
the binding of the HsdS, HsdM, eventually HsdR, subunits since their replacement markedly
altered the subunit assembly and, consequently the binding of the mutant enzymes to the DNA.
8
Ing. Martin Bláha
Název: Studium faktorů ovlivňujících chuťové stárnutí piva
Školitel: Prof. Ing. Gabriela Basařová, DrSc.
SOUHRN
Rozsáhlé studie provedené v poslední době s největší pravděpodobností prokázaly, že vznik
senzoricky významných aldehydů lze výhradně připsat oxidativnímu odbourávání mastných
kyselin. Z toho důvodu jsou hydroxymastné kyseliny, jakožto nejdůležitější prekursory těchto
komponent, klíčem vedoucím ke zlepšení chuťové stability piva.
V první části disertační práce byly porovnány původní a modifikovaná metoda stanovení volných
a v triglyceridech vázaných hydroxymastných kyselin. Zřetelně vyšší množství těchto sloučenin
bylo zjištěno pomocí metody založené na extrakci směsí chloroform/methanol (2:1 v / v). Byla
popsána kvalitativní analýza a stanovení různých frakcí hydroxymastných kyselin v ječmeni a
sladu. V jednom kroku bylo provedeno stanovení polární, nepolární a volné frakce
hydroxymastných kyselin.
Zkoumala se některá technická opatření ovlivňující obsah hydroxymastných kyselin v průběhu
přípravy mladiny.
V modelových fermentacích v 35 litrových skleněných nádobách se na 12 % mladině testovaly tři
kmeny spodních pivovarských kvasinek, označené ve sbírce VÚPS Praha č. 2 – středně hluboko
až hluboko prokvašující, č. 7 – středně hluboko prokvašující a č. 95 – hluboko prokvašující.
Nejvyšší tvorbu SO2 vykazoval při různých teplotách kmen č. 2. Nižší tvorba byla stanovena u
kmene č. 95 a ještě nepatrně nižší u kmene č. 7. Se stoupající teplotou kvašení rostla úměrně
hodnota maxima tvorby SO2. Nepotvrdil se vliv zvýšené zákvasné dávky kvasnic na tvorbu SO2
při kvašení. Prokázalo se, že kmen č. 7 má na křivce charakterizující počet buněk ve vznosu
kratší lag-fázi, strmější exponenciální fázi, dosahuje dříve maxima růstu, ale i počátku aglutinace
a sedimentace. Nižší tvorba SO2 u kmene č. 7 korelovala jak s průběhem křivky charakterizující
počet buněk ve vznosu, tak i s mírně vyšším obsahem rezervního polysacharidu glykogenu v
buňkách v porovnání s kmeny č. 2 a č. 95 po ukončení kvašení, které proběhlo za zcela shodných
podmínek.
Nezjistil se průkazný vliv kmene kvasnic na oxidačně-redukční kapacitu zkvašované mladiny, ani
vliv kmene kvasnic na vylučování celkových, oxidovaných a oxidovatelných polyfenolů z
roztoku během kvašení.
Ing. Martin Bláha
Title: Studium of factors influencing flavour aging of beer
Supervisor: prof. Ing. Gabriela Basařová, CSc.
SUMMARY
Extensive studies in recent years have shown into near certainty that ageing aldehydes come
exclusively from oxidative fatty acids breakdown. Thus the hydroxy fatty acids , as the most
important precursors of these connections, are a key to improving beer flavour stability.
In the first part of dissertation thesis, the origin and modified method for determination of free
and triglyceride-bonded hydroxy fatty acids were compared. The distinct higher amounts of these
compounds were found using a method based on the extraction with chlorofom/methanol (2:1 v /
v).
The quality analysis and the determination of the different fractions of hydroxy fatty acids were
described in barley and malt. The polar, non-polar and free fraction of hydroxy fatty acids was
determined in one step.
Some technical measures for influencing hydroxy fatty acids content during wort production have
been investigated.
Three strains of bottom yeast (marked in the RIBM collection as No. 2 – medium high to high
attenuating, No. 7 – medium high attenuating and No. 95 – high attenuating) were tested on the
12 % hopped wort in simulative fermentations in 35 – liter glass vessels. The highest production
of SO2 was shown at various temperature in strain No. 2. Lower production was determined in
strain No. 95, and only slightly lower in strain No. 7. The value of peak production of SO 2 was
growing in proportion to the rising temperature. The influence of the increased pitching yeast rate
on SO2 production was not proved during the fermentation. Strain No. 7 showed shorter lag
phase, steeper exponential phase on the growing curve, and it reached the peak of growth earlier
as well as the beginning of agglutination and sedimentation.
Lower SO2 production of strain No. 7 correlated with both the development of the growing curve
and also a slightly higher content of spare polysaccharide of glycogen in the cells compared with
strains No. 2 and No. 95 after finishing the fermentation, which had occurred under the
completely same conditions.
Neither a significant influence of the yeast strain on oxidation-reduction capacity of fermentable
wort nor the influence of yeast strain on the separation of total, oxidized and oxidizable
polyphenols from the solution during the fermentation was found out.
Ing. Veronika Kristová
Název: Použití enzymové hydrolýzy nitrilů a amidů pro přípravu biologicky aktivních látek
Školitel: Doc. Ing. Jan Masák, CSc.
SOUHRN
Náplní této disertační práce je studium enzymové hydrolýzy nitrilů a amidů a jejího využití pro
přípravu bioaktivních látek. K uvedeným studiím byl použit bakteriální izolát Rhodococcus equi
A4 disponující širokým potenciálem metabolických schopností. Práce je zaměřena v první části
na biotransformace N-acylovaných hexosaminů klidovými buňkami bakteriálního kmene R. equi
A4 a purifikaci enzymu zodpovědného za hydrolýzu amidové vazby přítomné v těchto látkách.
Druhá část práce je věnována biokonverzím nitrilových derivátů sacharidů a β-aminokyselin.
Tyto biokonverze byly prováděny jak klidovými buňkami bakteriálního kmene R. equi A4, tak
nitrilhydratasou, která byla dříve z tohoto kmene purifikována.
Na základě screeningu dostupných bakteriálních kmenů utilizujících 2-acetamido-2-deoxyDglukopyranosu (N-acetylglukosamin) byl vybrán kmen s nejvyšší aktivitou vůči této sloučenině
– R. equi A4. Z uvedeného kmene byla částečně purifikována Nacetylglukosamin-6fosfátdeacetylasa
(EC
3.5.1.25;
2-acetamido-2-deoxy-6-O-fosfonato-Dglukopyranosaamidohydrolasa), klíčový enzym metabolické dráhy N-acetylglukosaminu v buňkách R. equi A4.
Vlastní purifikaci předcházela optimalizace kultivačních, dezintegračních a chromato-grafických
metod. Purifikací se specifická aktivita enzymu zvýšila téměř 16krát a výtěžek celkové aktivity
byl 18%. Optimální reakční teplota enzymu leží v rozmezí 57 až 60 °C a optimální pH v intervalu
8 až 9. Částečně purifikovaná N-acetylglukosamin-6fosfátdeacetylasa je monomer s molekulovou
hmotností přibližně 42 kDa a velmi úzkou substrátovou specifitou. Jeho aktivita je mírně
inhibována ionty Al3+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Mn2+ nebo Zn2+ a dvojnásobně zvyšována
přítomností iontů Mg2+. V koncentrované formě je enzym vysoce stabilní v prostředí 0,1 M
síranu amonného.
Schopnosti celých buněk R. equi A4 rozlišovat mezi manno- a gluko- -konfigurací
Nacylhexosaminů bylo využito při chemoenzymové přípravě mannosaminů nesoucích různé
Nacylové skupiny. N-Acylglukosaminy byly připraveny N-acylací glukosamin hydrochloridu a
podrobeny alkalické Lobry de Bruyn – Alberda van Ekensteinově C-2 epimerizaci vedoucí ke
vzniku rovnovážné směsi dvou epimerů (gluko- a manno-izomerů). Klidové buňky R. equi A4 z
uvedené směsi odstraňují pouze gluko-izomer, zatímco manno-izomer zůstává v reakční směsi
nedotčen. Tímto způsobem byly připraveny 2-butyramido-2-deoxy-D- -mannopyranosa, 2-deoxy2-propionamido-D-mannopyranosa
a
2-deoxy-2-fenyl-acetamidoD-mannopyranosa
s
potenciálními imunoaktivačními účinky.
Druhá část práce je věnována studiu biokonverzí kyanoglykosidů a β-aminonitrilů.
Biotransformace kyanoglykosidů 2,6-anhydro-D-glycero-D-ido- -heptononitrilu a 2,6anhydro-3deoxy-D-lyxo-hept-2-enononitrilu provedená za katalýzy nitrilhydratasou purifikovanou z R.
equi A4 poskytovala příslušné amidy. 2,6-Anhydro-D-glycero-L-mannoheptononitril substrátem
nitrilhydratasy nebyl. Klidové buňky R. equi A4 byly vhodné pouze k deacetylaci
peracetylovaných
kyanoglykosidů
3,4,5,7-tetra-O-acetyl-2,6-anhydro-Dglycero-D-idoheptononitrilu, 3,4,5,7-tetra-O-acetyl-2,6-anhydro-D-glycero-L-mannoheptononitrilu a 4,5,7-tri-
O- -acetyl-2,6-anhydro-3-deoxy-D-lyxo-hept-2-enononitrilu, ale nikoliv k hydrataci nebo
hydrolýze jejich nitrilové skupiny.
Biokonverze β-aminonitrilů trans-1-kyano-2-(tosylamino)-cyklopentanu a trans- -1-kyano2(tosylamino)-cyklohexanu na příslušné amidy a kyseliny probíhala za přítomnosti klidových
buněk R. equi A4 vyšší rychlostí než konverze příslušných cis-izomerů (cis-1-kyano2(tosylamino)-cyklopentanu a cis-1-kyano-2-(tosylamino)- -cyklohexanu). β-Aminonitrily s
chránicí benzoylovou skupinou – trans-1-kyano-2- -(benzoylamino)-cyklopentan a trans-1kyano2-(benzoylamino)-cyklohexan – byly buňkami rovněž transformovány rychleji než příslušné cisizomery (cis-1-kyano-2- -(benzoylamino)-cyklopentan a cis-1-kyano-2(benzoylamino)cyklohexan). Vzhledem k esterasové aktivitě přítomné v celých buňkách R. equi A4 docházelo u
substrátů chráněných benzoylovou skupinou k nežádoucímu odštěpování chránicí skupiny, a
proto substráty tohoto typu nejsou pro tyto biotrasformace vhodné. U uvedených biokonverzí
byla sledována i enantioselektivita reakce. Enantiomerní přebytky vypočtené pro substrát
(výchozí β-aminonitril) a produkt (vznikající βaminokyselinu) vypovídají o slibné
enantioselektivitě těchto biokonverzí. Vzhledem k tomu, že se jedná o novou problematiku,
budou tyto výsledky použity jako výchozí bod pro další experimenty.
Ing. Veronika Kristová
Title: Application of enzyme hydrolysis of nitriles and amides for preparation of biological
active compounds
Supervisor: Doc. Ing. Jan Masák, CSc.
SUMMARY
This thesis deals with the enzymatic hydrolysis of nitriles and amides and its use for the
preparation of bioactive compounds. The bacterial strain Rhodococcus equi A4 was chosen for
this study because of its wide range of metabolic abilities. The first part of the work is concerned
with biotransformation of N-acylated hexosamines by the resting cells of R. equi A4 and
purification of the enzyme responsible for the hydrolysis of the amide bond in these compounds.
The second part of the work is focused on bioconversions of nitrile derivatives of saccharides and
β-aminoacids. These biotransformations were catalyzed by the resting cells of R. equi A4 as well
as by the nitrile hydratase, which was previously purified from this strain.
Based on screening of available bacterial strains that were able to utilize 2-acetamido-2deoxy-Dglucopyranose (N-acetylglucosamine) R. equi A4 was chosen as the strain with the highest
activity for the above compound. The key enzyme of the N-acetylglucosamine metabolic
pathway in R. equi A4 – N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase (EC 3.5.1.25; 2acetamido-2-deoxy- -6-O-phospho-D-glucose amidohydrolase) – was partially purified after the
optimization of cultivation, disintegration and chromatographic methods. The specific activity of
the N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase increased nearly 16-fold by purification with
an overall yield of 18 %. The optimum temperature and pH of the enzyme intervene between 57–
60 °C and 8.0–9.0, respectively. The enzyme was a monomer with an apparent molecular mass of
approx. 42 kDa and a very narrow substrate specificity. Its activity was slightly inhibited by the
addition of 1 mM Al3+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Mn2+ or Zn2+ and increased twice by 1 mM Mg2+.
The concentrated enzyme is highly stable at 4 °C in the presence of 0.1 M ammonium sulfate.
Whole cells of R. equi A4 are able to discriminate between manno- and gluco- -configuration of
N-acylhexosamines. The advantage of this ability was taken for chemoenzymatic preparation of
several mannosamines carrying different N-acyl groups. N-Acylglucosamines prepared by Nacylation of glucosamine hydrochloride were subjected to alkaline Lobry de Bruyn – Alberda van
Ekenstein C-2 epimerization leading to equilibrium mixture of two epimers (gluco- and manno- isomers). Resting cells of R. equi A4 removed only the glucoisomer from this mixture while the
manno-isomer remained intact. Compouds with potential immunomodulating effects – 2butyramido-2-deoxy-D-mannose, 2-deoxy-2- -propionamidoD-mannose and 2-deoxy-2phenylacetamido-D-mannose – were prepared by this method.
The second part of the present work is focused on cyanoglycoside and β-aminonitrile
bioconversions. Biotransformation of 2,6-anhydro-D-glycero-D-ido- -heptononitrile and
2,6anhydro-3-deoxy-D-lyxo-hept-2-enononitrile by the nitrile hydratase purified from R. equi A4
afforded the corresponding amides. 2,6-Anhydro- -D-glycero-L-manno-heptononitrile was not a
substrate for the nitrile hydratase. Resting cells of R. equi A4 were suitable only for deacetylation
of peracetylated cyanoglycosides – 3,4,5,7-tetra-O-acetyl-2,6-anhydro-Dglycero-D-idoheptononitrile, 3,4,5,7-tetra-O-acetyl-2,6-anhydro-D-glycero-L-mannoheptononitrile and 4,5,7-
tri-O- -acetyl-2,6-anhydro-3-deoxy-D-lyxo-hept-2-enononitrile – but not for hydration or
hydrolysis of the nitrile group.
Bioconversion of β-aminonitriles – trans-1-cyano-2-(tosylamino)-cyclopentane and trans-1cyano2-(tosylamino)-cyclohexane – into the corresponding amides and acids in the presence of resting
cells of R. equi A4 proceeded at a higher rate than conversion of the cisisomers (cis-1-cyano-2(tosylamino)-cyclopentane and cis-1-cyano-2-(tosylamino)cyclohexane). β-Aminonitriles
carrying a benzoyl protecting group – trans-1-cyano-2(benzoylamino)-cyclopentane and trans-1cyano- -2-(benzoylamino)-cyclohexane – were also transformed faster by the cells than the
corresponding cis-isomers (cis-1-cyano-2(benzoylamino)-cyclopentane and cis-1-cyano-2(benzoylamino)-cyclohexane). However, due to the esterase activity of the whole cells of R. equi
A4 the substrates protected with benzoyl group were cleaved and therefore are not suitable for
these biotransformations.
The enantioselectivity of the above biotransformations was monitored. Enantiomeric excesses
calculated for substrate (β-aminonitrile) and product (β-aminoacid) show a promising
enantioselectivity of these biotransformations. Considering the fact that this topic is brand new,
the results obtained in the present thesis will be used as a leaving point for further experimental
work.
Ing. Lucie Hušáková
Název: Enzymová syntéza glykokonjugátů – nové substráty a nové enzymy
Školitel: Prof. RNDr. Vladimír Jirků, DrSc.
SOUHRN
Náplní předkládané disertační práce je studium enzymových reakcí při syntéze glykokonjugátů,
příprava a následná optimalizace přípravy nových substrátů se zajímavými biologickými
vlastnostmi. Pro získání nových látek byly použity postupy enzymové a chemoenzymové
syntézy.
Směs disacharidů O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2deoxy-Dglukopyranosy a O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)-2acetamido-2-deoxy-Dmannopyranosy byla připravena Lobry de Bruyn – Alberda van Ekensteinovou C-2 epimerizací
za katalýzy Ca(OH)2 z O-(2-acetamido-2-deoxy-β-Dglukopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2deoxy-D-glukopyranosy. Výsled-ná směs obou epimerů je jen těžko separovatelná pomocí
preparativního HPLC.
β-N-Acetylhexosaminidasa z Aspergillus oryzae CCF 1066 je schopna selektivně rozlišovat mezi
oběma epimery; zatímco O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)-2acetamido-2deoxy-D-glukopyranosa je štěpena na monosacharid 2-acetamido-2-deoxy-Dglukopyranosu, její
C-2
epimer
O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)-2acetamido-2-deoxy-Dmanno-pyranosa zůstává v reakční směsi nedotčen. Vzniklou směs disacharidu a mono-sacharidu
lze snadno rozdělit gelovou filtrací.
β-N-Acetylhexosaminidasy z A. terreus CCF 2539, A. flavus CCF 3056, Mucor dimorphosporus
CCF 2609, z hovězích ledvin a nadvarlat vykazují stejnou selektivitu jako βNacetylhexosaminidasa z A. oryzae. Naopak β-N-acetylhexosaminidasy z A. sojae CCF 3060, A.
flavipes CCF 1895, A. tamarii CCF 1665, Penicillium brasilianum CCF 2155, P. oxalicum CCF
2430, P. funiculosum CCF 2984, P. chrysogenum CCF 1269, P. multicolor CCF 2244,
Talaromyces flavus CCF 2686 a Canavalia ensiformis hydrolyzují oba typy disacharidů.
Analogickým
způsobem
lze
alkalickou
epimerizací
O-(2-acetamido-2-deoxy-βDgalaktopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glukopyranosy a následnou selektivní
hydrolýzou reakční směsi připravit O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-galaktopyranosyl)-(1→4)2acetamido-2-deoxy-D-mannopyranosu.
Disacharid
O-(2-acetamido-2-deoxy-βDgalaktopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glukopyranosa
byl
připraven
transglykosylační reakcí z 4-nitrofenyl-2-acetamido-2- deoxy-β-D-galaktopyranosidu jako
donoru a 2-acetamido-2-deoxy-D-glukopyranosy jako akceptoru za katalýzy βNacetylhexosaminidasou z A. oryzae CCF 1066.
Molekulární model β-N-acetylhexsaminidasy z Aspergillus oryzae CCF 1066 a „docking“
experimenty s oběma typy disacharidů odhalily, že ManNAcový zbytek způsobuje určitou torsi
disacharidové molekuly vedoucí ke sterickému konfliktu s Trp482, což vede ke snížení
stabilizace oxazolinového přechodového stavu. Disacharid O-(2-acetamido-2-deoxy-βDglukopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranosa
není
pro
βNacetylhexosaminidasu inhibitorem.
Při chemoenzymovém způsobu přípravy 2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranosu
obsahujících disacharidů je až 80 % výchozího disacharidu rozloženo enzymovou hydrolýzou.
Proto byla vyvinuta a optimalizována preparativní separační metoda pro separaci komplexních
derivátů 2-acetamido-2-deoxy-hexopyranosidů založená na rozdílné síle borátového komplexu s
příslušnými sacharidy za použití vylučovací gelové chromatografie. Tato separační metoda
umožňuje nejen preparativní separace směsí epimerů disacharidů, ale také epimerů mono- a
trisacharidů a dále methylglykosidů odpovídajících pyranosových a furanosových forem 2acetamido-2-deoxy-hexos. Pro preparativní separaci těchto látek byly testovány tři typy
polyolických gelů: Sephadex G-15, Cellufine GCL-25 a Toyopearl HW-40F.
O-(2-Acetamido-2-deoxy-β-D-galaktopyranosyl)-(1→4)-O-(2-acetamido-2-deoxy-βDukopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranosa
byla
při-pravena
transglykosylační reakcí katalyzovanou β-N-acetylhexosaminidasou z Aspergillus oryzae, kde
jako donor byl použit 4-nitrofenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-galaktopyranosid. Jako akceptor
mohl být s výhodou využit připravený disacharid O-(2-acetamido-2-deoxy-β-Dglukopyranosyl)(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranosa, který je vůči hydrolytickému působení použité
β-N-acetyl-hexosaminidasy rezistentní. O-(2-Acetamido-2deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)-O(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)-2acetamido-2-deoxy-D-mannopyranosu lze
připravit analogickým způsobem – jako donor byl použit 4-nitrofenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-Dglukopyranosid.
Trisacharid
O-(2-acetamido2-deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)-O-(2acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranosa může
být také připraven Lobry de Bruyn – Alberda van Ekensteinovou transformací z O-(2-acetamido2-deoxy-β-D- glukopyranosyl)-(1→4)-O(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glukopyranosyl)-(1→4)-2acet-amido-2-deoxy-D-glukopyranosy a následnou separací směsi dvou epimerů na gelu v
borátovém pufru.
Ing. Lucie Hušáková
Title: Enzymatic synthesis of glycoconjugates – new substrates and new enzymes
Supervisor: Prof. RNDr. Vladimír Jirků, DrSc.
SUMMARY
The present thesis deals with the study of enzymatic reactions in glycoconjugate synthesis, with
the preparation of new substrates with interesting biological properties and its optimisation.
Enzymatic and chemo-enzymatic approaches have been applied in the synthesis of new
compounds.
The mixture of two disaccharides O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)2acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose and O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)(1→4)2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranose was prepared by Lobry de Bruyn – Alberda van
Ekenstein epimerization at C-2 of the O-(2-acetamido-2-deoxy-β-Dglucopyranosyl)-(1→4)-2acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose, catalysed by aqueous Ca(OH)2.
The resulting mixture of both epimers is hardly separable by preparative HPLC. The βNacetylhexosaminidase from Aspergillus oryzae CCF 1066 selectively discriminates between
both epimers. O-(2-Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-2acetamido-2-deoxy-Dglucopyranose is hydrolysed to monosaccharides by the enzyme, whereas its C-2 epimer O-(2acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-2acetamido-2-deoxy-D-mannopyranose remains
intact. The resulting mixture of mono- and disaccharide is then easily separable by gel filtration.
The β-N-acetylhexosaminidases from A. terreus CCF 2539, A. flavus CCF 3056, Mucor
dimorphosporus CCF 2609, bovine kidney and bovine epididymis exhibit the same selectivity as
the β-N-acetylhexosaminidase from A. oryzae. On the other hand, the β-Nacetylhexosaminidases
from A. sojae CCF 3060, A. flavipes CCF 1895, A. tamarii CCF 1665, Penicillium brasilianum
CCF 2155, P. oxalicum CCF 2430, P. funiculosum CCF 2984, P. chrysogenum CCF 1269, P.
multicolor CCF 2244, Talaromyces flavus CCF 2686 a Canavalia ensiformis hydrolyse both
types of disaccharides.
The disaccharide O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2deoxyD-mannopyranose can be prepared by alkali epimerization of O-(2-acetamido-2deoxy-β-Dgalactopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose followed by analogous
selective enzymatic hydrolysis. The transglycosylation of 4-nitrophenyl 2acetamido-2-deoxy-βD-galactopyranoside (glycosyl donor) to 2-acetamido-2-deoxy-Dglucopyranose using the β-Nacetyl-hexosaminidase from A. oryzae CCF 1066 gave yield to disaccharide O-(2-acetamido-2deoxy-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2deoxy-D-gluco-pyranose.
Molecular modelling of the β-N-acetylhexosaminidase from A. oryzae CCF 1066 and docking
experiments with both types of disaccharides revealed that the ManNAc residue causes distortion
of disaccharide molecule resulting in a steric conflict with Trp482, which causes a diminished
stabilization of the oxazolinium tranzition state. The disaccharide O(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-Dmannopyranose
is
not an inhibitor for the β-N-acetylhexosaminidase.
Up to 80 % of the starting disaccharide is hydrolysed using chemo-enzymatic approach for the
preparation of 2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranose containing disaccharides.
Therefore a separative method for the preparative separation of the complex derivatives of 2acetamido-2-deoxy-hexopyranosides was developped and optimised. This method is based on the
different strength of a borate complex with corresponding saccharides using gel exclusion
chromatography. This method enables an efficient preparatory separation of the above
disaccharides, and even of the mixtures of mono-, di- and tri-saccharides with the respective
separation of isobaric epimers. This method was also extended to an efficient preparative
separation of the mixtures of α/β methyl glycosides of the respective pyranose/furanose forms of
2-acetamido-2-deoxyhexoses. A three types of polyolic gels were tested for the preparative
separation of these compounds: Sephadex G-15, Cellufine GCL-25 and Toyopearl HW-40F.
The transglycosylation of 4-nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-galactopyranoside (glycosyl
donor)
to
O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2deoxy-Dmannopyranose using the β-N-acetylhexosaminidase from A. oryzae gave yield to trisaccharide
O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-acetamido2-deoxy-β-Dglucopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranose. The disaccharide O-(2acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxyD-mannopyranose can be
used as an acceptor owing to its resistantce to the hydrolytic cleavage by the corresponding β-Nacetylhexosaminidase. The trisaccharide O-(2acetamido-2-deoxy-β-D- glucopyranosyl)-(1→4)O-(2-acetamido-2-deoxy-β-Dglucopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranose
can be prepared by analogy – with 4-nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosid as a
glycosyl donor. The trisaccharide O-(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O(2acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-mannopyranose can
be alternatively prepared by Lobry de Bruyn – Alberda van Ekenstein epimerization of O-(2acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2-acetamido-2-deoxy-β-Dglucopyranosyl)(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose. The mixture of two epimers is then separable by
gel chromatography in borate buffer.

2004-2015

Transkript

Podobné dokumenty

zde - Lékařská biofyzika

PETrA 2011 PETrA 2011

Sborník konference - XXXVIII. dny lékařské biofyziky

PETrA 2011 - Odour sro

PDF formát

program

Text práce ve formátu PDF

Kniha abstraktů s programem 24. kongresu ČSSM

Alergeny v pivu Allergens in beer

Polysacharidy v potravinách a jejich identifikace

28_capouchova_s82-84 132KB Oct 08 2012 04:04:38 PM

Výroční zpráva 2012 - Endokrinologický ústav

Rok 2008

Vulvovaginální kandidózy u žen ve spádové oblasti ZÚ Ostrava poster

Odhad minimální potřebné kapacity PET a PET/CT pro onkologické

Rok 2006

Náměty pro postgraduální studium v rámci „Institutu pro studium

Sborník 2011 - Ústav biotechnologie

Životopisy panelistů EN + CZ

Sborník 2012 - Ústav biotechnologie

fse brand esecutivo ceco