Základní principy transgenoze rostlin a její využití pro produkci

Základní principy transgenoze
rostlin a její využití pro produkci
nových odrůd
Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.
BC AV ČR, v.v.i. a PřF JU České Budějovice
Šlechtění rostlin
 v neolitu umělý výběr – na výsev používána semena z
nejlepších rostlin
 na konci 17. st. (po poznání pohlavnosti rostlin) přibyla
druhá metoda – křížení
 ve 20. st. pak mutační šlechtění, využití tkáňových kultur a
nakonec genové inženýrství
 nástroje gen. inženýrství
- molekulární mapování (umožňuje přesně sledovat
přenos mol. znaku v zastoupení nepřesně sledovatelného
znaku – např. odolnosti vůči houb. onemocnění)
- transgenoze (vnášení klonovaných genů do rostlinného
genomu)
Šlechtění rostlin
 na základě charakteru použité DNA lze rozčlenit genetické
modifikace na několik typů:
i) xenogenní modifikace – do rostl. genomu včleněna
syntetická DNA
ii) transgenní modifikace – do genomu včleněna DNA
pocházející z různých často fylogeneticky velmi
vzdálených druhů
iii) intragenní modifikace – do genomu vložen gen
pocházející ze stejného rostlinného druhu, ale ostatní
sekvence (promotor, terminátor) pocházejí z druhů
jiných, ale navzájem křižitelných
iv) cisgenní modifikace – do genomu integrován gen
(kódující sekvence včetně jejich nativních regul.
sekvencí) ze stejného druhu nebo druhu křižitelného
Agrobacterium tumefaciens
nepřímá metoda prostřednictvím bakterií rodu
Agrobacterium
přímá metoda prostřednictvím DNA
1) Bakterie Agrobacterium tumefaciens
- několik druhů půdních bakterií indukuje morfogenetické
změny rostlin (rody Agrobacterium, Rhizobium,
Bradyrhizobium a Azorhizobium)
- bakterie rodu Rhizobium, Bradyrhizobium a Azorhizobium
přeměněné v bakteroidy se stávají trvalou součástí pletiv
kořenových hlízek leguminózních rostlin
- u rodu Agrobacterium však bylo prokázáno, že bakterie
vnášejí své specifické geny až do rostlinného genomu
Agrobacterium tumefaciens
- vnášené geny jsou lokalizovány na bakt. plazmidu
nazývaném Ti (tumor inducing), přenášená část plazmidu se
označuje jako T-DNA (transferred DNA)
Agrobacterium tumefaciens
- T-DNA plazmidu Ti přináší do rostl. buněk:
i) geny pro nové cesty biosyntézy auxinů a cytokininů
(dochází tím k dediferenciaci rostl. buněk, takže
transformovaná pletiva rostou jako nediferencované
nádory - crown galls)
Agrobacterium tumefaciens
ii) geny pro syntézu nádorově specifických látek –
opinů případně agrocinopinů
(ty slouží pro příslušný typ bakterií jako zdroj C, N
případně P a energie; jsou vylučovány do okolních
netransformovaných pletin a do půdy)
- zákl. typy Ti plazmidů jsou oktopinový a nopalinový, dalšími
pak leucinamopinový, sukcinamopinový a kukumopinový
Agrobacterium tumefaciens
 rod Agrobacterium má tyto druhy:
i) A. tumefaciens (infikuje několik stovek převážně
dvouděložných druhů rostlin)
ii) A. rhizogenes
iii) A. rubi (způsobuje cane galls na maliníku)
iv) A. vitis (infikuje vinnou révu)
v) A. radiobacter (nevirulentní, někdy za druh nepovažován)
 Prvním krokem zachycení buněk A. tumefaciens na rostl.
buňkách je navázání bakterií prostřednictvím specifických
bakteriálních receptorů typu vitronektinů. Ty jsou kódovány
geny chvA, chvB, pscA, exoC a att umístěnými na bakt.
chromosomu.
Agrobacterium tumefaciens
 Ti plazmid má dva úseky nezbytné pro indukci nádorů:
i) T-DNA (vstupuje do rostl. buněk, geny pro vlastní integraci
do hostitelské DNA nemá)
ii) úsek virulence (vir oblast; obsahuje geny vedoucí k
přenosu T-DNA do rostl. buněk a její integraci do genomu
rostliny)
 Vir oblast má délku 35 kb a je tvořena minimálně 8 operony
– virA, virB, virC, virG, virD, virE, virF a virH, jež kódují
zhruba 35 polypeptidů
 Přenos T-DNA do rostl. buněk indukují fenolické látky typu
acetosyringonu (mj. acetovanilon, kys. sinapová, kys.
lysergová, katechol, kys. ferulová). Tyto látky jsou
produkovány poraněnými buňkami většiny dvouděložných
rostlin, ne však buňkami většiny rostlin jednoděložných.
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
 Přenos T-DNA začíná od pravé hraniční 25 bp sekvence,
kde mezi 3. a 4. bází vznikne zlom v dolním řetězci T-DNA,
a to činností VirD1-VirD2 endonukleázového komplexu. Do
rostl. buňky přechází T-DNA v jednořetězcové formě (Tstrand) s navázanou molekulou VirD2 na 5` konci a
asociovanými molekulami VirE2 po celé své délce (Tkomplex).
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
 Současné znalosti o integraci T-DNA jsou spojeny do tohoto
modelu:
i) T-DNA je zbavena asociovaných proteinů a je
konvertována do dvouřetězcové molekuly replikačními
nástroji hostitelské buňky
ii) proteiny reparace DSB (Ku70, Ku80 aj.) interagují s
dvouřetězcovou DNA a asistují při jejím směrování k
dvouřetězcovým zlomům hostitelského genomu
iii) v tomto stádiu může zřejmě také docházet ke spojování
několika molekul T-DNA vedoucí nakonec k
mnohačetné inserci T-DNA
iv) T-DNA nacházející se v místě DSB hostitelské buňky je
spojena s rostl. genomem ligázovým reparačním
komplexem
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
 T-DNA plasmidu Ti
- nopalinová z jediného úseku
- oktopinová z levé a pravé části s meziúsekem, jenž
neobsahuje žádné geny a vstupuje do rostl. genomu
fakultativně
Agrobacterium tumefaciens
- společné geny T-DNA nopalinových a oktopinových
plazmidů Ti tvoří tzv. jádro (core) T-DNA
- u oktopinových plazmidů je jádro tvořeno levým úsekem TDNA (TL-DNA)
- geny očíslovány podle velikosti jimi kódované mRNA
Gen 1 (iaaM) kóduje tryptofanmonooxygenázu pro první
stupeň nové biosyntetické dráhy auxinů
Gen 2 (iaaH) kóduje indolylacetamidhydrolázu pro druhý
stupeň nové syntézy auxinů
Gen 3 (ocs) kóduje oktopinsyntázu pro syntézu oktopinu z
argininu a pyruvátu
Gen 4 (ipt) kóduje izopentenyltransferázu pro první stupeň
syntézy cytokininů
Gen 5 kóduje produkt účastnící se nové syntézy auxinů
Agrobacterium tumefaciens
Gen 6a kóduje transportní protein pro sekreci opinů
Gen 6b kóduje protein účastnící se nové syntézy cytokininů
Gen 7 jeho funkce zatím neznámá
Nopalinová T-DNA má vlevo od core genů 6 genů (a, b, c, d, e,
acs), kde jenom o posledním je známo, že kóduje syntézu
agrocinopinů, funkce ostatních je neznámá.
Pravá část oktopinových plasmidů (TR-DNA) obsahuje 5 genů
(0` až 4`). Geny 1` a 2` se podílejí na syntéze manopinu, 0`
na syntéze agropinu, funkce ostatních je zatím neznámá.
T-DNA je vymezena vysoce konzervativními přímými
repeticemi o délce 25-28 bp, jež se nazývají pravá (BR) a
levá hranice (BL).
Agrobacterium rhizogenes
2) Bakterie Agribacterium rhizogenes
- vnášené geny jsou lokalizovány na bakt. plazmidu
nazývaném Ri (root inducing)
- transformovaná pletiva rostou jako kořeny (hairy roots)
- základními typy Ri plazmidů jsou manopinový a agropinový
Agrobacterium rhizogenes
- hairy roots jsou schopny proliferace in vitro na médiu bez
růstových látek
- z obou typů transformovaných pletiv (crown galls, hairy roots)
mohou diferencovat transformované nebo i netransformované
výhony
Agrobacterium rhizogenes
- k diferenciaci dochází u hairy roots nikoliv z kořenových
špiček, ale ze starší části kořene
- téměř všechny kmeny A. rhizogenes mají 3 komponenty Ri
plazmidu:
i) malý (Mr~90 MD) s geny pro utilizaci opinů
ii) velký (Mr~150 MD) s dalšími geny pro využití opinů a
pro využití agrocinopinů
iii) kointegrovaný vzniklý spojením předcházejících
- T-DNA manopinových plazmidů je tvořena jedním úsekem,
agropinových dvěma (TL a TR) úseky oddělených segmentem,
který do rostlinných buněk nevstupuje
- geny na TL-DNA: celkem asi 18, z nichž 4 (rolA, rolB, rolC,
rolD) podrobně prostudovány – působí zvýšení senzitivity k
auxinům
Agrobacterium rhizogenes
- geny na TR-DNA: nejdůležitější jsou geny pro syntézu auxinů,
homologní s geny 1 (iaaM) a 2 (iaaH) v T-DNA A. tumefaciens,
a geny pro syntézu agropinu a nedávno objeven analog genu
rolB z TL-DNA
Vektory
Pro využití bakterií Agrobacterium jako vektorů transgenů je
třeba odstranit původní geny a místo nich (tj. mezi hraniční
sekvence T-DNA) vložit geny, které chceme do rostl. genomu
integrovat.
A) Intermediární (kointegrativní) vektory
- intermediární vektor je malý plazmid s krátkými úseky s levou
a pravou hraniční sekvencí, mezi nimiž jen vložen
zájmový gen a gen selekční
- je schopen replikace v E. coli, nikoliv však v agrobakteriu
- po vnesení do agrobakteria (transformací nebo konjugací) se
trvale udrží jen v buňkách, ve kterých došlo k
rekombinaci mezi homologními sekvencemi Ti plazmidu
a intermediárního vektoru
Vektory
Vektory
Vektory
B) Binární vektory
- jejich konstrukce založena na skutečnosti, že schopnost
indukovat nádor má i Ti plazmid, který je rozdělen na dva
menší:
i) jeden obsahuje úsek virulence, ale nikoliv T-DNA, a
počátek replikace pro agrobakterium (Ti plazmid
zbavený T-DNA)
ii) druhý obsahuje T-DNA a počátek replikace pro
agrobakterium (vektorový plazmid); má vhodná
restrikční místa pro inzerci cizorodé DNA
- příkladem kmene A. tumefaciens nesoucí Ti plazmid bez TDNA je kmen LBA4404, jenž obsahuje plazmid zvaný
pAL4404, odvozený od Ti plazmidu pTiAch5 delecí TDNA úseku
Vektory
Vektory
- jedním z prvních binárních vektorů byl v r. 1984 pBin19, který
byl v r. 1987 vylepšen doplněním o reportérový gen za vzniku
pBI121
- tyto dva vektory a jejich deriváty jsou stále nejpopulárnější (v
letech 2000-2007 byly použity v pracech zabývajících se
transformací vyšších rostlin ve 40 % případů)
Vektory
Vektory
- za posledních 20 let byla vyvinuta řada systémů binárních
vektorů, ovšem díky omezení velikosti vkládané DNA nesou
vedle selekčního genu jen 1-2 geny zájmové
- toto omezení je dáno monocistronickou expresí eukaryotních
ORF, což vede ke značné velikosti vkládané DNA a komplikuje
klonovací postupy
- v r. 2005 byl publikován modulární vektorový systém pSAT,
který umožňuje vložení až 7 ORF do jedné T-DNA a jež je
založen na tzv. homing (naváděcích) endonukleázách; ty
rozpoznávají velmi raritní sekvence (např. I-SceI 18 bázovou
sekvenci, která se teor. vyskytuje každých 7 x 1010 bp)
- binární vektor obsahuje 6 různých raritních sekvencí a přes
různé expresní kazety pSAT jsou do nich bez komplikací
vkládány jednotlivé zájmové geny
Vektory
Vektory
C) Superbinární vektory
- vektory, které vedle T-DNA obsahují ještě některé z genů vir
oblasti
- využívá se poznatku, že některé z produktů vir genů vykazují
dávkový efekt, tj. čím více je těchto produktů v buňce
přítomno, tím větší je účinnost transformace
- tyto vektory hrály v pol. 90. let stěžejní úlohu při rozšiřování
spektra druhů transformovatelných agrobakteriem o obiloviny
Nepřímá transformace
 používá se agrobakterium s vhodným binárním
(superbinárním) vektorem
 z akceptorové rostliny se používají různé orgány resp. pletiva:
listové disky, děložní listy, stonky
 explantát se kultivuje s bakteriemi agrobakteria v řádech
minut až dní a pak se přenese na médium obsahující
selekční agens, antibiotikum pro eliminaci agrobakteria a
růstové látky (RL) v poměru vedoucím k organogenezi
(vzniku prýtů)
 na selekčním médiu bez RL pak prýty zakoření a obvykle
ponesou stabilně integrovaný transgen (ověření PCR a
Southernovou hybridizací)
Nepřímá transformace
Nepřímá transformace
 při transientní (dočasné) in planta expresi dojde k případné
expresi v rostl. buňce během několika hodin až dní a
záhy odezní – ověřování funkčnosti konstruktů, rychlá
jednorázová produkce velkého množství produktu
jedna z metod pro indukci transientní exprese využívá
agrobakterium – agroinfiltrace
- tekutá kultura agrobakteria s binárním vektorem se
vakuově nebo pomocí inj. stříkačky infiltruje do listu
Nepřímá transformace
 další metody pro transientní expresi:
- mikroprojektily zlata nebo wolframu o velikosti zhruba 1
μm s navázanou plazmidovou DNA; vnášejí se buď
ručním přístrojem Helios Gene Gun přímo na živé
rostlině nebo do oddělených explantátů ve vakuové
komoře (PDS-1000 He); limitující je především vysoká
vstupní investice
Nepřímá transformace
 další metody pro transientní expresi:
- virové vektory, v nichž je zájmový gen vložen do
virového genomu; obzvláště účinný je sytém
magnifection, ve kterém virové replikony nesoucí
zájmový gen jsou naklonovány do T-DNA a do rostliny
jsou vnášeny již zmíněnou agroinfiltrací; během množení
viru je zájmový gen exprimován spolu s virovými geny,
což vede k masivní produkci požadovaného produktu
Přímá transformace
 různé metody začaly být vyvíjeny jako alternativa k
agrobakteriové transgenozi pro druhy, u níž Agrobacterium
nefungovalo
 jako první vznikla metoda transformace protoplastů (PP)
- omezeno na druhy se zvládnutou regenerací PP
- DNA přijímána endocytózou, k její stimulaci lze použít buď
PEG nebo elektroporaci
- DNA lze do jader PP vložit mikroinjekcemi
 biolistika (biologická balistika)
- jde o bombardování buněk nebo pletiv mikropartikulemi (~1
μm) zlata nebo wolframu, na nichž je navázaná
plazmidová DNA
Přímá transformace
- jen 7-10 % mikroprojektilů pronikne alespoň do epidermis,
ale je třeba proniknout až do buněk mezofylu; pokud se
tak stane, jen u 5 % z těchto buněk se projektil dostane
až do jádra, ale většina (95-98 %) těchto buněk po
zásahu stejně odumírá
- pokud se mikroprojektil s DNA dostane až do jádra a buňka
zásah přežije, je frekvence integrece vnesené DNA do
jaderné DNA (alespoň) u tabáku značně vysoká (u
tabáku 10-100 integrací na jeden výstřel - 0,5 mg Au s
0,8 μg DNA)
 vsakování roztoku DNA dehydratovanými rostl. pletivy
- metoda stále studována a optimalizována (není pro rutinní
transgenozi)
Přímá transformace
 přenos zprostředkovaný liposomy (lipofekce)
- uvnitř liposomů roztok DNA, aplikováno na zralá pylová zrna,
lze použít na PP
- úspěšných prací poskrovnu
 přenos zprostředkovaný alginátovými mikrokapičkami
- umožňuje přenos velmi velkých fragmentů DNA do PP, a to
navíc s řádově větší transformační účinností než PEG
Přímá transformace
 technologie transformace pylu
i) biolistika jednobuněčného pylu
- jednobuněčné mikrospory jsou bombardovány v G1 fázi, po
dozrání mikrospor je pyl použit k opylení in vivo a
semena testována na selekčním médiu
Přímá transformace
ii) biolistika mikrospor nebo nezralých pylových zrn
reprogramovaných stresem k tvorbě sporofytu
- embryogenní mikrospory či nezralá pylová zrna jsou
transformována a vzniklé embryogenní buňky dávají
vznik haploidnímu embryu a rostlinám (diploidizace
spontánně či chem. indukována)
Cisgenoze
 Cisgenoze je definována jako přenos genů s jejich nativními
regulačními sekvencemi metodami genového inženýrství z
druhu přirozeně křižitelného nebo z druhu téhož.
 Jde též o vytvoření nových transformačních protokolů bez
použití (bakteriálních) selekčních markerů – u generativně
množených druhů kotransformací, u vegetativně množených
druhů odstranitelnými selekčními geny nebo použitím vektorů
bez markerových genů (marker-gene-free vectors).
 Díky tomu by na takto geneticky upravené rostliny nemuselo
být nahlíženo jako na GMO, ale jako na klasickými metodami
vyšlechtěné odrůdy se všemi legislativními dopady a s
příznivým míněním veřejnosti.
Cisgenoze
 V praxi bude cisgenoze vhodná zvláště pro rezistentní
šlechtění vegetativně množených vysoce heterozygotních
plodin (brambory, jabloně), kde zdrojem genů rezistence jsou
příbuzné plané druhy.
Využití GM plodin
„GM crops are not the problem, but part of the
solution to sustainably feeding 9 billion
people.“
(Professor Giles Oldroyd, Senior Plant Scientist, John Innes
Centre, UK)
Do roku 2030 je třeba celosvětově zvýšit výrobu potravin
nejméně o 50 %, což se nedá zvládnout pouze klasickými
šlechtitelskými postupy. Genetické modifikace budou tedy
muset být jednou z technologií, jak se s tímto požadavkem
úspěšně vyrovnat.
Využití GM plodin
 Přes legislativní problémy v určitých částech světa plocha
GM plodin stále roste, protože přinášejí vyšší zisk pěstitelům a
vyšší užitnou hodnotu spotřebitelům.
Využití GM plodin
 Drtivá většina v současnosti v praxi využívaných GM plodin
nese geny tolerance k herbicidům (HT) nebo geny pro tvorbu
δ-endotoxinu z B. thuringiensis (BT).
Využití GM plodin
 Z hlediska plodin vede sója následovaná kukuřicí a
bavlníkem.
Využití GM plodin
 Podíl nejrozšířenějších GM plodin na jejich celkové světové
produkci:
Využití GM plodin
 Přehled zemí s povoleným polním pěstováním viz obr.:
Využití GM plodin
 Přicházející GM plodiny:
i) kukuřice s genem pro fytázu (Čína) – podstatná část fosforu
ve zralých obilovinách a olejninách je obsažena ve formě
fytátu; vzhledem k tomu, že monogastrická zvířata mají málo
střevní fytázy, je jejich využití fosforu z obilovin a olejnin
omezené a fytát, který není zvířaty využit, je vylučován v hnoji
a způsobuje problémy se znečištěním prostředí; kyselina
fytová dále může snížit biologickou dostupnost dalších prvků
– Ca a Zn
ii) kukuřice se sníženým obsahem fytátu v semeni (USA,
Pioneer Hi-Bred International)
iii) Bt rýže se zvýšenou rezistencí vůči zavíječům (Čína)
iv) „SmartStax“ kukuřice (Monsanto, 2010) – nese 8 různých
transgenů (2 pro rezistenci k glyfosátu resp. glufosinátu) a 6
genů BT směrovaných proti různým živočišným škůdcům
Využití GM plodin
v) kukuřice se zvýšenou odolností vůči suchu (Monsanto);
očekávané tržní zavedení 2012
vi) geny zlepšující nutriční vlastnosti plodin – sója se
zvýšeným obsahem 3-ω mastné kyseliny - kyseliny
stearidonové (Monsanto), která je stabilnější než rybí tuk a v
lidském či zvířecím těle je konvertována na polynenasycené
3-ω mastné kyseliny s příznivým účinkem na vaskulární
systém
vii) „zlatá rýže 2“ s velmi vysokým obsahem β-karoténu bude
zavedena 2012
Využití GM plodin
 Příklad vývoje GM plodin firmou Monsanto
Využití GM plodin
Využití GM plodin
Využití GM plodin

Využití GM plodin

Využití GM plodin
 Perspektivní GM plodiny:
i) rajčata s genem Bs2 z papriky pro rezistenci vůči
Xanthomonas sp. v polních podmínkách
ii) rajčata rezistentní vůči Phytophtora infestans s geny
rezistence z planých druhů rajčat
iii) rajčata se zvýšenou odolností k bakteriálním chorobám (vč.
Ralstonia solanacearum) s genem efr z arabidopsis
iv) banánovník je nyní devastován chorobou sigatoga
způsobovanou houbou Mycosphaerella fijiensis – téměř
veškerá světová produkce banánů je tvořena extrémně
citlivou odrůdou Cavendish; žádný GM rezistentní banánovník
ještě není hotov, ale několik nadějných postupů je testováno
Využití GM plodin
 Perspektivní GM plodiny:
v) rajčata s výrazně vyšším (3x) obsahem antioxidantů
(antokyanů a flavonolů) díky expresi dvou genů pro
transkripční faktory z hledíku – (purple tomato)
Využití GM plodin
 Perspektivní GM plodiny:
vi) zvýšení účinnosti příjmu N rostlinami k omezení hnojení a
znečišťování povrchových i spodních vod –
alaninaminotransferasa je slibným kandidátem; v delším
horizontu je žádoucí vytvořit GM plodin se schopností vytvořit
symbiotický vztah s dusík fixujícími bakteriemi leguminóz
vii) zavedení rezistence vůči rzi trávní (Puccinia graminis) do
pšenice; geny rezistence jsou dostupné v planých druzích, ze
kterých budou klonovány a vneseny do kultivarů pšenice
Důvody využití GM plodin
 umožní nutné zvýšení světové produkce potravin přes
pokles rozlohy obdělávatelné půdy
 umožní produkci potravin na půdách dosud pro zemědělskou
produkci nevhodných (sucho, zasolení)
 redukují environmentální dopady rostlinné zemědělské
výroby snižováním počtu pesticidních ošetření a tím
snižováním potřeby fosilních paliv na jednotku produkce
 redukují spotřebu paliv díky aplikaci úspornějších metod
obdělávání půdy
 zlepšují nutriční hodnotu potravin a krmiv
 zlepšují vlastnosti surovin pro průmyslové využití
 umožní zvýšit produkci rostl. hmoty jakožto obnovitelného
zdroje energie