Rok 2005

Diplomové práce absolventů studijního oboru „Kvasná chemie a bioinženýrství“,
obhájené na Fakultě potravinářské a biochemické technologie VŠCHT v Praze
v akademickém roce 2004/05
Zaměření Sladařství a pivovarství:
Helena Denisovová: Studium fyziologických změn pivovarských kvasinek
imobilizovaných v kontinuálním reaktoru (Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT
Praha)
Cílem diplomové práce bylo zjistit fyziologické změny pivovarských kvasinek rodu
Saccharomyces cerevisiae imobilizovaných v kontinuálním reaktoru.
Kontinuální kultivace byla prováděna při třech různých teplotách a to 15°C, 20°C a 25°C.
Použitý kmen pivovarských kvasinek byl poskytnut pivovarem UNICER (Bebidas
de Portugal, S.A., S. Mamede de Infesta, Portugalsko). V průběhu kultivace byla pomocí
průtokové cytometrie a metody barvení methylenovou modří sledována změna viability
volných i imobilizovaných buněk. Pomocí výsledků viability poskytnutých průtokovou
cytometrií byla vypočítána specifická rychlost odumírání buněk. Dále byla pomocí průtokové
cytometrie sledována změna relativního množství glykogenu a bílkovin.
Experiment ukázal, že viabilita volných buněk se drží po celou dobu pokusu na konstantní
hodnotě. Drobný pokles viability a následný návrat k hodnotám blízkým počáteční nastává při
náhlé změně kultivační teploty (teplotní šok). Naopak viabilita imobilizovaných buněk klesala
s délkou kultivace a s hloubkou biofilmu. Při náhlé změně kultivační teploty došlo rovněž u
imobilizovaných buněk k dočasnému poklesu jejich viability. Při studiu rychlosti odumírání
imobilizovaných kvasinek se ukázalo, že na tuto rychlost má vliv teplota. Zvyšující se teplota
kultivace způsobuje rychlejší odumírání imobilizovaných buněk, což potvrzují hodnoty
specifické rychlosti odumírání imobilizovaných buněk (Kd). Vyšší obsah glykogenu a nižší
počet pučících buněk byl nalezen v hlubších vrstvách imobilizovaného biofilmu. Výsledky
sledování obsahu bílkovin ve volné a imobilizované biomase neumožňují vyvozovat obecné
závěry.
The aim of this diploma thesis was to study the physiolgical changes of immobilized brewing
yeast Saccharomyces cerevisiae in continuous reactor.
Continuous cultivation was carried out at three different temperatures (15°C, 20°C and 25°C).
The applied brewing yeast was kindly supplied by the brewing company UNICER (Bebidas
de Portugal, S.A., S. Mamede de Infesta, Portugal). During the continuous experiment the
viability of free and immobilized cells was followed using flow cytometry and methylene blue
staining. The results of viability determination were used to calculate the specific death rate of
the immobilized cells (Kd). Further, the flow cytometry was used to follow the glycogen and
proteins content of cells.
The experiments showed that the viability of free cells remained constant in the course of the
whole experiment. The small decrease and the subsequent return of the viability to the initial
values was caused by a sudden alteration of the cultivation temperature (temperature shock).
Conversely, the viability of immobilized cells decreased during the whole time of the
cultivation as well as the viability decreased in the direction from the surface to the depth of
the yeast biofilm. The sudden temperature drop caused a temporary decrease of immobilized
cell viability too. The study of the immobilized yeast biofilm allowed to determine the
specific immobilized cell death rate (Kd) as a function of cultivation temperature. The values
of the specific death rate (Kd) increased with temperature. Higher content of glycogen and a
lower count of budding cells was found in the deeper regions of the immobilized biofilm.
Jana Fuchsová: Účinek resveratrolu a jeho analogů na populaci kvasinek pod vlivem
oxidativního stresu (Ing. Irena Kolouchová, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha)
V rámci této práce byl studován vliv stilbenových fytoalexinů (trans-resveratrolu, transpinosylvinu a trans-pterostilbenu) na kvasinkovou buňku Saccharomyces cerevisiae ssp.
Malaga za oxidačního stresu. Oxidační stres kvasinkových buněk byl vyvolán působením
různých koncentrací peroxidu vodíku. Změny v chování kvasinkových buněk za oxidačního
stresu byly sledovány na základě růstových křivek, změny v metabolismu stanovením aktivity
katalasy a superoxiddismutasy. V souvislosti se stanovením aktivity katalasy
a superoxiddismitasy byly hledány vhodné dezintegrační metody. Jako nejvhodnější
dezintegrační metody se jeví použití tekutého dusíku a systému BioNeb. Dále byly provedeny
experimenty ověřující toxicitu testovaných látek pro S. cerevisiae ssp. Malaga. Bylo zjištěno,
že testované látky nevykazují v koncentračním rozmezí od 50 g.l-1 do 10 mg.l-1 výrazné
inhibiční účinky na kvasinkové buňky S. cerevisiae ssp. Malaga. Mírné inhibiční účinky byly
zjištěny u trans-pterostilbenu při koncentraci 10 mg.l-1. Vliv H2O2 se projevil inhibicí růstu
kvasinkových buněk a nárůstem aktivity katalasy a superoxiddismutasy. Přítomnost
testovaných fytoalexinů při kultivacích měla patrný ochranný účinek na kvasinkové buňky
S. cerevisiae ssp. Malaga.
Influence of stilbene fytoalexines (trans-resveratrole, trans-pinosylvine and transpterostilbene) on Saccharomyces cerevisiae ssp. Malaga yeast cells under oxidation stress
was studied. Oxidation stress of the yeast cells was caused by hydrogen peroxide with
different concentration. Growth curves showed changes in behaviour of the yeast cells under
oxidation stress and catalytic activity of catalase and superoxidismutase indicates changes in
metabolism of Saccharomyces cerevisiae ssp. Malaga. For determination of catalytic activity
of catalase and superoxiddismutase was also necessary to find appropriate desintegration
method. It was also found, that liquid nitrogen and BioNeb system was suitable method for
desintegration of yeast cells. Toxicity of tested compounds for yeast cells was also measured.
It was found, that inhibition effect of tested compounds on Saccharomyces cerevisiae ssp.
Malaga growth was neglible in concentration range from 50 µg.l-1 to 10 mg.l-1.
Trans-pterostilbene has slight inhibition effect in concentration of 10 mg.l-1. All concentration
of hydrogen peroxide has inhibitory effect on growth of the yeast cells and induce higher
catalytic activity of catalase and superoxidismutase. Presence of fytoalexines during
cultivation has evident protective effect on S. cerevisiae ssp. Malaga against oxidation stress.
Petr Hulín: Stanovení rostlinných fenolů v pivu (Ing. Pavel Dostálek, CSc., ÚKCHB
VŠCHT Praha)
Rostlinné látky fenolové povahy se vyskytují v pivu ve velmi nízkých koncentracích. Z tohoto
důvodu je potřeba před vlastním stanovením tyto analyzované látky zakoncentrovat. Vhodnou
metodou pro izolaci, purifikaci a zakoncentrování fenolových látek ze složité matrice je
extrakce na pevné fázi. Byla testována vhodnost různých komerčních a nekomerčních
sorbentů pro použití v této části analýzy.
Použité komerční sorbenty využívaly oktylových, oktadecylových, fenylových nebo
kyanopropylových funkčních skupin, případně polyamidu jako reverzní fáze. Nekomerční
sorpční materiály se sestávaly z křemeliny modifikované vrstvou polyamidu. Jejich
schopnost záchytu byla kvantifikována pomocí měření úbytku celkových polyfenolů v pivu
po kontaktu s 500 mg sorbentu. Sorpce se uskutečnila buď ve vsádce nebo na kolonce.
Analýzou roztoku standardů byly získány hodnoty zachycení jednotlivých látek pro různé
sorbenty. Všechny komerční a některé nekomerční sorbenty byly také použity pro analýzu
jednoho druhu českého piva. Koncentrace detekovaných fenolových sloučenin se pohybovaly
v jednotkách miligramů na litr. Jako nejúčinnější byly komerční sorbenty DSC-C8 a
AccuBond C18, následované polyamidovým sorbentem DPA-6S. Nekomerční materiály
dosáhly podobné míry účinnosti. Aceton se ukázal být vhodným činidlem pro eluci
fenolových látek adsorbovaných na polyamidové reverzní fázi.
Dále byly stanoveny koncentrace vybraných fenolických sloučenin v několika vzorcích
různých druhů běžně dostupných českých piv. Obsah vybraných fenolových látek
korespondoval s obsahem celkových polyfenolů dle EBC.
Plant phenolic substances are present in beer samples at low concentration levels which
necessitates an initial preconcentration prior to their analysis by HPLC. Solid phase extraction
is one of the appropriate techniques for isolation, purification and preconcentration of
phenolic compounds from complex sample. Different commercial and non-commercial
sorbents were tested to compare their suitability for this step of phenolic analysis.
Materials with octyl-, octadecyl-, phenyl- and cyanopropyl- bonded functional groups or
polyamide reversed phase were used as commercial sorbents. Non-commercial materials
consisted of diatomaceous earth modified with polyamide layer and their retention abilities
were quantified by measuring of decrease of phenolic content in beer after treatment with 500
mg of sorbent as added powder or as filling matter of columns. Recovery values were
obtained by analysing of mixed standard solution. All types of commercial and some of
non-commercial sorbents were then used for analysis of the same type of Czech beer.
Phenolic compounds were found at the amount lower than 10 mg/l. Commercial sorbents
DSC C-8 and AccuBond C18 (followed by polyamide sorbent DPA-6S) have shown the
highest efficiency. Non-commercial materials reached similar levels of efficiency. Aceton
was found to be appropriate solvent for the elution of phenolic substances adsorbed on
polyamide reversed phase.
Furthermore, concentrations of some phenolic compounds in several samples of commercially
available Czech beers were measured. Amounts of monitored phenolic compounds were
agreed with the total amount of polyphenols analysed by EBC method.
Ondřej Koucký: Vliv sladu na čirost sladin a filtrovatelnost piva (Ing. Pavel Dostálek,
CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Tato diplomová práce je zaměřena na studium vlivu sladu na čirost sladiny a filtrovatelnost
piva. Zvýšená pozornost je věnována vlivu rozluštění sladu na sledovanou problematiku a
možnosti předpovědi zhoršené čirosti sladiny během scezování a filtrovatelnosti hotového
piva pomocí analytických parametrů sladu, zejména pak využití výsledků Sarxova
scezovacího testu.
Bylo uskutečněno 22 várek na třech rozdílných zařízeních: 12 várek čtvrtprovozních (30 l), 5
poloprovozních (200 l) a 5 várek v průmyslovém pivovaru (200 hl).
Během těchto várek byly sledovány zejména kvalitativní parametry sladiny, mladiny a piva.
Byla kontrolována čirost, obsah potenciálně problematických složek - β-glukanů a pentosanů
(arabinoxylanů) a u piva byla stanovována navíc filtrovatelnost.
Výsledky ukazují, že nižší stupeň rozluštění zrna zvyšuje obsah rozpustných β-glukanů ve
sladině a tím negativně ovlivňuje viskozitu sladiny, to se projevuje i prodlouženou dobou
scezování a zhoršením filtrovatelnosti piva. Důležitým parametrem pro sledovanou
problematiku je obsah bílkovin, jejich vysoký obsah ve sladu zhoršuje čirost sladiny a
zhoršuje filtrovatelnost piva. Použitelnost Sarxova testu pro reálnou předpověď
filtrovatelnosti piva nebyla jednoznačně potvrzena.
The thesis deals with influence of malt on sweet wort clarity and beer filterability. Special
attention is devoted to influence of malt modification on the monitored characteristics and the
possibility of using analytical parameters of malt for predicting lower sweet wort clarity
during lautering as well as lower filterability of beer, focusing in particular on the possibility
of using Sarx's lauter test results.
The total of 22 brews were brewed in three different facilities – 12 semi-pilot brews (30 l), 5
pilot brews (200 l) and 5 brews in an industrial brewery (200 hl).
In these brews, in particular qualitative parameters of sweet wort, hopped wort and beer were
monitored. Clarity and content of potentially problematic components (β-glucans, pentosans –
arabinoxylans) were assessed; in beer also its filterability was monitored.
Our results show that a lower degree of barley grain modification leads to an increased
content of soluble β-glucans in sweet wort, thus negatively influencing its viscosity resulting
in longer time of lautering and lower beer filterability. Proteins in malt represent an important
parameter as their high content in malt negatively influences sweet wort clarity and decreases
beer filterability. The possibility of using Sarx’s straining test for reliable prediction of beer
filterability was not confirmed with clear evidence.
Josef Moravec: Optimalizace ošetření piva před stočením do transportních obalů KEG
(Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Cílem diplomové práce je porovnat různé možnosti závěrečného ošetření piva před stočením
do transportních obalů, zhodnotit vliv různých metod ošetření na konečnou kvalitu piva,
koloidní stabilitu a senzorické hodnocení konzumenty a optimalizovat způsob závěrečného
ošetření piva před stočením do transportních obalů. Práce byla měřena ve dvou různých
středně velkých českých pivovarech. Porovnávány byly tunelový pastér, membránový filtr,
hloubkový filtr a průtokový pastér.
Porovnávání jednotlivých zařízení bylo provedeno sledováním rozdílných hodnot vybraných
analytických parametrů piva před a po ošetření piva jednotlivými zařízeními zahrnujících
barvu piva, pH, obsah alkoholu, extrakt, zákal, obsah polyfenolů, pěnivost NIBEM. Byla
provedena šoková zkouška podle Basařové a Kahlera a senzorická analýza. Na cestě piva
z ležáckého sklepa až po stočení byla měřena změna obsahu kyslíku v pivě a změna
redoxního potenciálu. Získaná data byla zpracována statistickými funkcemi programu
Microsoft Excel.
Na základě naměřených dat na zařízeních bylo prokázáno, že tunelová a průtoková pasterace
mají negativní vliv na koloidní stabilitu piva, dochází k nárůstu barvy piva a ke změně
senzorického profilu. Hloubková filtrace a membránová filtrace nemají vliv na koloidní
stabilitu piva, ani na senzorický profil piva. Při ošetření membránovou filtrací dochází
k poklesu pěnivosti. Z hlediska spotřeby energie byl tunelový pastér vyhodnocen jako zařízení
s největší spotřebou energie, hloubková filtrace a membránová filtrace vykazovaly nejnižší
spotřebu energie.
Bylo doporučeno přednostně používat hloubkovou filtraci nebo membránovou filtraci.
V případě použití pastéru bylo doporučeno modernizovat průtokový pastér, což by snížilo
tepelnou zátěž piva při odstávce stáčecí linky a usnadnilo ovládání pasterace. V obou
případech pasterace je nutné minimalizovat odstávky stáčecí linky.
The objective of the thesis is to compare different ways of final treatment of beer before
filling into the transport vessels, evaluate influences of different treatment methods at final
beer quality, colloidal stability and senzoric profile and optimize way of final beer treatment
before filling into the transport vessels. Thesis was made in two different middle sized
breweries. Tunnel pasteurization, flash pasteurization, deep filtration and membrane filtration
were compared.
Testing of individual processes was done by monitoring different values selected analytical
parameters of beer before and after treatment with individual devices including beer color,
pH, alcohol content, extract, haze, content of polyphenolics, foam stability NIBEM. Shock
test according to Basarova and Kahler and senzoric analysis was made. Beer track from lager
cellar to filling line was characterized with changes of oxygen content and changes of redox
potential. Results were handled with Microsoft Excel statistical functions.
Based on the measured results at the devices was proved that tunnel pasteurization and flash
pasteurization have negative influence at colloidal stability, is increasing beer color and is
changing senzoric profile of beer. Membrane filtration and deep filtration do not have any
influence at beer colloidal stability, beer color and senzoric profile. Membrane filtration is
decreasing foam stability. Tunnel pasteurization was found as a process with highest energy
demand. Membrane filtration and deep filtration are processes with lowest energy demand.
It was recommended to use membrane filtration and deep filtration. In case of using
pasteurization was recommended to modernize the flash pasteur, what leads to lower heat
stress of beer at filling line shutdowns and simplify pasteurization handling. In both ways of
pasteurization shutdowns of the filling line have to be prevented.
Olga Vavrušková: Využití kvasničného glykanu v potravinářském průmyslu (Ing. Pavel
Dostálek, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Tato práce se zabývá zpracováním odpadních pivovarských kvasnic na glykan a jeho
následnou aplikací formou přídatné látky do nízkotučných jogurtů.
V laboratorním a poloprovozním měřítku byl připraven bílý preparát glykanu obsahující
vysoké množství β-glukanů buněčných stěn. Ze získaného glykanu byly extrakcí odstraněny
nežádoucí sloučeniny (lipidy). Velké shluky glykanu byly následně sonikací rozbity na menší
částice. U nich byly sledovány viskoelastické vlastnosti – schopnost tvorby gelu, zdánlivá
viskozita, vaznost pro vodu, olej a mléko.
Druhá část práce byla zaměřena na sledování rheologických a senzorických vlastností
nízkotučných jogurtů obsahujících glykan. Textura nízkotučného jogurtu obsahující glykan
byla srovnatelná se smetanovým jogurtem.
This work deals with a treatment of the waste brewing yeast and its transformation to glycan
particles. These particles were used as a supplement into low-fat yoghurt.
The white glycan particles were isolated in the laboratory and pilot plant scale. These
products contain high amount of cell wall β-glucan. The undesirable substances (lipids) were
removed by organic solvent extraction. The big glycan particles were broken by the
sonication into the smaller particles. These particles were measured for viscoelastic
characteristics – gel creation, apparent viscosity, swelling volume for water, oil and milk.
The second part of this work is focused in study of rheological and sensorial properties
of low-fat yoghurt with the glycan particles. Texture of low-fat yoghurt with glycan was
comparable to cream yoghurt.
Zaměření Kvasná chemie a technologie:
Josef Beránek: Mikrobní degradace nitroaromatických sloučenin v náplňových
reaktorech (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Práce se zabývá aerobní biodegradací nitrotoluenů z vodného prostředí v kontinuálních
náplňových reaktorech pomocí imobilizované směsné mikrobiální populace.
Prvním cílem bylo porovnat zátěžové charakteristiky degradace směsi mononitrotoluenů na
třech různých náplňových materiálech (Poraver, expandovaná břidlice, šamot). Pokusy byly
provedeny ve třech reaktorech označených A (Poraver), B (břidlice) a C (šamot). Jako
nejvhodnější náplňový materiál byla vyhodnocena expandovaná břidlice.
Poté byly reaktory přestaveny, všechny byly naplněny expandovanou břidlicí. Testovala se
schopnost mikrobiální populace odbourávat směsi nitrotoluenů při zkracování střední doby
zdržení částic v reaktoru.
Buňky využívaly mononitrotolueny jako zdroj uhlíku a dusíku při době zdržení 10, 8, 4
a 2 hodiny. 2,4-dinitrotoluen nebyl degradován.
Vedle experimentů v kontinuálním uspořádání byly provedeny degradační testy v třepaných
baňkách. Jako biokatalyzátor byla použita směsná populace izolovaná při přestavbě
náplňového reaktoru s expandovanou břidlicí. Mononitrotolueny byly rozkládány, 2,4dinitrotoluen nebyl buňkami odbouráván.
This study was focused on aerobic biodegradation of nitrotoluenes from water in a concurrent
flow packed-bed bioreactor, using an attached mixed microbial population.
The first goal of this work was to compare the removal efficiency and the degradation rate of
a mixture of mononitrotoluenes using different packing materials (Poraver, expanded slate,
fire clay). Experiments were carried out in three reactors, marked as A (Poraver), B (expanded
slate) and C (fire clay). Expanded slate was evaluated as the best packing material.
Afterwards, the reactors were rearranged and each one was filled with expanded slate.
Microbial consortia were tested with respect to an ability to degrade nitrotoluene mixtures
when stressed by decreasing the hydraulic retention time.
Mononitrotoluenes were used as a sole carbon and nitrogen source for hydraulic retention
times of 10, 8, 4, and 2 hours. The microbial population had never been able to degrade
2,4-dinitrotoluene.
In addition to the experiments performed in a continuous arrangement, various tests were
carried out in batch reactors. A mixed microbial population isolated from the reactor B was
used in these tests. Again, 2,4-dinitrotoluene was not degraded in the batch experiments.
Petra Horová: Utilisation of substrate mixtures by recombinant Pichia pastoris in
continuous and fedbatch cultures (doc. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha a
prof. Ing. Karin Kovar, PhD, UAS Waedenswil, Švýcarsko)
Cílem předložené diplomové práce bylo určit základní kinetické a stechiometrické parametry
dvou rekombinantních kmenů Pichia pastoris (Mut+, MutS), které po indukci methanolem
produkují proteolytický enzym bromelain, a srovnat tato data s výsledky pro kmeny
exprimující jiné proteiny.
Ve vsádkových a kontinuálních kultivacích byl sledován vliv tří základních faktorů (tj. druhu
substrátu, fenotypu a zvoleného typu kultivace) na růst a fyziologii buněk při 30°C a pH 6.
Jako zdroj energie a uhlíku byly použity glycerol, glukosa, methanol nebo jejich směsi,
přičemž celková koncentrace substrátu byla vždy 11,73 g uhlíku L-1. V žádném z růstových
experimentů nebyly pozorovány rozdíly v chování Mut+ a MutS fenotypu, vliv na tvorbu
produktu je předmětem paralelně probíhajících prací.
Maximální specifické růstové rychlosti (0,280 ± 0,006) h-1 bylo dosaženo v kultivacích
s glycerolem. S glukosou byla její hodnota (0,250 ± 0,011) h-1. Výtěžnostní koeficient pro
glycerol byl (1,69 ± 0,045) g C g-1 a pro glukosu (1,35 ± 0,092) g C g-1.
Pro růst s methanolem byla maximální specifická růstová rychlost výrazně nižší (0,078 ±
0,005) h-1, což platilo i pro výtěžnostní koeficient (0,74 ± 0,133) g C g-1.
V kontinuálních kultivacích bylo dosaženo podobných výtěžnostních koeficientů jako
v případě vsádkových experimentů.
Během kultivací s nadbytkem glycerolu nebo glukosy byla zaznamenána tvorba primárních
metabolitů (ethanol a neidentifikovaná sloučenina) negativně ovlivňujících tvorbu produktu.
Při růstu s nadbytkem methanolu stejně jako v kontinuálních kultivacích se všemi třemi
substráty či jejich směsmi vznik těchto metabolitů zaznamenán nebyl.
Ethanol (≥ 3,3 g L-1) se vyskytoval pouze v kultivacích s glukosou. Neznámý metabolit byl
stanoven ve vsádkových kultivacích s glycerolem i glukosou. Tvorba tohoto metabolitu byla
pozorována od počátku kultivace, zatímco produkce ethanolu přibližně o pět hodin později.
Jejich utilizace nastala současně v okamžiku vyčerpání primárního substrátu, což je také
zřetelné z průběhu pO2 či koncentrace CO2 v odplynech.
Na základě porovnání experimentálně získaných kinetických a stechiometrických parametrů
s literaturou vyplývá, že základní růstová charakteristika rekombinantních Pichia pastoris
kmenů pravděpodobně nezávisí na vneseném genu. Na základě experimentálně stanovených
růstových parametrů bude navrženo optimální uspořádání přítokované kultivace plánované
pro produkci enzymu ve velkém měřítku.
This paper aims to determine the basic kinetic and stoichiometric parameters of two
recombinant Pichia pastoris strains (i.e. Mut+ and MutS phenotypes) which, after induction by
methanol, produce the proteolytic enzyme bromelain. A further aim is to compare these data
with results for strains of further products published in the literature.
The growth behaviour and the physiology as affected by the substrate used, phenotype and
cultivation mode were monitored in experiments with excess or limitation of substrate (each
at 30°C and pH 6). The total concentration of the carbon- and energy source was 11.73 g C L1
, irrespective of glycerol, glucose or methanol or mixtures of them were used.
All values of kinetic and stoichiometric parameters for the two different phenotypes are very
similar. However, the maximum specific growth rates determined for each of these three
substrates differ significantly [e.g. (0.280 ± 0.006) h-1, (0.250 ± 0.011) h-1, (0.078 ± 0.005) h-1
µmax for glycerol, glucose and methanol respectively]. The same values of growth yields were
determined in batch and continuous cultures [e.g. (1.69 ± 0.045) g C g-1, (1.35 ± 0.092) g C g1
, (0.74 ± 0.133) g C g-1 YX/C for glycerol, glucose and methanol respectively]. Furthermore,
the comparison with literature data for other recombinant strains expressing different products
supports the conclusion that the basic growth characteristics of recombinant Pichia expressing
heterologous proteins under the control of AOX1 promotor are independent of the introduced
gene.
In experiments with excess of glucose or glycerol overflow metabolites, ethanol and a not yet
identified primary metabolite were detected. However, these metabolites were not detected
during the growth with methanol nor in C-limited continuous cultures with all substrates as
single compounds nor with mixtures of them. The pattern how are these metabolites built and
utilised is different. Ethanol (≥ 3.3 g L-1) was secreted in cultures with glucose only and its
production began some 5 hours delayed compared to the non-identified metabolite. As also
detected by the exhaust gas analysis or pO2, both metabolites accumulated in the culture until
the substrate was utilised and were used subsequently.
Hana Pondělíková: Kultivace aerobních termofilních mikroorganismů v prostředí s vyšší
koncentrací buněk (prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Diplomová práce byla zaměřena na zjištění možností zvýšení koncentrace buněk směsné
aerobní termofilní bakteriální populace při kultivaci na modelovém médiu, které simuluje
vlastnosti odpadní vody z potravinářského průmyslu. Termofilní aerobní mikroorganismy, i
když se vyznačují vysokou degradační účinnosti, vykazují slabé nárůsty a zvýšení jejich
koncentrace by mohlo přispět k dalšímu zvýšení degradačního účinku. Pro všechny
experimenty byla použita směsná termofilní aerobní populace získaná z aerobní termofilní
stabilizace kalu.
Semisyntetické médium obsahující glycerol (často se vyskytující složka v odpadech po
zpracování tuků a při rafinaci glycerolu) sloužilo pro aerobní kultivaci termofilních
mikroorganismů. Průběh kultivací byl monitorován kontinuálně (koncentrace rozpuštěného
kyslíku, koncentrace CO2 a O2 v odcházejících plynech) a další důležité veličiny jako CHSK
(mg/l O2), koncentrace substrátu, koncentrace suché biomasy byly analyzovány z odebraných
vzorků.
Vsádková kultivace vykazuje nárůst biomasy kolem 3 – 4 g/L, vstupní koncentrace substrátu
o velikosti narostlé biomasy mnoho nerozhoduje. Při přítokované kultivaci, které se běžně
používá ke zvýšení koncentrace biomasy se podařilo dosáhnout jen 6 g/L suché biomasy.
Kontinuální experimenty s úplným recyklem biomasy vykázaly po 100 hodinách koncentraci
suché biomasy až 18 g/L. Pro separaci mikroorganismů byly použity keramické tubulární
membrány s velikostí pórů 0,2 µm. Celý modul s 23 kanály byl dlouhý 17 cm a představoval
filtrační plochu 0,05 m2. Tato membránová jednotka byla součástí zařízení ARNO 600 –
BIO (výrobce Mikropur s.r.o. Hradec Králové).
Diplomová práce ukázala, že vracením mikroorganismů lze dosáhnout zvýšené degradace
odpadních organickch látek. Je však nutno zařízení pro tento účel upravit a zabývat se otázkou
čištění membrán.
Diploma Theses was oriented to find out if an increase of cell concentration of a mixed
aerobic thermophilic population during cultivation on a model medium is possible. Medium
used in this work should simulate properties of waste water from food industry. Aerobic
thermophilic micro-organisms, in spite of their high degradation effectiveness, show low
growth of biomass and therefore an increase of biomass concentration could contribute to
further increase of degradation effect. For all experiments a mixed thermophilic aerobic
population from aerobic stabilization of sludge was used.
Semi-synthetic medium containing glycerol (component often appearing in wastes from fat
processing industry and from glycerol refinery) was used for aerobic cultivation of
thermophilic micro-organisms. Course of cultivations was monitored on–line (DOC,
concentration of O2 and CO2 in exhaust gas) and the other important parameters such as COD
(mg/L O2), concentration of the substrate, cell dry weight concentration were analysed offline.
Batch cultivation showed biomass growth around 3 – 4 g/L BDW (biomass dry weight),
initial concentration of substrate does not affect biomass concentration much. Fed-batch
cultivation commonly used for increasing biomass concentration showed in our case only 6
g/L BDW.
Continuous experiments with full recycle of biomass demonstrated after 100 h of cultivation
concentration of biomass up to 18 g/L. For separation of micro-organisms was employed a
ceramic tubular membrane module with pore diameters of 0.2 µm. The module with 23
channels was 17 cm long and represented a surface area of 0.05 m2. This membrane module
was a part of a membrane separation unit ARNO 600-BIO (manufacturer: Mikropur s.r.o.
Hradec Králové)
Diploma thesis has proved that continuous cultivation with recirculation of biomass is able to
reach higher degradation of waste organic material. However, it is required to adapt the
equipment and to study fouling of membranes and their cleaning.
Lenka Postlerová: Studium fyziologických změn bakterií rodu Thermus v průběhu
stárnutí populace (doc. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Diplomová práce byla zaměřena na sledování morfologických a fyziologických změn bakterií
Thermus aquaticus, Thermus sp. a Thermus ruber v závislosti na stárnutí populace a
kultivační teplotě. Ke studiu jednotlivých parametrů byly využity přímé optické metody,
konkrétně průtoková cytometrie a světelná a fluorescenční mikroskopie v kombinaci
s následným zpracováním dat pomocí počítačové analýzy obrazu systémem LUCIA Imagine.
Za účelem sledování fyziologických charakteristik byly buňky barveny těmito
fluorescenčními barvivy: propidium jodidem (PI) pro sledování membránové integrity a
obsahu nukleových kyselin, fluorescein isothiokyanátem (FITC) k určení obsahu bílkovin,
5(6)-karboxyfluorescein
diacetátem
(CFDA)
ke
studiu
aktivity
esteráz,
3,3`-diethyloxakarbokyanin jodidem (DiOC2(3)), rhodaminem 123 a bis-oxonolem za účelem
sledování membránového potenciálu a 5-kyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium chloridem (CTC)
ke studiu aktivity dehydrogenáz. Pro jednotlivá barviva a příslušné kmeny byly nejprve
optimalizovány podmínky barvení. Bylo provedeno porovnání stanovení obsahu bílkovin
spektrofotometricky a průtokovou cytometrií (v kombinaci s barvením fluorescein
isothiokyanátem).
Sbírkové kmeny bakterií byly kultivovány za aerobních podmínek v Luria-Bertani médiu při
teplotách 60°C, 70°C a 80°C. V průběhu kultivací byly pozorovány tyto morfologické
parametry: plošný obsah, délka, šířka a cirkularita buňky. Studium fyziologie bakterií se
opíralo o sledování integrity cytoplazmatické membrány, membránového potenciálu,
esterázové aktivity, obsahu bílkovin a obsahu nukleových kyselin. Růst bakterií, jejich
morfologie a fyziologie závisely na teplotě kultivace a růstové fázi. Maximální viabilita byla
zaznamenána u buněk v exponenciální fázi růstu a přechodem do stacionární fáze prudce
klesala.
This study was focused on monitoring of morphological and physiological changes
of the Thermus aquaticus, Thermus sp. and Thermus ruber depending on ageing process
and cultivation temperature. Direct optical methods such as flow cytometry and light
and fluorescent microscopy were used to cell analysis. Digital pictures were processed using
the LUCIA imaging ssftware.
In order to physiological characteristics observation, the cells were stained using following
dyes: propidium iodide (PI) for membrane integrity and nucleic acid content determination,
fluorescein isothiocyanate (FITC) for cellular protein level assessment, 5(6)carboxyfluorescein diacetate (CFDA) as an esterase activity indicator, 3,3`diethyloxacarbocyanin iodide (DiOC2(3)), rhodamine 123 and bis-oxonol for membrane
potential presence assessment and 5-kyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium chloride (CTC)
for dehydrogenase activity determination. Staining conditions for particular dyes and strains
were optimised first. The applicability of flow cytometric technique (coupled with fluorescein
isothiocyanate staining) for the cellular protein quantification was evaluated on the basis
of comparison with spectrophotometric method.
Collected bacteria strains were cultivated at 60°C, 70°C and 80°C in Luria-Bertani medium
under aerobic conditions. Following morphological and physiological parameters were
observed during the cultivation processes: the area, the length, the width and the circularity of
a cell, the cytoplasmatic membrane integrity, the presence of membrane potential, esterase
activity and the levels of cellular proteins and nucleic acids. The bacterial population growth
characterizations were based on optical density measurement. Flow cytometry and light
and fluorescent microscopy were useful techniques for population analysis on single cell
level.
Martina Skarkeová: Studium termofilních mikroorganismů metodami molekulární
biologie (Dr. Ing. Petra Patáková, ÚKCHB VŠCHT Praha)
Cílem této diplomové práce bylo nalézt metody, které by umožňovaly rychlou a spolehlivou
identifikaci termofilních mikroorganismů. Metody molekulární biologie a klasické
mikrobiologické metody byly použity pro identifikaci termofilních i mezofilních zástupců
rodu Bacillus.
Prvním krokem byla izolace DNA. Pro izolaci bylo použito pět metod a komerční kit
ROCHE. Na základě výsledků byla vybrána metoda, která poskytovala nejlepší výtěžek a
čistotu izolované DNA.
Na celkem 8 kmenů, z toho 5 termofilních a 3 mezofilní, byly aplikovány následující metody:
polymorfismus náhodně zmnožené DNA (RAPD), amplifikace intergenové oblasti 16S-23S
rRNA (ITS-PCR) a polymorfie délky restrikčních fragmentů (RFLP) jak 16S rRNA tak
produktů ITS-PCR reakce. Pro všechny výše uvedené metody byly optimalizovány jejich
protokoly pro snadné laboratorní použití.
Analýza RAPD byla provedena za použití dvou různých primerů. V obou případech se na
agarózovém gelu po elektroforéze objevily specifické vzory, které umožnily rozlišení
zkoumaných bakterií na druhové úrovni. Stejně tak i výsledkem amplifikace intergenové
oblasti 16S-23S rRNA (ITS-PCR) byl profil skládající se z několik pruhů, což naznačuje
variabilitu této oblasti pro jednotlivé bakterie a vhodnost jejího použití při identifikaci
bakterií.
Pro restrikční analýzu (ITS-PCR RFLP, 16S rRNA RFLP) byly použity 4 restrikční
endonukleázy, které zatím neposkytly uspokojující výsledky při identifikaci bakterií na
druhové ani kmenové úrovni.
The aim of this diploma work was to find methods, which enable fast and reliable detection of
thermophilic microorganisms. Molecular biology assays were used for identification of
thermophilic and mesophilic bacteria of the genus Bacillus.
The first step was isolation of genomic DNA. There were used 5 different methods for
isolation and purification of genomic DNA and commercial kit ROCHE. According to the
results of the research, the method, which provided DNA with the optimal yield and purity,
was selected for further usage.
A genotypic study using randomly amplified polymorphic DNA analysis (RAPD),
amplification of the 16S-23S rRNA intergenic transcribed spacer (ITS-PCR), restriction
fragment length polymorphism (RFLP) of 16S rRNA and restriction fragment length
polymorphism of the ITS-PCR (ITS-PCR RFLP) was carried out with 5 thermophilic and 3
mesophilic Bacillus isolates. All above mentioned techniques have been optimized to be able
to reach special electrophoresis pattern and discriminate among different species.
RAPD protocol was optimized by using two different primers which both have been found to
be effective for the RAPD fingerprinting of assessed bacilli. Amplification of the 16S-23S
rRNA ITS produced multiple bands in gel electrophoresis, implying multiple copies of
variable length in the ITS of these bacteria.
Four restriction enzymes were used in both RFLP analysis (ITS-PCR RFLP, 16S rRNA
RFLP). RFLP does not provide sufficient results for identification of bacteria on species or
strain level.
Marta Zlámalová: Vliv kultivační teploty na složení mastných kyselin termofilních
bakterií (Dr. Ing. Leona Paulová, ÚKCHB VŠCHT Praha)
Předmětem diplomové práce bylo sledování vlivu kultivační teploty na složení mastných
kyselin u termofilních bakterií Thermus species, Meiothermus ruber, Geobacillus
thermoglucosidasius a Geobacillus stearothermophilus. Teplotní rozmezí bylo zvoleno od
40°C do 80°C. Mikroorganismy byly kultivovány v komplexním mediu 48 hodin na třepačce
při konstantní teplotě. Poté byla buněčná kultura lyofilizována a z této vysušené biomasy byla
provedena nejprve izolace mastných kyselin varem v roztoku hydroxidu sodného a následně
jejich derivatizace v kyselém roztoku methanolu. Připravené methylestery byly extrahovány
do organického rozpouštědla, hexanu, a analyzovány na plynovém chromatografu. Získané
chromatogramy neboli profily mastných kyselin byly identifikovány porovnáním retenčních
časů se standardem BAME Supelco (bacterial acid methyl esters standard solution).
Získané profily mastných kyselin jednotlivých mikroorganismů se navzájem lišily. Byl
potvrzen vliv kultivační teploty na spektrum mastných kyselin studovaných termofilních
bakterií. Při nižších teplotách byly detekovány rozvětvené kyseliny s kratšími řetězci a
hydroxylované kyseliny. S růstem kultivační teploty těchto látek ubývalo a naopak stoupal
obsah většinových kyselin (iC15, iC17).
Metoda stanovení spekter mastných kyselin je rychlá a relativně nenáročná a díky její
citlivosti ji lze použít jako metodu k identifikaci mikroorganismů.
The aim of my diploma thesis was to study the influence of cultivation temperature on the
fatty acid profiles of termophilic bacteria. The following microorganisms Thermus species,
Meiothermus ruber, Geobacillus thermoglucosidasius and Geobacillus stearothermophilus
were studied under different temperatures ranging from 40°C to 80°C. In the first step the
microorganisms were cultivated on a shaker for 48 hours on a complex media. Constant
temperature was held during cultivation. Then the cells were centrifuged and lyophilised and
the fatty acids were isolated according to the following procedure. Lyophilised cells were
boiled in the solution of natrium hydroxide to release fatty acids from the cells. To iniciate the
ester-forming reaction the solution of methanol was then added and fatty acid methylesters
were extracted into an organic solvent, hexane. In the last step the obtained sample was
analysed by gas chromatography using capillary column. Chromatograms were compared
with a chromatogram of BAME (bacterial acid methyl esters) standard solution to identify the
fatty acid profiles.
It was found that there exists the influence of cultivation temperature on the fatty acid profiles
of studied thermophilic bacteria. At lower temperatures (40, 45, 50°C) hydroxy and branchedchain fatty acids were identified in the sample. With the increasing temperature a decreasing
amount of short chain and hydroxy fatty acids and increasing amount of fatty acids (iC15,
iC17) was detected.
According to our expectation there was found an influence of cultivation temperature on the
spectrum of fatty acids of studied thermophilic bacteria strains. It was validated that the
presented method is suitable for identification of mixed thermophilic bacteria population
according to their fatty acid profiles.
Zaměření Aplikovaná biologie a bioinženýrství:
Dušan Daňha: Význam aplikace aditiv při bioremediaci půdní matrice (Ing. Martina
Siglová, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Cílem předložené diplomové práce bylo posouzení skutečného vlivu známých a běžně
využívaných bioremediačních přístupů na dekontaminaci půdního prostředí znečištěného
ropnými produkty a vyhodnocení míry jejich účinnosti. Z tohoto pohledu byly testovány adice alochtonní a autochtonní mikroflóry, biostimulace, přídavek povrchově aktivních látek a
huminových kyselin.
Míra účinnosti daného bioremediačního přístupu byla určována pomocí respiračních testů a
reprodukční aktivity přítomné mikroflóry. Z těchto nepřímých parametrů bylo usuzováno na
postup biodegradačního procesu v průběhu krátkodobých laboratorních experimentů.
V testech byly používány reálné vzorky zemin, pocházející přímo z lokalit kontaminovaných
ropnými polutanty. Konkrétně se jednalo o lokalitu Chemopetrolu Litvínov (rafinérskopetrochemického komplexu s přidruženou chemickou výrobou) a skládky odpadů s.p. Diamo
(tzv. laguny Ostramo).
Získané výsledky naznačily možnosti a omezení jednotlivých bioremediačních přístupů a
vedly k závěru, že nejvýhodnějším přístupem je využití obohacení místního prostředí o
bakteriální kmeny schopné degradace ropných polutantů získané z konkrétní lokality, na které
probíhá sanace (tzv. autochtonní mikroflóra) a dále kombinace tohoto přístupu s biostimulací,
nebo-li dodávkou N, P nutrientů. Využití směsných kultur založených převážně na
alochtonech (lokalita Litvínov) přineslo pouze průměrné výsledky. Nejednoznačné závěry
byly získány při testování surfaktantů jako aditiva umožňujícího zvýšit biodostupnost ropných
látek. Jako částečně uspokojivé byly vyhodnoceny experimenty při nichž byla do půdní
matrice aplikována huminová kyselina, která byla schopna průběh bioremediačních procesů
mírně ovlivnit, avšak tento efekt je silně závislý na použité koncentraci huminových kyselin.
The aim of presented work was the examination of factual influence of known and commonly
used bioremediation approaches to a decontamination of soil environment polluted by oil
products and evaluation of their effectiveness degree. From this point of view the addition of
allochthonous and autochthonous microflora, biostimulation, supply of surfactants and humic
acids were tested.
The efficiency of chosen bioremediation approach was determined with the help of respiration
tests and reproduction activity of participating microflora. From these indirect parameters was
estimated the progress of biodegradation process in the course of short-term laboratory
experiments.
In the tests there were used the real samples of soils originated directly from the two localities
contaminated by oil hydrocarbons. Concretely it was locality Chemopetrol Litvínov
(petrochemical complex with ancillary chemical plant) and landfill site s.p. Diamo (lagoons of
former Ostramo).
Obtained results indicate possibilities and restrictions of individual bioremediation approaches
and lead to the conclusion, that the most advantageous way is enrichment of local
environment by bacterial strains which are able to degrade oil hydrocarbons and that were
obtained from the concrete area (so-called autochthonous microflora). And further the good
results were gained also thanks to the combination of bioaugmentation and biostimulation.
Usage of mixed cultures based on the allochthonous species has brought only average results.
Ambiguous conclusions were obtained during the testing of surfactants and the experiments
with humic acids were evaluated as a partly favourable. But it is necessary to become
conscious of the varying effect of different humic acids concentrations.
Kristián Gešev: Interakce obalových vrstev mikroorganismů a huminových kyselin (doc.
Ing. Alena Čejková, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Huminové látky jsou nedílnou součástí přírodních prostředí. Vyskytují se v půdě, vodě a
sedimentech. Vznikají rozkladem organických zbytků živých organismů. Huminové látky
jsou různorodé makromolekulární látky a jejich struktura dosud často není popsána. Tyto
sloučeniny můžeme rozdělit na humin, huminové kyseliny a fulvinové kyseliny.
Huminové kyseliny (HA) dokáží působit na živé organismy. Již v minulém století byly hojně
využívány pro jejich pozitivní vliv na rostliny. V poslední době se však ubírá pozornost
na působení huminové kyseliny na mikroorganismy. Zkoumá se pozitivní vliv na růst
mikrobiálních populací, na degradaci a bioremediaci polutantů.
Předmětem této práce bylo popsání vlivu huminové kyseliny na modelový mikroorganismus
Rhodococcus erythropolis. Byly potvrzeny pozitivní vlivy HA na mikroorganismus
při stresových podmínkách. Dále byla potvrzena sorpce HA na buněčný povrch a zjištěno, že
množství sorbované HA se zvyšuje během růstu populace. Množství sorbované HA bylo
do jisté míry kvantifikováno pomocí Freundlichových izoterem. V neposlední řadě byl
potvrzen pozitivní vliv HA na degradaci modelové aromatické sloučeniny (fenolu). Bylo
taktéž popsáno množství intracelulárního fenolu a složení buněčné stěny za přítomnosti a bez
HA.
Humic substances represent inseparable part of natural environments. They may be found in
soil, water and sediments. They accrue from organic residues degradation. Humic substances
are different macromolecular compounds and their structure has not often been described, yet.
These compounds may be divided into fulvic, humic acids and humins.
Humic acids (HA) are able to affect live organisms. They were already frequently used during
the last century for their positive impact on plants. However, recently the attention has been
paid to the humic acid impact on microorganisms. The object of research is positive impact on
microbial populations, on pollutants’ degradation and bioremedation.
The objective of this thesis is the description of humic acid impact on a model microorganism
Rhodococcus erythropolis. Positive impact of HA on the microorganism in stressful
conditions has been confirmed. Also, sorption of HA on cellular surface has been confirmed;
it was identified that the amount of sorbed HA increases during the population growth. The
amount of sorbed HA has been quantified to certain extent by using Freundlich‘s isotherms.
In addition, positive impact of HA on model aromatic compound (phenol) degradation has
been confirmed. The amount of intra-cellular phenol and cellular wall composition both with
and without the presence of HA has been described.
Alena Janová: Mikrobní degradace fenolových sloučenin ve vsádkovém a kontinuálním
procesu (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Tato práce se zabývá aerobní biodegradací 2-nitrofenolu, 3- nitrofenolu a 4- nitrofenolu
z vodného prostředí za použití směsné mikrobiální populace. Degradace byla sledována
jednak v batch uspořádání, jednak v kontinuálních souproudých náplňových reaktorech K2 a
K3.
Během batch experimentů byly mononitrofenoly používány jako jediný zdroj uhlíku, dusíku a
energie. Průběh degradace jednotlivých mononitrofenolů byl sledován při různých
počátečních koncentracích. Při pokusech byly měřeny a vyhodnocovány následující
parametry: Úbytek koncentrace mononitrofenolů, produkce metabolitu a hodnoty pH na
začátku a na konci kultivace. Z naměřených hodnot byla následně vypočítána kinetika
degradace jednotlivých mononitrofenolů.
V náplňovém bioreaktoru K2 byla sledována degradace směsi 3-nitrofenolu a fenolu. Vstupní
koncentrace 3-nitrofenolu byla udržována na konstantní hodnotě (40 mg.L-1), zatímco
koncentrace fenolu byla postupně zvyšována (z 20 až na 90 mg.L-1). V náplňovém
bioreaktoru byla sledována degradace směsi všech tří mononitrofenolů. Vstupní koncentrace
2- and 3-nitrofenolu (15 mg.L-1) byla udržována na konstantní hodnotě, koncentrace 4nitrofenolu byla postupně zvyšována (z 15 až na 90 mg.L-1). Pokusy byly zaměřeny na
sledování organické zátěže, degradační rychlosti a degradační účinosti.
This study deals with the aerobic biodegradation of 2-nitrophenol, 3-nitrophenol and 4nitrophenol from water using a mixed microbial population. Degradation was studied both
under batch conditions and in continuously operated concurrent packed bed reactors K2 and
K3 (PBR K2, K3).
During batch experiments, each of the mononitrophenols (MNPs) was used as a sole source of
carbon, nitrogen and energy. A degradation process of the individual MNPs was performed
under various initial concentrations. The following parameters were measured and evaluated:
Uptake of mononitrophenols by mixed microbial population, metabolite production, and pH
values at the start and end of cell cultivations. Consequently, the degradation kinetics of the
individual MNPs were calculated from measured values.
In the PBR K2, a simultaneous degradation of the mixture of 3-nitrophenol and fenol was
studied. The initial concentration of 3-nitrophenol (40 mg.L-1) was maintained at the constant
level while the concentration of phenol increased gradually (from 20 to 90 mg.L-1). In the
PBR K3, the degradation of the mixture of all three MNPs was studied. The initial
concentration of 2- and 3-nitrophenol (15 mg.L-1) was maintained at the constant level. The
concentration of 4-nitrophenol increased gradually (from 15 to 90 mg.L-1). The following
parameters were evaluated from the experiments: Organic load, nitrophenol degradation rate
and removal efficiency.
Iva Javorková: Produkce extracelulárních biopolymerů vláknitými houbami (doc. Ing.
Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
Mikroorganismy submersně kultivované v přítomnosti stresových faktorů mají několik
způsobů, jak se s těmito nepříznivými vlivy vyrovnat. Jedním z možných obranných
mechanismů je produkce extracelulárních polysacharidů, které mohou účinky stresoru zmírnit
nebo mu zcela zabránit.
Studium této problematiky bylo provedeno na modelovém vláknitém mikroorganismu – plísni
Aspergillus terreus, která prokázala tvorbu těchto polymerů i bez použití negativních faktorů
při kultivaci.
Ve své diplomové práci jsem se zaměřila zejména na studium různých kultivačních
podmínek, které mohou ovlivňovat tvorbu exopolysacharidů. Tyto faktory zahrnovaly
především vliv odlišného zdroje uhlíku a dusíku a jejich koncentraci, vliv pH, iontové síly,
vápenatých a hořečnatých iontů a iontů těžkých kovů. Dále byla studována distribuce iontu
těžkého kovu v systému biomasa – kultivační medium – exopolysacharidy. Bylo stanoveno
též hrubé složení exopolysacharidů, což zahrnovalo množství všech cukrů a proteinů
obsažených v produktu. Tvorba exopolysacharidů byla zdokumentována také fluorescenční
mikroskopií barvením Alcianovou modří.
Microorganism submersly cultivated in presence of stress factors use different ways of
overcoming these negative influences. One of these mechanisms to be used is producing of
extra cellular polysaccharides (EPS) that can reduce or terminate influence of the stressors.
Mechanism of producing was studied by means of filamentous mould microorganism
Aspergillus terreus. This microorganism can produce EPS also without influence of stressors.
In my diploma thesis I especially focused on the observation of various cultivation conditions,
which can affect producing of EPS. Conditions included mainly different C, N – sources and
their concentration, pH, ionic strength, Ca2+, Mg2+ ions and heavy metal ions. Furthermore
distribution of heavy metal ions in the system of biomass – cultivation medium – EPS was
studied. Also rough composition of EPS was determined. It contained amounts of all
saccharides and proteins included in the product. Creation of EPS was observed by
fluorescence microscopy after Alcian Blue dyeing.
David Kubáč: Biotransformace nitrilů imobilizovanými bakteriálními biokatalyzátory
(doc. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
V této práci byly studovány biotransformační schopnosti bakteriálního kmene Rhodococcus
equi A4 k několika skupinám nitrilů. Jako biokatalyzátory byly použity rozpustná a
imobilizovaná nitrilhydratasa a volné a imobilizované buňky tohoto kmene.
Pro imobilizaci volných buněk byla vybrána patentovaná technologie LentiKat®, která byla již
dříve pro biokatalytické aplikace úspěšně použita. Pro imobilizaci enzymu byla použita
adsorpce na chromatografických materiálech a to Q-Sepharose a Phenyl- Sepharose.
S imobilizovanými biokatalyzátory byly provedeny vsádkové i kontinuální reakce, s volnými
buňkami a enzymem pak vsádkové reakce.
Jako substráty pro přípravu příslušných amidů a/nebo kyselin byly použity 2-metylennitrily
1a - 6a. Jako modelový substrát pro porovnání aktivit jednotlivých biokatalyzátorů byl použit
benzonitril.
1a
3a
2a
CH2
CH2
CN
CH2
OH
CN
CN
OH
OH
4a
OH
MeO
5a
CH2
CH2
CN
OMe
6a
CN
OH
H3COC
O
MeO
CH2
CN
OMe
Schéma 1: Nitrily konvertované bakteriálním kmenem Rhodococcus equi A4.
Celé buňky transformovaly nitrily 1a - 5a na příslušné amidy 1b - 5b a po delší době reakce
na příslušné karboxylové kyseliny 1c - 5c. K transformaci substrátů 1a, 2a a 5a byly použity
též imobilizované buňky, které vykazovaly dobrou stabilitu při opakovaném použití (nejlepší
v případě nitrilu 1a). Tento biokatalyzátor byl také vhodný pro opakovanou hydrataci
benzonitrilu a 3-kyanopyridinu.
Standardy chirálních substrátů a produktů, připravených jako racemické směsi, byly
analyzovány na chirálních kolonách Chiralcel OD-H, Chiralcel OJ. Byla nalezena možnost
sledování enantioselektivity reakcí u některých substrátů. Pro některé substráty se
stereogenním centrem v β-poloze (2a, 5a, 2b, 5b) byla zjištěna určitá enantioselektivita
nitrilhydratasy a amidasy (E = 3-4).
This work examined the biocatalytic ability of a bacterial strain, Rhodococcus equi A4,
towards several groups of nitriles. The biocatalyst formulations used were the soluble and
immobilized nitrile hydratase as well as free and immobilized whole cells of this strain.
For whole cell immobilization the patented technology LentiKat®was used, which has been
successfully applied in biocatalysis. For enzyme immobilization the adsorption
on chromatographic materials (Q-Sepharose and Phenyl-Sepharose) was utilized. With
immobilized biocatalysts batch and continuous reactions were carried out. The free cells and
the soluble enzyme were used in batch reactions.
For the preparation of amides and/or acids, 2-methylennitriles 1a - 6a (see Scheme) was used
as substrates. Benzonitrile was used as the model substrate for the comparison of the activity
of individual biocatalysts.
1a
3a
2a
CH2
CH2
CN
CH2
OH
CN
CN
OH
OH
4a
OH
MeO
5a
CH2
CH2
CN
OMe
6a
CN
H3COC
O
MeO
CH2
CN
OH
OMe
Scheme 1: Nitriles converted by the bacteria strain Rhodococcus equi A4.
Whole cells transformed nitriles 1a - 5a into the corresponding amides 1b - 5b and into the
corresponding acids 1c - 5c after a prolonged reaction time. The immobilized cells were also
used for the transformation of substrates 1a, 2a and 5a and they exhibited a good stability
in repeated use (the best one in case of nitrile 1a). This biocatalyst was also suitable for the
repeated hydration of benzonitrile and 3-cyanopyridine.
The standards of chiral substrates and products, prepared as racemic mixtures, were analyzed
on the chiral columns Chiralcel OD-H, Chiralcel OJ a (Chiral AGP?) and methods
of monitoring the enantioselectivity of the reactions were elaborated for some substrates.
For some substrates with the stereogenic center in the β-position (2a, 5a, 2b, 5b) some
enantioselectivity of the nitrile hydratase and amidase (E = 3-4) was revealed.