Diagnostika LB

Průkaz specifickédeoxyribonukleovékyseliny v diagnosticelymeskéborreliózy
HulínskáD.,VotýpkaJ.,
Serologic\ý průkaz
Diagnostikapůvodcelymeskéboneliózy (LB)je od popsríní
tétonemocia identifikacejejího
původceBorrelia burgdorfer'(BB) postavenana prukazuspecifickýchprotilátekmetodou
(ELISA) a protilátekpomocíimunoblotu(Westernblot).obězmíněnémetody
jsou v naší
laboratořiakreditovríny.Serologické
metodyjsou velmi přesné,standardizovény,obecně
přijatéa nejčastějivyužívanépři
prukazuLB.Výhodou metodje vysoká specifičnost,a
možnostpoměrnéhokvantitativníhostanoveníproti|átek.Zezasí|aného
materiáluje pozitivita
na|ezenav 14-50 % u Elisy av 23-26 oÁu imunoblofu. Vlastní prťkazprotilátekvšaknení
průkazemakutníhoonemocnění,
velmi častopotvrzujekontakts původcemonemocnění
nebo
prodělanéonemocnění.Vtomtosměrub:fo'áu někteých metodproblémemna|éú.
zce|a
negativnívzorky. Yýznan serologickýchmetod m:ůže
byt ovlivněn i stále se více
vyskytujícímiimunodeťrcientní
stavyr,yšetřovaných
pacientůa měnícíse antigennískladbou
genomospeciés
BB.Popsáníjednotliých serotypů,vícei méněpatogenních,
vnášídalší
problémydo serologickédiagnostiky.Problémem
je i odlišnostantigenův jednotliqých
oblastecha odlišnost,,divokých..a sbírkových-kultivovaných
kmenůpoužívaných
pro
přípravuantigenůdiagnosticsýchsouprav.Zde můžedochézetkrozdílůmve qýsledcích
laboratoří,kterépoužívají
diagnostickésoupravyod ruznýchv1irobců.Výsledek
by měl být
vždydoprovénen
sdělením'kÍery,místrrí,
nebo sbírkoqikmen byl použiti kdy a kde byl
kmen izolován.Využitímonoklonálníchlátek vznášído diagnostikydalšíproměnné,
a nemůŽe
odráůetměnící
se antigennívybavení,kterázpůsobujev určitém
regiónu onemocnění.
Kultivace a mikroskopiclry průkaz.
Přímý prtkaz BB je možnýpomocíkultivacev BSK mediu' mikroskopiív zástinu a pomocí
imunofluorescence'
imunoelektronopticky.Kultivacepůvodcenemocije obtížnápřiizolacích
ztěIníchtekutin,úspěšnější
je ztkáni. Nejlepšímzdrojempro kultivaci borrelií(BB) jsou
infikovanáklíšťata,
která obsahujídesetitisícespirochét.
optická mikroskopiev zástinu,
případnědoplněnáimunofluorescencí,se uplatňujejen při vyšetřování
vzorkůs větší
koncentracíborrelií.Výěžnějšíje již kombinaceelektronové
mikroskopie s koncentrací
vzorkůpomocícentrifuagacea imunosorbcedoplněnénegativnímbarvením.Tato
dnes
akreditovanámetodadokaže
jižprukaz těl bonelií,určení
druhu,identifikacičástitěl borrelií
(flagella)nebo,,pobytové
stopy..přítomnostiborreliíve formě cyst.DlouhodobáqitěŽnost
metodyje od 2 do 7 Yoze zaslanéhomateriálu.
Průkaz deoxyribonukleovélryseliny Borrelia burgďorferi
Btzy po zavedenípolymeriízové
řetězovéreakce(PCR,1988)'ale i velmi záhypo popsrání
původcelymeskéborreliózy (1982)zkoušelanašelaboratořv retrospektivní
studii moŽnost
příméhoprůkazuDNA v tkaňoqýchtekutinácha ve tkríních.Pro
nedostupnost
komerčních
setůpro prtkaz borrelióvéDNA muselijsme vyzkoušetřadu metodiki materiálů.Dozačátku
roku 1996jsme lyzkoušeli postuppro izolaci DNA,vybrali setyprimeru_ specifických
sekvencíz DNA chromozómuBorrelia burgdorferi.Vyzkoušeli
variacetermálníchprogramů
pro cyklery, zaved|ikontrolucitlivosti reakce.odtéhoždatajsme zaved|iparalelní
vyšetření
materiáluzasílaného
na vyšetřeníserologickéa elektronoptické
s vpžitím evidencevzorkůa
pomocíprogramuEPI INFO. Časemjsme definovalipodmínkypro
ýsledků vyšetření
správnýodběri zacházenís lyšetřovanýmmateriálemi způsobhodnocenízískaných
výsledků.Potěšilo
nás,kdyžjsme později zjistí|i,že
tatonašezávěryjsou v souhlase
s publikovanými pracemipředníchza}trantčních
pracovišť
v problematicelaboratorní
diagnostikylymeskéborreliózy.od roku 1996jsme vyšetřilipomocíPCR 18690vzorků
tělníchtekutina tkríní.(Viztabulkač.1)
Tabulka č'1:Počty lyšetřenóho materiálu v letech 1996.2003
Rok
vyšetření
1996
Počet
vyšetřených
Vzorků PCR
r43
r997
r998
1592
2446
2000
2001
2002
2003
2839
2548
2581
3186
18690
1999
Celkem
33s5
o vyšetření
metodouPCR zájem narůstaltak,žeod roku 2000 bylo nutnékaždýrok
omezovatpoěetvyšetření.Vedli
nás k tomujak pohnutkyekonomickéi technickói qfzkumný
zám&.omezili jsme především
počtyvyšetřené
k'rve.Zájemnásvedl k přednostnímu
vyšetření
mozkomíšního
moku,výpotkůa tkání.VýběrsekvenceDNA Z genomubakteriemá
rozhodujícíýznampro specifičnost
a citlivost reakcePCR Při srovniíní
primeru jsme měli
možnostvyzkoušetprimery odvozenéz genůgenomovéi plasmidovéDNA. Kriteriem pro
ýběr byla genetickástabilitavybranésekvence,specifiěnosta dostateěnácitlivost i při
jednokrokovéPCR. ffiz tabulkaě.2)
Tabulka č.2:Zkoušenéprimery pro průkaz DNA Borrelia burgdorferis.lato
označení primeru
Druh PCR
Autor a rok publikace
bb
Jednokrokové,i
nested
Jednokrokové i
nested
Nested
Rosa,P.A.,1991
Jednokrokové,
a sonda
Marconi,R.T.,1992
Jednokrokové'
a sonda
Marconi"R.T..1992
cc
bb-cc
LD
BB
Rosa.P.A..1991
Melchers.W..l99I
Z čehoje primer
odvozen
Klonovany fragment
genomu
Klonovaný fragment
genomu
Klonovaný fragment
genomu
165 rRNA
genom
165 rRNA
genom
BG
VS
WK1.WK2
F7,F2
P41
Jednokrokové'
a sonda
Marconi.R.T."1992
Jednokrokové,
a sonda
Marconi,R.T.,1992
Jednokrokové,
a sonda
Jednokrokové,
a sonda
Jednokrokové,
a sonda
Jednokrokové.
a sonda
Kruooger,W.H.,1991
165rRNA
genom
165rRNA
genom
Flagellin gen
Lebech.A.M..1991
Flagellin gen
Luft.B.J."1992
Jednokrokové,
a sonda
Luft.8.J.,1992
Gen P41 antigenu
flagellin
Gen P41 antigenu
flagellin
Gen 165rRNA
Adam,T.,1992
Gen 165 rRNA
OSPA
Jednokrokové,
a sonda
Nested
Luft.B.J.1995
OSPA L5,R5
Jednokroková,
a sonda
Manak,M.M.,1997
PlasmidováDNA
OSPA gen
OSPB
16S
BBUTP-BBURT
Luft,B.LI992
Plasmidová DNA,
OSPA sen
Specifičnost
primeru pouŽívaných
pro identifikacipůvodcelymeskéborreliózy nemusíbý
vždyjednoznačnájakjsme si ověřili testovánímpoužívaných
primeru s DNA z narostlé
kultury sbírkoqýchkmenůrťuných bakterií.(viz tabu|ka3)
Tabulka 3.: Specifita primerů používanýchpro identifikaci DNA Borrelia burgďorferi
sensu lato .Srovnání s DNA některých sbírkoých mikroorganismů.
IZo-LovANÁ
Sbírkový
mikrooragnismus
Bacillus cereus
DNA
Označení
kmene )*
Bc 8/78
C orynebacterium murium Cor 35170
Enterobacter aerogens
Ae I/43
Escherichia coli
EcKI4Il59
Klebsiella ozaenae
Klo 1/35
Micrococcus luteus
M 8/58
Proteus hauseri
PrK4157
Proteus morpanii
Prm ll37
Proteus mirabilis
Pnni26177
P seudomonas aerupinosa Ps 3 7 1 65
Serratia marcescens
Sr 20161
Staphylococcus aureus
Mau ll45
Pozitivita primerů při uvedenéteplotě
anilingu )**
LD LD OSPA VS BG
bb.cc
47 57 57
47 47
37t55
T
+
+
+
-J-
+
+
-r
+
t
Ť
T
Yersinia enterocolitica
Candida albicans
Borrelia burgdorferis.s.
Borrelia garinii
Borrelia afzelii
Y 1164
55/79
B31 )x
M 1 9 2) x
Kc90 )x
++
++
-t--t-
++
++
-r-T-
-r-r
++
++
++
!
++
TT
)*
CNCTC {zechoslovak National Collection of Type Cultures,SZÚ Praha
)x
Nrírodníreferenční
laboratořpro lymeskouborreliózu 'CEM,SZÚ Praha
)**
Uveden nánevprimerua teplotaannealing,druhého
kroku po|ymerénové
řetězové
reakce
Ze získanýchvýsledkůje zřejmé,Že k identifikacije nutnépoužítvždy
několik primerus
odlišnýmisekvencemi.Dáleje nutnédůsledněpoužívatupozitivníchvzorkůdalšíidentiťrkaci
produktu pomocídruhověspecifickéhybridizační
sondy,případně
restrikčníana|ýzunebo
sekvenciproduktu.Vtabulcenejsouuvedenyvšechnyzkoušené
organismyjejichžDNA byla
vyšetřenaspeciťrckými
primery pto Borrelia burgdorferi.Jednáseo následující
druhy:
Legionellapneumophila,Anaplasmaphagocytophilum,Human
herpesI simplexvirus,Human
herpes2 simplexvirus a Human herpes4 lymphocryptovirus,
Human herpes5
cytomegalovirusaDNA 30 izolátů blíženeidentifikovanýchbakterií,kterékontaminovaly
vzorky při kultivaci boneliív BSK mediu z lidskych i zvířecíchvzorků.Vyšetření
výše
uvedenýchdruhůDNA bylo při použitípollžívartých
primeru k prukazu agenslymeské
bonelliózy negativní.MnoŽství
primerupoužívaných
k identifikaciDNA Borrelia burgdorferi
sensulatoje od počátkupoužívéní
tétometodyvelkémnožství.
JednokrokováPCR
umožňujespolehlivěidentifikovat40-400fentogramů
DNA Borrelia burgdorferisensulato
v 1 mililitru tělnítekutinynebove vyšetřované
tkani. Při obsahu20 fentogramů
chromozomové
DNA v jednéburíceBB, můžeme
při ideálníchpodmínkáchptokazat2-21
spirochét.CitlivějšínestedPCR _ prokažei menšímnožství
DNA v materiálu.Zvyšovéni
citlivosti přinášívzrtsta1ící
riziko kontaminace.U nestedPCR dochazík manipulaci
s namnoŽeným
produktemanziko kontaminaceje již reálnéatatometodase neupouživápři
vyšetřovrání
většíhomnoŽstvívzorků.JednokrokováPCR bezpečně
odhalípatogenní
spirochetémie,
navícje možné
u nípoužívat
účinnou
ochranupřed kontaminací- systému
cÍlÍTy-over
prevence.Pro zqýšeníspecifityje možnLedále
použíthorky start.Přesto,Žepoěet
je úlymeskéborrelióry v těle velmi nízkýv porovnánís jinými bakteriálnímii
organismů
virovými původcionemocněnístačí
jednokrokováPCR prokrízatpůvodceBB v materiálu.
Yiztabulka 4.
Tabulka 4: Množstvíspirochétve vyšetřovaném
materiálu nemocného
jedince a
nejnižší
početpro úspěšnou
izolaci DNA(podle B.L.Schmidta (1))
Druh materiálu
Infikovanéklíště
Krevníplasma
Krevní plasma u pacientůs erythema
migrarrÁ
Moč
Výpotek kloubní
Mozkomíšnímok
Plná krev
Krevní sérum
Početspirochét
v materiálu
vml
4 500-55000/iedinci
Pod 50
Nejnižšípočet
spirochét
pro izolaci DNA v ml
4000
10
t0
Pod 50
50
5000-10000
r-20
Pod 50
Pod 50
?(10)
10
10
100
50
Výs1edky
Vybraný panel vyšetření
Výsledkempokusůa srovnánís dostatečným
počtemvyšetření
bylqýběr postupupři
vyšetření
vzorkůna přítomnostDNA původcelymeskéborreliózy.Byl tak vytvořenpanelpro
vyšetření,který
byl z většíčástipřevzatdo akreditované
metody.DNA se získáváz citrátové
krevníplasmy(krvinkyv EDTě rychle hemolysují),nativníhomozkomíšního
moku'nativďho
qipotku aztkání ve fuziologickémroiloku.Yzorky se nesmízmrazovatmimoumístění
tkáně
v tekutémdusíku.Seruma močse k vyšetření
nepoužívá.Tekutiny
se koncentrujícentrifugací
do 6000 g.K přípravěse používákomečních
kitůpro izolaci geonomové
DNA.Komerčně
vyraběný mix pro amplifikaci v systému horký start obsahuje l0 Yoternp|átllizo|ovaného
ze
vzotku,vyvéženémnožstvídvou páru primeru Jedna sada primeru je
odvozena z l6SrRNA
genu geonomovéDNA a druhá sadaz OSPA genu plastidovéDNA
Bonelia
burgdorferz.Rozpustidlemje qýhradně sterilní destilovaná voda pro parenterální
použítí,bez
pyrogenů.Reakční
směs o objemu nejméně25 mikrolitru je amplifiko vána v35 cyklech
programu v teplotnímprofilu pro multiplex PCR. 10 % produktu je použito
pro elektro forézu
v T,5 %oagarczovém ge|u zapřítomnosti velikostního DNA markeru.Po obarveníje
produkt
odečítanproti pozitivním a negativníkontrole,velikostnímu markeru . Pozitivní
vzorky jsou
verifikovríny hybridizací nebo sekvenací.
Yýsledky vyšetření materiálu podle druhu
Během retrospektivnístudie jsme měli možnost zptacovávatmateriál zasí|anýzoddělení
infekčních,neurologických, revmatologických a dermatologických, menšíčástvzorků i
z jinýchpracovišť.Většinazaslanýchvzorků byla od pacientůs chronickou LB.Akutní
případy jsme měli většinouz vlastních odběru, zřadpracovníků Státníhozdravotrrího
ústavu
velmi častos prokazatelným erythema migrans. Pruměrnéročníprocento pozitivity krevní
plasmy bylo 9,8 oÁ (8,9-12,ÍYov posledníchtřech letech).U mozkomíšníhomoku
bylo
průměrné procento 8,0 "Á (s rozptylem 4,4-12 % v jednotliqych letech).Nejvyššíprocento
pozitivních vzorků z pruměru posledních tří let bylo zjištěno u kloubních výpotků23,l%o(od'
I4,| do 36 Yo rcčníchpruměru).Poměrná pozitivita u jednotliých druhůodpovídá
qýsledkům jiných laboratoří používajících
diagnostiku PCR pro identifikaci DNA Borrelia
burgdorfer'.Nižšíprocento pozitivních vysledků u mozkomíšďho moku je dáno tím,že
zptacovávámepÍevážněvzorky z chronických, častojiž \éčenýchpřípadů.Vesledovaném
období jsme neměli možnostvyšetřit biopsie kůžezakutních případůs prťrkaznýmerythema
migrans, kde bywá pozitivitanejvyšší' nad 50 %.(2).
vyvoj procenta pozitivity během posledníchčtyřlet
o roku 1998jsme zjistili kolísrín
počtupozitivníchqfsledkův jednotlivýchletech.Počtyjsme
v^áhli k pocT vyšetřenýchvzorkůa dostalitak ročníprocentopozitivity vyšetření
v naší
laboratoři.od roku 1998narůstalo
procentopozitivity z IO na 17 Yov roce 2000.od tohoto
vrcholu docházíkminimu v roce 2003(7 %),letosji žv pwétřetinězaznamenáváme
mírný
niírustpočtupozitir,níchvzorků.(Viz graf č.1)
Graf č.1
Ročníprůměrpozltiviý PcR LB v procent.ech
18
--
16
\
./
14
\.
\
12
10
I
6
4
2
0
rok 1998
rok í999
rok2000
rok2001
rok2}O2
rok2003
rok2oo4
Při porormánípoměrného
počtuvyšetřenýchdruhůklinickéhomateriálu v posledníchletech
zjišt'ujemežepoětypozitivníchvzorků v krvi ztlstávajípraktickystejné,počty
pozitivních
kloubníchvýpotkuse rychle zvyšují.Naopakpočtypozitivďch mozkomíšních
mokůse
dlouhodoběsniŽují.Tomůžesouvisetse změnoupočtujednotliqich genospeciésBB ve
zkoumanýchoblastech. Niz grafč.2)
Graf č.2
Graf č.2
40
35
30
25
20
15
10
5
0
rok rok rok rok
2001 2002 2003 2A04
Při měsíčnímrozboru počtupozitivních vzorků během roku jsme pravidelně zjišťovalidvě
ročnímaxima. Jedno bylo na jďe,většinou v březnu aŽ květnu a pak na podzim v záňíaž
ffjnu. Několikrát nás překvapil vysoký početpozitivních vzorků v lednu někteých
roků.Situacese opakovala a tak jsme tomuto zjištěnívěnovali většípozornost.V jednotliých
letech od roku l998 jsme stanovili ročnípruměr pozitivity a ten porovnali s počtypozitivních
v měsíci lednu všech sledovaných let od roku 1998 do roku 2004.v letech 2OO0,200I a2OO3
jsme zjistili procento pozitivity v lednu vyššínežje pruměr pro celý rok. Přitom v letech 2001
a2003 byla tato odchylka velmi vyrazná.Yiz gtaf ě.3
Graf č.3
Lednové hodnoty pozitiviý v oÁa ročniprůměry
25
20
15
10
5
0
ffiffi %leden
.p*.p"1p".p.1.*"tpŤ
Zajíma|onás co ovlivnilo lednovó narusty pozitivity.Hledali jsme spojitost s oslabením
organismuběhemprobíhající
epidemie,nebo souvislosts wý,raznýmpodchlazením
organismu
a vývořenímpodmínekpro množení
bonelíí(rustovéoptimumje u BB 32-33C)v akrálních
částechtě14nebov podchlazenýchkloubech. Dalšípodezřeníbylo na užívání|éku
snižujících
obranyschopnost
organismu(krtikoidy q) aumožňující
vycestováníspirochétdo
tělníchtekutin.Sledovalijsme i moŽnost,Že
borrelieperzistující
v organismučlověka
prodělávajísvůjŽivotnícyklus a v určitýchobdobíse v organismupomnožíapŤipravítak
podmínkypro následnoumoŽnostopuštění
hostitelského
organismuv rrámcidalšíhoživotního
cyklu.
Lednovéodchylky pozitivníchýs|edků proti ročnímuprůměru
14
12
10
8
6
4
2
0
€
4
rok
í998
rok
't999
rok
2000
rok
2002
rok
2003
rok
2004
Citace:
1. Schmidt,B.L.,PCR in LaboratoryDiagnosisof HumanBorrelia burgdorferi
Infections,Clinical Mikrobiology Reviews,Ian.I 997,p.I 85-201
2. lnformacez EUCALB 1997-2004EuropeanUnion ConcertedAction on Lyme
Borreliosis
http:i/vie.dis.strath.ac.ulďvie/LymeEU/diagnosis_clinical-features-pcr.html