Žádost o udělení povolení k uvádění geneticky modifikovaného lnu

Signature Not Verified
Digitally signed by
Ing. Karel Bláha,
CSc.
Date: 2012.01.02
13:35:21 CET
Žádost o udělení povolení
k uvádění geneticky modifikovaného lnu FAD2-i do životního prostředí
ČÁST A
VŠEOBECNÉ NÁLEŽITOSTI ŽÁDOSTI
Datum podání
21.12.2011
1. Název projektu
Transformace lnu pro RNA inaktivaci FAD2 desaturázy
2. Žadatel
(+) Výpis z obchodního rejstříku (ne starší než 3 měsíce), případně úředně ověřená kopie
živnostenského listu nebo zakladatelského dokumentu
2. 1. Jméno, popřípadě jména, a příjmení (obchodní firma), je-li žadatelem fyzická osoba
oprávněná k podnikání – nevztahuje se
2. 2. Název (obchodní firma) a právní forma, je-li žadatelem právnická osoba
AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby s.r.o., společnost s ručením omezeným
2. 3. Státní občanství (u fyzických osob) – nevztahuje se
2. 4. Sídlo (u právnických osob), nebo místo podnikání a adresa bydliště (u fyzických osob)
Zemědělská 2520/16, Šumperk, PSČ 787 01
2. 5. IČO: 48392952
2. 6. DIČ: CZ48392952
2. 7. Předmět činnosti (podle zakladatelského dokumentu nebo zápisu v obchodním rejstříku)
- výzkum a vývoj v oblasti přírodních a technických věd nebo společenských věd
- testování, měření, analýzy
- činnost technických poradců v oblasti chemie, potravinářství, zemědělství a lesnictví
- pořádání odborných kurzů, školení a jiných vzdělávacích akcí včetně lektorské činnosti
2. 8. Jméno, popřípadě jména, a příjmení osob, které tvoří statutární orgán žadatele, s
uvedením způsobu, jímž jménem žadatele jednají (u právnických osob).
Ing. Miroslav Hochman – jednatel, ředitel
Ing. Zdeněk Muroň - jednatel
Ing. Prokop Šmirous, CSc. - jednatel
Jednatelé jsou oprávněni jednat jménem společnosti samostatně.
3. Odborný poradce
(+) Výpis z evidence Rejstříku trestů, popřípadě jiný odpovídající doklad podle zvláštního
právního předpisu. 7)
Viz oprávnění udělené MŽP Jihočeské univerzitě, Biologické fakultě č.j. 60955/ENV/06
1
(+) Doklad o dosaženém vzdělání a délce odborné praxe (bylo- li odborné vzdělání nebo
praxe získáno v jiném členském státě státním příslušníkem členského státu, rozumí se tímto
dokladem rozhodnutí o uznání odborné kvalifikace podle zvláštního právního předpisu 7))
Viz oprávnění udělené MŽP Jihočeské univerzitě, Biologické fakultě č.j. 60955/ENV/06
3. 1. Jméno, popřípadě jména, příjmení, titul
RNDr. Slavomír Rakouský, CSc.
3. 2. Povolání, případně zaměstnavatel a funkce
Odborný asistent, Zdravotně sociální fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích
3. 3. Vzdělání
Vysokoškolské – absolvent Přírodovědecké fakulty UK, Praha
3. 4. Odborné kurzy
Národní a mezinárodní projekty zaměřené na bezpečnost nakládání s GMO (UNEP – GEF,
SIGMEA, AIGM – ESF)
3. 5. Dosavadní praxe
30 let vědecké práce, převážně na GM rostlinách, lektor řady odborných kurzů o GMO,
tajemník České komise transgenoze rostlin, poté člen České komise pro nakládání s GMO,
účastník mezinárodních programů GMO
3. 6. Adresa bydliště
Vodňanská 9, 370 11 České Budějovice
3. 7. Kontaktní adresa
Branišovská 31, 370 05 Č. Budějovice
3. 8. Telefon
387 775 537
3. 9. Fax
387 775 537
3. 10. E-mail
[email protected]
4. Charakteristika nakládání s geneticky modifikovaným organismem
4. 1. Účel uvádění do životního prostředí, popřípadě název a označení projektu,
zadavatel (účel uvádění včetně všech potenciálních přínosů pro životní prostředí, které
je možné očekávat)
V rámci řešení projektu MŠMT 2B06087 (uzavřené nakládání - viz Oznámení č.j.
13527/ENV/10, Rozhodnutí č.j. 48336/ENV/10) byly získány regeneranty olejného lnu
nesoucí úsek plasmidu pPCV812i/35S/FAD2i/35S/GUS (FAD2-i GUS), ve kterém je obsažen
segment DNA FAD2-i, což je upravený segment genu FAD2 pro desaturázu mastných
kyselin, jenž byl uzpůsoben tak, aby byla potlačena exprese původního FAD2 genu rostliny.
Další materiály budou postupně vznikat opakováním transformačních pokusů za použití téhož
plasmidu v rámci uzavřeného nakládání neboť se předpokládá vliv místa inzerce transgenu na
jeho expresi. Předpokládá se, že v důsledku exprese tohoto segmentu genu dojde
k posttranskripčnímu umlčování genu pro FAD2 desaturázu rostlinám lnu vlastní. Díky
nepřítomnosti nebo silné redukci funkčních molekul FAD2 desaturázy bude snížena nebo
zcela zastavena konverze kyseliny olejové v linolovou a tím dojde ke zvýšení obsahu kyseliny
olejové v semenném oleji. Obsah mastných kyselin podléhá silně vlivům prostředí a výsledky
získané ze skleníkových podmínek jsou zkreslené, proto je nutné k získání objektivních
výsledků pěstovat rostliny v polních podmínkách.
2
4. 2. Předpokládaný výsledek uvádění do životního prostředí
V polních pokusech bude prověřována hypotéza, že přítomnost konstruktu v buňkách
vyvíjejících se embryí zvýší obsah kyseliny olejové v semenném oleji. Současně bude ověřen
pravidelný přenos konstruktu do vyšších generací a stabilita exprese transgenu FAD2-i.
5. Doba uvádění do životního prostředí
5. 1. Celková doba uvádění geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí
a datum jeho předpokládaného zahájení
Datum předpokládaného zahájení: 2. polovina dubna 2012 (po obdržení kladného rozhodnutí)
Předpokládaná celková doba nakládání: 7 let (poslední monitoring do 30.06.2018).
5. 2. Závazný harmonogram (rozpis jednotlivých dílčích etap, datum jejich
předpokládaného zahájení a doba jejich trvání)
2012-2014 – namnožení semenného materiálu, sledování pravidelnosti přenosu transgenu do
dalších generací, sledování exprese transgenu v následujících generacích.
2013-2018 – sledování vlivu přítomnosti konstruktu na morfologické znaky a biologické
charakteristiky u transformantů. Výhledově budou začleňována i potomstva rostlin získaných
transformací nově vyvíjenými konstrukty na bázi FAD2-i, případně dalších FAD genů a jejich
kombinací
6. Plánuje žadatel uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do životního
prostředí v některém členském státě Evropských společenství nebo mimo jeho území?
NE
7. Podal žadatel žádost pro uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do
životního prostředí v některém členském státě Evropských společenství ?
NE
8. Podal žadatel žádost pro uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do
životního prostředí nebo do oběhu mimo území Evropských společenství ?
NE
9. Hodnocení rizika uvádění geneticky modifikovaného organismu do životního
prostředí
(+) Hodnocení rizika podle § 7 zákona včetně dokumentace výsledků předchozích uvádění
do životního prostředí, především z hlediska různého rozsahu činnosti a různých přijímajících
ekosystémů
9. 1. Shrnutí hodnocení rizika
Uvádění výše popsaného geneticky modifikovaného lnu do životního prostředí odpovídá
činnostem bez škodlivého působení na zdraví člověka a zvířat, na životní prostředí nebo
biologickou rozmanitost (viz Hodnocení rizik v příloze 3).
Pěstování geneticky modifikovaného lnu s upraveným genem pro FAD2 desaturázu je
prakticky bez rizika, neboť použité konstrukty neobsahují geny, které by samy o sobě nebo
zprostředkovaně mohly způsobit toxicitu rostlin nebo jejich částí, nezpůsobují zvýšenou
vitalitu lnu v přírodním prostřední (ověřeno ve skleníkových pokusech firmy Agritec v rámci
uzavřeného nakládání), nehrozí únik lnu do životního prostředí (při běžné agrotechnice není
len schopen přežívat na poli v následujícím roce po výsevu, není schopen přežívat a množit se
v přírodě bez pomoci člověka, nemá v přírodě ČR příbuzný druh, který by byl schopen
přijmout jeho pyl - viz Tejklová a Seidenglanz (2004) a Hodnocení rizik (příloha 3).
3
ČÁST C
DALŠÍ NÁLEŽITOSTI ŽÁDOSTI PRO GENETICKY MODIFIKOVANÉ VYŠŠÍ
ROSTLINY
1. Údaje o příjemci, případně (kde je to aplikovatelné) rodičovském organismu
1. 1. České a latinské rodové a druhové jméno organismu, s přesným určením kultivaru
(odrůdy, linie, hybridu)
K transformaci byly použity linie olejného lnu (Linum usitatissimum L.) AGT 583/05 a AGT
952/04. První je klasického typu (s vysokým obsahem kyseliny alfa-linolenové), s vysokou
odolností k houbovým chorobám, s nižším výnosem semene, druhá je nízkolinolenová –
s obsahem kyseliny alfa-linolenové kolem 5 %, s vyšším výnosem semene, středně odolná
k houbovým chorobám.
1. 2. Původ (sbírka, sbírkové číslo, dodavatel)
Jmenované linie použité k transformaci vznikly v rámci řešení projektu NAZV QE1123 a
výzkumného záměru MŠMT MSM2678424601 ve firmách AGRITEC, výzkum, šlechtění a
služby s.r.o. a Agritec Plant Research s.r.o. Transformace byly provedeny v rámci řešení
projektu MŠMT 2B06087 ve firmě Agritec Plant Research s.r.o. v rámci uzavřeného
nakládání.
Body 1. 3. -1. 9. viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07. Pro
úplnost a přehlednost uvedeny i zde:
1. 3. Rozmnožování
1. 3. 1. Způsob rozmnožování
Len setý (n=15) se rozmnožuje výhradně semeny. Kulturní len má homostylické květy a je
samosprašný. K opylení dochází v době otevírání květů. Pyl lnu je relativně těžký, proto je
špatně přenosný větrem. Většina pylu se v kvetoucích porostech nachází do výše 50 cm. V
přirozených podmínkách frekvence cizosprášení u přadného lnu představuje jen zlomek
procenta, u olejného typu 1,38-0,16 % ve vzdálenosti 0-4,4 m (Tejklová, 2005). Cizosprášení
lnu je zprostředkováno hmyzem (třásněnky, včely), ale zejména přímým kontaktem květů
sousedních rostlin. Při sprášení cizím pylem u květů již opylených vlastním pylem vzniká od
2 do 55 % hybridů, v závislosti na době přenesení pylu. Plodem je pětipouzdrá tobolka, ve
které může být až 10 semen. Zpravidla je však v tobolce 7 až 8 vyvinutých semen (Gill,
1987). U kulturního lnu zůstávají zralé tobolky uzavřené, takže nedochází k samovolnému
výdrolu semen. Zralé semeno je 4-6 mm dlouhé a 2,4 až 3 mm široké. Hmotnost 1000 semen
je podle genotypu 4-13 g (Muir a Westcott, 2003). Semeno nemá dormanci a klíčí při
dostatku vláhy ihned po sklizni.
1. 3. 2. Specifické faktory, které ovlivňují rozmnožování (pokud existují)
Teplota a vlhkost vzduchu výrazně ovlivňují násadu semen u lnu. Kvetení začíná na teplotě a
vlhkosti vzduchu mezi 6.-7. hodinou ranní a ve slunečném počasí již kolem 10. - 11. hodiny
opadají korunní plátky květů (Muir a Westcott, 2003). V deštivém počasí se květy rozvíjejí
pomalu až do druhého dne. Neopylená blizna zasychá na přímém slunci během několika
desítek minut. Pyl přenesený na bliznu klíčí a prorůstá relativně rychle. Již za 2,5-3 hodiny po
opylení dosahuje pylová láčka semeníku (Jevminov, 1963) a za 4 hodiny proběhne oplození.
Doba kvetení porostu lnu nepřesahuje 2 týdny. Při teplotě 23-26 0C a slunečním svitu zůstává
pyl životný po dobu 3 dnů, při 15-16 0C ve stínu až 8 dní.
4
1. 3. 3. Generační doba
Přadný len v závislosti na odrůdě má vegetační dobu 85-120 dnů. Vegetační doba olejných
typů se pohybuje mezi 110 až 120 dny po vzejití (tj. celkově až 135 dnů od výsevu). V našich
podmínkách vytváří len jedinou generaci do roka.
1. 3. 4. Sexuální kompatibilita s jinými pěstovanými nebo planými druhy a rozšíření těchto
kompatibilních druhů v ČR
V našich podmínkách se nevyskytuje žádný z pěstovaných či planě rostoucích druhů, se
kterým by docházelo k samovolnému křížení s kulturním lnem L. usitatissimum L. Druh
Linum angustifolium, ze kterého pravděpodobně L. usitatissimum pochází (Gill, 1987) a se
kterým se kulturní len může úspěšně křížit, se ve volné přírodě na našem území nevyskytuje.
1. 4. Schopnost přežití
1. 4. 1. Schopnost vytvářet struktury, které umožňují přežití nebo dormanci, a délka možného
přežívání nebo dormance,
Len setý je jednoletou rostlinou bylinného typu. Nevytváří žádné vegetativní orgány
umožňující jeho šíření v přírodě. Jedinými částmi rostliny, které umožňují jeho šíření a
přežití, jsou semena. Semena lnu si zachovávají v příznivých podmínkách (sucho, teploty
nepřekračující 20oC) klíčivost i deset let, avšak již od třetího roku klíčivost klesá, takže
v desátém roce po sklizni je již téměř nulová. Semena lnu nemají dormanci, příležitostně
uvolněná dozrálá semena začínají klíčit po kontaktu s půdou při dostatku vláhy již po dvou
dnech. Vzhledem ke klimatickým podmínkám v ČR vyklíčí semena z výdrolu během
podzimu. Rostliny lnu nestačí před zimním obdobím dosáhnout zralosti a po nástupu mrazů
hynou. V našich pěstebních podmínkách nebyly zaznamenány případy přežití nevyklíčených
semen z výdrolu do jara následujícího roku. Experimenty firmy Agritec s kompostováním
plev s klíčivými semeny lnu dokázaly, že v následujícím roce po založení kompostu se již
neobjevily žádné klíční rostliny. Tzv. „ozimé lny“, seté v první polovině září, přežívají
v závislosti na klimatických podmínkách v určitém procentu zimu ve fázi stromečku. Semena
tohoto typu lnu rovněž nemají dormanci (jde zde o vyšší odolnost k nízkým teplotám) a
semena z výdrolu klíčí ihned, jakmile získají dostatek vláhy. Vzhledem k ranější sklizni
ozimého lnu (kolem poloviny července), oproti lnu setému na jaře, mají semena dostatek
možností vzejít a většinou se před nástupem mrazů dostávají do fáze rychlého růstu. V této
fázi zimu nepřežijí. Část semen může klíčit později (při pozdějším uvolnění z tobolek ze
stonků po sklizni nebo při výjimečně dlouhém období bez srážek), potom mohou rostliny ve
fázi stromečku přežít do nové vegetace. Při dodržení běžné agrotechniky (podzimní orba,
jarní příprava půdy) však ani tyto rostliny nejsou schopny přežít. Při ponechání pozemku po
sklizni ladem nejsou schopny rostliny ozimého lnu konkurovat plevelům a nejpozději během
následujícího roku odumírají. Jen výjimečně méně oslabené rostliny dozrávají a poskytují
klíčivá semena. Ta už však mají na pozemku zarostlém plevelem možnost klíčit velmi
omezenou a možnost růstu prakticky žádnou. Pěstování tohoto typu lnu v ČR není zavedeno,
neboť jeho odolnost ke chladu není ve většině let dostačující a vymrzáním dochází ke značým
ztrátám.
1. 4. 2. Další specifické faktory umožňující přežití, pokud existují
Neexistují.
1. 5. Šíření rostliny v prostředí
1. 5. 1. Způsob a rozsah šíření (pokles množství pylu a semen v závislosti na vzdálenosti od
zdroje, síly a směru větru, toku vody a dalších faktorech)
Pyl lnu je relativně těžký, a proto je špatně přenosný větrem. Cizosprášení u lnu je
zprostředkováno hmyzem, hlavně včelami, čmeláky a třásněnkami, nebo přímým kontaktem
5
květů sousedních rostlin. V rámci řešení projektů NAZV QC 1362 (2001-2004) a MŠMT
1M06030 bylo sledováno šíření pylu v porostu lnu. Cizosprášení bylo prokázáno do
vzdálenosti 440 cm od zdroje pylu a to ve frekvenci 0,16% (Tejklová, 2005).
Semena lnu se nešíří vzduchem ani vodou. Semeny lnu se živí některé druhy zpěvného
ptactva: pěnkava obecná, pěnkava jikavec, zvonohlík zahradní, zvonek zelený, stehlík obecný,
čížek lesní, konopka obecná, čečetka zimní, hýl rudý, hýl obecný, dlask tlustozobý, strnad
obecný, strnad zahradní, strnad luční, vrabec domácí, vrabec polní, bělořit šedý, pěvuška
modrá, červenka obecná, rehek domácí, rehek zahradní, bramborníček hnědý, bramborníček
černohlavý, linduška luční, skřivan polní a chocholouš obecný (dle sdělení Moravského
ornitologického spolku). Kromě zvonka zeleného však všechny ostatní druhy dávají přednost
semenům jiných druhů rostlin, kterých nacházejí v době dozrávání lnu dostatek. Zvonci
vyzobávají semena z tobolek lnu v období zelené až plné zralosti, což odpovídá konci
července až polovině srpna. Mimo toto období nemají ptáci k semenům přístup.
1. 5. 2. Specifické faktory ovlivňující šíření (pokud existují)
Šíření lnu je omezováno v důsledku působení těchto faktorů: teplota a vlhkost vyvolávající
klíčení semen před příchodem zimy, vlhkost a houbové choroby ničící nevyklíčená nebo
klíčící semena i rostliny, výskyt konkurenčních rostlin (plevelů).
1. 6. Zeměpisné rozšíření rostliny
Ve světě se len pěstuje na ploše asi 2 mil. hektarů v oblastech mírného a subtropického pásma
(především Čína, Indie, Rusko, Holandsko, Belgie, Francie, Kanada, USA). V našich
podmínkách se pěstuje olejný len zejména v bramborářských, kukuřičných a řepařských
oblastech.
1. 7. Pokud není rostlina v ČR pěstována, popis habitu včetně informace o přirozených
konzumentech, patogenech, parazitech, konkurentech a symbiontech
Nevztahuje se – len je v ČR pěstován
1. 8. Další možné relevantní interakce rostliny s jinými organismy v ekosystému, ve
kterém se rostlina obvykle pěstuje
V našich podmínkách oblasti pěstování kulturního lnu nedosahují oblastí výskytu planých
druhů lnu. Plané druhy lnu vyskytující se v ČR navíc mají (až na jednu výjimku) jiný počet
chromozómů, takže nehrozí vznik mezidruhových hybridů. Len žlutý (Linum flavum L.),
mající stejný počet chromozómů (n=15), se v pokusech provedených ve firmě Agritec se lnem
setým nekřížil ani při umělém opylování (Tejklová a Seidenglanz, 2004).
1. 9. Účinky na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí.
- toxicita
- alergennost
- jiné (jednoznačně identifikujte)
Len je v naší oblasti tradiční zemědělskou plodinou, Odedávna byl používán nejen
k technickým účelům (především pro obsah vlákna ve stonku v textilní výrobě, pro obsah
oleje v semeni k výrobě nátěrových hmot, apod.), ale také ke konzumaci (čerstvě vylisovaný
olej, celé semeno) nebo jako součást krmiv pro domácí zvířata (celé semeno nebo pokrutiny)
(Muir a Westcott, 2003). Nebyly u něho pozorovány toxické účinky na lidi nebo zvířata, i
když v malé míře obsahuje některé antinutriční látky (kyanogenní glykosidy). Pro silný
laxativní účinek slizů pokrývajících semeno nebyl len nikdy používán v množství, při kterém
by se toxické účinky způsobené uvolňováním kyanovodíku z kyanogenních glykosidů mohly
za určitých podmínek projevit. Semeno nebo pokrutiny z lněného semene nebyly bez tepelné
6
úpravy zkrmovány přežvýkavci, v jejichž bachoru jsou příhodné podmínky k uvolňování
kyanovodíku při požití syrových semen.
Z historie nejsou známy případy vyvolání alergických reakcí při kontaktu s rostlinami lnu
nebo s produkty z lněného vlákna nebo semene ani při konzumaci produktů z lněného
semene. Lněné semeno je dokonce využíváno k výrobě léčiv a kosmetických přípravků.
2. Údaje o genetické modifikaci a geneticky modifikované vyšší rostlině
2. 1. České a latinské rodové a druhové jméno geneticky modifikované vyšší rostliny, s
přesným určením kultivaru (odrůdy, linie, hybridu)
Len setý (Linum usitatissimum L.), semenná potomstva rostlin pěstovaných v GM skleníku
(viz Oznámení č.j. 13527/ENV/10 a Rozhodnutí č.j. 48336/ENV/10) vzniklá samosprášením
regenerantů po transformacích šlechtitelských linií AGT 583/05 a AGT 952/04. Předpokládá
se, že v následujících letech budou do polních pokusů zařazována semenná potomstva dalších
transformatů získaných výše uvedeným konstruktem po transformacích obou linií, jakož i
dalších šlechtitelských linií a odrůd lnu. Výhledově budou začleňována i potomstva rostlin
získaných transformací nově vyvíjenými konstrukty na bázi FAD2-i. O případném zařazení
nových transgenních materiálů lnu bude vždy ministerstvo životního prostředí informováno
s předstihem před jejich uvedením do životního prostředí.
2. 2. Popis a charakteristika dědičných vlastností, které byly vloženy nebo změněny,
včetně signálních a selekčních genů a předchozích modifikací a popis jejich
fenotypových projevů
Obě šlechtitelské linie AGT 583/05 a AGT 952/04 byly transformovány bakteriemi kmene
GV3101 Agrobacterium tumefaciens nesoucími plazmidový konstrukt
pPCV812i/35S/FAD2i/35S/GUS (FAD2-i GUS).
Transformované genotypy obsahují selekční gen hpt pro odolnost k hygromycinu, reportérový
gen pro beta-glukuronidázu (GUS, uidA) a expresní kazetu se segmentem genu lnu pro FAD2
desaturázu, spacerem a segmentem DNA komplementárním k segmentu daného genu.
Transformace byla provedena k uplatnění systému RNA interference k blokaci translace
mRNA pro FAD2 desaturázu na základě posttranskripčního umlčování genu („gene
silencing“). Gen pro FAD2 desaturázu se exprimuje v buňkách vyvíjejícího se embrya lnu.
Nejprve dochází k transkripci, kdy se DNA přepisuje se do mRNA. V transformovaných
buňkách se současně přepisuje upravený segment FAD2-i. Příslušná mRNA pro FAD2-i
vytvoří díky navržené sekvenci bází vlásenku, která je rozpoznána jako dvouřetězcová RNA a
štěpena na fragmenty. Fragmenty se rozpadnou na jednotlivá vlákna a ta pak nasedají na
komplementární úseky mRNA pro FAD2. Tato nyní dvouvláknová místa jsou rovněž štěpena
a mRNA pro FAD2 je rozdělena na fragmenty, podle kterých nemůže dojít k translaci a proto
ani nevzniká molekula bílkoviny enzymu FAD2 desaturázy. Enzym FAD2 desaturáza se
normálně účastní konverze kyseliny olejové na kyselinu linolovou, ke které tedy v důsledku
transformace nemůže dojít. Rostliny lnu nesoucí funkční konstrukt FAD2-i mají v závislosti
ještě i na dalších faktorech zvýšený obsah kyseliny olejové, což je cílem transformace. Gen
hpt ani gen pro GUS na vlastnosti lnu vliv nemají, jak bylo ověřeno v rámci uzavřeného
nakládání firmy Agritec (č.j. 13527/ENV/10, rozhodnutí č.j. 48336/ENV/10) i polních pokusů
s GM lnem Agritec (č.j. 1010/OER/GMO/01).
2. 3. Typ genetické modifikace
2. 3. 1. Vnesení cizorodého dědičného materiálu
ANO – v obou případech
2. 3. 2. Vynětí části dědičného materiálu
NE – v obou případech
7
2. 3. 3. Kombinace vynětí a vnesení dědičného materiálu
NE – v obou případech
2. 3. 4. Buněčná fúze
NE – v obou případech
2. 3. 5. Jiné (jednoznačně identifikujte)
NE – v obou případech
2. 4. Vlastnosti a původ použitého vektoru (pokud byl vektor při genetické modifikaci
použit) (+ mapa vektoru)
K transformaci lnu byl použit konstrukt připravený ve firmě Agritec s.r.o. Šumperk ve
spolupráci s Ústavem Biochemie a Mikrobiologie, VŠCHT v Praze v r. 2009.
Příprava konstruktu:
1) vektor: plasmid pPCV812i (Koncz et al. 1994). Tento plasmid nese gen pro ßglukuronidasu s intronem a byl použit jako výchozí vektor.
2) příprava plasmidu pPCV812i/35S: do plasmidu pPCV812i byl vnesen CaMV 35S
promotor o velikosti 810 bp a to do míst EcoRI/BamHI. (Surá et al. 2004).
3) příprava plasmidu pPCV812i/35S/FAD2i/35S/GUS: Do pPCV812i/35S byla do místa
EcoRI vnesena (Ústav Biochemie a Mikrobiologie, VŠCHT v Praze, 2009) kazeta
35S/FAD2i o velikosti 1600 bp (Agritec s.r.o. Šumperk).
Genetická mapa plasmidu 2PCV812i/35S/FAD2i/35/GUS (FAD2-i GUS):
HindIII
Hind III
Eco RI
35S
FAD2
FAD2
Sma I
Eco RI
 kazeta
35S FAD2-i
8
Plasmidový konstrukt obsahuje expresní kazetu FAD2-i (promotor CaMV 35S, segment DNA
pro FAD2 desaturázu, spacer, invertovaný segment DNA), promotor CaMV 35S z plazmidu
pAN4, hpt gen z E. coli, gen pro -glukuronidázu s intronem z E. coli (K12). K přenosu
plasmidového konstruktu byl použit kmen GV3101 Agrobacterium tumefaciens, který
neobsahuje gen pro rezistenci k hygromycinu, což umožnilo použít gen hpt přítomný
v konstruktu k selekci transformantů. Vektorové bakterie A. tumefaciens i transformované
rostliny je možné identifikovat na základě průkazu přítomnosti transgenu hpt nebo gus
v jejich DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a jejich modifikací. Pozn. FAD2
gen je lnu vlastní, a proto sekvenci FAD2-i nelze použít pro detekci inzertu běžnou PCR.
Detekce PCR GUS pPCV812i/35S/FAD2i/35S/GUS:
Pár primerů produkující část genu pro ß-glukuronidasu s intronem:
primer 1 (5‘-3´)
ACGTCCTGTAGAAACCCCAA
primer 2 (5‘-3‘)
CCCGCTTCGAAACCAATGCC
produkt: 544 bp
Alternativně: jiný pár primerů (mimo intron, Horáček, Agritec, leden 2011):
primer 1 (5‘-3´) GGC ACA GCA CAT CAA AGA GA
primer 2 (5‘-3´) CTG ATA GCG CGT GAC AAA AA
produkt: 211 bp
Detekce nested-PCR transgenu hpt:
picA1: 5´-ATGCGCARGAGGCTCGTCTTCGAG
picA2: 5´-GACGCAACGCATCCTCGATCAGCT
specificky amplifikují oblast 568 bp (Kononov et al. 1997), pro druhý běh nested-PCR
picA3: 5´-GAGGATGGTTGTGTCTATCGCG
picA4: 5´-CTTCTTGTGCCAATAATTGCCG
velikost produktu: 283 bp
2. 5. Údaje o každé části úseku DNA, který byl vnesen do organismu příjemce (pokud
genetická modifikace zahrnuje vnesení dědičného materiálu)
2. 5. 1. Původ (české a latinské rodové a druhové jméno dárcovského organismu přesným
určením kultivaru -odrůdy, rasy, plemene, linie, formy, hybridu, kmene, patovaru)
Název
Inserty
plasmidu
pPCV812i/35 hpt
S/FAD2i/35S
/GUS =
uidA=
FAD2-i GUS GUS
FAD2i
Zdroj
Funkce
Reference
E. coli
rezistence rostlin k
hygromycinu
KONCZ et al. (1994)
E. coli (K12)
signální gen pro
GUS = betaglukuronidázu
gene silencing
mRNA pro FAD2
desaturázu
konstitutivní
promotor
selektovatelný gen
pro rezistenci
vektorových bakterií
k ampicilinu
VANCANNEYT
et al. (1990)
Linum
usitatissimum L.
CaMV 35S virus žilkové
mozaiky květáku
AmpR
E. coli
9
Genbank acc No.
DQ222824,
nepublikováno
KONCZ et al. (1994)
KONCZ et al. (1994)
Údaje o dárcovských organizmech pro jednotlivé dílčí konstrukty jsou uvedeny v bodě 2.4.
Segment genu pro FAD2 byl uměle syntetizován.
2. 5. 2. Funkční charakteristika
viz bod 2.5
2. 5. 3. Velikost
Nebyla dosud zjišťována, bude předmětem analýz linií GM lnu, jež budou vybírány na
základě výsledků polních testů
2. 5. 4. Poloha - pokud byl integrován
Poloha vneseného inzertu nebyla zatím pro jednotlivé linie transformantů zjišťována – viz
bod 2.5.3.
2. 5. 5. Sekvence
Nebyly dosud pro jednotlivé linie transformantů zjišťovány – viz bod 2.5.3.
2. 6. Pokud se jedná o vynětí části dědičného materiálu (deleci), velikost a funkce
vyňatého úseku
Nejedná se o delece dědičného materiálu
2. 7. Popis metody použité pro genetickou modifikaci
Transformace byly provedeny pomocí vektorových bakterií Agrobacterium tumefaciens
modifikovanou kokultivační technikou dle Donga a McHughena (1993).
2. 8. Jestliže je příjemce nebo rodičovský organismus lesní dřevina, popište způsoby
šíření a specifické faktory ovlivňující šíření
Není
2. 9. Umístění vloženého dědičného materiálu v rostlinné buňce (vložen do chromozómů,
chloroplastů nebo v neintegrované formě)
Podle stávajících výsledků genetických a molekulárních analýz se předpokládá vložení DNA
do chromozómů.
2. 10. Počet kopií vloženého dědičného materiálu
Nebyl dosud studován. Bude předmětem analýz u jedinců vybraných na základě jejich
úspěšnosti v polních testech.
2. 11. Stabilita vloženého dědičného materiálu a stabilita jeho umístění
Byla prokázána přítomnost genu uidA pro GUS v explantátech v in vitro kultuře,
v regenerovaných rostlinách ve fázi stromečku a v regenerovaných rostlinách ve fázi kvetení
jednak barevnou reakcí se substrátem, jednak metodou PCR. Dále byl prokázán přenos po
autogamii rostlin do generace T2, v níž byla pomocí RT-PCR prokázána cDNA pro FAD2 u
kontrolní varianty, zatímco v regenerantech vykazujících barevnou reakci GUS se substrátem
(transformovaných regenerantech) nebyla cDNA pro FAD2 prokázána, což svědčí o RNA
umlčování genu pro FAD2 díky vnesenému konstruktu.
2. 12. Metody stanovení uvedených údajů
K důkazu přenosu plasmidu do lnu je používan test na GUS (na aktivitu beta-glukuronidázy),
metoda PCR ke stanovení genů hpt a uidA a metoda RT PCR ke stanovení RNA-i blokace
exprese FAD2.
10
2. 13. Údaje o expresi vloženého dědičného materiálu
2. 13. 1. Místo, kde dochází v rostlině k expresi vložených genů (např. kořeny, lodyha, listy,
pyl apod.)
Exprese genu uidA pro GUS byla zatím prokázána v listech a stoncích. RNA-i blokace byla
prokázána v embryích v kotyledonárním stádiu.
2. 13. 2. Změny exprese v závislosti na životním cyklu rostliny
Nebyly zatím sledovány – viz bod 4.2. Část A
2. 13. 3. Stabilita exprese
Nebyla zatím sledována – viz bod 4.2. Část A
2. 13. 4. Metody použité pro charakterizaci exprese
RT PCR
2. 14. Údaje umožňující jednoznačnou identifikaci geneticky modifikované vyšší rostliny
2. 14. 1. Popis části změněné DNA
Viz body 2.4 a 2.5
2. 14. 2. Metody detekce a identifikace geneticky modifikované vyšší rostliny a jejich ověřená
metodika
Detekce PCR plasmidu pPCV812i/35S/FAD2i/35S/GUS:
Pár primerů produkující část genu pro GUS (uidA) s intronem:
primer 1 (5‘-3´)
ACGTCCTGTAGAAACCCCAA
primer 2 (5‘-3‘)
CCCGCTTCGAAACCAATGCC
velikost produktu: 544 bp
Jiný pár primerů (mimo intron, Horáček, Agritec, leden 2011):
primer 1 (5‘-3´) GGCACAGCACATCAAAGAGA
primer 2 (5‘-3´) CTGATAGCGCGTGACAAAAA
velikost produktu: 211 bp
2. 15. Chování vložených genů
2. 15. 1. Při hybridizaci se stejným druhem
Na základě literárních údajů i výsledků předchozích polních studií firmy Agritec s GM lnem
prováděných podle rozhodnutí MŽP (č.j. 1010/OER/GMO/01, č.j. 20955/ENV/07) se vložené
transgeny chovají jako dominantní geny a jsou přenášeny mendelististicky na potomstvo.
Přestože nejsou očekávány odchylky od tohoto pravidla, bude v pokusech chování vložených
cílových genů studováno.
Len je samosprašnou rostlinou s velmi nízkým podílem cizosprášení (0-1,38 % podle
vzdálenosti). Předpokládá se, že při případné hybridizaci GM linie s jedinci jiné odrůdy budou
transgeny přenášeny a exprimovány stejným způsobem jako při samosprášení.
2. 15. 2. Při hybridizaci se vzdálenými druhy
Hybridizace s Linum flavum, jediným druhem z rodu Linum vyskytujícím se přirozeně v ČR
se stejným počtem chromozómů jako u L. usitatissimum byla neúspěšná.
11
2. 16. Jednoznačné údaje o tom, v čem se geneticky modifikované vyšší rostliny liší od
příjemce nebo rodičovského organismu
- způsob a rychlost rozmnožování: Některé z regenerantů byly částečně sterilní, jiné se od
netransformované kontroly ve skleníkových podmínkách nelišily.
- šíření v prostředí: nepředpokládá se odlišnost
- schopnost přežití: nepředpokládá se odlišnost
- účinky na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí: nepředpokládá se odlišnost
- jiné (upřesněte)
2. 17. Fenotypová stabilita geneticky modifikované vyšší rostliny
Bude studována v rámci uvádění transformovaného lnu do životního prostředí.
2. 18. Jakákoliv změna schopnosti geneticky modifikované vyšší rostliny přenášet
genetický materiál na jiné organismy v důsledku genetické modifikace
Nepředpokládá se.
2. 19. Informace o každém možném škodlivém účinku geneticky modifikované vyšší
rostliny na zdraví lidí způsobeném genetickou modifikací
Nepředpokládají se žádné škodlivé účinky GM lnu v důsledku genetické modifikace. Při
transformaci FAD2-i je do lnu vnášen segment vlastního genu, jedná se zde o umlčení genu
rostlině vlastního. Použitý selekční gen hpt pro odolnost k hygromycinu nemá na zdraví lidí
žádné nepříznivé účinky. Gen hpt byl zařazen vědeckým výborem Evropského úřadu pro
bezpečnost potravin (EFSA) do nejnižší kategorie selektovatelných genů kódujících odolnost
k antibiotikům s žádnými či velmi nízkými potenciálními riziky na zdraví člověka a zvířat
(EFSA 2004).
2. 20. Údaje o bezpečnosti geneticky modifikované vyšší rostliny pro zdraví zvířat,
zejména s ohledem na jakékoliv škodlivé účinky způsobené genetickou modifikací,
pokud má být geneticky modifikované vyšší rostliny použito jako krmivo
Předmětem plánovaných polních pokusů s GM liniemi lnu není jeho potravinářské či
krmivářské užití. Po vyhodnocení pokusů a sklizni budou zbytky rostlin zničeny. Odpad po
odsemeňování bude spálen na vyhrazeném místě nebo zkompostován na kompostu pro tento
účel zřízeném (viz žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07, rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07).
2. 21. Mechanismus interakce mezi geneticky modifikovanou vyšší rostlinou a cílovým
organismem, pokud cílový organismus existuje
Cílový organismus neexistuje.
2. 22. Možné změny v interakcích geneticky modifikované vyšší rostliny s necílovými
organismy plynoucí z genetické modifikace
Nepředpokládají se.
2. 23. Možné interakce geneticky modifikované vyšší rostliny s neživými složkami
životního prostředí
Nepředpokládají se.
3. Údaje o množství geneticky modifikovaných vyšších rostlin, které má být použito, a o
celkové rozloze pozemků
3. 1. Přibližné množství geneticky modifikovaných vyšších rostlin, které má být uváděno
do životního prostředí
12
V polních podmínkách bude hodnocen materiál T2 generace získaný z transformačních
pokusů v rámci uzavřeného nakládání. V jednotlivých letech se bude počet rostlin uváděných
do životního prostředí lišit v závislosti na výsledcích skleníkových pokusů. Průměrně se bude
jednat řádově o tisíce až desítky tisíc rostlin lnu pěstovaných v polních pokusech ročně. V r.
2012 bude vyseto cca 30 linií odvozených ze tří původních regenerantů (počet záleží na
dozrání semen regenerantů ve skleníku). Materiál bude v tomto roce v polních podmínkách
především namnožen pro další analýzy. V dalších letech bude hodnocen vybraný materiál
v T3 a vyšších generací a půjde o desítky tisíc rostlin.
3. 2. Celková rozloha plochy, na které mají být geneticky modifikované vyšší rostliny
pěstovány
V polních podmínkách bude hodnocen materiál jednak nově získaný z pokusů v rámci
uzavřeného nakládání, v dalších letech také z předchozích polních pokusů pro opakované
pozorování. V jednotlivých letech se bude plocha, na které bude GM len uváděn do životního
prostředí, lišit v závislosti na výsledcích skleníkových a polních pokusů. Průměrně se bude
jednat o plochu kolem 100 m2 (včetně cestiček mezi parcelkami). Tyto pokusy budou
přiřazeny ke stávajícím polním pokusům s GM lnem uváděným do životního prostředí na
základě Žádosti č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07.
4. Pracoviště a pozemky, na kterých bude uvádění do životního prostředí probíhat
(+) Havarijní plán podle § 20 zákona – příloha č. 1
(+) Provozní řád pracoviště podle přílohy č. 4 zákona – příloha č. 2
(+) Kopie katastrálních map s vyznačením pozemku a přehledná mapka s vyznačením plodin,
pěstovaných na okolních pozemcích – příloha č. 2 Havarijního plánu (přílohy č. 1); přehledná
mapka s vyznačením místa pěstování GM lnu a plodin pěstovaných na okolních pozemcích
bude MŽP poskytována vždy v předstihu před výsevem.
4. 1. Účel uvádění do životního prostředí (včetně všech relevantních informací
dostupných v této fázi), jako například agronomické účely, zkoušky hybridizace, změna
schopností přežití nebo šíření, zjišťování účinků na cílové nebo necílové organismy
V potomstvech regenerantů budou v polních podmínkách vyhledávány odchylné typy (díky
somaklonální variabilitě nebo vlivem místa inzerce konstruktu do chromozómu) od výchozího
materiálu použitého pro transformace zejména s ohledem na jejich možné šlechtitelské
využití. Ve sklizených semenech bude sledován obsah mastných kyselin v semenném oleji.
Bude také sledován přenos transgenu do dalších generací a exprese transgenu v polních
podmínkách. Dále bude sledován případný vliv transgenu na morfologické znaky a biologické
charakteristiky.
4. 2. Umístění pozemku
4. 2. 1. Kraj
Olomoucký
4. 2. 2. Obec
Vikýřovice
4. 2. 3. Název katastrálního území a parcelní číslo
V katastrálním území Vikýřovice bude v jednotlivých letech vyséván GM len v osevním
sledu na parcelách č. 1670/1-9, 1712/1-24 a 1715/1-15 (viz příloha č. 2a-2c Havarijního plánu
– přílohy č. 1 Žádosti). Firma AGRITEC s.r.o. si tento pozemek pronajímá od uživatele
pozemku - Výzkumného ústavu pro chov skotu (VÚCHS) Rapotín. Parcelky s GMO jsou
13
umisťovány podle osevního plánu, a proto se v jednotlivých letech budou nacházet na
různých místech pozemku, vždy v bloku ostatních pokusných parcel firmy AGRITEC s.r.o.
Pro každý rok bude vytvořen plánek umístění polního pokusu (kopie katastrální mapy, do
které bude zakresleno umístění parcely s GMO) – pro rok 2012 viz příloha 3 Havarijního
plánu.
4. 2. 4. Identifikační číslo půdního bloku a případně dílu půdního bloku, je-li pozemek
předmětem evidence využití zemědělské půdy podle zvláštního právního předpisu 10)
Nevztahuje se.
4. 3. Velikost pozemku
4. 3. 1. Poloha pěstování geneticky modifikované vyšší rostliny na pozemku a její velikost
(m2) (plánek ve vhodném měřítku)
Plocha osetá GM lnem bude v jednotlivých letech přibližně 10-100 m2 (v závislosti na
množství vyprodukovaného osiva). Plánek pro r. 2012 je přikládán formou přílohy č. 3
k Havarijnímu plánu (příloha č. 1 Žádosti), v dalších letech bude každoročně zasílán na MŽP.
VÚCHS bez problémů umožňuje vstup na pozemky odpovědným pracovníkům firmy
Agritec, kteří provádějí kontroly pozemků v následujících letech po pěstování transgenního
materiálu.
4. 3. 2. Velikost (m2) a způsob využití izolačního pásma kolem plochy pěstování geneticky
modifikované vyšší rostliny (vyznačit v plánku)
Kolem plochy pěstování GM lnu bude cesta nejméně 3 m široká, na které budou likvidovány
veškeré rostliny lnu vzešlé z případně vytroušených semen při setí.
4. 4. Využití okolních pozemků
Pozemek, který je firmou Agritec využíván k polním pokusům, je rozdělen do pěti honů.
Jeden hon je vždy obsazen pokusy firmy Agritec (hrách, peluška, vikve, lupina, bob koňský,
netransgenní a transgenní len), ostatní čtyři pak slouží VÚCHS Rapotín k pěstování polních
plodin (obiloviny, ozimá řepka, svazenka atd., nikdy len). Blok pokusů se každoročně
posouvá v souladu s osevním plánem, takže se na stejný hon dostává až po pěti letech.
Uvedené parcely se nacházejí mezi poměrně málo frekventovanou silnicí 3. třídy a železniční
tratí vedoucí na zvýšeném náspu. Pozemky za železniční tratí jsou využívány jako pastviny.
K pěstování GM rostlin lnu budou vybírány plochy u železniční trati ve vzdálenosti min. 300
m od ostatních porostů lnu (izolační vzdálenost je větší než vzdálenost daná směrnicemi
ÚKZÚZ pro len, přitom naše normy jsou v tomto ohledu jedny z nejpřísnějších).
Body 4.5.1. – 4.5.5. viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07.
Pro úplnost a přehlednost uvedeny i zde:
4. 5. Vzdálenost pozemku od specifických území (v metrech nebo kilometrech)
4. 5. 1. Zvláště chráněná území 11)
Pozemek je vzdálen 2 km vzdušnou čarou od okraje Chráněné krajinné oblasti Jeseníky a 8
km vzdušnou čarou od nejbližší národní přírodní rezervace Rašeliniště na Skřítku.
4. 5. 2. Ochranná pásma vodních zdrojů
V blízkosti pěstební lokality se nenachází.
14
4. 5. 3. Vodní toky, vodní nádrže
Nejbližší vodní tok je vzdálen cca. 500 metrů od lokality. Kontaminace vodních ploch GM
rostlinami lnu ani jejich částmi není aktuální.
4. 5. 4. Území obhospodařovaná v ekologickém zemědělství 12)
V blízkém okolí se nenachází žádná plocha obhospodařovaná v režimu ekologického
zemědělství.
4. 5. 5. Jiné
Nevztahuje se
4. 6. Způsob zabezpečení pozemku
4. 6. 1. Zabezpečení pozemku proti neoprávněným osobám
Pokusné plochy firmy AGRITEC s.r.o. jsou označeny tabulemi a je do nich přístup
nepovolaných osob zakázán. Vlastní parcelka pro pěstování GM rostlin lnu bude dále
označena tabulemi „Pokusný pozemek firmy Agritec s.r.o. Vstup zakázán! Geneticky
modifikovaný len“ a výstražnou značkou Biohazard.
Body 4.6.2. – 4.8. viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07. Pro
úplnost a přehlednost uvedeny i zde:
4. 6. 2. Zabezpečení pozemku proti zvěři
Na pozemek občas vstupují zajíci, srnci a divoká prasata. Vzhledem k tomu, že v blízkém
okolí se vyskytují pokusy a ochranné pásy oseté hrachem, nevěnují zvířata lnu pozornost.
V nutných případech jsou zvířata z pozemku odháněna.
4. 6. 3. Zabezpečení pozemku proti splachu
Pozemek se nachází na rovině, kde prakticky nehrozí nebezpečí splachu.
4. 7. Popis ekosystému v místě pozemku
Typ pěstební oblasti: bramborářská, subtyp bramborářsko-pšeničný
4. 7. 1. Typ půdy
hnědá půda, ilimerizovaná, oglejená, středně těžká
zásoba živin P, K, Mg: střední
4. 7. 2. Vodní režim včetně zavlažování
Pozemek není zavlažován.
4. 7. 3. Klimatické podmínky
nadmořská výška: 315 m
roční teplotní normál: 7,45oC
roční srážkový normál: 693 mm
4. 7. 4. Flóra včetně zemědělských plodin
V nejbližším okolí lokality se vyskytuje flóra a fauna typická pro zemědělskou oblast
bramborářského typu, bramborářsko-pšeničného subtypu. Běžně jsou zastoupeny zejména
plevele jako pýr plazivý, ježatka kuří noha, rozrazil rolní, zemědým lékařský, penízek rolní,
violka trojbarevná rolní, hluchavka nachová, konopice rolní, heřmánkovec přímořský, svízel
přítula, pcháč rolní, přeslička rolní. V blízkosti pokusů firmy Agritec není zásadně vyséván
len (dohoda s VÚCHS).
15
4. 7. 5. Fauna včetně hospodářských a migrujících zvířat
Z hmyzu jsou zastoupeny zejména slunéčko sedmitečné, dřepčík, včela medonosná, střevlíci.
Lokalitu navštěvují běžní obratlovci jako hraboši, myši, zajíci, srnci, prase divoké, bažanti,
koroptve, křepelky a drobné ptactvo. Porosty lnu bývají navštěvovány zejména zvonkem
zeleným. Jde o druh obecně rozšířený, v posledních letech přemnožený a působící značné
škody na porostech lnu, řepky a dalších zemědělských plodin. Ze savců připadá jako
konzument lněného semene v úvahu hraboš polní. Na pozemek nevstupují žádná hospodářská
zvířata.
4. 8. Přítomnost planých nebo pěstovaných sexuálně kompatibilních rostlin na pozemku
a v jeho okolí
Na pozemku ani v jeho okolí nejsou přítomny žádné sexuálně kompatibilní rostliny.
4. 9. Relevantní údaje týkající se předchozích případů uvádění do životního prostředí
stejné geneticky modifikované vyšší rostliny, pokud existují, zejména ve vztahu k
možným vlivům na zdraví lidí a zvířat, životní prostředí a biologickou rozmanitost
V letech 1999-2011 byly na stejném pozemku stejnou firmou uváděny do životního prostředí
lny po inzerční mutagenezi, po transformaci genem bar (nefunkčním, jak se později ukázalo),
lny po transformaci s cílem zvýšení schopnosti odčerpávat těžké kovy z půdy a lny
s konstruktem s předpokládaným pozitivním účinkem na odolnost lnu ke škůdcům a
chorobám. Žádný vliv na zdraví lidí ani zvířat, na životní prostředí nebo biologickou
rozmanitost nebyl zjištěn.
5. Popis nakládání s geneticky modifikovanými vyššími rostlinami
5. 1. Nakládání s geneticky modifikovanými vyššími rostlinami před jejich uváděním do
životního prostředí (uzavřené nakládání, přeprava)
Materiál uváděný do životního prostředí byl ve firmě Agritec Plant Research s.r.o. získán
transformací výše zmíněných linií lnu uvedeným konstruktem (oznámení č.j. 13527/ENV/10
a rozhodnutí č.j. 48336/ENV/10 o uzavřeném nakládání).
Explantáty jsou udržovány ve sterilních in vitro podmínkách (v uzavřených kultivačních
baňkách), manipulace s explantáty probíhá v laminárním boxu typu Biohazard, zakořeněné
prýty (rostliny T1 generace) jsou dopěstovány do semen (T2 generace) v kontejnerech ve
fytotronu nebo ve skleníku určených pro práci s GMO. Získaná semena jsou uložena do sáčků
a do uzavíratelných boxů (plastové truhlíky RM Plastig s.r.o., kat č. 074 nebo 075 - bez
otvorů, opatřené víky z dřevotřísky). Je-li z regenerantů sklizeno příliš malé množství semen
pro následný výsev na pole, je osivo v následujícím roce přemnoženo opět ve skleníku
(sklizena semena T3 generace).
5. 2. Postup, kterým budou geneticky modifikované vyšší rostliny uváděny do životního
prostředí
Výsev, ošetřování během vegetace a sklizeň GM lnu bude prováděna stejným způsobem jako
u netransformovaného lnu. Výsev potomstev jednotlivých rostlin bude prováděn ručně, výsev
většího množství osiv (do řádků dlouhých 1m) bude prováděn bezezbytkovým secím strojem
Hege.
Během vegetace budou jednotlivé testované linie odvozené z regenerantů sledovány a
porovnávány s výchozími odrůdami, které budou současně vysety jako kontroly. Budou
vyhledávány a označovány genotypy s morfologickými a dalšími odchylkami od výchozích
materiálů.
16
Z potomstev jednotlivých regenerovaných rostlin budou odebrány vzorky k analýzám. Bude
v nich prokazována přítomnost vneseného konstruktu. Ve zralých semenech bude stanovován
obsah mastných kyselin.
O průběhu pozorování a provádění pokusu budou vedeny záznamy. Rovněž bude provedena
fotodokumentace pokusu.
Sklizeň bude prováděna ručně vytrháním rostlin, jen v případě zkoušek výnosu na parcelách
velkých 10m2 bude sklizeň prováděna maloparcelkovým kombajnem.
Body 5.3. – 5.4. a 5.6., 5.8., 5.10. - viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j.
20955/ENV/07. Pro úplnost a přehlednost uvedeny i zde:
5. 3. Přibližný počet geneticky modifikovaných vyšších rostlin na m2
Na 1 m2 se vysévá kolem 1000 semen, do zralosti dorůstá zpravidla kolem 700 rostlin.
5. 4. Příprava a způsob úpravy pozemku před pěstováním geneticky modifikovaných
vyšších rostlin
Běžný postup jako pro geneticky nemodifikovaný len. Podle aktuálního stavu půdy na
pozemcích budou použity: podmítka, středně hluboká orba, smykování, vláčení, kypření
kombinátorem, základní hnojení NPK.
5. 5. Způsob dopravy geneticky modifikovaných vyšších rostlin
Osiva i sklizené rostliny a semena budou převážena vlastními vozidly firmy Agritec
v uzavřeném prostoru. Na pole budou semena určená k výsevu přepravována v sáčcích nebo
ve skleničkách používaných k setí strojem Hege, uložených v umělohmotných přepravkách
bez otvorů (např. Manutan CL605005) s víkem. Přepravky budou v úložném prostoru vozidla
zabaleny do plachet z hustě tkané látky nebo husté síťoviny, která zabrání případnému
vysypání semen do přepravního prostoru vozu.
Sklizené rostliny a sklizená semena (po kombajnové sklizni) budou uloženy do pytlů z husté
síťoviny a převezeny v uzavřeném voze zabalené v plachtě z hustě tkané látky nebo husté
síťoviny, která zabrání případnému vysypání semen uvolněných z rostlin do přepravního
prostoru vozu, do areálu firmy k dalšímu zpracování.
5. 6. Způsob ochrany zdraví pracovníků v průběhu nakládání s geneticky
modifikovanými vyššími rostlinami v souladu se zvláštními právními předpisy9)
Materiál, se kterým bude nakládáno, nepodléhá žádným zvláštním právním předpisům. Proto
při nakládání budou používány běžné ochranné pomůcky odpovídající charakteru dané
činnosti.
5. 7. Způsob kultivace geneticky modifikovaných vyšších rostlin na pozemku
Přibližně v polovině dubna každého roku (podle klimatických podmínek) budou vyseta
semena genotypů vybraných pro hodnocení v polních podmínkách. V souladu
s agrotechnikou běžně používanou ve lnu budou porosty ošetřovány proti škůdcům
(dřepčíkům) a proti plevelům (jednoděložným, dvouděložným).
Výsev semen sklizených z regenerantů T1 bude proveden ručně, v případě většího množství
osiva v T2 a vyšších generacích bude k výsevu využito bezezbytkových secích strojů typu
Hege. Výsev bude prováděn proškolenými pracovníky za přítomnosti zodpovědné osoby dr.
E. Tejklové. Po výsevu bude technika zkontrolována, případné zbytky semen budou
odstraněny, obaly použité pro převoz a výsev osiva budou vyčištěny, zbytky semen budou
převezeny na pracoviště k likvidaci zkompostováním na kompostu pro GMO, viz Oznámení
č.j. 5603/ENV/06 a Rozhodnutí č.j. 5603/ENV/06 o uzavřeném nakládání a Žádost č.j. MŽP
20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07 o uvádění GM lnu do životního prostředí.
17
Ošetřování rostlin během vegetace bude stejné jako u netransgenního lnu: ošetření proti
dřepčíkům (Vaztak aj.) v době vzcházení, postemergentní ošetření proti plevelům
jednoděložným (Pantera aj.) a dvouděložným (Glean 75 WG, Basagran aj.).
5. 8. Způsob sklizně geneticky modifikovaných vyšších rostlin
Po dozrání budou rostliny sklizeny ručně vytrháním nebo v případě hodnocení ve zkouškách
výkonu budou sklizeny maloparcelkovým kombajnem.
5. 9. Popis dalšího nakládání s geneticky modifikovanými vyššími rostlinami
GM len bude zpracováván odděleně od ostatního, netransgenního materiálu.
Sklizené rostliny a semena budou uloženy na půdě snopkárny, resp. ve stodole na sušce, které
jsou uzamčeny a kam mají přístup pouze oprávněné osoby proškolené v nakládání s GMO, k
dosušení. Vybrané rostliny (s detekovanými odchylkami) budou rozborovány a jednotlivě
ručně odsemeněny. Ostatní rostliny budou odsemeněny po svazcích na drhlíku. Semena
budou uložena na určeném místě na půdě technohaly do doby, než budou podrobena dalším
analýzám, případně připravena pro výsev.
Pracoviště bude vždy dokonale uklizeno od zbytků rostlin a semen smetením a vysátím.
Odpad bude na vyhrazeném místě zkompostován – viz Oznámení č.j. 5603/ENV/06 a
Rozhodnutí č.j. 5603/ENV/06 o uzavřeném nakládání.
Semena budou dále hodnocena a použita k testům v rámci uzavřeného nakládání: Hodnocení
barvy, velikosti, zdravotního stavu, semen, stanovení obsahu oleje, obsahu mastných kyselin,
výsev na plata ve skleníku pro nakládání s GMO pro získání vzorků na PCR analýzy apod.
5. 10. Termín a způsob vyhodnocení uvádění geneticky modifikovaných vyšších rostlin
do životního prostředí
Každoročně budou semena vysévána ve druhé polovině dubna (v závislosti na klimatických
podmínkách), rostliny budou sklízeny během srpna (v závislosti na klimatických
podmínkách), sklizené rostliny a semena zpracována během října až prosince, případně během
prvních měsíců následujícícho roku. Každoročně bude v lednu na MŽP ČR podáváno hlášení
v souladu se zákonem č. 78/2004 Sb. o nakládání s GMO.
Body 6.1. – 6.5.4. a 6.5.6. – 6.7. – viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j.
20955/ENV/07. Pro úplnost a přehlednost uvedeny i zde:
6. Opatření na ochranu zdraví lidí, zvířat, životního prostředí a biologické rozmanitosti
a nakládání s odpadem
6. 1. Vzdálenost plochy pěstování geneticky modifikovaných vyšších rostlin od planých
nebo pěstovaných sexuálně kompatibilních druhů rostlin
Bude dodržována minimální vzdálenost 300 m od ploch osetých netransgenním lnem.
6. 2. Opatření pro snížení nebo zabránění úletu pylu nebo semen, jsou-li použita
Mimo výše uvedených, nejsou potřebná žádná další opatření.
6. 3. Popis metod pro úpravu pozemku po skončení pokusu
Po sklizni je pozemek ponechán do vzejití semen z výdrolu bez ošetření, vzešlé rostliny jsou
ošetřeny totálním herbicidem (Roundup), další postup podle běžné agrotechniky.
6. 4. Popis metod pro dopravu a zpracování geneticky modifikovaných vyšších rostlin
Celé sklizené rostliny budou uloženy do pytlů z husté síťoviny a převezeny v uzavřeném voze
zabalené v plachtě z hustě tkané látky nebo husté síťoviny, která zabrání případnému
vysypání semen uvolněných z rostlin do přepravního prostoru vozu, do areálu firmy, kde
18
budou uloženy na dosušení v určených půdních prostorách. Sklizená semena (po kombajnové
sklizni) budou přepravována v pytlích z husté síťoviny uložených v umělohmotných
přepravkách s víkem (bez otvorů – např. Manutan CL605005). Rostliny a semena budou dále
využity k účelům uvedeným v bodě 5.9.
6. 5. Kontroly a monitorování výskytu a účinků geneticky modifikovaných vyšších
rostlin
6. 5. 1. Metody zjišťování přítomnosti geneticky modifikovaných vyšších rostlin a
monitorování jejich účinků na ekosystém
Monitoring v průběhu vegetačního období:
Plán monitoringu je založen na závěrech hodnocení rizika GM lnu vůči životnímu prostředí a
má za cíl včasné zjištění a identifikaci jevů, které by měly očekávaný i neočekávaný vliv v
důsledku uvedení GM rostlin lnu do životního prostředí. Bylo prokázáno, že při dodržení
minimální vzdálenosti pěstování GM lnu od ostatních ploch lnu nehrozí žádné riziko jeho
úniku do životního prostředí. Přesto však byla přijata opatření k omezení potenciálních rizik
nakládání na nejmenší možnou míru. Vlastní pozemek a jeho nebližší okolí budou v průběhu
vegetační doby pravidelně kontrolovány min. 1 x za 2 týdny zodpovědným pracovníkem,
případně doprovázeným vedoucím oddělení či osobou odborného poradce. O výsledku
provedené kontroly budou prováděny písemné záznamy. Zaznamenávány budou veškeré
skutečnosti týkající se nejen samotného porostu GM lnu, ale i možných vlivů na okolí a na
sousední plochy s dalšími plodinami. Na základě běžné zemědělské praxe budou
zaznamenávány obecné charakteristiky plodiny (UPOV), vztahující se k agronomickým
vlastnostem GM linií lnu, jako odolnost k patogenům, napadení škůdci atd. Záznamníky
budou doplňovány o nové údaje během celého období uvádění GM lnu do životního prostředí.
Chování geneticky modifikovaných linií lnu bude porovnáváno s chováním odrůd příjemce,
které budou pěstovány paralelně na stejném pokusném místě jako srovnávací kontrola.
Posklizňový monitoring pokusných ploch:
Po sklizni bude ve dvoutýdenních intervalech monitorován výskyt rostlin lnu vzešlých
z výdrolu. Vzešlé rostliny budou zlikvidovány ošetřením totálním herbicidem Roundup.
V průběhu následující sezóny bude monitorován výskyt rostlin lnu v následné plodině
pěstované na pokusné ploše a v jejím nejbližším okolí. V případě výskytu budou rostliny lnu
vytrhány, při masovějším výskytu budou zlikvidovány aplikací selektivního herbicidu dle
typu následné plodiny. Dosud ale takové případy nejsou známy ani ze zemědělské praxe
v ČR, ani z pokusů s transgenním lnem dosud prováděných v rámci uvádění do životního
prostředí firmou Agritec s.r.o. Při běžné agrotechnice nepřežívá len přes zimu ani ve
vegetativním stadiu, ani ve formě semen. Očekává se, že pěstování GM lnu za účelem
realizace polních pokusů nebude mít žádný jiný vliv na ekosystém, než jaký má netransgenní
len.
Konstrukty, respektive transgeny vnesené do rostlin jsou detekovatelné PCR metodou za
použití příslušných primerů (viz bod 2.4. této žádosti).
6. 5. 2. Specificita metod identifikace geneticky modifikovaných vyšších rostlin a odlišení
geneticky modifikovaných rostlin od dárcovského organismu, příjemce, případně
rodičovského organismu, citlivost a spolehlivost těchto metod
Konstrukt, respektive transgen GUS nebo hpt vnesený do rostlin je detekovatelný PCR
metodou za použití příslušných primerů (viz bod 2.4. této žádosti). Tato metoda je dostatečně
citlivá a spolehlivá k odlišení GM linií od konvenčních materiálů lnu.
19
6. 5. 3. Techniky (metody) detekce přenosu vloženého dědičného materiálu na další
organismy
Přestože otázka případného přenosu dědičného materiálu ze lnu na další organizmy není
aktuální, lze použít k detekci transgenů stejné metody jako jsou uvedené v bodu 2.4.
6. 5. 4. Plocha, na které bude monitoring prováděn
Monitorován bude pozemek, na kterém byl pěstován geneticky modifikovaný len a blízké
okolí tohoto pozemku (do 20 m od pozemku).
6. 5. 5. Doba trvání monitoringu
Na plochách osetých GM lnem v jednotlivých letech bude monitoring prováděn vždy od
sklizně do jara následujícího roku. Po ukončení plánovaných pokusů s GM lnem (r. 2017)
bude prováděn monitoring poslední pěstební plochy na jaře r. 2018.
6. 5. 6. Četnost monitoringu
Monitoring bude prováděn:
- po sklizni opakovaně po 2 týdnech do vzejití rostlin z výdrolu (ke vzejití rostlin je
potřeba dostatečná vláha – závisí na počasí)
- cca 2 týdny po ošetření vzešlých rostlin totálním herbicidem
- v následujícím roce na jaře, asi 3 týdny po zasetí následné plodiny
Opatření přijatá pro zakládání, udržování a sklizeň polních pokusů i pro další nakládání se
sklizeným geneticky modifikovaným lnem odpovídají pravidlům předběžné opatrnosti a
jejich dodržování plně zajistí bezpečnost při uvádění jmenovaného geneticky modifikovaného
lnu do životního prostředí.
6. 6. Nakládání s odpady včetně likvidace geneticky modifikovaných, vyšších rostlin
Odpady po sklizni (vymlácené stonky a strniště po kombajnové sklizni, ulomené větve a
tobolky po ruční sklizni), které zůstanou na poli, budou spolu s klíčními rostlinami z výdrolu
ošetřeny totálním herbicidem Roundup a později zaorány. Zbytky z rostlin sklízených ručně
po odsemenění a odpad po čištění semen po kombajnové sklizni budou kompostovány na
určeném kompostu pro GMO.
6. 7. Shrnutí ochranných opatření
Opatření přijatá pro zakládání, udržování a sklizeň polních pokusů i pro další nakládání se
sklizeným geneticky modifikovaným lnem odpovídají pravidlům předběžné opatrnosti a
jejich dodržování plně zajistí bezpečnost při uvádění jmenovaného geneticky modifikovaného
lnu do životního prostředí.
7. Shrnutí informací o plánovaných polních pokusech prováděných za účelem získání
nových údajů o vlivu uvádění geneticky modifikovaných vyšších rostlin do životního
prostředí na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí
Plánované pokusy nebudou prováděny za tímto účelem. Případné nové poznatky získané
v průběhu pěstování a monitoringu GM lnu budou bezprostředně předávány Ministerstvu
životního prostředí, případně dalším subjektům dle zákona.
Použitá literatura
De Jong, J., Mertens, M. M. J., Rademaker, W. (1994): Stable expression of the GUS reporter
gene in Chrysanthenum depends on binary plasmid T-DNA. Plant Cell Reports 14: 59-64
Dong, J.-Z., McHughen, A. (1993): An improved procedure for production of transgenic flax
plants using Agrobacterium tumefaciens. – Plant Sci. 88: 61-71,.
20
EFSA (2004): Opinion of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on the use
of antibiotic resistance genes as marker genes in genetically modified plants. The EFSA J.
48: 1-18.
Fischer, U., Kuhlmann, M., Pecinka, A., Schmidt, R., Mette, M.F., 2008. Local DNA features
affect RNAdirected transcriptional gene silencing and DNA methylation. Plant Journal 53,
1-10.
Gilissen, L.J.W., Metz, P.L.J., Stiekema, W.J., Nap, J.P. (1998): Biosafety of E.coli glucuronidase (GUS) in plants. Transgenic Research 7: 157-163.
Heilersig, B., Loonen, A., Janssen, E.M., Wolters, A.M.A., Visser, R.G.F., 2006. Efficiency
of transcriptional gene silencing of GBSSI in potato depends on the promoter region that is
used in an inverted repeat. Mol. Genet. Genomics 275, 437-449.
Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W. (1987): GUS-fusions: glucuronidase as a
sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6:3901-3907.
Koncz C., Martini N., Szabados L., Hrouda M., Bachmair A., Schell J.: Specialized vectors
for gene tagging and expression studies. In:: Plant Molecular Biology Manual B2. Kluwer
Academic Publishers, Belgium 1994, pp. 1-22..
Kononov, M.E., Bassuner, B., Gelvin, S.B. (1997): Integration of T- DNA binary vector
backbone sequences into the tobaco genome evidence for multiple complex patterns of
integration. Plant J. 11: 945-957.
Matzke, M., Matzke, A.J.M., Kooter, J.M., 2001. RNA: Guiding gene silencing. Science 293,
1080-1083.
Rakouský, S., Tejklová, E., Wiesner, I., Wiesnerová, D., Kocábek, T., Ondřej, M. (1999):
Hygromycin B - an alternative in flax transformant selection. Biol. Plant. 42: 361-369.
Surá M., Macková M., Borovka R., Frančová K., Szekeres M. a Macek T.: Cloning of
bacterial PCB-degrading gene into the plants. In Verstraete (ed.): Environmental
Biotechnology, Taylor and Francis Group, London 2004, pp. 749-752. ISBN 905809653,
Tejklová, E. (2005): Šíření pylu v porostech lnu setého (Linum usitatissimum L.). In:
OVESNÁ, J. (Ed.): Geneticky modifikované organismy. Současnost, rozšíření a možné
interakce s životním prostředím. VÚRV Praha 2005, ISBN: 80-86555-80-1, str. 15-19.
Tejklová, E., Seidenglanz, M. (2004): Studium ekologických rizik pěstování geneticky
modifikovaného lnu setého (Linum usitatissimum L.) v ČR. Sborník ze semináře Otázky
biologické bezpečnosti, GMO a mezinárodní závazky ČR. Praha 18.2.2004. str. 35-44.
Vancanneyt, G., Schmidt, R., O‘Connor-Sanchez, A., Willmitzer, Z., Rocha-Sosa, M. (1990):
Construction of an intron-containing marker gene: Splicing of the intron in transgenic
plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant
transformation. Molec. Gen. Genetics, 220: 245- 250.
Yang, N.-S., Christou, P. (1990) Cell type specific expression of a CaMV 35S-GUS gene in
transgenic soybean plants. Develop. Genet. 11:289-293
Seznam příloh Žádosti:
1. Havarijní plán vč. Plánu areálu firmy Agritec s.r.o. s vyznačením míst nakládání s GMO,
Kopií katastrálních map a Plánku umístění pokusu s GM lnem v r. 2012
2. Provozní řád
3. Hodnocení rizika
4. Výpis z obchodního rejstříku žadatele
21
ČÁST D
SPOLEČNÁ NÁLEŽITOST PRO VŠECHNY ŽÁDOSTI
Vyjádření, datum a podpis odborného poradce
Výše uvedené údaje odpovídají skutečnosti. Firma AGRITEC, výzkum, šlechtění a
služby s.r.o. disponuje kvalifikovanými odborníky a veškerým potřebným materiálnětechnickým zázemím k zajištění bezpečného nakládání při uvolňování GM linií lnu
s vloženým transgenem FAD2-i do životního prostředí za účelem realizace polních pokusů,
v souladu se zákonem č. 78/2004 Sb. ve znění pozdějších předpisů.
V Českých Budějovicích, dne 12.12.2011
RNDr. Slavomír Rakouský, CSc.
odborný poradce pro nakládání s GMO
Šumperk, 21.12.2011
Datum, podpis a razítko žadatele
22