file 6 MB

Materiály pro buněčnou a tkáňovou
transplantaci.
RNDr. Pavla Jendelová PhD.
Ústav experimentální medicíny AVČR
Ústav neurověd, UK 2. lékařská fakulta
Regenerativní medicína
Buněčná terapie
Genová terapie
Produkce růstových faktorů
Počet publikací (WOS)
Tkáňové inženýrství
Biomateriálové inženýrství
Transplantační medicína
Počet citací (WOS)
Kmenové buňky - definice
sebeobnovující se „nezralé“ buňky, které se mohou vyvinout v
plně funkční diferencované buňky
Hlavní kategorie kmenových buněk
• embryonální
• fetální
• „dospělé“ nebo somatické kmenové buňky
• indukované pluripotentní
Dvě vlastnosti, které jsou esenciální pro obě kategorie:
• schopnost sebeobnovy (schopnost generovat identické kopie sebe sama)
• schopnost diferencovat se (schopnost dát vznik různým diferencovaným
buněčným typům)
Kmenové buňky a jejich zdroje
EMBRYO X FETUS X DOSPĚLÝ JEDINEC
Embryonální kmenové buňky (největší potenciál, zdroj embrya
z in vitro fertilizace nebo přenos jader, etický problém)
Fetální neurální kmenové buňky (dokáží nahradit nervové
buňky, zdroj potraty, etický problém, nedostatečné množství),
Indukované pluripotentní buňky (jako embryonální, genová
manipulace z dospělé buňky pacienta)
Z dospělých jedinců:
Kmenové buňky kostní dřeně, tukové a čichové buňky
(používají se, zdroj pacient sám, podpůrná funkce)
Kmenové buňky pupečníkové krve (malé možnosti použití,
omezeně např. u některých sourozenců)
Zvířecí buňky – xenotransplantáty (používají se jako
přechodné náhrady nebo v bioreaktorech)
Funkce kmenových buněk
Pluripotentní kmenové buňky
Embryonální kmenové buňky
Diferenciace embryonálních kmenových buněk
Lidské embryonální buňky – diferenciace ve zkumavce
Je experimentování s lidskými embryonálními
kmenovými buňkami v České republice legální?
ANO
Zákon o výzkumu na lidských embryonálních
kmenových buňkách a souvisejících činnostech
a o změně některých souvisejících zákonů
Schválen Poslaneckou sněmovnou dne 26. dubna 2006
Platný od 1. června 2006 jako zákon č. 227/2006 Sb.
Povolení pro práci s lidskými embryonálními kmenovými buňkami
Registr linií lidských embryonálních kmenových buněk
Embryonální kmenové buňky - legislativa
Výzkum, tvorba embryonálních KB a terapeutické klonování
povolen: (nepovoleno klonování člověka)
Velká Británie, Belgie, Finsko, Španělsko, Švédsko
Výzkum a tvorba embryonálních KB z IV fertilizace povolen:
Bulharsko, Chorvatsko, Česká republika, Dánsko, Estonsko, Finsko,
Francie, Gruzie, Řecko, Maďarsko, Irsko, Lotyšsko, Moldavsko,
Nizozemí, Norsko, Portugalsko, Rumunsko, Rusko, Slovinsko,
Švýcarsko, Turecko
Německo, Itálie – zákaz derivace linií, povolen výzkum na dovezených
linií
Výzkum embryonálních KB a derivace linií není povolen
Rakousko, Litva, Polsko, Slovensko
USA – 2011 prezident Obama povolil federální podporu výzkumu
některé státy USA výzkum zakazují (např. Indiana, Louisiana, Severní a
Jižní Dakota)
Indukované pluripotentní buňky
(účinnost 0.1%)
Selekce pomocí resistence na antibiotika pod
specifickým promotorem typickým pro pluripotentní
buňku (jako je Oct3/4, Nanog)
Výhody:
-lze je derivovat přímo z buněk pacienta (jsou
imunologicky kompatibilní)
-možnost derivace přímo od pacienta s určitou nemocí
-možnost diferenciace na typ buněk, které nemoc
postihuje
-tím je dána možnost hledání vhodných terapií in vitro
-eticky akceptovatelná metoda
Výběr na základě morfologie
Kolonie iPS
Zdroje reprogramovaných buněk
Integrace pluripotentních buněk do mozku také
nemá 100% úspěšnost
Cv
HuNu
iPS a hES v klinických studiích
• 12.9. 2014 první pacientka (70 let) v Japonsku
transplantovaná sítnicovým pigmentovým epitelem,
vypěstovaným z její kožní buňky (přes iPS buňky
• Studie GRNOPC1 Pacienti s míšní lézí v hrudní
oblasti 7-14 dní po úrazu dostali prekurzory
oligodendrocytů diferencované z ESC, 2 mil buněk
do léze, imunosuprese 60 dní
Studie zastavena po 5 pacientech z finančních důvodů
Embryonální kmenové buňky v klinických studiích
Clinical
Start
Trials.gov
(yr)
NCT01344993 2011
NCT01345006 2011
NCT01469832 2011
NCT01625559 2012
Sponsor
Title
Condition
Intervention
Remarks
Advanced cell Safety and tolerability of transplantation of MA09- Advanced dry age related Sub-retinal
A Phase I/II, open-label,
technology
hRPE cells in patients with advanced dry age related macular degeneration
transplantation of
multi-center, prospective
(USA)
macular degeneration
human embryonic stem study.
cell derived retinal
pigmented epithelial
cells. MA09-hRPE
Advanced cell Transplantation of MA09-hRPE cells in patients with Stargardt's macular
Sub-retinal
A Phase I/II, open-label,
technology
stargardt's macular dystrophy
dystrophy
transplantation of
multi-center, prospective
(USA)
MA09-hRPE
study
Advanced cell Safety and tolerability of transplantation of hESCStargardt's macular
Sub-retinal
A PhaseI/II, open-label,
technology
RPE cells in patients with stargardt's macular
dystrophy
transplantation of
multi-center, prospective
(USA)
dystrophy
MA09-hRPE
study
CHA Bio and
diostech
(Korea)
CHA Bio and
diostech
(Korea)
Safety and tolerability of MA09-hRPE cells in
patients with stargardt's macular dystrophy
Sub-retinal
transplantation of
MA09-hRPE
Safety and tolerability of transplantation of MA09- Dry age Related macular Sub-retinal
hRPE cells in patients with advanced dry age-related degeneration
transplantation of
macular degeneration (AMD)
MA09-hRPE
A Phase I, open-label,
prospective study in
Korea
A Phase I/IIa, open-label,
single-center, prospective
study in Korea
NCT01691261 2014
Pfizer
(UK)
Implantation of human embryonic stem cell derived Age related macular
retinal pigment epithelium in subjects with acute wet degeneration
age related macular degeneration and recent rapid
vision decline
Implantation of human
embryonic stem cell
derived retinal pigment
epithelium
Phase 1, open-label,
safety and feasibility
study in United
Kingdom.
NCT02057900 2013
Assistance
publique hôpitaux de
Paris
Transplantation of human embryonic stem cellderived progenitors in severe heart failure
(ESCORT)
Ischemic heart disease
Human embryonic
stem cell-derived
CD15+ Isl-1+
progenitors
Phase 1, open-label,
feasibility and safety
study in France
NCT02122159 2014
University of Research with retinal cells derived from embryonic
California, Los stem cells for myopic macular degeneration
Angeles
Myopic macular
degeneration
MA09-hRPE cellular
therapy
A Phase I/II, Open-label,
prospective study to
determine the safety and
tolerability in United
States
NCT01674829 2012
Stargardt's macular
dystrophy
Fetální kmenové buňky
Neurální kmenové buňky
 Tkáňově specifické multipotentní
buňky
 Fetální a dospělý CNS
 Definovány jako buňky schopné
sebeobnovy a diferenciace v
neurony, astrocyty a
oligodendrocyty
Fetální kmenové buňky
Fetální tkáně získané přímo z potratů bude vždy nedostatek, proto se
biotechnologické společnosti (Neuralstem, ReNeuron, Advanced Cell
Technologies, Phenocell) soustřeďují na vytvoření a využití buněčných linií
derivovaných z fetální tkáně nebo z iPS buněk.
iPS-NPs
Korová nebo
krční oblast 10týdenního
lidského fétu
4-hydroxy
tamoxifenem
indukovaný
cMyc
(cMycERTAM)
CTX03E03
Fetální plicní
fibroblasty
iMR90
Oct4, SOX2,
Nanog
a LIN28
Noggin,
SB431542,
bFGF a
hBDNF
SPC-01,
Cocks et al., Stem Cell Therapy & Res, 2013
Polentes et al., Cell Transplantation, 2012
ReNeuron
StemCells
Velká Británie
Švýcarsko
Studie PISCES (Pilot
Investigation of Stem Cells in
Stroke)
Pacienti muži po iktu > 60let, 6
měsíců – 5 let po iktu
12 pacientů, postupné
zvyšování dávky 2,4,10, 20 mil)
produktu ReN001 (CTX)
do oblasti iktu, 05/2014 report o
11 pacientech po ročním
sledování
bez imunosuprese
Fáze II v 10 UK centrech pro
41 pacientů 8-12 týdnů po iktu
(červen 2014)
Spinal Cord Injury Clinical
Trial
Pacienti s míšní lézí 3-12
měsíců po úraze
HuCNS-SC buňky z mozku
aplikace přímo do míchy
imunosuprese
Neuralstem

Lidské spinální
kmenové buňky
izolované z krční míchy
8 týdnů starého
lidského fétu

Preklinické studie na
prasetech (testováno
podání a počet buněk

Ideálně 30 000 b v objemu
6-8ul
Neuralstem
USA
Studie ALS
Studie Míšní poranění (srpen 2014)
3 Pacienti s ALS 20 injekcí po
400 000 b do cervikální a
lumbální oblasti
8 pacientů, 5 let sledování
1 pacient vykazuje mírné
zlepšení
1-2 roky po úrazu
léze na úrovni TH2-TH12
2 pacienti setrvalý stav 3 roky
po podání buněk
Buňky NSI566 izolované z lidského 8 týdenního plodu.
Fetální kmenové buňky v terapii
Clinical Trials.gov Start (yr) Sponsor
Title
Interventions
Cell source
NCT 01013194
2007
The Mediterranean
Institute
Human fetal liver cell Transplantation in chronic Human fetal liver cell
liver failure
transplantation
NCT 01151124
2010
ReNeuron Limited.
(UK)
Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Surgical delivery of a neural stem CTX0E03 neural stem
1
cell line to the brain
cells
NCT 01321333
2011
StemCells, Inc.
(USA)
Study of HuCNS-SC in patients with thoracic
spinal cord injury
Intramedullary spinal cord
HuCNS-SC cells (Human
transplantation of human CNS stem Central Nervous System
cells
Stem Cells)
NCT 01348451
2009
Neuralstem Inc.
(USA)
Human neural stem cell Transplantation for the Surgical implantation of human
Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
neural stem cells
Human spinal cord derived
neural stem cells
NCT 01632527
2012
StemCells, Inc.
(USA)
Study of HuCNS-SC in age-related macular
degeneration
Transplanting HuCNS-SC cells
directly into the subretinal space
HuCNS-SC cells
NCT 01640067
2011
Azienda Ospedaliera
Santa Maria
Human neural stem cell Transplantation in
Amyotrophic Lateral Sclerosis
Surgical microinjection of human
neural stem cells
Human foetal neural stem
cells
NCT 01730716
2013
Neuralstem Inc.
(USA)
Dose escalation and safety study of neural stem Human spinal cord stem cell
cell transplantation for the treatment of
implantation
amyotrophic lateral sclerosis
NCT 01772810
2014
Neuralstem Inc.
(USA)
Safety study of human spinal cord-derived
Human Spinal Cord-derived Neural Human spinal cord derived
neural stem cell transplantation for the treatment Stem Cell Transplantation
neural stem cells
of Chronic SCI
NCT 01860794
2013
Bundang CHA Hospital Evaluation of safety and tolerability of fetal
mesencephalic dopamine neuronal precursor
cells for Parkinson's disease
Transplantation of fetal
Fetal mesencephalic
mesencephalic dopamine neuronal dopamine neuronal
precursor cells
precursor cells
NCT01898390
2012
University of Cambridge TRANSEURO open label transplant study in
(UK)
Parkinson's disease
Neural allo-transplantation with
fetal ventral mesencephalic tissue
Fetal liver cells derived
Human spinal cord derived
neural stem cells
Fetal ventral
mesencephalic tissue
Buňky pupečníkové krve
 alogenní
 Odběr na porodním sále po
porodu a odstřižení dítěte, před
porodem placenty
 Omezené množství
 Převážně pro transplantace
dětských pacientů
 Uchování v BPK
 Méně imunogenní, příjemce
nemusí mít úplnou HLA schodu
 U dospělých se může použít 2
nepříbuzných graftů
 Snaha o expanzi in vitro
 Zdroj různých typů
progenitorových buněk
Buňky pupečníku
pupečníková žíla
Pupečníkové tepny
Pupečník je extra-embryonální orgán tvořený dvěma arteriemi a jednou žílou, které jsou
obklopeny mukózní tkání – matrix (Wharton‘s jelly, WJ).
WJ je želatinová tkáň tvořena myofibroblastům podobnými stromálními buňkami,
kolagenními vlákny a proteoglykany
WJ je jedním z nejdostupnějších zdrojů kmenových buněk – a to jak technicky tak eticky,
mohou být získávány neinvazivně
Somatické kmenové buňky
z dospělých jedinců
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mozek
Kostní dřeň, periferní krev, cévy
Tuková tkáň
Kosterní svalstvo,
Kožní epitel
Trávicí trakt
Rohovka, sítnice
Dentální pulpa
Játra
Slinivka
Kmenové buňky z dospělého organizmu
Leri, Kajstura, Anversa, Physiol. Rev., 2005
Definice multipotentních
Mesenchymových stromálních buněk ( MSC)
Adherentní (CFU-F)
Připomínají fibroblasty
Pozitivní na adhezní molekuly CD73, CD 90, CD105
Negativní na hematopoietické markery CD14 nebo 11a, CD 34
and CD 45, CD 19, HLA- II
Schopnost diferenciace do osteo, adipo and chondrogeního
fenotypu
( Dominici et al ,Cytotherapy, 2006)
Proč právě MSCs?
Možné mechanismy, jak mohou transplantované MSC
zlepšit regeneraci tkáně příjemce:
•
MSCs jsou hypoimunogenní, nevyvolávají imunitní odpověď po
allogenní transplantaci
•
Ovlivňují zrání dendritických buněk a modulují reakci T buněk
•
Uvolňují rozpustné látky, které navozují immunosupresivní
prostředí
•
Produkují Galectin-1, který moduluje produkci cytokinů, potlačuje
autoimunitní odpověď, inhibuje akutní a chronický zánět a produkci
ECM.
•
MSCs se používají v léčbě akutní GVHD.
•
Mají neuroprotektivní účinek, brání rozvinují léze
Machová et al., 2014, BioMedical Engineering OnLine
Podání MSC zlepšuje mikrostrukturu šlachy
Využití MSC v léčbě obratlového defektu a fůze obratlů
mCT of vertebrae with defect
Impl. CEM-OSTETIC + MSCs
Vaněček et al. Eur Spine J 2012
Klíma et al. Physiol Res 2015
Lidské MSC modulují zánětlivou reakci po
míšním poranění
10 days
28 days
14 days
Machová Urzíková et al. IJMS 2014
Běžící klinické studie s MSC z kostní dřeně
Klinické studie v ortopedii
Poté
Osteoindukce ve fúzi obratlů
Kalcium trifosfát + MSCs
Před
Poté
Revize totální endoprotézy kyčelního kloubu
pomocí kalcium trifosfátu a autologních MSC
Klinická aplikace KB u diabetické nohy
Jehlou 26G, do hloubky 2-3 cm, vpichy á 1-2ml, celkem cca 40 vpichů
Jirkovská, et al IKEM
KB v klinických studiích
• Revaskularizace ischemických dolních
končetin
• Amyotrofická laterální skleróza
• Iktus
• Chrupavka a kost
• Srdeční sval
• Autoimunitní onemocnění
• GVHD
• Parkinsonova choroba
• Míšní poranění
Transplantace diferencovaných
buněk
•
•
•
•
•
Léčba diabetu
Léčba ischemických končetin a vředů
Léčba popálenin
Léčba chrupavek
Léčba myokardu
Tkáňové inženýrství
• „ Je interdisciplinární obor, který spojuje a
aplikuje pojmy materiálového výzkumu a
biologických věd s cílem vytvořit
strukturální a funkční náhrady tkání“
(Langer & Vacanti)
Principy tkáňového inženýrství
Odběr buněk
Izolace buněk
Kultivace, proliferace
Příprava nosiče (scaffoldu),
Osazení buňkami (3D buněčný
konstrukt)
Implantace scaffoldu
Integrace scaffoldu a obnovení funkce
tkáně
Chrupavka - historie
• Implantát připraven z
PLLA/PGA vláken s
autologními
chondrocyty
• Kultivován in vivo na
athymické myši
• Při pokusu využít jej u
lidí selhal
Chrupavka
Perioperační foto
Chondrograft (chondrocyty ve
fibrinovém lepidle)
Vyrůstání buněk z chondrograftu
Adler et al.
Kůže - Apligraf
Kůže –keratinocyty na pHEMA
Biomateriály jako nosiče buněk
Buňky
+
Biomateriály
HEMA
Přemostění chronické léze
Kompresní léze
posttraumatická kavita
5 neděl po indukci léze
Implantace hydrogelu
Přemostění léze
Chronic SCI repair with HPMA-RGD hydrogel and MSCs
Control
HE
1mm
Implanted hydrogel
3,5
1mm
3
NF160-p75
2,5
2
1,5
1
0,5
0
SCI
SCI+Hydrogel
SCI+Hydrogel+MSCs
RECA/GFP
Přírodní hydrogely na bázi ECM
•
Napodobují extracelulární matrix (kolageny, fibronektin, laminin, proteoglykany)
•
Tkáňově specifické– homologní tkáň
•
Biologická aktivita – zbytkové růstové faktory
•
Injikovatelné – in situ polymerizace
•
Degradabilní
Decelularizace:
 Prasečí míšní tkáně(SCM)
 Prasečí mozkové tkáně(BM)
 Prasečího mozkového měchýře (UBM)
 Lidské pupečníkové tkáně
SCM
BM
Medberry,… Badylak et al., Biomaterials 34, 2013, 1033-
UBM
In vitro charakteristika ECM hydrogelů
Decelularizovaná m.t.
H&E
Mozková tkáň
ECM
sGAG ug/mg
Collagen ug/mg
mícha
1.7
26.5
mozek
3.3
26.6
Močový měchýř
2.0
38.7
4h po osetí
24h po osetí
UBM
MSCs 5 dní ve 2D kultuře
50 mm
50 mm
z
MSCs 4 dny v 3D kultuře
x
3D kultura phalloidin/DAPI
ECM hydrogely injikované do míšní hemisekce
Neurofilamenta – NF160
Růst axonů v lézi
SCM
2 týdny
UBM
500mm
500mm
SCM
4 týdny
Růst neurofilament v lézi
25
control
20
UBM
SC
area (%)
500mm
8 týdnů
SCM
15
10
5
0
500mm
50mm
2weeks
4weeks
8weeks
Budoucnost buněčné terapie
• Musíme vypěstovat vhodné buňky pro klinické užití a v dostatečném
množství.
• Takové buňky musí zůstat tak stabilní, aby stále generovaly dostatečné
množství požadovaných buněk, nebo aby produkovaly faktory podporující
regeneraci, diferenciaci nebo neurogenesi.
• Buňky po přenosu nesmějí vytvářet nádory, nebo vést k přenosu jiných
onemocnění.
• Tyto buňky musí mít i u člověka potenciál napravit anatomické a funkční
defekty.
• Umělé biomateriály budou sloužit jako nosiče a mosty, nanotechnologie
umožní sledovaní buněk i vnášet potřebné látky.
Děkuji Vám za pozornost !