02042014

• malé inhibiční molekuly
• protilátky a konjugáty
• terapeutické a preventivní vakcíny
• ve vývoji…
(Více či méně) cílené terapie
Fotodynamická terapie
Diferenciační terapie
Diferenciační terapie
Maligní fenotyp je často asociován s defektem diferenciace
Za normálních okolností nukleární receptor Retinoic acid receptor alfa
(RAR) reguluje expresi proteinů diferenciačního programu (například
granulocytů) RAR funguje jako transkripční aktivátory v heterodimeru s
RXR vazbou na RAREs (retinoic acid responsive elements)
Receptor kyseliny retinové
Diferenciační terapie
Maligní fenotyp je často asociován s defektem diferenciace
Normální diferenciační program je blokován
(nedozrávají neutrofily)
vznikem fuzního proteinu PML-RAR který
blokuje transkripci směřující k diferenciaci
(váže represory a histondeacetylázy)
Promyelocytární leukemie (PML) t(15;17)
Za normálních okolností nukleární receptor Retinoic acid receptor alfa
(RAR) reguluje expresi proteinů diferenciačního programu (například
granulocytů) RAR funguje jako transkripční aktivátor v heterodimeru s
RXR. Dimer se váže na RAREs (retinoic acid responsive elements)
Receptor kyseliny retinové
Diferenciační terapie
Maligní fenotyp je často asociován s defektem diferenciace
Exprese diferenciačního programu je
obnovena.
Komplex PML-RAR je po navázání jedné ze
strukturních variant kyseliny retinové
- all-trans retinové kyseliny (ATRA, Trentoin)
uvolněn z vazby na DNA a degradován v
proteazomu
Retinol
uvolnění z vazby na DNA a degradace v proteazomu
Inukuje sumoylaci PML-RAR
Podobný diferenciační účinek má také oxid arzenitý (Trensox)
Nasr R et al. Clin Cancer Res 2009;15:6321-6326
APL pathogenesis and mechanisms of action of the curable combination RA-As.
Senzitizující látka + světlo
Aktivovaná senzitizující látka
(Opačný spin párových pí
elektronů )
Excitovaný vysoce reaktivní
(singletový) kyslík
Využívá kombinace fotosenzitizující látky a světla.
Dochází ke generaci reaktivního singletového kyslíku, který způsobí poškození nádorové tkáně
Fotodynamická terapie (PDT)
Deriváty porfyrinu
nebo jeho prekurzory
(Photofrim, kyselina aminolevulová)
porfyrin
630 nm
Oxidativní poškození
buněčných struktur (MK, proteiny, NA…)
APOPTÓZA
1O singletový kysík
2
Nádorové buňky obsahují/kumulují vyšší množství porfyrinů než zdravé
Photofrin
Kromě porfyrinů v testech také ftalocyaniny a jejich komplexy s kovy
některé nádory jícnu a plic nádory děložního čípku
močového měchýře
Štítné žlázy
Komplikací PD terapie je následná citlivost kůže na světlo
Klinické studie (pomocí endoskopie)
Využití „kam lze posvítit“ – karcinomy kůže a kožní T‐buněčné lymfomy
Aplikace buď lokální (krém‐ kyselina aminolevulová) nebo systemická (porfyriny (Photofrin)
Brown SB et al. Lancet Oncol. 2004 Aug;5(8):497-508.
Kumulace aminolevulinátu v nádorové tkání
tamoxifen
bortezomib
ATRA
Protilátky
TKIs
?
Na rychle proliferující (nádorovou) buňku?
Na konkrétní molekulu?
Na konkrétní molekulu kvalitativně nebo kvantitativně změněnou?
Interkalující
látky
Antimitotika
antimetabolity
Alkylanty a Pt
Specifičnost
Cílenost ?
Klasická cytostatika – nízká účinnost a negativní vedlejší efekty, riziko sekundárních malignit
Cílené a biologické terapie
Inaktivace pro‐proliferačních proteinů (onkogenů) over‐exprimovaných, mutovaných nebo jinak aktivovaných
Gatekeepers and caretakers? (antionkogeny jako p53, DNA repair…)
Zpravidla utlumeny nebo inaktivovány/mutovány v nádorových buňkách
X je komplikované obnovit jejich aktivitu
Terapeutické cíle nádorových buněk ‐ antionkogeny nebo onkogeny?
Je snazší něco rozbít, než opravit
Cílené a biologické terapie
? Přispívá protein svou (nadměrnou/změněnou) funkcí k onemocnění?
? Je tento protein druggable?
? Známě detailně jeho molekulární strukturu?
Cca 20 procent proteinů je považováno za druggable
Druggable targets
Inaktivovat lze proteiny s definovanou (enzymatickou) funkcí, které mají jasně
strukturovaný povrch, vhodným cílem je např. „kapsa“ pro vazbu substrátu nebo místo interakce s jiným proteinem nebo molekulou. (strukturní požadavek neplatí pro terapeutické protilátky)
Inaktivace pro‐proliferačních proteinů (onkogenů) over‐exprimovaných, mutovaných nebo jinak aktivovaných
Je snazší něco rozbít, než opravit
Cílené a biologické terapie
Protilátky a jejich konjugáty
Malé molekuly Cílené a biologické terapie
Inhibice enzymatické aktivity
Přes 500 kináz, cca 90 tyrozinkinázy. Vysoká homologie
ATP-vazebné místo (dutina, zářez) receptorových i nereceptorových kináz
Možnost zásahu na více stupních (downstream signalizace)
P-P interakce
(snaha o interferenci s komplexy p53/Mdm2 a Bcl2/BH3 only proapoptotickými proteiny
Jasná aktivita a struktura, snazší je inhibovat, než zvyšovat aktivitu
Cílená terapie‐ malé molekuly
Inhibitory proteazómu
Inhibitory mTOR (Ser/Thr kináza)
BCR‐ABL
EGFR
BTK
Inhibitory tyrozinkináz
Cílená terapie‐ malé molekuly
Minimální rozdíly ve struktuře IRK a IGF‐1R
Vysoká strukturní podobnost Ser/Thr kináz i tyrozinkináz
Výskyt různých variant i v jiných typech leukemie
Aktivace
Ras dráhy, PI3K‐Akt/PKB, Jak‐Stat,
Aktivace TF: Myc, Jun, NFB
95% pacientů s CML má translokaci t(9;22) Vzniká tak filadelfský (Ph) chromozóm
Vzniká některá z variant fúzního
proteinu BCR‐ABL (konstitutivně aktivní tyrozinkináza)
Chronická myeloidní leukémie (CML)
Nebrání vazbě ATP, ale stabilizuje BCR‐ABL v inaktivní podobě.
Navozuje dlouhodobou remisi u většiny pacientů s CML.
(Jen 4 TK jsou inaktivovány)
Testy v 1996‐2000
Schválen 2001 pro terapii CML
Vysoce specifický pro ATP–vazebný zářez BCR‐ABL
Gleevec (imatinib mesylate)
Část pacientů s CML získá rezistenci na imatinib, často mutací vazebného místa
‐ Vyvinuta řada inhibitorů nových – nilotinib, dasatinib, bosutinib
Gleevec (imatinib mesylate)
Gleevec (imatinib mesylate)
Jen 4 z 90 TK jsou inaktivovány (BCR‐ABL, v‐ABL, PDGFR, Kit)
Jednou z nich Kit receptor aktivovaný/mutovaný u vzácných a těžko léčitelných gastro‐
intestinálních stromálních tumorů (GIST)
Off-target aktivita imatinibu
High-throughput screening potenciálních inhibitorů kináz
Inhibitory receptorové tyrozinkinázy EGFR-1/HER1
(epidermal growth factor recepor 1)
EGFR je aktivován/overexprimován u 1/3 karcinomů
Může vytvářet heterodimery s HER2
(erlotinib)
(gefitinb)
Blokace ATP vazebného místa Tarceva (erlotinib) a Iressa (gefitinb)
Tarceva (erlotinib)
Ústup nemalobuněčného karcinomu plic po 6 týdnech terapie gefitinibem (Irresa)
2004‐2005 Schváleny pro terapii nemalobuněčného karcinomu plic
Tarceva (erlotinib) a Iressa (gefitinb)
– ibrutinib
Schválen 2013 k terapii některých B‐buněčných lymfomů a CLL
BTK se podílí na B‐buněčné signalizaci (přežití, maturace aproliferace B‐buněk)
Inhibitor BTK (Bruton´s tyrosine kinase) – ibrutinib
Sunitinib (EGFRA, EGFRB, KIT, RET, FLT3, VEGFR1‐3…)
Ponitinib (BCR‐ABL, SRC, VEGFR1‐3…)
Sorafenib (PDGFRB, VEGFR, KIT, FLT…)
Multikinázové inhibitory
Inhibitory mTOR
Ser/Thr kináza regulující:
Buněčný růst, proliferaci, motilitu, proteosyntézu,
angiogenezi…
Integruje signály z mnoha drah – tlak kyslíku, dostupnost
nutrientů, hladiny ATP, mitogenní signály…
mTOR (mammalian target of rapamycin)
Později demonstrovány imunosupresivní účinky a identifikován
cílový protein
Rapamycin – antibiotikum ze Streptomycety
z velikonočních ostrovů (1960s)
mTOR – mammalian target of rapamycin
Inhibitory mTOR
Rapamycin se váže na FKBP12
a komplex rapamycin-FKBP12 asociuje s mTOR
Inaktivace Akt/PKB
Ty jsou inaktivovány rapamycinem
mTOR funguje ve dvou komplexech (s proteiny Raptor a Rictor) s odlišnou funkcí
Redukce adenokarcinomu tlustého
střeva v myši po aplikaci
rapamycinu
Rapamycin (sirolimus)
Temsirolimus –schválen pro karcinom ledviny a testuje se pro další
Regulační komplexy mTOR-raptor a mTOR-rictor jsou inaktivovány rapamycinem
a jeho variantami – pleiotropní antiproliferační a antiangiogenní efekt
Terapeutické protilátky a protilátkové konjugáty
Fc fragment
Fab fragment
Terapeutické protilátky a protilátkové konjugáty
Myelomům chybí
HGPRT (salvage
purinů) a pokud
aminopterin
v HAT médiu naruší i
de novo syntézu přežijí jen fůzované
lymfocyty s myelomy.
Samotné lymfocyty
mají omezenou
životnost.
Vyředění a selekce klónů
Monoklonální protilátky a hybridomy
Humanizovaná protilátka
(např.trastuzumab)
-omab
-zumab
Myší protilátka
(např.ofatumumab)
(např.rituximab)
Lidská protilátka
-umab
-ximab
Chimérická protilátka
Monoklonální protilátky - nomenklatura
Jak se ale vyhnout lidské imunitní odpovědi na myší
protilátky při dlouhodobém/opakovaném podání ?
• Fc fragmenty přitahují imunitní buňky, hlavně cytotoxické T-lymfocyty, NK
buňky a makrofágy – indukce fagocytózy nebo apoptózy cytotox. látkami
(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)
• Fc fragmenty aktivují komplement – lýza buněk a atrakce imunitních buněk
(complement dependent cytotoxicity)
• Protilátky narušují signalizaci od receptoru dovnitř buňky (přímá toxicita)
Fc fragmenty - přitahují imunitní buňky a aktivují komplement
Fab fragmenty – vážou se na nádorový antigen (nejčastěji
povrchový receptor nebo jeho solubilní ligand)
Terapeutické protilátky – mechanismus účinku
(Avastin alias Bevacizumab )
Inhibitor angiogeneze
Širší spektrum solidních nádorů (2005)
anti VEGF (ligand receptoru VEGFR, vascular endothelial growth factor)
(Cetuximab)
kolorektální karcinom (2004)
anti EGFR‐1/ HER1/ERBB/ ‐ epidermal growth factor receptor
(Herceptin alias trastuzumab)
karcinom prsu (2000)
anti HER2/ERBB2/neu
(Rituximab) lymfomy a některé leukemie (1998)
anti CD20
MAPK
NFB
PI3K/Akt
Kaskáda:
CD 20 exprimován na povrchu B‐lymfocytů důležitý pro jejich maturaci
(Rituximab) lymfomy a některé leukemie (1998)
anti CD20
Receptorová tyrozinkináza
(human epidermal growth factor receptor 2) Kaskáda:
PI3K/Akt
RAS
PKC
….
Amplifikován nebo overexprimován
u 15‐30 procent nádroů prsu HER2/ERBB2/neu
Anti HER2 (Herceptin alias trastuzumab)
(2000 schválen pro terapii HER+ karcinomu prsu)
Kaskáda:
RAS
STAT
PI3K/Akt
mutace a overexprese u různých nádorů
( human epidermal growth factor receptor 1)
EGFR/ HER1/ERBB
(Cetuximab)
kolorektální karcinom a nádory hlavy a krku
anti HER1/EGFR‐1/ERBB VEGEF-A (vascular endothelial growth factor)
je ligand receptoru VEGFR
SIGNALIZACE ZODPOVĚDNÁ ZA ANGIOGENEZI
(migrace endotelových buněk, jejich dělení, aktivita MMP)
anti VEGF-A (Avastin alias Bevacizumab )
Schválen jako inhibitor angiogeneze
Širší spektrum solidních nádorů
(Avastin alias Bevacizumab )
Inhibitor angiogeneze
Širší spektrum solidních nádorů (2005)
anti VEGF (ligand receptoru VEGFR, vascular endothelial growth factor)
(Cetuximab)
kolorektální karcinom (2004)
anti EGFR‐1/ HER1/ERBB/ ‐ epidermal growth factor receptor
(Herceptin alias trastuzumab)
karcinom prsu (2000)
anti HER2/ERBB2/neu
(Rituximab) lymfomy a některé leukemie (1998)
anti CD20
Konjugované protilátky mohou nést k buňce nebo do ní cytotoxické látkyradiokativní zářiče nebo cytostatika
• Fc fragmenty přitahují imunitní buňky, hlavně cytotoxické T-lymfocyty, NK
buňky a makrofágy – indukce fagocytózy nebo apoptózy cytotox. látkami
(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)
• Fc fragmenty aktivují komplement – lýza buněk a atrakce imunitních buněk
(complement dependent cytotoxicity)
• Protilátky narušují signalizaci od receptoru dovnitř buňky (přímá toxicita)
Fc fragmenty - přitahují imunitní buňky a aktivují komplement
Fab fragmenty – vážou se na nádorový antigen (nejčastěji
povrchový receptor nebo jeho solubilní ligand)
Terapeutické protilátky – mechanismus účinku
• s radioaktivním izotopem
• s cytostatikem
Konjugované terapeutické protilátky
Použití:
Některé lymfomy a
CLL
Bexxar (anti CD20 + iód 131)
Zevalin (anti CD20 + indium 120 nebo yttrium 90)
Konjugované protilátky s radioaktivním zářičem
Použití:
Karcinomy prsu
HER2+
adenokarcinom
žaludku a jícnu
Anti HER2 (trastuzumab)+inhibitor polymerace MT(maytansin)
Konjugované protilátky s cytostatikem
Internalizace a uvolnění cytostatika katepsinem/ny
Anti CD30 protilátka konjugovaná s monomethylauristatinem (inhibitor polymerace MT)
Pro terapii některých lymfomů
Brentuximab vedotin (Adcetris)
Konjugované protilátky s cytostatikem
CD33 - myeloblasty a nezralé myelomonocyty (AML)
Po internalizaci a okyselení dojde k uvolnění kalicheamycinu. Vazba na DNA a
vytvářen ds zlomů.
Mylotarg (anti CD33 + bakteriální antibiotikum kalicheamycin)
Konjugované protilátky s cytostatikem
Terapeutické a preventivní vakcíny
Lepuleucel T v klinických testech (antigenem je HER2/neu) pro terapii ca prsu
Terapiie se zpravidla 3x opakuje (100000 USD), schválen 2010
• pacientovi se odeberou leukocyty (především APC/dendritické buňky)
• ty se inkubují s fuzním proteinem PAP-GMCSF
(prostatic acid phosphatase (antigen ca prostaty)a růstový faktor
granulocyte-macrophage stimulating factor stimuluje APC k maturaci)
• takto aktivované se vrátí pacientovi a aktivují imunitní odpověď proti PAP na
nádoru.
Sipuleucel T (2010, k terapii karcinomu prostaty)
„vakcína“ musí být vyrobena pacientovi na míru jedná se o jeho vlastní
stimulované APC
Terapeutická vakcína
Gardasil - HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18
Cervarix – HPV 16, HPV 18
(HPVs) Human papilloma virus - 150 příbuzných virů
HPV 6, 11, 16,18 – vysoce rizikové - děložního čípku, pochvy, dělohy,
nádory úst a hrtanu…
Preventivní protinádorové vakcíny
Inhibice CDK
flavopiridol, bohemin, olomoucin a jeho analog roscovitin (prof. Veselý )
RAS-RAF-MEK-ERG
Inhibitory Ras – (ukotvení na vnitřní stranu membrány prenylací –
inhibitory farnesyltransferázy (lonafarnib, tipifarnib)
Další cílené terapie – dosud ve vývoji či v testech
Cílená tvorba volných radikálů - elesklomol
Inhibice chaperonů - HSP (zvýšená exprese má antiapoptotický efekt) např.
gelandamycin
Inhibice antiapoptotických BCL2 proteinů – látkami mimikujícími BH3-only proteiny
(BH3 mimetika – ABT733)
Přímá indukce apoptózy přes TRAIL receptory (extrinsic apoptóza)
Protilátky proti TRAIL-receptrům R1 (mapatumumab) a TRAILR2 (lexatumumab)
Inhibice AURORA kináz podílejících se na mitóze – alisertib, danusertib
Další cílené terapie – dosud ve vývoji či v testech