CesCasFyz 2006 5

23.10.2006
8:58
Page 281
Československý
časopis pro fyziku
Československý časopis pro fyziku
Založen roku 1872 jako „Časopis pro pěstování mathematiky a fysiky“
Vydává Fyzikální ústav Akademie věd
České republiky
Vychází 6 čísel ročně, uzávěrka tohoto
čísla byla v září 2006.
Copyright-1996, Inst. of Phys. AS CR
/283
Úvodník
/284
V. Vetterl / Biofyzika na prahu
druhého tisíciletí
/288
C. Hofr / Mikrokalorimetrie biologicky
významných molekul
/293
J. Vacek, M. Masařík, E. Paleček, M. Fojta /
Elektrochemické metody v analýze
nukleových kyselin a bílkovin
/305
P. Rybár, T. Hianik / Štúdium fyzikálnych
vlastností binárnych zmesí fosfolipidov
metódou ultrazvukovej velocimetrie
/312
M. Melicherčík, J. Urban, T. Hianik / Štúdium
interakcie modelových α-helikálnych peptidov
s lipidovými dvojvrstvami pomocou
molekulovej dynamiky
/319
D. Němeček, E. Kočišová, P. Praus, J. Štěpánek /
Studium oligonukleotidů pokročilými
technikami optické spektroskopie
/327
L. Šikurová / Charakteristiky a aplikácie
merocyanínu 540
/332
J. Plášek, D. Gášková / Fluorescenční sondy
a měření membránového potenciálu
/340
K. Tománková, H. Kolářová, R. Kubínek, M. Vůjtek,
H. Dušková / Mikroskopie atomárních sil
v biologických aplikacích
/346
V. Dvořák / Jak rostou nádory
Vedoucí redaktor – Editor in Chief:
Zdeněk Chvoj
Technický redaktor – Technical Editor:
Andrea Cejnarová
Redakční kruh – Associate editors:
Ivo Čáp, Andrej Dobrotka, Jan Fischer,
Antonín Fejfar, Ivan Gregora, Jiří Janta,
Libor Juha, Zdeněk Kluiber, Jarmila
Kodymová, Petr Kulhánek, Štefan Lányi,
Jan Mašek, Jan Novotný, Pavel Svoboda,
Aleš Trojánek, Vladimír Vetterl.
Grafická úprava: Adam Hlaváč
Jazyková úprava: Šárka Vorková
Sekretariát redakce – Editorial secretary:
Věra Králová, Fyzikální ústav AV ČR,
Na Slovance 2, 182 21 Praha 8,
tel.: 266052152, 286589325,
fax: 286890527
E-mail: [email protected]
http://www.cscasfyz.fzu.cz
Sazba, litografie – Setting, lithography:
QT studio s.r.o., Hornokrčská 60, Praha 4
Tiskne – Printed by:
VAMB, Štěchovice 121
Rozšiřuje Fyzikální ústav AV ČR – redakce.
Na Slovensku rozšiřuje JSMF v Žilině.
Objednávky a prodej jednotlivých čísel
vyřizuje redakce.
Distribution rights in foreign countries:
Kubon & Sagner, P.O. Box 240108,
D - 8000 München 34
Registrace
MK ČR E 3103
E-mail: [email protected]
http://www.cscasfyz.fzu.cz
2006
Fyzikální metody v biologii
Cena jednoho čísla 70 Kč
Founded in 1872 as „Časopis pro pěstování mathematiky a fysiky“ (Journal for
mathematics and physics)
Published in Czech and Slovak by Institute
of Physics, Academy of Sciences of the
Czech Republic
Published bimonthly, closing of this issue:
September 2006
5/
/ OBSAH /
vnitrek_5-06.qxd
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
281
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
Page 282
CONTENTS
Physicist methods in biology
/283 Editorial
/284 V. Vetterl / Biophysics at the treshold of the second millenium
/288 C. Hofr / Microcalorimetry of biologically significant molecules
/293 J. Vacek, M. Masařík, E. Paleček, M. Fojta / Electrochemical methods in analysis of
nucleic acids and proteins
/305 P. Rybár, T. Hianik / Study of physical properties of binary phospholipids mixtures
by means of Ultrasonic Velocimetry
/312 M. Melicherčík, J. Urban, T. Hianik / Study of model α-helical peptides and lipid
bilayers interaction by means of Molecular Dynamics
/319 D. Němeček, E. Kočišová, P. Praus, J. Štěpánek / Study of oligonucleotides by
advanced techniques of Optical Spectroscopy
/327 L. Šikurová / Characteristics and application of Merocyanin 540
/332 J. Plášek, D. Gášková / Fluorescent probes and membrane potential measurement
/340 K. Tománková, H. Kolářová, R. Kubínek, M. Vůjtek, H. Dušková / Atomic Force
Microscopy in biological application
/346 V. Dvořák / How tumors grow
František Mizera © 2006
282
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
23.10.2006
8:58
Page 283
Milí čtenáři,
v loňském roce jsme věnovali část čísla 6 hraničnímu oboru mezi fyzikou a chemií – chemické fyzice (Čs. čas
fyz. 55, 576 (2005)). Ohlas na toto číslo byl ze strany vás, čtenářů, velmi dobrý, proto jsme se rozhodli pokračovat v tomto směru dále. Výsledkem je číslo, které právě držíte v ruce, věnované další mezioborové problematice – biofyzice. Poněvadž ale biofyzika je sama o sobě velmi širokým vědním oborem, který by se nám jen stěží
podařilo celý obsáhnout, a vlastně by se to ani zcela neshodovalo s naší vlastní, čistě fyzikální tematikou,
rozhodli jsme se soustředit zájem na užší oblast – aplikaci fyzikálních metod v biologii a medicíně.
/ ÚVOD /
vnitrek_5-06.qxd
Abychom se ale s biofyzikou nerozloučili tak rychle, zařazujeme na úvod příspěvek Vladimíra Vetterla, který
se podrobněji věnuje vymezení pojmu biofyzika, historii i současnosti této mezioborové disciplíny a velmi fundovaně podává přehled některých významných směrů výzkumu. Je pochopitelné, že největší pozornost je
věnována Masarykově univerzitě v Brně – domovskému pracovišti prof. Vetterla.
Z širokého spektra témat, kterými se biofyzika zabývá, jsme vybrali několik článků, jejichž obsahem jsou
konkrétní aplikace experimentálních metod, dobře známých všem fyzikům. Za jeden z nejstarších „biofyzikálních výzkumů“ lze považovat výzkum elektřiny v živých organismech, se kterým začal v osmnáctém století Ital
Luigi Galvani. Ne o moc mladší jsou kalorimetrické experimenty zaměřené na sledování tepelné výměny
probíhající v živých organismech – tehdy byl sledován poměr výdeje tepla těla morčete a množství uvolněného
oxidu uhličitého. Od té doby se citlivost a spolehlivost této metody zvýšila natolik, že současné mikrokalorimetrické metody mohou být rutinně používány k stanovování základních termodynamických parametrů. Více
se dozvíte v článku Ctirada Hofra z PřF MU v Brně.
Ke starším metodám patří rovněž metody elektrochemické, jejichž použitelnost pro studium základních
stavebních kamenů živých organismů – nukleových kyselin a bílkovin – je známa již několik desetiletí. O nových
aplikacích této klasické metody informuje ve svém příspěvku Jan Vacek z Biofyzikálního ústavu AV ČR v Brně
se spoluautory. K metodám s dlouhou historií se řadí rovněž akustika, která je ve své varietě molekulární
akustiky silným nástrojem pro studium fyzikálních vlastností i biologických látek – jak ukazují autoři P. Rybár
a T. Hianik z Katedry jaderné fyziky a biofyziky FMFI UK v Bratislavě. Z tohoto pracoviště přišla rovněž práce
věnovaná metodám molekulové dynamiky.
Široce využívanými jsou v biofyzice dále nejrůznější optické metody. Například k sledování membránového
potenciálu – významného fyziologického parametru živých buněk. Mezi tyto metody patří spektrofluorimetrie,
proudová cytometrie a konfokální mikroskopie. Více se o těchto metodách dozvíte z článku J. Pláška
a D. Gáškové, kteří jej pojali rovněž jako průřez aktivitami biofyzikálního oddělení Fyzikálního ústavu MFF UK
v Praze. O jiné konkrétní aplikaci pokročilých optických technik – Ramanovy spektroskopie a fluorescenční
mikrospektroskopie – informují ve svém příspěvku autoři ze stejného pracoviště, Daniel Němeček a kol.
Fluorescenční spektroskopie je rovněž tématem článku L. Šikurové z FMFI UK v Bratislavě, která ukazuje
možnosti biofyzikálních a biomedicínských aplikací konkrétního fluorescenčního barviva merocyanínu 540.
Mezi moderní a prudce se rozvíjející experimentální metody bezesporu patří mikroskopie atomárních sil
(AFM), kterou lze využít k zobrazování vodivých i nevodivých vzorků, a navíc v nejrůznějších prostředích.
Biologickým aplikacím této metody se věnuje K. Tománková se spoluautory z Lékařské a Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci.
Poněkud nad rámec tématu experimetálních metod v biofyzice stojí článek Vladimíra Dvořáka o dynamice
růstu zhoubných nádorů vycházející z koncepce fraktální geometrie. Závěry tohoto článku jsou dech beroucí.
Ve stručnosti: dynamika růstu nádorů je univerzální a lze ji měnit (a snad i zastavit) stimulací imunitní odpovědi. Z toho vyplývá možnost nové nadějné terapie, která se už začala testovat na zvířatech i na člověku.
I když lze soubor článků publikovaných v tomto čísle označit pouze za stručný exkurs do zvoleného oboru,
věříme, že vás zaujme. To, že nám zbývá ještě mnoho témat ke zpracování, je výzvou, abychom se k této
problematice ještě v budoucnosti vrátili. Měli bychom se věnovat radiologii, nejrůznějším diagnostickým a terapeutickým metodám využívajícím fyzikální metody (ultrazvuková tomografie, rentgenová počítačová tomografie, laserová chirurgie apod.), za zmínku by rovněž stála i biomechanika a další. Všechny příspěvky
(i překladové články) s touto tematikou jsou vítány!
ANDREA CEJNAROVÁ
VÝKONNÁ REDAKTORKA
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
283
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
BIOFYZIKA
Page 284
NA PRAHU DRUHÉHO TISÍCILETÍ
Vladimír Vetterl, Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno
Biofyzika je dnes velmi dynamicky se rozvíjející vědní
obor. Co se ale vlastně za tímto názvem skrývá?
Dříve se vyskytoval názor, že biofyzika se zabývá
působením ionizujícího záření na organismy a že je
to vlastně jen modernější název pro radiobiologii.
Otázky související s vlivem ionizujícího záření na
živé organismy patří do biofyziky, je to však pouze
její část. Náplň biofyziky v celé její šíři snad nejlépe
vystihuje definice, kterou používal zakladatel
československé biofyziky prof. MUDr. et RNDr.
Ferdinand Herčík: „Biofyzika studuje účinky fyzikálních faktorů na biologické systémy a objasňuje
fyzikální zákonitosti, které se významně uplatňují
při základních biologických dějích.“
Prof. Herčík byl dlouhá léta vedoucím Biologického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně. 1. února 1954 zde založil Laboratoř
biofyziky jako součást bývalé Československé
akademie věd. 1. ledna 1955 se tato laboratoř stala
Biofyzikálním ústavem ČSAV. Prof. Herčík byl světově uznávaným odborníkem v oblasti biologických
účinků ionizujícího záření. Věděl, že k jejich objasnění je třeba sestoupit až na molekulární úroveň.
Původní vědecký tým Biofyzikálního ústavu složený
převážně z lékařů začal doplňovat o biology,
chemiky, biochemiky a fyziky.
VÝZKUM BUNĚČNÉHO JÁDRA A DNA
Ukázalo se, že klíčovou úlohu v poznání příčin biologických účinků ionizujícího záření mají nukleové
kyseliny, a to zejména kyselina deoxyribonukleová
(DNA) sídlící v buněčném jádře, ve které je ukryta
genetická informace a která tuto informaci přenáší
při reprodukci, dělení somatických buněk, buňky
mateřské na buňky dceřiné (Čs. čas. fyz. 50, 152
(2000)) Ionizující záření způsobuje velmi vážné
poškození integrity DNA, spočívající v přerušení
obou jejich řetězců a ke vzniku tzv. dvouřetězcových
zlomů (double strand break - DSB). Buňka je
vybavena mechanismy, které dovedou toto
poškození reparovat, avšak často při tom dochází
k chybám, které vedou k výměně genetického
materiálu mezi chromosomy a vznikají tak chromosomové aberace. Tyto aberace vedou často
k neomezené proliferaci buněk, což je charakteristický znak rakovinného bujení. I když poškození
DNA indukovaná ionizujícím zářením jsou známá už
několik desítek let, molekulární mechanizmy,
podílející se na reparaci tohoto poškození a na
vzniku chromosomových aberací dosud známé ne-
284
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
jsou. Současné metody molekulární biologie
umožňují sledovat proces reparace na živých
buňkách a současně umožňují zjistit, zda při
reparaci dochází k pohybu konců DSB, což by
mohlo zvýšit pravděpodobnost vzniku aberací. Tyto
metody také pomáhají odhalit molekulární mechanismy jiných důležitých procesů v buněčném jádře,
na př. sledování procesu pohybu cizorodé DNA
v cytoplasmě a buněčném jádře, což je důležité pro
objasnění nádorové transformace buněk virovou
DNA [1]. Jedná se především o metodu konfokální
mikroskopie živých buněk, v nichž jsou některé proteiny zviditelněny transfekcí příslušných genů spojených s fluorescenčním proteinem nebo krátkým
řetězcem aminokyselin, který poskytuje fluorescenci po detekci specifickým nízkomolekulárním
činidlem. Na BFÚ AV ČR se těmito problémy zabývá
jedna ze skupin ředitele ústavu doc. RNDr.
Stanislava Kozubka, DrSc. (RNDr. M. Falk, Ph.D.,
RNDr. V. Ondřej, Ph.D. a Ing. E. Lukášová, CSc.).
V popředí mimořádného zájmu lékařů, molekulárních biologů, biochemiků a biofyziků je bílkovina
p53, která zabraňuje vzniku nádorových onemocnění,
a proto bývá označována jako „tumor supressor“.
Na výzkumu tumor-supresorových proteinů,
spolupracuje BFÚ s Masarykovým onkologickým
ústavem (RNDr. B. Vojtěšek, DrSc. za MOU a doc.
RNDr. M. Fojta, CSc. a prof. RNDr. E. Paleček, DrSc.
za BFÚ). V současné době BFÚ AV ČR spolupracuje
také s LF MU a dalšími lékařskými pracovišti. Velmi
úspěšný je např. výzkum mnohočetného myelomu
v rámci centra základního výzkumu pod vedením
prof. MUDr. R. Hájka, CSc., za LF MU a RNDr.
E. Bártové, Ph.D. za BFÚ. Dalším významným projektem je výzkum struktury chromatinu u leukemických buněk, který je veden za LF MU prof.
MUDr. J. Mayerem, CSc., a za BFÚ ing. E.
Lukášovou. V součinnosti informatiků z Fakulty
informatiky MU a biologů z BFÚ pod vedením doc.
M. Kozubka, Ph.D., je již deset let vyvíjen software
pro optickou mikroskopii, který řídí špičkový
mikroskopický systém. Skupina je zapojena do centra základního výzkumu i do projektu 6. Rámcového
programu EU. Významná je také spolupráce se
stomatologickou klinikou Fakultní nemocnice u sv.
Anny v Brně v rámci Stomatologického výzkumného
centra, kde se BFÚ podílí na výzkumu biokompatibility titanových zubních implantátů. Centrum je
vedeno prof. MUDr. J. Vaňkem, CSc., z BFÚ je
vedoucím pracovníků podílejících se na tomto
výzkumu a jeho garantem autor tohoto článku.
23.10.2006
8:58
Page 285
BIOFYZIKA
BIOFYZIKA A NANOTECHNOLOGIE
V současné době se biofyzika úzce stýká s obory,
jako je nanobiologie a nanomedicína, které vznikly
díky rozvoji vědy a techniky v oblasti nanotechnologií, umožňujícími zobrazovat jednotlivé molekuly a manipulovat s nimi. Pro rozvoj nanotechnologií
měl zásadní význam objev skenovacího tunelového
mikroskopu (STM – Scanning Tunneling Microscope)
Binningem a Rohrem v r. 1981 a později vyvinuté
další typy skenovacích mikroskopů, zvláště mikroskop využívající atomárních sil (AFM – Atomic Force
Microscope). Pomocí nanotechnologií můžeme sledovat fyzikální vlastnosti jediné molekuly DNA, jako
je třeba její elektrická vodivost, flexibilita, síla nutná
k přetržení molekuly apod. Schopnost DNA hybridizovat s komplementárním řetězcem umožňuje díky
nanotechnologiím vytvářet z ní různé útvary a konstrukce [3] a uvažuje se o jejím využití v molekulární
elektronice ke konstrukci přístrojů, užívajících
molekuly DNA jako dráty, přepínače atd. S tím
vyvstává otázka elektrické vodivosti DNA. Bylo
zjištěno, že DNA je pro stejnosměrný proud velmi
špatně elektricky vodivá [3]–[8]. Odpor dvoušroubovicové DNA o délce 16 µm izolované z bakteriofága λ (λ-DNA) stanovený ze závislosti proudu na
napětí (I-E charakteristika) je za pokojové teploty
1016 Ω, DNA o délce 1,8 µm měla odpor 1012 Ω.
Monovrstva DNA obsahující asi 25 000 molekul měla
vodivost 0,7–1 x 10-3 S.cm-1 [3]. U dvojšroubovicové
DNA je vodivost dána převážně přeskokem elektronů mezi ne příliš vzdálenými páry bází v důsledku
tunelového jevu. Vodivost jednořetězové DNA je
ještě o dva řády nižší nežli vodivost dvoušroubovicové DNA. Větší elektrická vodivost DNA pro střídavý proud je vysvětlována Debyeovými relaxačními
ztrátami vznikajícími při reorientaci dipólů vody,
kterou je DNA hydratována [4].
Medicínské implantáty
Nanotechnologie umožňují rovněž zvýšit biokompatibilitu materiálů používaných pro implantáty v medicíně.
Častou příčinou zhoršení zraku, které může vést
až k oslepnutí, je zánik světločivých buněk (fotoreceptorů) sítnice – tyčinek a čípků – následkem
úrazu, onemocnění (retinitis pigmentosa) nebo
degenerativních změn ve stáří (makulární degenerace). Nejsou-li poškozeny nervové dráhy přenášející elektrické impulsy z fotoreceptorů do mozku, lze
zlepšení zraku docílit implantátem složeným z řady
fotodiod, které nahradí funkci tyčinek a čípků.
Implantát se zavádí buď na povrch sítnice (epiretinal), nebo pod sítnici (subretinal). Jednotlivá pracoviště přistupují k řešení této problematiky
odlišnými způsoby [9]-[11].
Křemíkové implantáty vkládané pod sítnici (ASR
– Artificial Silicon Retina – umělá křemíková sít-
NA PRAHU DRUHÉHO TISÍCILETÍ
nice) obsahují 4 až 5 tisíc mikrofotodiod napojených
na mikroelektrody. Fotodiody jsou stimulovány
světlem dopadajícím na sítnici a vznikající elektrické signály na elektrodách nabuzují přilehlé neurony sítnice [11]. Implantáty vyráběné společností
Optobionics, Naperville, USA, mívají průměr
2–3 mm a tloušťku 50–100 µm. Nevyžadují vnější
elektrický zdroj, dopadající světelná energie
postačuje ke stimulaci. Životnost těchto implantátů
zkoušená na zvířatech je asi třicet měsíců [11].
U šesti pacientů trpících chorobou retinitis pigmentosa došlo po vložení ASR ke zlepšení subjektivního vjemu jasu, kontrastu, barev, pohybu a tvaru
[11].
Implantáty vkládané pod sítnici mají výhodu
v tom, že jsou umístěny blízko nervových buněk sítnice a mohou je stimulovat nižším elektrickým proudem. Jejich nevýhodou je, že zhoršují výživu vnitřní
části sítnice. Další nevýhodou je, že jsou umístěny
v prostředí o špatné tepelné vodivosti a jejich ohřev
dopadající světelnou energií by mohl vést k poškození sítnice.
Implantáty umístěné na povrchu sítnice jsou
tvořeny řadou elektrod, které dostávají elektrické
signály digitalizovaného obrazu vysílané videokamerou umístěnou mimo tělo pacienta, např. na
obroučce brýlí. Elektrody implantátu pak stimulují
gangliové buňky sítnice a vyvolávají optický vjem.
Implantát vyráběný společností IIP Technologies má
průměr 4–5 mm a obsahuje pouze šestnáct elektrod.
Jiná firma zabývající se vývojem a výrobou sítnicových implantátů umístěných na povrch sítnice je The
Boston Retina Implant Project. Výhodou těchto
implantátů je, že signál vysílaný kamerou lze upravit, zesílit, optimalizovat, což může vést ke zlepšení
kvality optického vjemu. Výhodou je rovněž jejich
menší zahřívání, protože jsou umístěny v prostředí,
které je dobře tepelně vodivé (sklivec) [11].
Křemíkové sítnicové implantáty se nacházejí
v agresivním biologickém prostředí, které může
narušit jejich funkci a snížit životnost. Proto je
snaha o jejich „zapouzdření“ do ochranného „obalu“.
V poslední době se k tomu užívá nanotechnologií
a křemíkové implantáty se povlékají nanodiamantovou vrstvou tvořenou drobnými diamantovými
zrnky o průměru asi 5 nm [10]. Tuto vrstvu lze
„bioaktivovat“ vložením např. aminokyselin, což
vede k jejich větší biokompatibilitě. Křemíkové sítnicové implantáty pokryté nanodiamantovou
vrstvou vyrábí např. firma Second Sight, Sylmar,
Kalifornie. V ČR se intenzivně věnuje problematice
nanodiamantových vrstev a jejich bioaktivace
Fyzikální ústav AV ČR (RNDr. Jan Kočka, DrSc.)
a Fyzikální ústav Matematicko-fyzikální fakulty UK
(Doc. RNDr. Jaromír Plášek, CSc.) v rámci Centra
nanotechnologií a materiálů pro nanoelektroniku,
které zahájilo činnost 1. května 2005.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
285
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
286
23.10.2006
8:58
Page 286
První pokus s implantací umělé křemíkové sítnice
společnosti Second Sight slepým pacientům se
konal v r. 2002. Implantát o šestnácti elektrodách
umožnil pacientovi rozlišit talíř od šálku a rozeznat
větší písmena. K získání jasnějšího obrazu a větší
rozlišovací schopnosti by implantát musel mít tisíce
elektrod [9].
V biologii umožňují nanotechnologie studovat
např. fyzikální mechanismy vedoucí ke kompaktizaci DNA v chromozomech [12]. V eukaryontních
buňkách je DNA spolu se specifickými proteiny –
histony součástí chromatinu, který vytváří specifické struktury zvané chromosomy. V chromosomech je chromatin svinut vysoce organizovaným,
avšak dosud ne zcela známým způsobem, který
zajišťuje jednak zkrácení délky, u lidí cca 2 m dlouhé
DNA, a současně dovoluje realizaci v ní obsažené
genetické informace. První stupeň kondenzace DNA
spočívá v obtočení DNA 2x kolem disku histonů
o průměru 8,5 nm a šířce 6,7 nm a nazývá se nukleosomovou strukturou. Tato struktura, nazývána také
"šňůra perel", je dále podrobena vyššímu stupni
kondenzace chromatinu, které představuje základní
vlákno chromatinu, jehož průměr je 30 nm. Na způsob svinutí nukleosomového vlákna do této základní struktury chromatinu však existují v současné
době různé názory. Histon má na povrchu kladný
náboj, kterým přitahuje záporně nabitou cukr-fosfátovou kostru DNA. Protože vazba DNA na histony je
elektrostatická, je ovlivněna koncentrací elektrolytu, ve kterém se chromatin nachází. Při nízké
koncentraci elektrolytu nejsou záporné náboje na
fosfátech DNA stíněny, odpuzují se a DNA se stává
tuhou, roztaženou, nemůže se „omotat“ kolem histonu. Při velmi vysoké koncentraci elektrolytu je
DNA elektrostaticky odstíněna od histonu a nemůže
se na něj navázat. Existuje však určitá optimální
střední koncentrace příhodná pro vazbu DNA na histon. Byl zhotoven model chromatinu, kde histony
jsou nahrazeny sférickými nanočásticemi. Bylo
zjišťováno, jak poloměr nanočástice a koncentrace
elektrolytu, ve kterém se nacházejí, ovlivňuje účinnost kompaktizace chromatinu [12].
Současné moderní fyzikální metody umožňují
podrobnější náhled do nitra buňky, studium jednotlivých molekul a organel v buňce [13] a trojrozměrné
zobrazení buňky [14]. Metoda FRET (fluorescence
resonance electron transfer) dovoluje stanovit
vzdálenost molekul („spektroskopické pravítko“)
v řádu nanometrů [15]. Metoda HILO (highly
inclined and laminated optical sheet microscopy)
umožňuje zviditelnit jednotlivé molekuly v buňce
a jejich transport obalem buněčného jádra [16],
metoda CARS (coherent anti-stokes Raman scattering spectroscopy) mapuje jednotlivé molekuly
využitím vibračních vlastností jejich chemických
vazeb [17].
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
1/ Měření vodivosti DNA (dvoušroubovicová poly
(dG). poly (dC) o 30 párech bazí, délka 10,4 nm)
uchycené mezi Pt nanoelektrodami vzdálenými 8 nm
(převzato z D. Porath, A. Bezryadin, S. de Vries,
C. Dekker, Nature 403, 635 (2000)).
Mezinárodní spolupráce biofyziků je organizována
zejména společnostmi International Union of Pure
and Applied Biophysics (IUPAB) a European
Biophysics Societies Association (EBSA). Předsedou českého komitétu IUPAB je ředitel BFÚ AV ČR
doc. RNDr. Stanislav Kozubek, DrSc., předsedou
slovenského komitétu IUPAB je prof. RNDr. Pavol
Miškovský, DrSc., oddělení biofyziky Přírodovědecké fakulty, Univerzita P. J. Šafaříka, Košice.
Koncem srpna loňského roku se konal v Montpellier
15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics
Congress. Další mezinárodní organizace, koordinující spolupráci biofyziků zabývajících se bioelektrochemií a bioenergetikou jsou International Society
of Electrochemistry (ISE) a Bioelectrochemical
Society (BES). Sekci Bioelektrochemie v ISE vede
prof. Ana Brettová, University of Coimbra,
Portugalsko. V dubnu letošního roku ISE pořádala
ISE Spring Meeting 2006 v Singapuru, kde jedna ze
sekcí byla věnována nanobiologii a nanomedicíně.
Biofyzikální problematika bývá také často náplní
Heyrovského diskusí, které každoročně pořádá
Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR.
VÝUKA BIOFYZIKY V ČR A NA SLOVENSKU
Pro potřeby lékařů je již dlouhou řadu let zavedena
zpravidla dvousemestrová výuka lékařské fyziky
a biofyziky na lékařských fakultách. Na přírodovědeckých, případně matematicko-fyzikálních
fakultách byla výuka biofyziky jako samostatného
programu při fyzikálních oborech zavedena mnohem později. Tak např. v r. 1968 bylo zahájeno
studium biofyziky na Fyzikálním ústavu Matematicko-fyzikální fakulty Karlovy univerzity,
v r. 1978 na katedře experimentální fyziky
Palackého univerzity v Olomouci. V Bratislavě
započali s výukou biofyziky na Přírodovědecké
fakultě Univerzity Komenského už v r. 1964.
Samostatná katedra biofyziky tam vznikla v r. 1978
23.10.2006
8:58
Page 287
BIOFYZIKA
a po vytvoření Matematicko-fyzikální fakulty UK se
v r. 1980 stala její součástí a byla přejmenována na
Katedru biofyziky a chemické fyziky. Dnes se jmenuje Katedra jadrovej fyziky a biofyziky, vedoucím je
prof. RNDr. Tibor Hianik, DrSc.1
Na katedře fyzikální elektroniky Přírodovědecké
fakulty Masarykovy univerzity v Brně byly již od
r. 1970 zadávány diplomové práce s biofyzikální
tematikou díky tehdejšímu vedoucímu katedry prof.
RNDr. Vratislavu Kapičkovi, DrSc., a prof. RNDr.
Janu Jančovi, DrSc. Posluchačům přednášel úvodní
kurs biofyziky autor tohoto článku. Avšak k širšímu
rozvoji výuky biofyziky tu mohlo dojít až po politických změnách v našem státě v r. 1989, kdy se stal
děkanem PřF MU prof. RNDr. Eduard Schmidt, CSc.
Ten začal usilovat o zřízení magisterského a doktorandského studia biofyziky při oboru fyzika.
Studium bylo akreditováno v r. 1991 při Katedře
fyzikální elektroniky vedené prof. RNDr. Janem
Jančou, DrSc.
Později začal v té době už rektor MU prof.
Schmidt a tehdejší děkan LF MU prof. MUDr. Jiří
Vorlíček, CSc., uvažovat o tom, že by bylo žádoucí,
aby se výuky biofyziky na PřF a LF vzájemně
doplňovaly a aby bylo zřízeno jedno centrální pracoviště. To se posléze uskutečnilo, takže v současné
době působí na MU Centrum biofyziky vedené prof.
RNDr. Vojtěchem Mornsteinem, CSc., vedoucím
Biofyzikálního ústavu LF MU, které zastřešuje
výuku biofyziky jak na přírodovědecké, tak i na
lékařské fakultě MU. Garantem doktorandského
studia biofyziky a předsedou příslušné oborové
komise je prof. RNDr.Viktor Brabec, DrSc., který je
současně vedoucím jedné z laboratoří BFÚ AV ČR.
Výuka biofyziky na PřF MU spadá pod Ústav fyziky
kondenzovaných látek, vedený prof. RNDr. Josefem
Humlíčkem, DrSc.
1
NA PRAHU DRUHÉHO TISÍCILETÍ
Literatura
[1] V. Ondřej, S. Kozubek, E. Lukášová, M. Falk,
Pa. Matula, Pe. Matula, M. Kozubek, Chrom Res. 14,
505 (2006).
[2] E. Lukášová, Z. Kořistek, M. Falk, S. Kozubek,
S. Grigoryev, M. Kozubek, I. Kroupová. J. Leuk. Biol.
77(1), 100 (2005).
[3] B. M. Hartell: DNA manipulation and
charakterization for nanoscale electronics.
Ph.D.Thesis, Ohio University, 2004.
[4] M. Briman, N. P. Armitage, E. Helgren, G. Gruner:
Dipole relaxation losses in DNA. Nano Letters 4,
733 (2004).
[5] E. Paleček, F. Jelen: In: Perspectives in Bioanalysis.
Vol. 1. (Eds.: E. Paleček, F. Scheller, J. Wang).
Elsevier, Amsterdam 2005, s. 141.
[6] T. Heim, D. Deresmes, D. Vuillaume: Conductivity
of DNA probed by conducting-atomic force
microscopy: Effect of contact electrode, DNA
structure and surface interactions. J.Appl.Phys. 96,
2927 (2004).
[7] A. Terawaki, Y. Otsuka, H. Y. Lee, T. Matsumoto,
H. Tanaka, T. Kawai: Conductance measurement of
DNA network in nanoscale by point contact current
imaging atomic force microscopy. Appl. Phys.
Letters 86, Art.No.113901 (2005).
[8] Y. Ito, E.Fukusaki: DNA as a "Nanomaterial".
J.Mol.Catalysis B: Enzymatic 28, 155 (2004).
[9] D. Palanker, A. Vankov, P. Huie, S. Baccus: Design of
a high resolution optoelectronic retina prosthesis.
J.Neural Eng. 2, 105 (2005).
[10] D. D. Zhou, R. J. Greenberg: Microsensors and
microbiosensors for retina implants. Front Biosci.
10, 166 (2005).
[11] P. Hossain, I. W. Seetho, A. C. Browning,
W. M. Amoaku: Artificial means for restoring
vision. BMJ 330, 30 (2005).
[12] A. A. Zinchenko, K. Yoshikava, D. Baigl: Compaction
of single chain DNA by histone-inspired
nanoparticles. Phys. Rev. Lett. 95, 228101 (2005).
[13] P. Schwille: Single molecule spectroscopy in situ:
towards understanding the cell on a molecular
level. Europ. Biophys. J. 34, 531 (2005).
[14] W. P. Baumeister: Mapping molecular landscapes
inside cells by cryoelectron tomography. Europ.
Biophys. J. 34, 531 (2005).
[15] R. Steinmeyer, G. S. Harms: Combined FRET and
anisotropy measurements synchronized with patch
clamping. Europ. Biophys. J. 34, 536 (2005).
[16] M. Tokunaga, N. Imamoto: Single molecule imaging
of nuclear transport in living cells and
quantification of interactions. Europ. Biophys. J.
34, 536 (2005).
[17] N. Jaker, D. Gachet, P.-F. Lenne, H. Rigneault:
Refractive effects in coherent anti-stokes Raman
scattering (CARS) microscopy. Europ. Biophys. J.
34, 575 (2005).
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
Pozn. red.: Uvedená pracoviště pochopitelně nejsou jediná, kde se v současné době dá obor biofyzika (a jí blízké obory)
studovat. Za zmínku jistě stojí např. Biologická fakulta Jihočeské univerzity založená v roce 1991, nejmladší fakulta
ČVUT založená v roce 2005 – Fakulta biomedicínského inženýrství ČVUT v Kladně, Farmaceutická fakulta UK v Hradci
Králové a další.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
287
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
Page 288
MIKROKALORIMETRIE
BIOLOGICKY
VÝZNAMNÝCH MOLEKUL
Ctirad Hofr, Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodovědecká fakulta MU,
Kamenice 5, 625 00 Brno
Díky technologickému pokroku došlo v posledním desetiletí ke zvýšení citlivosti
mikrokalorimetrických technik na úroveň, která umožňuje jejich rutinní použití pro
získávání komplexního popisu termodynamického chování biologicky významných
molekul v roztoku. Mikrokalorimetrické metody jsou schopny přímo sledovat interakci
makromolekul a popisovat jejich energetickou stabilitu. Tento článek vysvětluje princip
izotermální titrační kalorimetrie a diferenční skenovací kalorimetrie a zabývá se
určováním základních termodynamických parametrů z mikrokalorimetrických
záznamů. Přímé stanovení kinetických a energetických parametrů vazby molekul
umožňuje využívání mikrokalorimetrických přístupů při farmakokinetických
studiích. Na příkladech jsou demonstrovány možnosti použití termodynamické
analýzy při in-situ testování nových typů léčiv a je přiblíženo využití
termodynamických dat získaných analýzou interakce stávajících léčiv pro cílené
navrhování léčiv nových.
HISTORIE A POKROKY KALORIMETRIE
Od počátku studia přírodních zákonitostí byl
vědecký zájem zaměřen na sledování procesů tepelné výměny u živých organismů. Při jednom z prvních
kalorimetrických experimentů bylo do tepelně izolované nádoby uzavřeno morče. Byl sledován poměr
výdeje tepla těla morčete a množství uvolněného
oxidu uhličitého. Bylo zjištěno, že změřená hodnota
byla podobná poměru určenému pro spalování uhlí.
To společně s dalšími experimenty prokázalo, že
dýchání je zvláštní formou pomalého spalování.
Tento pokus provedli v tzv. ledovém kalorimetru
Antoine Lavoisier a Pierre-Simon Laplace v roce
1782. Je to první známý experiment, při kterém byla
změřena tepelná výměna u biologického systému,
a je považován také za první v rámci nové vědní disciplíny zabývající se stanovením tepelné výměny
u biologických systémů, která byla později pojmenována biokalorimetrie.
Technický pokrok postupně posouval hranice
citlivosti detekce od množství tepla produkovaného
celými organismy až na současnou úroveň několika
mikrojoulů, kdy je možno sledovat tepelné změny
doprovázející vzájemné interakce makromolekul.
Zvýšení citlivosti kalorimetrů bylo umožněno nejen
díky technologickému rozvoji, ale zejména díky
nově navrženému systému detekce tepelné výměny
[1]. Technické vylepšení instrumentace a rozvoj
separačních technik, zejména kapalinové chromatografie, umožnily začít rutinně měřit energetické
charakteristiky biologicky významných makromolekul, zejména proteinů a nukleových kyselin.
První kalorimetrická měření přispěla k potvrzení
288
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
a rozvinutí teorie termodynamického chování
makromolekul v roztocích [2]. Byla rovněž podrobně zpracována teorie tepelně indukovaných strukturních přechodů nukleových kyselin [3]. Rozšíření
teoretických základů vysvětlujících termodynamické chování makromolekul umožnilo relativně
rychlou aplikaci kalorimetrie ve vědních disciplínách zabývajících se interakcí makromolekul.
Dokladem výrazného zvýšení popularity mikrokalorimetrie a možností její aplikace v širokém
spektru vědeckých disciplín je nárůst počtu vědeckých prací, které obsahují kalorimetrická měření.
S rostoucím zájmem o kalorimetrii souvisí mimo
jiné také relativně vysoká komerční úspěšnost
firem, které se zabývají vývojem a výrobou přístrojů
pro mikrokalorimetrická měření [4], [5].
TERMODYNAMICKÁ CHARAKTERIZACE
INTERAKCE MAKROMOLEKUL
Při vzájemné vazbě makromolekul se obvykle
uplatňují nekovalentní interakce, jejichž energetické
příspěvky jsou relativně malé, ale díky jejich velkému množství a často kooperativnímu působení mají
výrazný vliv na způsob a rychlost vzájemné vazby
makromolekul.
Jestliže uvažujeme vazbu molekuly M a jiné
molekuly L, kterou můžeme pro zjednodušení nazývat ligand, může být reakce vyjádřena:
(1)
Vazebná konstanta Kv příslušná reakci je pak dána
poměrem molární koncentrace vznikajícího kom-
23.10.2006
8:58
Page 289
MIKROKALORIMETRIE
plexu [M•L] a součinu molárních koncentrací jednotlivých reagujících molekul [M] a [L]:
(2)
Volná energie je pro vazbu M a L vyjádřena za standardních podmínek
BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MOLEKUL
ka toho, že se při vazbě uplatnily hydrofobní interakce. V tomto případě se při vazbě makromolekul
do volného roztoku uvolňují molekuly vody, které
byly původně uspořádány do vrstev kolem později
vzájemně reagujících hydrofobních částí makromolekul. To má za následek snížení schopnosti
celého systému molekul přijímat teplo, což se projeví celkovým snížením tepelné kapacity.
(3)
IZOTERMÁLNÍ TITRAČNÍ KALORIMETRIE
kde R je molární plynová konstanta a T je absolutní
teplota v kelvinech. Vazba makromolekul M a L je
možná, pouze je-li změna volné energie ∆G po asociaci makromolekul L a M negativní.
Z následující rovnice plyne vztah mezi volnou
energií, entalpií a entropií systému molekul:
(4)
Jak je patrno z rovnice (4), entalpický a entropický
příspěvek působí na celkovou změnu volné energie
∆G opačně. Zjednodušeně je možno říct, že vazebná
entalpie ∆H je z molekulárního hlediska teplo spojené se vznikem, zánikem a deformací chemických
vazeb. Vazebná entalpie ∆H obvykle popisuje změny
v počtu a typu vodíkových můstků. Hodnota ∆H je
negativní, jestliže během vzájemné vazby molekul
dochází k celkovému zvýšení množství a zesílení
vodíkových můstků; ∆H je naopak pozitivní, jestliže
dojde k zániku nebo zeslabení vodíkových můstků.
Pro měření termodynamických veličin makromolekulárních interakcí je výhodné jejich vyjádření
pomocí tepelné kapacity, kterou lze experimentálně
určovat. Tepelná kapacita Cp udává teplo, které je
nutno dodat za konstantního tlaku soustavě, aby se
ohřála o jeden stupeň.
Vazebná entalpie H při ději za stálého tlaku je zapsána pomocí tepelné kapacity
(5)
Změna entropie ∆S při dané teplotě T je spojena se
změnou v uspořádanosti systému molekul. Změna
entropie je pozitivní, jestliže při vzájemné vazbě
makromolekul dojde k uvolnění molekul vody
vázaných na povrchu makromolekul z prostoru
vazebného místa do volného roztoku. Tím se zvýší
neuspořádanost systému molekul a dojde ke zvýšení
celkové entropie. Negativní změna entropie většinou provází změny, při kterých dochází k omezení
možných konformačních stavů makromolekul.
(6)
Jestliže po vzájemné vazbě makromolekul dojde
k pozitivní změně entropie ∆S, která je doprovázena
negativní změnou tepelné kapacity ∆Cp, je to znám-
Izotermální titrační kalorimetrie (ITC z angl.
Isothermal Titration Calorimetry) přímo měří
změnu vazebné entalpie při interakci molekul v roztoku. Uspořádání měřicí části izotermálního
titračního kalorimetru ukazuje obr. 1, část a.
Referenční a vzorková měřicí cela mají tvar mince.
Plní se kapilárami, přičemž referenční cela je
zpravidla plněna pouze samotným pufrem. Objem
cel je řádově jeden mililitr. Teplota obou cel je
během celého měření udržována konstantní. Při
měření je do reakční cely s roztokem makromolekul
postupně, za stálého míchání, přidáván roztok vázající se molekuly – ligandu. Obvykle je koncentrace
ligandu přibližně desetkrát vyšší než koncentrace
molekuly v reakční cele. Celkový objem ligandu
v injektoru je 100–250 µl. Při interakci makromolekul s ligandem dochází k tepelným efektům,
které se projeví rozdílem teploty referenční cely
a cely se vzorkem. Rozdíl teplot je detekován
speciálně tvarovaným termočlánkem umístěným
v prostoru mezi celami. Termočlánek je spojen
s okruhem, který při známé tepelné kapacitě cely
vypočte dle vztahu (5) tepelný rozdíl a zajistí změnu
přísunu elektrické energie pro vyrovnání teplot
obou cel. Při exotermické reakci, kdy se při vazbě
molekul uvolňuje teplo, je přísun energie snížen,
naopak v případě endotermické reakce se teplo
spotřebovává a přísun energie je zvýšen. Změna
dodávané energie v závislosti na čase je zaznamenávána a je vztažena k okamžité koncentraci jednotlivých složek v reakční cele. Výsledkem měření je
závislost změny tepelné kapacity na čase. Následně
je provedena korekce na tepelné vlivy spojené
s ředěním ligandu a mícháním, což se provádí
odečtením referenční křivky získané při měření za
totožných podmínek, ale bez přítomnosti makromolekul v roztoku. Integrací je následně vypočtena
křivka závislosti vazebné entalpie na molárním
poměru ligandu a makromolekuly v cele. Nelineární
analýza výsledné křivky umožňuje na základě jednoho měření určit vazebnou entalpii ∆H, vazebnou
konstantu Kv a stechiometrii reakce N.
Výsledná sigmoidální křivka (obr. 1, část b) je
tvořena body, které udávají vazebnou entalpii příslušnou ke každému přídavku ligandu do reakce.
Hodnota signálu je největší na začátku titrace, kdy je
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
289
23.10.2006
8:58
Page 290
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
velký nadbytek makromolekul v cele a zpravidla
určuje hodnotu vazebné entalpie ∆H ligandu
k makromolekule. Postupně v průběhu titrace
dochází k obsazování vazebných míst ligandem
a odpovídajícímu snižování tepelného signálu až do
stavu, kdy dojde k nasycení vazebných míst a v roztoku se nachází volný ligand. Z tvaru titrační křivky
lze určit vazebnou konstantu Kv a ze vztahu (3)
následně změnu volné energie ∆G spojené se vzájemnou vazbou molekul. Poloha inflexního bodu
křivky udává stechiometrický poměr N ligandu
a makromolekuly při vzájemné vazbě. Právě schopnost určit přímo stechiometrii vazby makromolekul
činí z izotermální titrační kalorimetre jedinečný
nástroj pro studium interakce multimerních molekulových komplexů, kdy je stanovení vzájemného
poměru reagujících molekul často složité.
ITC PŘI NAVRHOVÁNÍ NOVÝCH LÉČIV
1/ (a) Schéma izotermálního titračního kalorimetru.
(b) V horní části je záznam tepla dodávaného do
reakční cely při titračním experimentu, kdy byl do
roztoku krátkého jednořetězcového fragmentu DNA
postupně přidáván komplementární řetěz. Docházelo
k hybridizaci – vzniku dvoušroubovice DNA, při kterém
se uvolňuje teplo, takže bylo nutno snížit dodávanou
tepelnou energii po každém přidání komplementárního
řetězce. Dolní panel ukazuje záznam, který vznikl
integrací jednotlivých signálů. Ze záznamu lze po
nelineárním proložení odečíst vazebnou entalpii ∆H,
vazebnou konstantu Kv a stechiometrii reakce N.
290
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
Izotermální titrační kalorimetrie našla své uplatnění
při navrhování léčiv. Limitujícím faktorem při vývoji
nových léčiv je schopnost léčiva dosáhnout místa
svého působení, dále zajištění postupného
uvolňování léčiva a častý požadavek na rozpustnost
léčiva ve vodě. Chemická povaha léčiva někdy
neumožňuje optimální splnění všech výše uvedených podmínek. Jednou z možností jak zlepšit farmakokinetické vlastnosti léčiva je navázat léčivo na
molekulu speciálně navrženého nosiče. Po podání
komplexu nosiče a léčiva pak může dojít k cílenému
transportu na místo účinku, kde postupně dochází
k uvolňování léčiva. Příkladem takových nosičových
molekul jsou cyklodextriny a jejich deriváty (obr. 2).
Cyklodextriny jsou v přírodě se vyskytující cyklické
oligosacharidy. Uvolňování léčiva je řízeno vazebnou afinitou léčiva a cyklodextrinu. Při hledání
vhodné nosičové molekuly cyklodextrinu se provádí
měření vazebné charakteristiky za použití ITC.
Na základě změřených hodnot vazebných charakteristik se zvolí nejvhodnější kandidát pro
nosičovou cyklodextrinovou molekulu daného léčiva. Cyklodextrinové nosiče jsou v současnosti
testovány při vývoji nových léčiv proti malárii,
rakovině tlustého střeva a různým druhům zánětů
[6]–[8].
2/ Cyklodextriny mohou sloužit jako nosičové
molekuly pro různé typy léčiv.
23.10.2006
8:58
Page 291
MIKROKALORIMETRIE
BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MOLEKUL
DIFERENČNÍ SKENOVACÍ KALORIMETRIE
Další kalorimetrická metoda, která umožňuje sledovat změny termodynamických parametrů molekul
po vzájemné vazbě, je diferenční skenovací
kalorimetrie (DSC z angl. Differential Scanning
Calorimetry). Jedno měření za použití DSC
umožňuje určit termodynamické parametry stability
makromolekul z množství tepla, které je uvolněno
nebo spotřebováno při tepelně indukovaných konformačních přechodech (např. tání DNA nebo denaturaci proteinů). Z rozdílu termodynamických
charakteristik pro makromolekulu s navázaným ligandem a nemodifikovanou makromolekulu je pak
určen termodynamický vliv vazby ligandu na energetickou stabilitu makromolekuly. Nejdříve se
stanoví hodnoty termodynamických parametrů pro
denaturaci nemodifikované makromolekuly, které
se následně odečtou od hodnot parametrů pro
denaturaci makromolekuly s navázaným ligandem,
jak je ukázáno následujícím vztahem:
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
(7)
Při měření je kontinuálně zahřívána cela se vzorkem
a cela referenční naplněná pouze pufrem (obr. 3,
část a). Teplota se obvykle mění v rozsahu 0-100 °C
s gradientem 1 °C/min. Jestliže dojde v cele se
vzorkem k denaturaci neboli tání dvoušroubovice
DNA, kdy se část dodaného tepla spotřebuje pro
narušení nekovalentních vazeb a oddělení komplementárních řetězců DNA, bude teplota cely se
vzorkem nižší než teplota cely referenční. Z rozdílu
teplot mezi oběma celami, který je zaznamenáván
termočlánkem, je určena dodatečná energie, která je
potřebná pro vyrovnání teplot obou cel. Tato
dodatečná energie je zaznamenávána. Výsledkem
měření je termogram, který udává závislost tepelné
kapacity Cp roztoku makromolekuly na teplotě.
Integrací termogramu lze přímo určit změnu
entalpie H příslušnou tání DNA podle (5) a po integraci závislosti Cp/T na teplotě ∆S podle (6).
Hodnota volné energie ∆G je vypočtena podle
vztahu (4). Teplota odpovídající maximu termogramu je teplota tání Tm, která charakterizuje teplotní
stabilitu DNA. Při teplotě tání Tm je právě polovina
molekul v denaturovaném stavu.
VYUŽITÍ DSC PŘI HLEDÁNÍ NOVÝCH LÉČIV
Diferenční skenovací kalorimetrie byla úspěšně
využita při popisu termodynamických změn
vyvolaných kovalentní vazbou protinádorově účinných koordinačních sloučenin kovů na DNA.
Protinádorový účinek komplexů platiny je obecně
spojován se strukturními a energetickými změnami
DNA, které jsou jejich vazbou vyvolávány. Klinicky
3/ (a) Schéma diferenčního skenovacího kalorimetru.
(b) Normalizované záznamy měření tání krátkého
fragmentu DNA bez modifikace a s navázanou
protinádorově účinnou cisplatinou. Hodnoty změny
entalpie ∆H ukazují, že vytvoření komplexu
cisplatina-DNA výrazně snížilo hodnotu entalpie pro
tání DNA, což odpovídá narušení vodíkových vazeb
přibližně v rozsahu pěti párů bází v okolí navázané
cisplatiny. (c) Strukturní změny dvoušroubovice DNA
po vytvoření komplexu cisplatina-DNA
používané protinádorové komplexy, jako je cisplatina, jsou však účinné proti relativně úzkému spektru
nádorů. Léčba s sebou nese nežádoucí vedlejší
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
291
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
Page 292
účinky a po čase dochází ke vzniku rezistence. Pak
je nutno zvyšovat dávku podávaných léčiv. Tyto
skutečnosti podněcují hledání nových protinádorových farmak, která by umožnila účinnější léčbu
s menšími vedlejšími účinky. Při cíleném hledání
nových léčiv může být s výhodou využito poznatků
získaných podrobným popisem změn struktury
a termodynamické stability DNA, které jsou
vyvolány protinádorově účinnými komplexy a jejich
neúčinnými izomery [9], [10]. Změny ve struktuře
a termodynamické stabilitě DNA jsou signálem pro
specifické proteiny, které rozpoznávají modifikovanou DNA a mohou se podílet na mechanismu
protinádorového účinku. Na základě těchto poznatků jsou pak navrhovány nové typy sloučenin,
které mohou být účinné proti doposud neléčitelným
typům nádorů, a léčba těmito novými farmaky nebude tolik zatěžovat organismus pacienta.
VÝHLEDY DO BUDOUCNA
Aby mohlo dojít k širšímu používání kalorimetrie,
bude nutno dále zvyšovat její citlivost. Při extenzivním hledání nových léčiv vyvstává požadavek
analyzovat v krátkém čase velké množství vzorků.
Nedávno se na trhu objevily DSC a ITC přístroje,
které jsou schopny měřit vzorky automaticky [5].
Vyvíjejí se kalorimetry na bázi čipů, které umožní
zvýšit počet vzorků měřených při jedné analýze
a zároveň snížit jejich spotřebu [11]. Mikrokalorimetrie je metodou, která má velký potenciál pro
monitorování mezimolekulových interakcí bez nutnosti speciální vizualizace reagujících molekul. Jako
jedna z mála experimentálních metod umožňuje pří-
292
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
mou a rychlou energetickou charakterizaci molekul.
Nové poznatky o termodynamickém chování
molekul mohou být pak s výhodou využity při
následné počítačové simulaci, což dovolí rychlejší
a efektivnější cílené navrhování nových typů farmak, která budou mít žádané farmakokinetické
vlastnosti. Tyto skutečnosti činí mikrokalorimetrické přístupy velmi atraktivní pro využití v moderní
strategii vývoje nových farmak. Jestliže dojde
k naplnění očekávání vkládaných do vývoje nových
typů kalorimetrů, význam mikrokalorimetrie při
hledání nových léčiv bude dále vzrůstat.
Literatura
[1] V. Plotnikov, J. M. Brandts, L. L. Lin, J. F. Brandts,
Analytical Biochemistry 250, 237 (1997).
[2] T. M. J. Record, C. F. Anderson, T. M. Lohman,
Quarterly Reviews of Biophysics II 2, 104 (1978).
[3] L. A. Marky, K. J. Breslauer, Biopolymers 26, 1601
(1987).
[4] Calorimetric Sciences Corp: [06-2006], URL:
http://www.calscorp.com.
[5] Microcal: [06-2006], URL:http://www.microcalorimetry.com.
[6] S. A.Charman, C. S. Perry, F. C. K. Chiu,
K. A. Mcintos, R. J. Prankerd, W. N. Charman,
Journal of Pharmaceutical Sciences 95, 256 (2005).
[7] T. Schluep, J. Cheng, K. T. Khin, M. E. Davis, Cancer
Chemotherapy and Pharmacology 57, 654 (2006).
[8] K. Uekama, Chem. Pharm. Bull. 52, 900 (2004).
[9] C. Hofr, V. Brabec, J. Biol. Chem. 276, 9655 (2001).
[10] C. Hofr, V. Brabec, Biopolymers 77, 222 (2005).
[11] F. E. Torres a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101,
9517 (2004).
23.10.2006
8:58
Page 293
ELEKTROCHEMICKÉ
METODY V ANALÝZE
NUKLEOVÝCH KYSELIN A BÍLKOVIN
Jan Vacek, Michal Masařík, Emil Paleček,
Miroslav Fojta, Laboratoř biofyzikální chemie a molekulární onkologie,
Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno
Jak nukleové kyseliny, tak bílkoviny jsou elektrochemicky aktivní látky a ke studiu
jejich vlastností lze tudíž využívat elektrochemické metody. Ačkoli je tato skutečnost
známa již několik desetiletí, současný rozmach molekulární biologie vytvořil příznivé
podmínky pro nové aplikace elektrochemie v analýze biomakromolekul. Vzrůstá
množství informací o úloze jednotlivých genů a jejich proteinových produktů
v buněčných regulačních procesech a v patogenezi závažných onemocnění. Očekává se,
že tyto znalosti bude možné využívat jak pro přesnou a včasnou diagnostiku, tak pro
vývoj cílených léčebných postupů. Dosažení těchto cílů by mohlo být příznivě ovlivněno
pokrokem v oblasti nových či alternativních bioanalytických technik, které by byly
nenákladné, rychlé, účinné, citlivé a přesné. V současné době se zdá, že takovéto
techniky mohou být založeny právě na elektrochemické analýze nukleových kyselin
a proteinů. Tento článek je věnován možnostem využití elektrochemických přístupů
při detekci poškození genetického materiálu, ve spojení s technikami hybridizace DNA,
při vyhledávání mutací v nukleotidových sekvencích a při analýze některých
důležitých proteinů.
Mezi moderními instrumentálními analytickými
metodami mají elektrochemické techniky nesporné
výhody vyplývající z jednoduchosti základního
experimentálního uspořádání. To je od vynálezu
polarografie Jaroslavem Heyrovským – přes stále
sofistikovanější přístrojové vybavení – v principu
stále stejné. Základem je pracovní elektroda zapojená do elektrického obvodu, umožňujícího přesnou
kontrolu vkládaného napětí a citlivé měření elektrického proudu, který pracovní elektrodou
prochází. Pracovní elektroda je obvykle ponořena
do roztoku základního elektrolytu. Pokud je v tomto
roztoku (respektive na povrchu elektrody) přítomna
látka, která je za určitých podmínek schopna odevzdávat elektrony pracovní elektrodě nebo je od ní
přijímat (oxidace či redukce), případně se na povrch
elektrody specifickým způsobem adsorbuje, lze
v obvodu naměřit v závislosti na vloženém potenciálu proudové signály (podle konkrétního experimentálního uspořádání např. vlny či vrcholy, píky).
Poloha těchto signálů na potenciálové ose poskytuje experimentátorovi informaci o charakteru přítomné látky a jejich velikost (intenzita) informaci
o jejím množství. Na tomto nebo podobných
principech je založena řada elektroanalytických
metod využívaných jak na úrovni vědeckého výzkumu, tak v praxi pro analýzu širokého spektra látek
od anorganických kationtů a aniontů, přes
jednoduché organické sloučeniny po složitější
bioaktivní látky, včetně vitamínů, peptidů, léčiv
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
apod. Významného uplatnění dosáhly elektrochemické techniky i při studiu biomakromolekul,
zejména nukleových kyselin a bílkovin (proteinů).
První polarografická měření bílkovin byla provedena relativně krátce po vynálezu polarografie ve
dvacátých letech minulého století. Již v letech
třicátých pak byla objevena tzv. Brdičkova reakce
[1], [2], komplexní elektrochemický proces, který
probíhá v přítomnosti určitého typu bílkovin na
rtuťové elektrodě za vzniku specifických signálů. Na
principu Brdičkovy reakce byly později navrženy
metody diagnostiky některých onemocnění, spočívající v polarografické analýze krevního séra pacientů. I když tento diagnostický přístup později ztratil
na významu, v současné době se zdá, že elektrochemické techniky založené na různých principech
(včetně zmíněné Brdičkovy reakce) se mohou při
studiu proteinů, včetně takových, které jsou
významné z biomedicínského hlediska, výrazně
uplatnit [3].
Počátek elektrochemie nukleových kyselin spadá
do druhé poloviny padesátých let dvacátého století.
Navzdory tehdy dostupným literárním údajům
o elektrochemické inaktivitě nukleových kyselin
zjistil jeden z autorů tohoto článku (E. P.) na brněnském Biofyzikálním ústavu ČSAV, že DNA poskytuje
na rtuťové elektrodě analyticky využitelné signály
[4]. Později se ukázalo, že tyto signály mohou
přinášet informaci nejen o přítomnosti a množství
(koncentraci) nukleových kyselin, ale i o jejich
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
293
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
Page 294
sekundární a terciární struktuře (přehledně [4]–[7]).
Elektrochemické metody se v průběhu následujících desetiletí osvědčily jako vynikající nástroje
pro studium struktury a strukturních změn, interakcí, poškození a chemických modifikací nukleových kyselin [8], [9].
Zpočátku byl vývoj v oblasti elektrochemie jak
DNA, tak bílkovin limitován na jedné straně dostupnou analytickou instrumentací a metodologií, na
straně druhé omezenými možnostmi přípravy kvalitního experimentálního materiálu. Tato situace se
výrazně změnila v osmdesátých letech a zejména
pak na přelomu dvacátého a jednadvacátého století
v souvislosti s prudkým rozvojem biologických
a biomedicínských věd. Díky pokroku v oblasti
chemické syntézy oligonukleotidů a oligopeptidů1
a také v oblasti genového a proteinového inženýrství
se staly dostupnými přesně definované vzorky nukleových kyselin i bílkovin. V současné době je
možné snadno připravit v dostatečném množství
a čistotě „kousky“ DNA vytvářející různé sekundární
struktury, úseky genů zodpovědných za určité
funkce buněk, specifické bílkoviny nebo jejich části.
Rovněž bylo dosaženo významného pokroku
v oblasti elektroanalytické instrumentace a vývoje
nových typů pracovních elektrod, umožňujících
aplikaci celé škály technik a experimentálních přístupů. Jedním z hlavních cílů současného výzkumu
v oblasti elektrochemie biomakromolekul je vývoj
elektrochemických biosenzorů, které by umožňovaly rychlou a citlivou detekci dějů, jichž se nukleové kyseliny nebo bílkoviny účastní. Předpokládá
se, že takováto zařízení v budoucnu najdou praktické uplatnění v biomedicíně (např. molekulární
diagnostika založená na hybridizaci DNA nebo na
analýze bílkovin), v ekotoxikologii (detekce genotoxických látek v životním prostředí), ve vývoji léčiv
aj. V následujícím textu se pokusíme uvést několik
příkladů aplikací moderních elektrochemických
přístupů při analýze DNA a proteinů.
NUKLEOVÉ KYSELINY
Vlastní elektrochemická aktivita nukleových
kyselin
Jak bylo řečeno v úvodním odstavci, k tomu, aby
bylo možné nějakou látku analyzovat pomocí elektrochemických metod, je nutné, aby její molekuly
byly schopny odevzdávat elektrony pracovní elektrodě (pak je elektrochemicky oxidována) nebo od
ní elektrony přijímat (pak je redukována), případně
aby se na povrchu elektrody specifickým způsobem
adsorbovala. Nukleové kyseliny tyto podmínky
splňují. DNA se skládá ze tří typů základních staveb1
2
294
1/ Dvoušroubovice DNA a strukturní vzorce adeninu,
thyminu, cytosinu a guaninu s vyznačenými
skupinami, které podléhají redoxním přeměnám na
rtuťové nebo uhlíkové elektrodě za vzniku analyticky
využitelných signálů. Orientace vzorců bází odpovídá
jejich orientaci v dvoušroubovici. Jak je patrno, jsou
primární redukční místa adeninu a cytosinu
(označená červenými šipkami) skryta uprostřed
dvoušroubovice, a v důsledku toho se na rtuťových
elektrodách chová za určitých podmínek nativní DNA,
na rozdíl od denaturované, jako elektrochemicky
téměř inaktivní. Naproti tomu primární oxidační místo
adeninu a část molekuly guaninu zodpovědná za jeho
elektrochemickou aktivitu na obou typech elektrod
jsou lokalizovány blíže povrchu dvoušroubovice
(v jejích žlábcích), což se projevuje na relativně
malých rozdílech v příslušných elektrochemických
odezvách nativní a denaturované DNA.
ních kamenů: dusíkatých bází (purinových derivátů,
obvykle adeninu a guaninu, a pyrimidinových
derivátů, obvykle cytosinu a thyminu), cukerné
složky (2-deoxyribózy) a zbytků kyseliny fosforečné. V RNA je cukernou složkou ribóza a namísto thyminu se v ní vyskytuje pyrimidinová báze
uracil2 [10], [11]. Z těchto složek jsou elektrochemicky redukovatelné pouze báze adenin, cytosin
a guanin; oxidovatelné jsou pak obě purinové báze
[6], [12] (obr. 1 a 2). K redukci adeninu a cytosinu
dochází při značně negativních potenciálech, jaké
Oligonukleotidy a oligopeptidy jsou krátké řetězce nepřesahující délku 100 bází, resp. aminokyselin.
Některé RNA kromě toho obsahují menší množství jiných bází.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
23.10.2006
8:58
Page 295
ELEKTROCHEMICKÉ
(A)
METODY V ANALÝZE NUKLEOVÝCH KYSELIN A BÍLKOVIN
(B)
(C)
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
2/ (A) Cyklický voltamogram denaturované DNA: redukce cytosinu a adeninu (pík CA) a signál guaninu (pík G) na
visící rtuťové kapkové elektrodě, (B) oxidace guaninu (Gox) a adeninu (Aox) v syntetickém oligonukleotidu na
uhlíkové elektrodě vyrobené z pyrolytického grafitu, (C) tenzametrické píky a) nadšroubovicové kovalentně
uzavřené kružnicové DNA neobsahující volné konce (pík 1 odpovídá adsorpci/desorpci částí molekul DNA
adsorbovaných prostřednictvím cukrfosfátové páteře) a b) poškozené DNA (pík 3 odpovídá odvinutým úsekům
DNA adsorbovaným prostřednictvím bází).
jsou dosažitelné pouze na rtuťových pracovních
elektrodách [7] nebo na elektrodách amalgamových
[13], [14] (např. slitiny rtuti a stříbra – podobný
materiál se používá k přípravě zubních plomb),
které mají dostatečně vysoké tzv. vodíkové přepětí
[7], [15]. Na elektrodách z jiných materiálů dochází
v dané oblasti potenciálů ve vodném prostředí
k prudkému vyvíjení vodíku, které znemožňuje
měření elektrochemických signálů jiných látek.
S redukcí adeninu a cytosinu v DNA je spojen vznik
jediného proudového signálu (v neutrálním
prostředí při potenciálu okolo –1,5 V3), označovaného obvykle jako pík CA (cytosin + adenin,
obr. 2A) [3], [6], [7], [12]. Má-li dojít k redukci
guaninu, je nutné vložit ještě negativnější potenciál
(≤ –1,6 V) a signál spojený s touto reakcí nelze ani na
rtuťové elektrodě přímo měřit. Protože je však
redukce guaninu chemicky reverzibilní proces, je
možné produkt této reakce (7,8-dihydroguanin)
elektrochemicky oxidovat zpět na guanin a měřit
anodický signál spojený s jeho oxidací [16], [17]. Ten
se vyskytuje při potenciálu okolo –0,3 V (pík G,
obr. 2A). K elektrochemické oxidaci purinových
bází naopak dochází při poměrně vysokých pozitivních potenciálech (v závislosti na podmínkách
okolo +1,0 až +1,1 V pro guanin a +1,2 až +1,3 V pro
adenin; viz obr. 2B) [18], jakých nelze na rtuťové
elektrodě dosáhnout (rtuť se za obvyklých podmínek při potenciálech pozitivnějších než cca +0,2 V
anodicky rozpouští za vzniku rtuťnatých iontů [15]).
Oxidační signály těchto bází lze nejlépe měřit na
různých typech uhlíkových elektrod [3], [6], [19].
3
4
Nukleové kyseliny jsou na površích jak rtuťových
a amalgamových, tak uhlíkových elektrod v širokém
rozmezí potenciálů silně adsorbovány, čehož lze
prakticky využít pro adsorptivní akumulaci těchto
látek na povrchu elektrod a pro jednoduchou
přípravu elektrod modifikovaných nukleovými
kyselinami (viz dále). Adsorpčně-desorpční děje,
jimž podléhají nukleové kyseliny na rtuťových (nebo
amalgamových) elektrodách při vkládání negativních potenciálů, dávají kromě toho vzniknout tzv.
tensametrickým (kapacitním) signálům, které
poskytují řadu cenných informací o vlastnostech
nukleových kyselin na povrchu elektrody [3], [6],
[7], [9]. Jelikož jsou molekuly DNA a RNA za
běžných podmínek záporně nabité, dochází při
vložení negativních potenciálů na elektrodu k jejich
elektrostatickému odpuzování, které může mít za
určitých podmínek za následek desorpci těchto
molekul nebo jejich částí z povrchu elektrody.4
Přitom se mění diferenciální kapacita elektrodové
dvojvrstvy a v důsledku toho se objevují zmíněné
tensametrické signály. Charakter této odezvy závisí
na tom, které složky molekuly DNA se adsorpčnědesorpčních dějů účastní [6], [9]. Úseky DNA, které
jsou na povrchu elektrody adsorbovány prostřednictvím negativně nabité cukrfosfátové páteře,
podléhají těmto dějům okolo potenciálu -1,2 V
(signál s tím spojený je označován jako pík 1,
obr. 2C). Pokud se adsorpce molekul DNA na elektrodovém povrchu účastní zbytky bází, které jsou
hydrofobní, a tudíž mají relativně větší afinitu
k hydrofobnímu povrchu rtuti a menší tendenci
Všechny údaje o potenciálech v tomto textu jsou vztaženy k nasycené kalomelové elektrodě.
Pro desorpci látky z elektricky nabitého povrchu není ve skutečnosti nutnou podmínkou, aby molekuly této látky nesly
elektrický náboj. I elektroneutrální molekuly jsou z elektrodového povrchu v oblasti dostatečně negativních nebo pozitivních potenciálů desorbovány v důsledku vytěsňování ionty základního elektrolytu, které jsou k opačně nabitému
povrchu přitahovány. V případě nukleových kyselin hraje jejich negativní náboj v těchto dějích výraznou úlohu.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
295
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
Page 296
přecházet do vodného prostředí, dochází k jejich
desorpci při výrazně negativnějších potenciálech (až
–1,4 V, kde lze pozorovat tzv. pík 3, obr. 2C).
Z výše řečeného vyplývá, že elektrochemické
chování nukleových kyselin je závislé na tom, do
jaké míry mohou jejich báze komunikovat
s povrchem elektrody, ať již formou přenosu elektronů (redukce, oxidace), nebo formou adsorpčnědesorpčních procesů. Přístupnost zbytků bází je
přitom silně závislá na struktuře DNA. V „nativní“
DNA jsou báze skryty uvnitř dvoušroubovice
(obr. 1), která je tvořena dvěma polynukleotidovými
řetězci spojenými právě prostřednictvím komplementárních párů bází, a nemohou volně komunikovat s prostředím ani s povrchem elektrody. Naproti
tomu v „denaturované“ jednořetězcové DNA jsou
báze volně přístupné. V důsledku toho se elektrochemické odezvy nativní a denaturované DNA na
rtuťové elektrodě v neutrálním prostředí výrazně
liší: zatímco denaturovaná DNA poskytuje výrazný
redukční pík CA i kapacitní pík 3, nativní
3/ Elektrochemická detekce poškození DNA.
(A) Kovalentně uzavřená kružnicová DNA
(nadšroubovicová DNA, scDNA) neobsahuje volné
konce a neposkytuje pík 3. (B) Zavedením zlomu
do molekuly scDNA (např. působením hydroxylových
radikálů) vzniká relaxovaná otevřená kružnicová
(oc) DNA, která pík 3 poskytuje. (C) Poškození jedné
nebo několika bází v scDNA (např. působením
UV-záření) bez vzniku zlomu se na jejím
elektrochemickém chování neprojeví. V místě
modifikované báze lze vytvořit elektrochemicky
detekovatelný jednořetězcový zlom pomocí
specifického enzymu (např. T4 endonuklázy V).
296
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
dvoušroubovice se za určitých podmínek může
v obou ohledech jevit jako prakticky inaktivní.
Jakmile však dojde k nějaké změně struktury DNA,
která je spojena se zvýšením přístupnosti zbytků
bází (odvinutí dvoušroubovice, tvorba jednořetězcových zlomů, tj. přerušení cukrfosfátové páteře
DNA, různé lokální deformace dvoušroubovice spojené s poškozením DNA), projeví se to na jejích elektrochemických signálech (obr. 3). Měření na
rtuťových elektrodách umožňují sledovat malé
změny ve struktuře DNA s vysokou citlivostí [3], [6],
[7], [9], [19]–[21]. Naproti tomu oxidační signály
purinových bází na uhlíkových elektrodách jsou ke
struktuře DNA méně citlivé, rozdíly v odezvách
nativní a denaturované DNA na uhlíkových elektrodách jsou poměrně malé a jemnější změny struktury DNA je obtížné postihnout (obr. 1) [8], [19].
Elektroaktivní značky nukleových kyselin
Vlastní elektrochemickou aktivitu nukleových
kyselin lze úspěšně využít při studiu řady jevů spojených se změnou struktury DNA (typickým příkladem je detekce poškození DNA, viz část dále).
V určitých případech se však jeví jako výhodnější
využít elektroaktivní značky, indikátory či mediátory, pomocí nichž je možné zvýšit citlivost nebo
specificitu analýzy [3], [6], [9]. Na většině pevných
„nertuťových“ elektrod (uhlíkových, zlatých apod.)
je možné dosáhnout spolehlivějšího rozlišení jednořetězcové a dvouřetězcové (případně poškozené
[22]) DNA pomocí elektrochemicky aktivních látek,
které jsou schopny se vázat s vysokou preferencí na
dvoušroubovici DNA. Takových látek existuje celá
řada, některé se vmezeřují (interkalují) mezi páry
bází dvoušroubovice, jiné se vážou do jejích žlábků
[10], [11]. Při detekci hybridizace DNA (viz dále)
je potřeba spolehlivě odlišit cílovou DNA od
hybridizační sondy, což je možné na základě vlastních elektrochemických signálů DNA pouze ve
specifických případech (např. pokud sonda neobsahuje elektroaktivní guaninové zbytky [23]). Proto
je výhodné na jeden z řetězců (obvykle „signální
sondu“ [24]) navázat značku poskytující výraznou
elektrochemickou odezvu. Jde o obdobu značení
sond DNA radionuklidy nebo fluorofory, jehož se
využívá v současných biochemických a molekulárně
biologických metodách. Mezi dosud navrženými
elektrochemickými značkami zaujímají zvláštní
místo organické komplexy přechodných kovů (např.
ferocén, komplexy ruthenia nebo osmia), které
poskytují dobře vyvinuté elektrochemické signály
na různých typech elektrod [6].
Za zmínku stojí, že pravděpodobně prvními elektroaktivními značkami DNA, zavedenými počátkem
osmdesátých let minulého století na Biofyzikálním
ústavu ČSAV v Brně [25], [26], byly komplexy oxidu
osmičelého (Os,L, kde L symbolizuje dusíkatý ligand
23.10.2006
8:58
Page 297
ELEKTROCHEMICKÉ
METODY V ANALÝZE NUKLEOVÝCH KYSELIN A BÍLKOVIN
– např. pyridin, 2,2'-bipyridin, 1,10-fenantrolin apod.),
které se kovalentně vážou na pyrimidinové báze
v DNA (přednostně thymin) [19], [27], [28]. Jelikož je
reakce Os,L s pyrimidinovými zbytky citlivá ke
konformaci DNA a v „nativní“ dvoušroubovici ze sterických důvodů téměř neprobíhá, jsou tyto látky
i cennými strukturními sondami [28], [29]. Adukty
DNA s Os,L poskytují řadu analyticky využitelných
elektrochemických signálů na různých typech elektrod. Na rtuťových a některých amalgamových elektrodách dochází v přítomnosti DNA značené osmiem
ke katalytickému vyvíjení vodíku, čehož lze využít
k podstatnému zvýšení citlivosti stanovení DNA [25],
[30], [31]. Elektrokatalytické děje obecně umožňují
citlivější měření, protože se jich obvykle účastní větší
počet elektronů (což se projevuje větším elektrickým
proudem) než u „běžných“ oxidačně-redukčních dějů
[15]. U těch jde o jeden až několik málo elektronů na
jednu elektroaktivní skupinu. Naproti tomu v případě
katalytického děje může jedna aktivní skupina
absolvovat velké množství cyklů, při nichž do reakce
vstupuje substrát, jehož je v prostředí nadbytek (to je
právě případ katalytického vylučování vodíku,
vznikajícího redukcí protonů ze složek základního
elektrolytu). V jistém smyslu analogického principu
využívá „biokatalytická amplifikace“ signálu, kdy je
DNA značena enzymem (nejčastěji peroxidázou nebo
fosfatázou) [6], [32], [33]. Ten katalyzuje přeměnu
inaktivního substrátu na produkt, který lze stanovit
elektrochemicky, přičemž každá molekula enzymu
může generovat velké množství molekul tohoto produktu. Lze hovořit o analogii se široce využívanou
imunochemickou metodou ELISA, která využívá
enzymem značených protilátek; produkty enzymových přeměn jsou v tomto případě obvykle
detekovány kolorimetricky.
Elektrody modifikované nukleovými kyselinami
a elektrochemické biosenzory
Při obvyklém elektrochemickém měřicím uspořádání je pracovní elektroda, na které dochází ke sledovaným elektrochemickým dějům, ponořena do
roztoku základního elektrolytu obsahujícího analyzovanou látku. V principu je však možné postupovat
také tak, že se studovaná látka nejprve vhodným
způsobem zachytí (imobilizuje) na povrchu pracovní elektrody a vlastní měření se provede v prostředí,
které již tuto látku neobsahuje (může se jednat
o čistý základní elektrolyt). Jelikož jsou nukleové
kyseliny na povrchu rtuťových a některých
uhlíkových elektrod pevně (v rozmezí běžných pracovních potenciálů prakticky ireverzibilně) adsorbovány, postačí pro imobilizaci DNA nebo RNA
elektrodu na krátkou dobu ponořit do jejich roztoku
5
[34], [35]. Poté je možné elektrodu s adsorbovanou
vrstvičkou nukleové kyseliny (tedy elektrodu modifikovanou DNA nebo RNA) opláchnout a přenést do
elektrochemické nádobky, kde je následně provedeno měření5 (analogický postup lze využít také při
analýze bílkovin, viz dále). Tento postup, který byl
poprvé použit v polovině osmdesátých let [35], znamenal z několika hledisek průlom v elektrochemii
nukleových kyselin [3], [6], [8], [19]. Skutečnost, že
biopolymery lze na povrch elektrod adsorbovat při
otevřeném proudovém obvodu z několika málo
mikrolitrů roztoku, usnadnila práci se vzorky, jejichž
příprava byla pracná nebo nákladná a které do té
doby nebylo možné analyzovat konvenčním způsobem, tj. v mililitrových objemech roztoku v obvyklých elektrochemických nádobkách. Prostředí, ze
kterého jsou DNA nebo RNA adsorbovány na elektrodu, není omezeno požadavky elektrochemického
děje, který je při vlastním měření sledován. Např.
redukce bází v DNA probíhá v kyselém nebo v neutrálním prostředí, zatímco pro měření tensametrických odezev je vhodnější prostředí mírně alkalické.
Tato skutečnost rozšiřuje možnosti elektrochemické
analýzy nukleových kyselin zcela zásadním způsobem, protože umožňuje sledovat vliv složení média,
přítomnosti různých specificky interagujících látek,
fyzikálních podmínek a dalších faktorů na vlastnosti DNA, aniž by tyto faktory ovlivnily vlastní elektrodové děje, dávající vznik analytickým signálům.
Elektroda s imobilizovanou vrstvou DNA na
povrchu představuje jednoduchý elektrochemický
biosenzor. Biosenzory jsou analytická zařízení skládající se z „biorekogničního prvku“, tvořícího
citlivou vrstvu na povrchu senzoru, a z převodníku
signálu [36]. Biorekogničním prvkem je biomolekula
(může to být nukleová kyselina, protilátka, enzym,
receptor apod.) sloužící k detekci jiné molekuly,
která s ní specificky interaguje (například komplementární vlákno DNA, antigen, substrát, hormon).
Pomocí převodníku signálu je změna v povrchové
biorekogniční vrstvě, vyvolaná touto interakcí,
převedena na měřitelný signál (např. elektrický).
Jak již bylo řečeno, závisí elektrochemická odezva
nukleových kyselin na jejich struktuře. Jestliže tedy
vystavíme elektrodu modifikovanou DNA nějakému
činidlu, které v imobilizované DNA vyvolá strukturní změny, projeví se to na změně jejich elektrochemických signálů (tohoto principu využívá senzor
pro poškození DNA [8], [37]). Podobně lze elektrodu
s imobilizovanou DNA použít k detekci komplementárního vlákna DNA (senzor pro hybridizaci DNA
[8], [9]). Při přípravě citlivých vrstev DNA na
površích elektrod se kromě výše zmíněné fyzikální
adsorpce, která je použitelná zvláště v kombinaci se
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
Tato procedura bývá v literatuře označována jako „adsorptivní přenosová technika“ (adsorptive transfer technique)
nebo jako elektrochemická analýza s výměnou média (medium exchange), případně „ex-situ“ analýza.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
297
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
298
23.10.2006
8:58
Page 298
rtuťovými, amalgamovými a uhlíkovými elektrodami, používají různé metody kovalentního ukotvení
DNA (přehledně [9], [19], [38], [39]).
Detekce poškození DNA
DNA je nositelkou dědičné informace, která je zakódována v pořadí bází (nukleotidů) představujících
jednotlivá písmena genetické „abecedy“ [10], [11].
Jak uchování dědičné informace mezi generacemi,
tak její „vyjádření“ prostřednictvím molekul RNA ve
struktuře bílkovin je na molekulární úrovni
zabezpečeno vzájemným rozpoznáváním komplementárních bází. Poškození genetického materiálu
(v důsledku jeho vystavení chemickým nebo fyzikálním vlivům) může mít za následek změnu „smyslu“
jednotlivých písmen genetické informace nebo
zamezení jejich rozpoznání [19], [40]. Buňky
disponují několika účinnými reparačními systémy
sloužícími k opravám poškození DNA, k němuž
během jejich života běžně dochází [40]. Ty však
mohou v případě masivního nebo opakovaného
poškození genetického materiálu selhat. Za
takových podmínek může být genetická informace
buňky trvale pozměněna (mutována), což může vést
ke ztrátě funkce jednotlivých genů a ke vzniku
vážných onemocnění (např. rakoviny). V souvislosti
se závažností možných důsledků poškození genetického materiálu je zřejmá důležitost rychlé
a citlivé detekce poškození DNA, respektive látek,
které mohou její poškození způsobit. V odborné literatuře lze nalézt řadu analytických metod vhodných k detekci a identifikaci produktů poškození
DNA, včetně metod elektrochemických [8], [19].
Poškozením DNA často dochází ke změnám její
struktury, které je možné zjistit na základě změn
v její elektrochemické odezvě. Určité typy poškození
DNA lze detekovat s velkou citlivostí pomocí
rtuťových a některých amalgamových elektrod [8],
[19], [41]. Platí to zejména o jednořetězcových nebo
dvouřetězcových zlomech (přerušení buď jednoho,
nebo obou vláken dvoušroubovicové molekuly
DNA). Zlomy vznikají po „napadení“ molekul DNA
řadou látek buď přímo, nebo nepřímo v důsledku
chemické modifikace bází [8], [40]. DNA obsahující
zlomy (volné konce vláken, např. lineární chromozomální DNA) vykazuje na rtuťové elektrodě kvalitativně odlišné chování než DNA, která žádné volné
konce neobsahuje. DNA „bez konců“ je snadné
připravit v podobě tzv. bakteriálních plazmidů, tj. relativně malých kružnicových molekul, jejichž obě
vlákna jsou kovalentně uzavřena. Tyto molekuly mají
často specifickou terciární strukturu označovanou
jako „nadšroubovicová“ nebo „superhelikální“ DNA
(scDNA, obr. 3). V okolí volných konců vláken bývá
dvoušroubovice DNA na rtuťové elektrodě poněkud
rozvolněna a zbytky bází v těchto oblastech mohou
vstoupit do kontaktu s povrchem elektrody. Jelikož
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
je adsorpce bází na rtuťový povrch silnější než adsorpce cukrfosfátové páteře DNA, vzniká při vložení
potenciálu okolo -1,2 V (kde dochází k reorientaci
částí molekul adsorbovaných prostřednictvím cukrfosfátové páteře, nikoli však těch, které jsou adsorbovány prostřednictvím bází, viz výše) v molekulách
DNA pnutí, které vede k jejich částečné denaturaci
[7], [21], [42]. Za určitých podmínek tak vzniknou
jednořetězcové úseky, které poskytují tensametrický
pík 3 (obr. 3). Pokud v DNA nejsou žádné volné
konce přítomny (scDNA), k tomuto jevu nedochází
a pík 3 není pozorován [37]. Kvalitativní změny
v elektrochemické odezvě DNA po vzniku zlomů lze
využít k monitorování výskytu látek, které mohou
způsobovat poškození genetického materiálu.
Jestliže vystavíme scDNA působení nějakého
prostředí (např. odpadní vody) a poté provedeme
měření na rtuťové nebo amalgamové elektrodě, lze
na základě přítomnosti píku 3 usoudit na přítomnost
látek způsobujících poškození DNA a na základě
jeho intenzity odhadnout rozsah tohoto poškození.
Podobně lze využít i elektrodu modifikovanou
scDNA [37], [43]. V tomto případě je analyzovanému
prostředí vystavena scDNA adsorbovaná na povrchu
elektrody (která tak vlastně představuje elektrochemický biosenzor s citlivou vrstvou scDNA, viz
výše). Ačkoli pomocí tohoto přístupu nelze přirozeně
přímo zjistit, o jaké konkrétní genotoxické činidlo
jde, získáme tak informaci o přítomnosti jakékoli
potenciálně nebezpečné látky bez ohledu na její
chemickou podstatu. Jde o velmi citlivou techniku,
která umožňuje detekovat jedno až dvě procenta
molekul DNA obsahujících jediný jednořetězcový
zlom v nadbytku nepoškozené scDNA (což odpovídá
jednomu místu poškození mezi přibližně 200 000 nukleotidy). Analogickou metodu lze využít i pro detekci určitých druhů poškození bází (tj. modifikace
jejich chemické struktury). Modifikace jedné nebo
několika málo bází v každé molekule scDNA se na
elektrochemickém chování této DNA obvykle neprojeví, pokud zároveň nedojde k přerušení její cukrfosfátové páteře. S využitím komerčně dostupných
enzymů lze v místech modifikovaných bází cukrfosfátovou páteř DNA přerušit. V buňkách mají takovéto enzymy za úkol odstraňovat poškozené nukleotidy
z DNA při opravných procesech. Typickým příkladem je enzym endonukleáza V z bakteriofága T4,
která rozpoznává a štěpí DNA obsahující tzv. pyrimidinové dimery, což jsou jedny z nejfrekventovanějších „lézí“ v DNA způsobených ultrafialovým
světlem [40]. Jestliže tedy zkoumaná DNA obsahuje
poškozené báze a vystavíme ji působení vhodného
enzymu, vzniknou zlomy, které lze elektrochemicky stanovit stejným způsobem, jako zlomy
vzniklé přímo působením genotoxického činidla
[44] (obr. 3). V současné odborné literatuře lze nalézt řadu dalších elektrochemických přístupů
23.10.2006
8:58
Page 299
ELEKTROCHEMICKÉ
METODY V ANALÝZE NUKLEOVÝCH KYSELIN A BÍLKOVIN
navržených pro detekci poškození DNA (shrnuto
v [8], [19]).
Hybridizace DNA a expanze trinukleotidových
opakování
Dva komplementární polynukleotidové řetězce, které
tvoří dvoušroubovici DNA, lze od sebe oddělit například zahřátím na dostatečně vysokou teplotu; tento
proces se označuje jako denaturace DNA. V šedesátých letech minulého století zjistil Julius Marmur [45],
že za vhodných podmínek mohou dvě komplementární vlákna dvoušroubovici opět vytvořit; DNA tedy
může „renaturovat“. Tento jev patří mezi fundamentální principy, na nichž jsou založeny metody současné
molekulární biologie a jejich aplikace v medicíně, agrobiologii a dalších praktických oblastech.
V případě analytického využití renaturace DNA
hovoříme o technikách „hybridizace DNA“. Jde v podstatě o soubor metodik využívajících specifický úsek
DNA o známé sekvenci bází (obvykle označovaný
jako hybridizační sonda) k detekci komplementárního
vlákna DNA nebo RNA. Vystavíme-li za vhodných podmínek sondu (kterou lze připravit synteticky nebo
4/ Dvoupovrchová technika elektrochemické detekce
hybridizace DNA. (A) Sekvence oligo(T) ukotvená na
paramagnetických mikročásticích vytváří (B) duplex
se sekvencí oligo(A) v cílovém vlákně DNA. Poté se
na specifický (komplementární) úsek v cílové DNA
naváže signální sonda nesoucí elektrochemicky
aktivní značku. (C) Po magnetické separaci se
hybridizované molekuly DNA z magnetického nosiče
uvolní a signální sonda je následně elektrochemicky
detekována. (D) Pokud obsahuje cílové vlákno DNA
více kopií sekvence komplementární k signální sondě
(repetitivní cílová sekvence), naváže se k němu více
molekul značené signální sondy. Intenzita měřeného
signálu pak závisí na počtu opakování (délce
repetitivní sekvence).
molekulárně-biologickými technikami) analyzovanému vzorku, dojde v případě přítomnosti komplementárního vlákna k vytvoření dvoušroubovice, tedy
k hybridizaci mezi sondou a cílovým vláknem. Z praktických důvodů je výhodné buď sondu, nebo analyzovanou cílovou DNA zakotvit na nějakém povrchu. Tím
se usnadní oddělení vzniklého hybridu od ostatních
složek vzorku, nenavázaných molekul sondy apod.,
což je obvykle podmínkou pro dosažení dostatečné
citlivosti a selektivity (odlišení hledaného úseku DNA
od ostatních). Tímto povrchem může být, v závislosti
na tom, jakou metodou bude hybridizace DNA detekována, například nylonová membrána (obvykle pro
detekci pomocí radioaktivních značek), destička ze
speciálně upraveného skla (pro fluorescenční detekci,
která se často využívá v moderních čipových analyzátorech) nebo také elektroda (ta pak představuje elektrochemický biosenzor pro hybridizaci DNA).
V minulém desetiletí bylo řadou světových laboratoří navrženo množství technik detekce hybridizace
DNA na elektrodách, které využívají nejrůznějších
principů (včetně vlastní elektroaktivity DNA, elektrochemicky aktivních indikátorů, kovalentně
značených signálních sond aj., přehledně [9], [38],
[39], [42]). Ačkoli jsou takto konstruované biosenzory ve své podstatě jednoduché, ukázalo se, že v některých případech lze lepších výsledků dosáhnout
oddělením hybridizace DNA od elektrochemické
detekce tím, že se tyto dva kroky provedou na dvou
různých površích [6], [7], [9], [42]. Pro hybridizaci
DNA je výhodné využít magnetických nosičů,
„kuliček“ z paramagnetického materiálu o řádově
mikrometrovém průměru, nesoucích příslušný
biorekogniční prvek (hybridizační sondu). Ve
srovnání s běžnou pracovní elektrodou mají tyto částice velký povrch, který umožňuje účinně zachytit
cílovou DNA. Pomocí magnetu je lze oddělit od roztoku a opakovaným promytím ve vhodném prostředí
zbavit všech nežádoucích složek, včetně nespecificky adsorbovaných nukleových kyselin. Poté je
možné hybridizované cílové DNA nebo sondy z magnetického nosiče oddělit a detekovat je pomocí
vhodné elektrody a elektrochemické techniky
(obr. 4). Ve srovnání s biosenzory založenými na
sondách imobilizovaných přímo na povrchu elektrod
(„jednopovrchový“ přístup) lze tento „dvoupovrchový“ postup mnohem snáze optimalizovat, protože
magnetické kuličky nemusí mít vlastnosti pracovní
elektrody vhodné pro elektrochemická měření,
a naopak povrch detekčních elektrod není nutné
upravovat tak, aby na něm bylo možné provádět
hybridizaci DNA. Výhody dvoupovrchových technik
je možné využít i při studiu interakcí DNA s proteiny
[46] nebo s nízkomolekulárními látkami.
Pomocí elektrochemických metod využívajících
hybridizace DNA lze nejen zjistit přítomnost určité
nukleotidové sekvence, ale také detekovat mutace
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
299
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
Page 300
a tzv. polymorfismy [47], tedy odchylky v pořadí nukleotidů od nějaké „standardní“ sekvence. Jak již bylo
zmíněno v souvislosti s poškozením DNA, změny
v genetické informaci mohou mít pro život buněk
i celých organismů fatální následky. V některých případech je pro ztrátu funkce klíčového genu postačující záměna jedné jediné báze. Detekce těchto tzv.
bodových mutací je tedy velmi důležitá z hlediska
včasné diagnostiky určitých onemocnění i prevence
jejich šíření v populaci. Pomocí elektrochemických
technik lze mutovaný úsek DNA zjistit na základě
jeho snížené schopnosti hybridizovat se standardní
sondou (dvoušroubovice vytvořená vlákny, které nejsou plně komplementární, je méně stabilní, zejména
za zvýšené teploty) [32]. Jiné přístupy jsou založeny
na zvláštních elektrochemických či elektrických
vlastnostech „heteroduplexů“ (tedy dvoušroubovic
vytvořených z ne zcela komplementárních vláken
DNA) [48]. Pro rozlišení těchto chybných párů lze
využít i specifické proteiny, které tato místa v DNA
rozpoznávají a vážou se na ně [46] (viz dále).
Jiným typem mutací, které se spontánně objevují
v genomu člověka, jsou tzv. expanze trinukleotidových opakování [49], [50]. Jde o úseky DNA vyskytující se v sousedství nebo uvnitř některých genů, ve
kterých se opakují sekvence tří bází (např. GAA,
CAG nebo CGG). U zdravých jedinců se vyskytuje
několik (nebo nanejvýš několik málo desítek)
tripletů. Tyto sekvence však mají schopnost se při
replikaci DNA prodlužovat (expandovat). Pokud
jejich délka dosáhne desítek až stovek trinukleotidů,
může dojít k zamezení správné exprese příslušných
genů, což má za následek vznik závažných dědičných
chorob, jako jsou syndrom fragilního chromozómu
X, myotonická dystrofie nebo Friedrichova ataxie.
Molekulární diagnostika těchto onemocnění je
založena na měření délky příslušných opakovaných
sekvencí. Nedávno bylo ukázáno, že stanovení délky
repetitivní sekvence DNA lze snadno provést pomocí
elektrochemických metod [51]. Jestliže se nějaký
motiv v nukleotidové sekvenci cílové DNA opakuje,
může dojít k vícenásobné hybridizaci krátké signální
sondy o sekvenci komplementární k opakovanému
motivu, jak je naznačeno v obr. 4. V ideálním případě
je počet navázaných molekul sondy úměrný počtu
opakování cílového motivu. Pokud je sonda vhodným způsobem označena, dochází s rostoucí délkou
repetitivní sekvence ke zvyšování počtu molekul
zachycené značky a tím ke zvyšování intenzity příslušného elektrochemického signálu (obr. 4); z jeho
intenzity lze tedy na základě vhodné kalibrace počet
opakování daného motivu odhadnout.
přítomnosti elektrochemicky aktivních skupin.
Základními stavebními kameny peptidů a bílkovin
jsou aminokyseliny. V přirozených bílkovinách se
obvykle vyskytuje 20 různých aminokyselin, z nichž
jsou pro elektrochemickou aktivitu bílkovin významné především cystein, tyrosin a tryptofan.
Zastoupení těchto aminokyselinových zbytků v jednotlivých proteinech se výrazně liší, na rozdíl od relativního zastoupení elektroaktivních bází v obvyklé
genomové DNA. Kromě toho existují složené proteiny, které obsahují další redox-aktivní centra neproteinové povahy (např. ferredoxiny, cytochromy,
hemoglobiny a další), vyznačující se výraznou elektrochemickou aktivitou. Tyto bílkoviny byly v uplynulých desetiletích intenzivně studovány v řadě předních
elektrochemických laboratoří [52]–[55] a posloužily
jako vynikající modely pro výzkum přenosu elektronů v biomolekulách (což je klíčový jev pro fundamentální bioenergetické procesy, jako je dýchání
nebo fotosyntéza). Moderní elektrochemické přístupy však nabízejí řadu možností ve výzkumu
bílkovin, které redox-aktivní prosthetické skupiny
neobsahují, včetně těch, jež hrají významnou úlohu
v patofyziologii závažných onemocnění [5].
Pro elektrochemické chování proteinů na rtuťových elektrodách je klíčová přítomnost sirné aminokyseliny cysteinu, případně cystinu, který je dimerem
cysteinu vzniklým oxidací thiolových skupin (-SH) na
skupinu disulfidickou (-S-S-). Atomy síry v těchto
aminokyselinách mají velkou afinitu ke rtuti a velmi
ochotně s ní reagují [5], [56]–[58]. V závislosti na podmínkách mohou vznikat sloučeniny charakteru
cystin/cystein-thiolátu rtuťného/rtuťnatého, jejichž
redoxní změny na rtuťové elektrodě se projevují dobře
vyvinutými elektrochemickými signály v oblasti –0,4
až –0,6 V. Negativnější signál v oblasti –0,7 V pak bývá
přisuzován přímé redukci -S-S- vazby cystinu (obr. 5).
Potenciál a velikost měřených signálů jsou závislé na
obsahu těchto aminokyselin v molekule, na jejich přístupnosti k povrchu elektrody, dále na velikosti
molekuly a na jejím redoxním stavu [59].
Podstatou tzv. Brdičkovy reakce [1], [2], [57] jsou
katalytické děje, které probíhají na rtuťových elektro-
BÍLKOVINY
Podobně jako v případě nukleových kyselin, také
elektrochemické vlastnosti bílkovin jsou závislé na
300
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
5/ Schematický přehled oxidačních a redukčních
signálů poskytovaných peptidy a proteiny na rtuťové
nebo uhlíkové elektrodě
23.10.2006
8:58
Page 301
ELEKTROCHEMICKÉ
METODY V ANALÝZE NUKLEOVÝCH KYSELIN A BÍLKOVIN
dách v přítomnosti proteinů (peptidů), jež obsahují
cystein (cystin) a iontů kobaltu (Co2+, [Co(NH3)6]3+).
Katalytickému vylučování vodíku odpovídá vznik
jedné nebo dvou polarografických vln (nebo voltametrických píků) v oblasti potenciálů –1,2 až –1,5 V (píky
a, b v obr. 5). Intenzita signálů souvisejících s Brdičkovou reakcí závisí na počtu cysteinových zbytků
v molekule proteinu a na jejich přístupnosti k povrchu elektrody. Některé „malé“ proteiny nebo peptidy
bohaté na cystein poskytují v přítomnosti iontů
kobaltu natolik výrazné signály, že je lze pomocí
Brdičkovy procedury stanovit i v přítomnosti jiných
bílkovin (např. metalothioneiny nebo fytochelatiny,
které slouží k detoxifikaci těžkých kovů v živočišných, respektive rostlinných buňkách) [60], [61].
Jiný typ katalytického signálu, který je poskytován
bílkovinami a peptidy, je tzv. prenatriová vlna. Tento
jev byl poprvé pozorován v roztocích chloridu sodného (odtud jeho název), který obsahoval stopy
bílkovin krevního séra [62]. Pro vznik prenatriové
vlny není nutná přítomnost ani sirných látek, ani
iontů kobaltu či podobných kovů [57]. Přestože bylo
navrženo několik mechanismů této reakce, nebylo
dosud zcela jasně prokázáno, které funkční skupiny
jsou za katalýzu vylučování vodíku zodpovědné.
V důsledku jejího výskytu v oblasti vysoce negativních potenciálů a s tím spojené obtížné měřitelnosti nenalezla prenatriová vlna v minulosti analytické
využití. V posledním desetiletí však bylo ukázáno
[63], že při aplikaci moderních elektrochemických
technik, zejména chronopotenciometrie s konstantním proudem, lze na místě prenatriové vlny získat
dobře vyvinutý, od pozadí oddělený pík (zvaný pík H).
Tento signál umožňuje vysoce citlivou detekci celé
řady bílkovin a peptidů [46]. Zdá se, že měření píku H
může otevřít zcela nové možnosti elektrochemické
analýzy v oblasti studia bílkovin, včetně sledování
změn struktury proteinů, jejich agregace, denaturace,
interakcí s dalšími molekulami včetně DNA aj.
Na uhlíkových elektrodách lze v bílkovinách elektrochemicky oxidovat zbytky aminokyselin tyrosinu, tryptofanu [64], [65], cysteinu, histidinu
a methioninu [66]. Oxidační signály posledních tří
jmenovaných aminokyselin dosud nenalezly
patřičné analytické využití. Naproti tomu tyrosin
a tryptofan poskytují dobře rozlišitelné oxidační
signály při potenciálech okolo +0,6 V (tyrosin)
a okolo +0,8 V (tryptofan) (obr. 5). V posledním
desetiletí byly tyto signály využity pro citlivé
stanovení řady bioaktivních peptidů (hormony
bombesin, neurotensin, angiotensin, vasopresin,
inzulín) [67], [68] a při studiu bílkovin, včetně jejich
agregace a dalších interakcí [69], [70].
Protein MutS a detekce bodových mutací v DNA
Protein MutS patří k bílkovinám, které se v buňkách
účastní procesů opravy DNA [40]. Tento protein má
schopnost rozpoznávat místa v DNA obsahující
chybné páry bází (např. G•T) nebo vmezeřené nukleotidy „navíc“, vázat se na ně a tím umožnit zahájení
jejich opravy. Tuto jeho vlastnost je možné analyticky využít pro detekci bodových mutací [46], [71],
[72]. Připravíme-li oligonukleotid jako sondu komplementární ke standardní (wild-type) sekvenci bází
zkoumaného úseku a hybridizujeme jej za vhodných
podmínek s odpovídajícím, ale mutovaným úsekem
(např. s jednou zaměněnou bází), vznikne „heteroduplex“, dvoušroubovice DNA s jedním nesprávným párem bází (single base mismatch, obr. 6).
Nesprávný pár bází pak představuje vazebné místo
pro MutS a zjištěním, že došlo k navázání tohoto
proteinu ke zkoumané DNA, získáváme informaci
o přítomnosti bodové mutace v cílovém vlákně. Byla
navržena řada technik umožňujících detekci vazby
MutS-DNA, které byly založeny na relativně
složitých procedurách včetně fluorescenčního
značení proteinu MutS [71], [72], případně použití
exonukleáz a následného značení volných konců
DNA speciálním fluorescenčním činidlem [72].
Elektrochemická detekce proteinu MutS a jeho
vazby na DNA nevyžaduje žádné značení ani jinou
úpravu proteinu a navíc je citlivější [46]. Postup
detekce bodových mutací v DNA pomocí dvoupovr-
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
6/ (A) Schéma plně komplementárního duplexu DNA
(homoduplexu) a duplexu obsahujícího chybný pár
bází (heteroduplexu). Heteroduplex vznikne např.
hybridizací sondy o standardní (wild type) sekvenci
s mutovaným cílovým vláknem.
(B) Znázornění elektrochemické detekce chybných
párů bází (resp. bodových mutací) v DNA pomocí
proteinu MutS. Koncově biotinylovaná DNA je vázána
streptavidinem, který je imobilizován na povrchu
paramagnetických mikročástic. Protein MutS se
váže na DNA obsahující chybné páry bází (1).
Po magnetické separaci a odmytí nenavázaného
proteinu (2) je specificky vázaný protein uvolněn
a detekován elektrochemicky (3).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
301
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
Page 302
7/ Modifikace peptidů a proteinů komplexy oxidu osmičelého. (A) Struktura aduktu tryptofanu s komplexem oxid
osmičelý, 2,2'bipyridin (Os,bipy). (B) Schematické znázornění elektrochemických odezev lidského (obsahuje jeden
zbytek tryptofanu, modrá křivka) a lososího luteinizačního hormonu (obsahuje dva zbytky tryptofanu, červená
křivka) modifikovaného Os,bipy na rtuťové elektrodě.
chové elektrochemické techniky je znázorněn na
obr. 6. Na paramagnetické mikročástice, které jsou
pokryty streptavidinem, je navázán dvouřetězcový
fragment DNA koncově modifikovaný biotinem.
Pokud tento duplex obsahuje chybné páry bází,
dojde v následujícím kroku k navázání proteinu
MutS. Po promytí magnetických „kuliček“ je protein
uvolněn při zvýšené iontové síle a teplotě a následně
elektrochemicky detekován pomocí adsorptivní
přenosové procedury, s využitím buď píku H na
rtuťové elektrodě [46], nebo oxidačního signálu
tyrosinu a tryptofanu na uhlíkových elektrodách
(M. Masařík a kol., připravovaný rukopis).
Parkinsonova choroba a agregace α-synucleinu
Řada závažných lidských onemocnění je provázena
poruchami v uspořádání polypeptidových řetězců
v molekulách proteinů (angl. protein misfolding),
které vedou ke ztrátě nebo změně jejich biologické
funkce. Existuje skupina asi dvaceti onemocnění,
která jsou provázena změnou rozpustných forem
specifických proteinů v nerozpustné fibrily. Tato
skupina zahrnuje neurodegenerativní choroby
známé jako Parkinsonova, Alzheimerova a Creutzfeldt-Jakobova nemoc. Protein, který se podílí na
patofyziologii Parkinsonovy a pravděpodobně
i Alzheimerovy choroby, se nazývá α-synuclein [73],
[74]. α-synuclein je ve velké míře syntetizován
v různých částech mozku. Na rozdíl od většiny
jiných bílkovin je tento protein ve své nativní formě
nestrukturovaný (unfolded). Agregací získává
uspořádanou fibrilární strukturu [75]. Vzhledem ke
zřejmé souvislosti mezi agregací α-synucleinu
a zmíněnými chorobami je tomuto jevu věnována
značná pozornost [73], [74]. Metody, které se běžně
používají pro in vitro analýzu α-synucleinu, jsou
cirkulární dichroismus, fluorescence s použitím
činidla thioflavin-T a atomová silová mikroskopie.
Tyto metody jsou obvykle schopny odhalit jeho
agregaci in vitro, v závislosti na podmínkách,
302
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
nejdříve po 24 hodinách [76]. V nedávné době byla
ke sledování agregace α-synucleinu využita elektrochemie [70]. Ukázalo se, že zejména s využitím tzv.
chronopotenciometrické rozpouštěcí analýzy k měření katalytického píku H (viz výše) je možné citlivě
stanovit α-synuclein jak v nativním, tak i v plně agregovaném stavu. Kromě toho lze na základě změn
výšky a potenciálu píku H zachytit časné fáze agregace tohoto proteinu (za vhodných podmínek již po
několika hodinách), což dosud využívané metody
neumožňovaly. Nedávná pozorování napovídají, že
za patogenezi Parkinsonovy choroby mohou být
zodpovědny pre-agregační změny ve struktuře
α-synucleinu a jeho časné agregáty spíše než nerozpustné fibrily vznikající později [75]. V této souvislosti se zdá, že nová elektrochemická metoda by
mohla v dalším výzkumu tohoto onemocnění sehrát
významnou úlohu.
Komplexy oxidu osmičelého jako elektroaktivní
značky pro proteiny
Jak již bylo zmíněno, vytvářejí komplexy oxidu
osmičelého s terciárními aminy (Os,L) s pyrimidinovými bázemi v DNA stabilní elektrochemicky
aktivní adukty [28], [29]. V souvislosti s používáním
oxidu osmičelého jako tkáňového fixačního činidla
byla zkoumána také jeho reaktivita s proteiny a jejich
jednotlivými aminokyselinovými zbytky a byla popsána tvorba sloučenin vzniklých reakcí komplexu
oxidu osmičelého s pyridinem s deriváty tryptofanu
[77]. Tyto adukty (obr. 7A) jsou podobné aduktům,
které poskytuje stejný komplex s thyminovým
zbytkem. Vzhledem k tomu, že tryptofanové zbytky
v peptidech a bílkovinách je možno podobně jako
thyminové zbytky v DNA modifikovat Os,L za fyziologických podmínek, nabízí se možnost využívat tyto
látky jako elektrochemicky aktivní značky (markery)
pro peptidy a proteiny obsahující tryptofan. Nedávno
byly publikovány dvě práce zabývající se studiem
osmiem modifikovaných bioaktivních peptidů
23.10.2006
8:58
Page 303
ELEKTROCHEMICKÉ
METODY V ANALÝZE NUKLEOVÝCH KYSELIN A BÍLKOVIN
pomocí elektrochemických metod, hmotnostní spektrometrie a kapilární elektroforézy [78], [79]. Jednalo
se o lidský a lososí luteinizační hormon, které se liší
záměnou pouze jedné aminokyseliny. Lidský
luteinizační hormon obsahuje jeden tryptofanový
zbytek, zatímco lososí luteinizační hormon obsahuje
tryptofanové zbytky dva. Počtu tryptofanových
zbytků v molekule peptidu odpovídá i intenzita
výsledných elektrochemických signálů souvisejících
s elektrochemickými procesy osmiových aduktů
(obr. 7B). Pokud jsou stejné analytické proceduře
podrobeny peptidy, které tryptofan neobsahují, vznik
signálu odpovídajícího aduktu peptidu s Os,L není
pozorován. Podobné vztahy mezi počtem tryptofanových zbytků, ale i jejich přístupnosti v rámci
prostorové struktury dané molekuly byly nedávno
zjištěny i u „velkých“ proteinů, např. avidinu, lysozymu, ribonukleáz či nádorového supresoru p53
(S. Billová, M. Fojta, E. Paleček a kol., nepublikované výsledky). Zdá se tedy, že Os,L v kombinaci
s elektrochemickou analýzou nebo jinými detekčními metodami se mohou stát významným nástrojem
studia bílkovin, podobně jako tomu bylo v osmdesátých letech minulého století v oblasti studia DNA.
ZÁVĚR
Základní principy elektrochemické analýzy biomakromolekul byly objeveny již před řadou let.
Současný rozvoj biologických věd, včetně moderních „-omik“ oborů (genomika, proteomika) a jejich
biomedicínských aplikací, vytváří mimořádně příznivou situaci pro nové využití elektrochemických
metod v analýze nukleových kyselin i proteinů.
V nedávné době byla stanovena kompletní nukleotidová sekvence lidského genomu a tento objev
otevírá zcela nové možnosti v medicíně, včetně
vývoje terapeutických postupů „šitých na míru“
konkrétnímu pacientovi na základě jeho genetických charakteristik. K tomu je však nutné znát právě
ony individuální genetické charakteristiky, neboť
sekvence lidského genomu tak, jak ji dnes známe, je
sekvencí průměrnou, nikoli sekvencí konkrétního
člověka. Právě odchylky od této průměrné sekvence
v určitých místech genomu mohou představovat
důležité znaky, na základě kterých bude lékař
rozhodovat o aplikaci nejvhodnějšího léčebného
postupu. V současnosti nejrozšířenější metody
zjišťování odchylek pořadí nukleotidů ve specifických místech genomu jsou založeny na principu
hybridizace DNA a obvykle využívají optickou
(fluorescenční) detekci (totéž platí o metodách
využívaných pro sledování aktivity jednotlivých
genů). Na tomto principu pracují populární DNA
čipy, umožňující analýzu mnoha genů (nukleotidových sekvencí) současně. Předpokládá se, že
elektrochemické metody by mohly představovat
alternativu k těmto metodám, díky nízkým nákladům, relativní jednoduchosti a vysoké citlivosti.
V tomto článku jsme se pokusili dokumentovat, že
pomocí elektrochemických metod lze zjišťovat
bodové mutace i patologické expanze opakovaných
sekvencí v DNA, detekovat poškození genetického
materiálu a sledovat výskyt genotoxických látek
v prostředí. Ukazuje se, že elektrochemické metody
mohou být podobně užitečné i při analýze proteinů,
přispět k poznání úlohy jednotlivých bílkovin při
vývoji závažných onemocnění i pomoci při hledání
nových léků. Stále rostoucí počet vědeckých článků
i zájem firem naznačuje, že diagnostické techniky
založené na elektrochemické detekci se mohou v budoucnu stát dostupnými nejen pro vysoce specializovaná pracoviště (kliniky, biomedicínská centra),
ale též pro běžné ordinace a pro samotné pacienty
tak, jako jsou dnes běžně dostupné třeba glukózové
senzory pro diabetiky nebo těhotenské testy.
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
Literatura
[1] R. Brdička, Coll. Czech. Chem. Commun. 5, 112
(1933).
[2] R. Brdička, Coll. Czech. Chem. Commun. 5, 148
(1933).
[3] E. Paleček, F. Jelen, Electrochemistry of nucleic
acids and proteins. Towards electrochemical
sensors for genomics and proteomics. Perspectives
in Bioanalysis. E. Paleček, F. Scheller, J. Wang
(eds.). Elsevier, Amsterdam 2005, s. 74.
[4] E. Paleček, Nature 188, 656 (1960).
[5] E. Paleček, Electrochemistry of nucleic acids and
proteins. Towards electrochemical sensors for
genomics and proteomics. Perspectives in
Bioanalysis. E. Paleček, F. Scheller, J. Wang (eds.).
Elsevier, Amsterdam 2005, s. 690.
[6] E. Paleček, M. Fojta, F. Jelen, V. Vetterl,
The Encyclopedia of Electrochemistry, A. J. Bard,
M. Stratsmann (eds.). Wiley-VCH, Weinheim 2002,
s. 365.
[7] M. Fojta, Collect. Czech. Chem. Commun 69, 715
(2004).
[8] M. Fojta, Electrochemistry of nucleic acids and
proteins. Towards electrochemical sensors for
genomics and proteomics. Perspectives in
Bioanalysis, E. Paleček, F. Scheller, J. Wang (eds.).
Elsevier, Amsterdam 2005, s. 386.
[9] E. Paleček, M. Fojta, Bioelectronics, E. Willner,
E. Kätz (eds.). Wiley-VCH, Weinheim 2005, s. 127.
[10] B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff,
K. Roberts, P. Walter, Základy buněčné biologie,
Espero Publishing, Ústí nad Labem, 1998, s. 183.
[11] S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie, díl první,
Nakladatelství Rosypal S., Brno, 2006, S. 31.
[12] E. Paleček, Nucleic acids. (a) Electrochemical
methods. Encyclopedia of Analytical Science,
C. F. Poole, (ed.), Elsevier, London 2005, s. 339.
[13] B. Yosypchuk, L. Novotný, Crit. Rev. Anal. Chem. 32,
141 (2002).
[14] R. Fadrna, K. Kucharikova-Cahova, L. Havran,
B. Yosypchuk, M. Fojta, Electroanalysis 17, 452 (2005).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
303
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
304
23.10.2006
8:58
Page 304
[15] A. J. Bard, L. R. Faulkner, Electrochemical Methods.
Fundamentals and Applications, John Willey &
Sons, USA, s. 833, (2000).
[16] F. Jelen, E. Paleček, Biophys. Chem. 24, 285 (1986).
[17] L. Trnkova, M. Studnickova, E. Palecek,
Bioelectrochem. Bioenerg. 7, 644 (1980).
[18] V. Brabec, Bioelectrochem. Bioenerg. 8, 437 (1981).
[19] M. Fojta, Electroanalysis 14, 1449 (2002).
[20] E. Paleček, Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 18, 151
(1976).
[21] E. Paleček, Topics in Bioelectrochemistry and
Bioenergetics, G. Milazzo (ed.), Wiley-VCH,
Chichester, 5 (1983) s. 65.
[22] M. Bučková, J. Labuda, J. Šandula, L. Křižková,
I. Stěpánek, Z. Ďuračková, Talanta 56, 939 (2002).
[23] H. H. Thorp, Tibtech 16, 117 (1998).
[24] M. Fojta, L. Havran, R. Kizek, S. Billová, E. Paleček,
Biosens. Bioelectron. 20, 985 (2004).
[25] E. Paleček, M. A. Hung, Anal. Biochem. 132, 236 (1983).
[26] E. J. Lukášová, F. Paleček, E., Gen. Physiol. Biophys.
1, 53 (1982).
[27] F. Jelen, P. Karlovský, P. Pečínka, E. Makaturová,
E. Paleček, Gen. Physiol. Biophys. 10, 461 (1991).
[28] E. Paleček, Meth. Enzymol. 212, 139 (1992).
[29] E. Paleček, Meth. Enzymol. 212, 305 (1992).
[30] L. Havran, M. Fojta, E. Paleček, Bioelectrochemistry
63, 239 (2004).
[31] B. Yosypchuk, M. Fojta, L. Havran, M. Heyrovský,
E. Paleček, Electroanalysis 18, 186 (2006).
[32] D. J. Caruana, A. Heller, J. Am. Chem. Soc. 121, 769 (1999).
[33] M. Fojta, P. Brazdilová, K. Cahová, P. Pečínka,
Electroanalysis 18, 141 (2006).
[34] E. Paleček, F. Jelen, C. Teijeiro, V. Fučík, T. M. Jovin,
Anal. Chim. Acta 273, 175 (1993).
[35] E. Paleček, I. Postbieglová, J. Electroanal. Chem.
214, 359 (1986).
[36] P. Skládal, Sensory, Masarykova univerzita Brno (2002).
[37] M. Fojta, E. Paleček, Anal. Chim. Acta 342, 1 (1997).
[38] M. J. Tarlov, A. B. Steel, DNA-Based Sensors.
Biomolecular Films. Design, Function, and
Applications, J. F. Rusling (ed)., Marcel Dekker, New
York 2003, s. 545.
[39] N. Popovich, H. Thorp, Interface 11, 30 (2002).
[40] O. D. Scharer, Angew. Chem. Int. Ed. 42, 2946 (2003).
[41] R. Fadrná, K. Kuchaříková-Cahová, L. Havran,
B. Yosypchuk, M. Fojta, Electroanalysis 17, 452 (2005).
[42] E. Paleček, M. Fojta, F. Jelen, Bioelectrochemistry
56, 85 (2002).
[43] M. Fojta, V. Staňková, E. Paleček, P. Koscielniak,
J. Mitáš, Talanta 46, 155 (1998).
[44] K. Cahová-Kuchaříková, M. Fojta, T. Mozga,
E. Paleček, Anal. Chem. 77, 2920 (2005).
[45] J. Marmur, R. Rownd, C. L. Schildkraut, Progress in
Nucleic Acid Research 1, 232 (1963).
[46] E. Paleček, M. Masařík, R. Kizek, D. Kuhlmeier,
J. Hassman, J. Schülein, Anal. Chem. 76, 5930 (2004).
[47] K. R. Mitchelson, Mol. Biotechnol. 24, 41 (2003).
[48] S. O. Kelley, E. M. Boon, J. K. Barton, N. M. Jackson,
M. G. Hill, Nucleic Acids Res. 27, 4830 (1999).
[49] H. L. Paulson, K. H. Fischbeck, Annu. Rev. Neurosci.
19, 79 (1996).
[50] V. Campuzano, L. Montermini, M. D. Molto,
L. Pianese, M. Cossee, F. Cavalcanti, E. Monros,
F. Rodius, F. Duclos, A. Monticelli, F. Zara, J. Canizares,
H. Koutnikova, S. I. Bidichandani, C. Gellera,
A. Brice, P. Trouillas, G. De Michele, A. Filla,
R. De Frutos, F. Palau, P. I. Patel, S. Di Donato,
J.-L. Mandel, S. Cocozza, M. Koenig, M. Pandolfo,
Science 271, 1423 (1996).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
[51] M. Fojta, L. Havran, M. Vojtíšková, E. Paleček, J. Am.
Chem. Soc. 126, 6532 (2004).
[52] F. A. Armstrong, G. S. Wilson, Electrochim. Acta 45,
2623 (2000).
[53] M. Fedurco, Coord. Chem. Rev. 209, 263 (2000).
[54] C. H. Fan, X. C. Chen, G. X. Li, J. Q. Zhu, D. X. Zhu,
H. Scheer, Phys. Chem. Chem. Phys. 2, 4409 (2000).
[55] F. A. Armstrong, H. A. Heering, J. Hirst, Chem. Soc.
Rev. 26, 169 (1997).
[56] M. Heyrovský, P. Mader, V. Veselá, M. Fedurco,
J. Electroanal. Chem. 369, 53 (1994).
[57] M. Heyrovský, Electrochemistry of nucleic acids
and proteins. Towards electrochemical sensors for
genomics and proteomics. Perspectives in
Bioanalysis, E. Paleček, F. Scheller, J. Wang (eds.),
Elsevier, Amsterdam 2005, s. 658.
[58] L. Havran, S. Billová, E. Paleček, Electroanalysis 16,
1139 (2004).
[59] M. J. Honeychurch, M. J. Ridd, Electroanalysis 8, 654
(1996).
[60] M. Fojta, M. Fojtová, L. Havran, H. Pivoňková,
V. Dorčák, I. Šestaková, Anal. Chim. Acta 558, 171
(2006).
[61] B. Raspor, M. Paic, M. Erk, Talanta 55, 109 (2001).
[62] J. Babička, J. Heyrovský, Coll. Czech. Chem.
Commun. 2, 270 (1930).
[63] M. Tomschik, L. Havran, M. Fojta, E. Paleček,
Electroanalysis 10, 403 (1998).
[64] V. Brabec, V. Mornstein, Biochim. Biophys. Acta 12,
159 (1980).
[65] V. Brabec, V. Mornstein, Biophys. Chem. 625, 43
(1980).
[66] J. M. Sequaris, Comprehensive Analytical Chemistry
27, 115 (1992).
[67] J. Wang, G. Rivas, X. H. Cai, M. Chicharro,
P. A. M. Farias, E. Palecek, Electroanalysis 8, 902
(1996).
[68] X. H. Cai, G. Rivas, P. A. M. Farias, H. Shiraishi,
J. Wang, E. Palecek, Anal. Chim. Acta 332, 49 (1996).
[69] M. Masařík, R. Kizek, K. J. Kramer, S. Billová,
M. Brazdová, J. Vacek, M. Bailey, F. Jelen,
J. A. Howard, Anal. Chem. 75, 2663 (2003).
[70] M. Masařík, A. Stobiecka, R. Kizek, F. Jelen,
Z. Pechan, W. Hoyer, T. M. Jovin, V. Subramaniam,
E. Paleček, Electroanalysis 16, 1172 (2004).
[71] H. A. Behrensdorf, M. Pignot, N. Windhab, A. Kappel,
Nucleic Acids Res. 30, e64. (2002).
[72] P. Sachadyn, A. Stanisawska, J. Kur, Nucleic Acids
Res. 28, e36. (2000).
[73] R. Kruger, T. Muller, O. Riess, J. Neural. Transm. 107,
31 (2000).
[74] M. H. Polymeropoulos, C. Lavedan, E. Leroy,
S. E. Ide, A. Dehejia, A. Dutra, B. Pike, H. Root,
J. Rubenstein, R. Boyer, E. S. Stenroos,
S. Chandrasekharappa, A. Athanassiadou,
T. Papapetropoulos, W. G. Johnson, A. M. Lazzarini,
R. C. Duvoisin, G. DiIorio, L. I. Golbe,
R. L. Nussbaum, Science 276, 2045 (1997).
[75] B. Caughey, P. T. Lansbury, Annu. Rev. Neurosci. 26,
267 (2003).
[76] T. Antony, W. Hoyer, D. Cherny, G. Heim, T. M. Jovin,
V. Subramaniam, J. Biol. Chem. 278, 3235 (2003).
[77] J. S. Deetz, E. J. Behrman, J. Org. Chem. 45, 135
(1980).
[78] S. Billová, R. Kizek, E. Paleček, Bioelectrochem. 56,
63 (2002).
[79] O. Šedo, S. Billová, E. M. Pena-Mendez, E. Paleček,
J. Havel, Anal. Chim. Acta 515, 261 (2004).
23.10.2006
8:58
ŠTÚDIUM
Page 305
FYZIKÁLNYCH VLASTNOSTÍ ZMESÍ
FOSFOLIPIDOV METÓDOU ULTRAZVUKOVEJ
VELOCIMETRIE
Peter Rybár, Tibor Hianik, Katedra jadrovej fyziky a biofyziky FMFI UK,
Mlynská dolina F1, 842 48 Bratislava
V práci sme študovali termodynamické vlastnosti lipidových dvojvrstiev veľkých
unilamelárnych vezikúl zložených z binárnych zmesí fosfatidylcholínov s rôznymi
dľžkami uhľovodíkových reťazcov. Na štúdium bola použitá metóda merania rýchlosti
a absorbcie ultrazvuku pri fixnej frekvencii (7,2 MHz). Fázové prechody dvojvrstiev
zložených z čistých fosfolipidov sa vyznačovali výrazným maximom inkrementu
absorbcie ultrazvuku, [αλ], kým v prípade binárnych zmesí boli pozorované dve
maximá. Na základe analýzy získaných experimentálnych dát sa domnievame, že dve
maximá inkrementu absorbcie [αλ] fázového prechodu binárnych lipidových zmesí
môžu odrážať existenciu dvoch separovaných fáz, spôsobených neideálnou
miešateľnosťou molekúl oboch komponent. Existencia dvoch absorbčných píkov môže
odrážať aj efekty formovania klastrov v lipidovej dvojvrstve počas procesu fázového
prechodu. Na základe vypočítaných hodnôt veľkostí kooperatívnych jednotiek môžeme
usudzovať o veľkosti laterálnej fázovej separácie jednotlivých komponent binárnych
lipidových zmesí. Z tvaru teplotných závislostí [αλ] pre binárne lipidové zmesi je
možné predpokladať, že ich fázový prechod je daný lineárnou kombináciou fázových
prechodov (absorbčných píkov) jednotlivých lipidových komponent.
Štúdium multikomponentných lipidových dvojvrstiev je veľmi dôležité pre pochopenie významu
a funkcie statických a dynamických štruktúr
membrán. Za týmto účelom bolo vyvinutých viacero
techník, ktoré boli aplikované na jednoduchých
dvojkomponentných systémoch: binárnych zmesiach syntetických fosfatidylcholínov [1–3], alebo
fosfatidylcholínov a cholesterolu [2], [4].
Jednou zo základných charakteristík lipidových
dvojvrstiev sú fázové prechody. Pôvod týchto prechodov na modelových, najmä monolipidových, systémoch bol študovaný meraním rôznych fyzikálnych
veličín. Jednokomponentné lipidové dvojvrstvy zo
syntetických fosfatidylcholínov študované kalorimetrickými metódami vykazujú výrazný, ostrý,
endotermický pík zodpovedajúci prechodu z fázy
gelovej do tekuto kryštalickej, v ktorej sa orientácia,
ako aj usporiadanie uhľovodíkových reťazcov stráca
[5]. Experimentálne údaje naznačujú, že tieto fázové
prechody majú charakter prvého a druhého druhu
súčasne [6]. V okolí fázových prechodov boli
pozorované ostré zmeny fyzikálnych vlastností
takých ako špecifické teplo [7], hustota [8],
molekulové vibrácie [9], orientácia a usporiadanie
uhľovodíkových reťazcov [10,11], medzimolekulárne
a vnútrimembránové vzdialenosti [12] a laterálna
difúzia [13]. Tieto náhle a výrazné zmeny zodpovedajú fázovým prechodom prvého druhu. Na
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
druhej strane anomálne minimá a široké anomálne
píky v oblasti fázových prechodov pri meraní
rýchlosti ultrazvuku a absorpcie [14, 15], permeability [16], relaxačných časov [17, 18] a dvojdimenzionálnej stlačiteľnosti [19] sú pozorované pri
náraste štrukturálnych fluktuácií fázových prechodov druhého druhu. Na základe týchto poznatkov sa
považujú fázové prechody lipidových dvojvrstiev za
slabé fázové prechody prvého druhu [5], [20], ktoré
vykazujú tak nenulové latentné teplo, ako aj kritické
anomálie (napr. anomálny pokles rýchlosti ultrazvuku a anomálny nárast fluktuácií hustoty).
Tepelná kapacita slabých fázových prechodov
prvého druhu je charakterizovaná izotermálnym
endotermickým teplom, sprevádzaným širokým
anomálnym zvýšením špecifického tepla. Keď je
fázový prechod veľmi blízko prechodu druhého
druhu, latentné teplo je menšie v porovnaní
s príspevkom pseudokritických anomálií. Významnou charakteristikou fázových prechodov
lipidových dvojvrstiev, spolu s teplotou fázového
prechodu TT, je pseudokritická teplota TC. Určenie
pseudokritickej teploty, ktorá je definovaná ako bod
divergencie rôznych termodynamických vlastností,
poskytuje informáciu o druhu fázového prechodu.
Rozdiel medzi pseudokritickou teplotou TC a teplotou fázového prechodu TT zaniká v kritickom bode
[21, 22].
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
305
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
306
23.10.2006
8:58
Page 306
Binárne lipidové dvojvrstvy poskytujú informácie
o molekulárnych interakciách medzi rôznymi lipidmi. Spoločnou črtou dvojkomponentných lipidových dvojvrstiev je rozšírený fázový prechod zo
stavu gelového do tekuto-kryštalického. Efekty na
binárnych zmesiach syntetických fosfatidylcholínov
s rôznou dĺžkou reťazca sledované DSC (differential
scanning calorimetry) kalorimetriou [1], [23]
ukazujú, že ak sú dĺžky uhľovodíkových reťazcov
oboch komponent podobné (nasýtené uhľovodíkové
reťazce sa líšia iba o dva atómy uhlíka) vykazujú
zmesi fosfatidylcholínov jeden široký endotermický
fázový prechod i ideálne zmiešanú a homogénnu
gelovú fázu (ideálnu miešateľnosť a spoločnú kryštalizáciu). Ak je dĺžka alebo nenasýtenie raťazcov
oboch komponent rôzne (uhľovodíkové reťazce sa
líšia o viac než dva atómy uhlíka), bolo pozorované
monotektické správanie sa zmesí počas fázového
prechodu (dvojitý fázový prechod a nehomogénna
gelová fáza). To znamená, že s rastom teploty disperzia zmesi fosfatidylcholínov, ktorá je pôvodne
v gelovej fáze, začne pri charakteristickej teplote
TS formovať malé množstvo tekuto kryštalickej fázy
v rovnováhe s gelovou fázou. Táto fázová separácia
charakterizovaná formovaním oblastí tekuto kryštalickej fázy obklopených oblasťami fázy gelovej
spojite pokračuje s rastom teploty, až nastane
rovnováha oblastí oboch fáz. Ďalším zvyšovaním
teploty sa redukujú oblasti gelovej fázy plávajúce vo
fáze tekuto kryštalickej, až sú pri teplote TF a nad
ňou všetky lipidy v tekuto kryštalickej fáze. Fázový
prechod komponenty s nižšou teplotou topenia je
v porovnaní s jej monolipidovou dvojvrstvou širší
a teplota fázového prechodu tejto komponenty je
vyššia. Tento efekt zodpovedá vyššej neusporiadanosti tekutých uhľovodíkových reťazcov jednej
komponenty, ktorý spôsobuje zvýšenie kinetických
pohybov usporiadanejších uhľovodíkových reťazcov
duhej komponenty. Predpokladá sa, že keď začne
kryštalizácia, molekuly fosfatidylcholínov v membráne migrujú, aby vytvorili monolipidové klastre.
Preto veľký význam pri fázovej separácii pri teplote
fázového prechodu TT a v jej okolí má laterálna
difúzia molekúl lipidov, pohyblivosť ktorých je daná
veľkou flexibilitou ich uhľovodíkových reťazcov.
Na základe výsledkov VPC (volume perturbation
calorimetry), relaxácie teploty a tlaku ako následku
objemových porúch, majú binárne zmesi fosfolipidov kratšie relaxačné časy gelovo-tekuto kryštalického fázového prechodu v porovnaní s čistými
komponentami. Výskyt maxím dvoch relaxačných
časov [24] v oblasti fázového prechodu binárnych
lipidových zmesí v molárnom pomere 1:1 naznačuje
existenciu dynamickej laterálnej fázovej separácie.
Maximum relaxačného času τmax(T) bolo pozorované v prípade jednokomponentných fosfatidylcholínových systémov v zhode s maximom tepelnej
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
kapacity prechodu Cp,max(T) [25]. Táto príbuznosť
medzi τmax(T) a Cp,max(T) bola pozorovaná v niektorých lipidových zmesiach s jednou majoritnou
a s druhou minoritnou komponentou [26]. Ak dve
maximá v tepelnej kapacite fázového prechodu
zmesi DMPC-DSPC (1:1) odrážajú existenciu dvoch
separovaných lipidových fáz, zodpovedajúcich
neideálnej miešateľnosti molekúl DMPC a DSPC,
potom nie je prekvapujúce, že dve relaxačné maximá zodpovedajú dvom píkom tepelnej kapacity. Pre
zmesi DMPC-DPPC a DPPC-DSPC nemôže byť prijatý predpoklad o neideálnej miešateľnosti lipidových fáz, lebo dva píky tepelnej kapacity nie sú
dobre separované.
Jähnig (1981) aplikoval Landauovú teóriu
fázových prechodov [21] na systémy lipidových dvojvrstiev s cieľom reprezentovať usporiadanie
uhľovodíkových reťazcov lipidov v neusporiadanej
fáze pomocou strednej hodnoty parametra usporiadania <s>. Veľkosť fluktuácií a ralaxačného času τ
anomálne narastá v okolí kritickej teploty TC. V prípade fázového prechodu prvého druhu je teplota
fázového prechodu TT ďaleko od kritickej teploty TC
a anomálne fluktuácie <s> a τ zanikajú. Teda
anomálny nárast fluktuácií <s> a τ je charakteristický pre fázové prechody druhého druhu.
Anomálne zníženie inkrementu rýchlosti ultrazvuku
[u], pozorované pre monolipidové suspenzie
syntetických fosfatidylcholínov (napr. DMPC
(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholín),
DPPC (1,2-dipal-mitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholín)),
zodpovedá anomálnemu nárastu fluktuácií <s>
a anomálny pík inkrementu absorpcie ultrazvuku
[αλ] zodpovedá kritickému spomaľovaniu (nárastu
relaxačného času). Tieto anomálie naznačujú, že
fázový prechod lipidovej dvojvrstvy má silný charakter prechodu druhého druhu. Náhle skokové zmeny
[u] a <s> sú charakteristické pre fázový prechod
prvého druhu. Minimum [u] je znakom fázového
prechodu druhého druhu. Monokomponentné lipidové dvojvrstvy sú charakterizované ostrým poklesom [u] pri teplote fázového prechodu, ktoré sú
znakom fázových prechodov prvého druhu, hoci ich
zreteľné minimum naznačuje, že sú veľmi blízko
fázového prechodu druhého druhu. Výsledky práce
Mitaku a spol. [27] podporujú teóriu (na základe
analógie tekuto-plynných fázových prechodov [28]),
že T-X fázový diagram (diagram teploty-zloženia)
binárnej zmesy DMPC-DPPC má kritický bod
v blízkosti pomeru 87 mol%. Túto ich hypotézu podporuje i fakt, že teplotná závislosť [αλ] nemá pri
tomto pomere dva superponované píky, ale iba
jeden symetrický pík.
Poznatky získané štúdiom monokomponentných
a binárnych lipidových systémov, ktoré boli použité
ako modelové objekty, možno uplatniť pri štúdiu
zložitejších polykomponentných systémov.
23.10.2006
8:58
Page 307
ŠTÚDIUM FYZIKÁLNYCH VLASTNOSTÍ ZMESÍ FOSFOLIPIDOV METÓDOU ULTRAZVUKOVEJ VELOCIMETRIE
MATERIÁL A METÓDY
Príprava lipozómov
Na prípravu veľkých unilamelárnych lipozómov bol
použitý syntetizovaný 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholín (DLPC, M.h.=621,8 g/mol), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholín
(DMPC,
M.h.=677,94 g/mol) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholín (DPPC, M.h.=734 g/mol) a 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholín (DSPC, M.h.=
790,2 g/mol) (Sigma Chemical Co., St. Luis. MO,
USA). Ako organické rozpúšťadlo bol použitý chloroform (Merck, Darmstadt, Nemecko). Všetky
chemikálie boli použité bez ďalšieho čistenia.
Jednotlivé binárne zmesi lipidov DMPC-DLPC,
DMPC-DPPC a DMPC-DSPC boli rozpustené v chloroforme v koncentrácii 20 mg/ml a po odparení chloroformu bola zmes lipidov hydratovaná redestilovanou vodou na koncentráciu 10 mg/ml, ktorá bola
použitá na prípravu lipozómov. Veľké unilamelárne
lipozómy (LUVET) s priemerom ~100 nm boli
pripravené zo zmesí DMPC-DLPC, DMPC-DPPC
a DMPC-DSPC v molárnych pomeroch 1:1 extrukčnou metódou použitím LiposoFast®-Basic (Avestin
Inc., Canada). Koncentrácia binárnych lipidových
zmesí všetkých vzoriek bola 2 mg/ml. Na prípravu
LUVET bola použitá redestilovaná voda.
Merania rýchlosti ultrazvuku a hustoty
Inkrement rýchlosti a absorpcie ultrazvuku boli
merané použitím ultrazvukovej velocimetrie. Vzťahy
pre koncentračný inkrement rýchlosti a absorbie
ultrazvuku, [u], respektíve [αλ] možno vyjadriť
nasledovne
(1)
a
(2)
kde indexy „M“ a „R“ sa vzťahujú na merný a referenčný rezonátor. ∆f0 je tzv. korekčný faktor pre rezonančnú frekvenciu a zodpovedá počiatočnému
rozdielu frekvencií a ∆δf0 je tzv. korekčný faktor pre
šírku rezonancie a je rovný rozdielu šírok rezonancií
na začiatku merania.
Rezonancie v cele sú spôsobené vytvorením stojatých vĺn s frekvenciami fn medzi paralelnými plochami piezokryštálov, ktorých vzdialenosť je l. Vlnové
dĺžky stojatých vĺn sú tie, ktoré vyhovujú rovnici
(3)
kde n je prirodzené číslo, l je vzdialenosť medzi
rezonátormi, medzi ktorými sa stojatá vlna vytvára
a λ je vlnova dĺžka.
Pre určenie koncentračného inkrementu rýchlosti
ultrazvuku [u], koncentračného inkrementu absorpcie ultrazvuku na vlnovú dĺžku [αλ] a koncentračného inkrementu hustoty [ρ] sa používajú
vzťahy:
(4)
(5)
(6)
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
kde c je hmotnostná koncentráci roztoku.
Určenie rezonančných parametrov bolo založené
na meraní inflexných bodov a šírok fázovofrekvenčných kriviek rezonancií použitím elektronického zariadenia využívajúceho počítačom
kontrolovanú fázovo-frekvenčnú spätnú väzbu.
Rezonátory boli vyrobené v Ústave teoretickej
a experimentálnej biofyziky Ruskej Akadémie Vied
(Puščino, Moskva, Rusko). Merný rezonátor obsahoval roztok lipozómov a referenčný redestilovanú
vodu. Meraná vzorka, rovnako ako aj referenčná,
bola pred meraním odvzdušnená po dobu 5 min
pomocou vodnej vývevy. Objem rezonátorov bol
0,7 ml a experimenty boli robené pri frekvencii
7,2 MHz. Kalibračný koeficient absorpcie ultrazvuku
W bol určený kalibráciou roztokom 0,1 M MnSO4 so
známou hodnotou koeficientu absorpcie na vlnovú
dĺžku pri 25,0 °C [29]. Rezonátory boli temperované
ultratermostatom Lauda RK 8 CS (Lauda-Königshofen, Nemecko). Namerané závislosti koncentračného inkrementu absorbcie ultrazvuku od teploty
boli aproximované lineárnou kombináciou dvoch
Gaussových funkcií.
Na meranie hustoty bol použitý komerčný densitometer pozostávajúci z meracej cely DMA 602 M
a čítača periód DMA 60 (Anton Paar, Graz,
Rakúsko). Meranie pozostávalo z určenia počtu
impulzov vnútorných hodín (perióda medzi impulzami 10-5 s) čítača periód počas dopredu zvoleného
počtu periód oscilátora (obyčajne 2x104). Meraná
vzorka (suspenzia lipozómov) bola pred meraním
odvzdušnená po dobu 5 min. Vnútorný objem oscilátora bol 0,7 ml. Cela bola temperovaná ultratermostatom Lauda RK 8 CS (Lauda-Königshofen,
Nemecko).
Špecifický objem rozpustenej látky ϕV je charakteristický parameter pri štúdiu takých procesov, ako
sú agregácia látok v roztoku, konformačné zmeny,
interakcia medzi rozpúšťadlom a rozpúšťanou látkou a iné intermolekulárne interakcie. Poskytuje tiež
informáciu potrebnú pre určenie molekulovej hmotnosti pomocou ultracentrifugácie a RTG difrakcie.
Hodnota zdanlivého špecifického objemu ϕV mera-
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
307
23.10.2006
8:58
Page 308
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
1/ Závislosť inkrementu rýchlosti [u] od teploty T pre
DMPC-DLPC 50 mol% (), DMPC ( ), DMPC-DPPC
50 mol% (), DPPC (), DMPC-DSPC 50 mol% ( )
ného pri jednej hmotnostnej koncentrácii roztoku c
je daná tromi parametrami systému podľa vzťahu
(7)
kde ρ je hustota roztoku udávaná v g/cm3, ρ0 je hustota rozpúšťadla. To znamená, že hodnota ϕV môže
byť určená z presného diferenciálneho merania hustôt (ρ – ρ0).
VÝSLEDKY A DISKUSIA
Závislosť rýchlosti ultrazvuku, absorbcie ultrazvuku
a hustoty sme merali v takých teplotných intervaloch, aby sme zachytili pokiaľ možno celú oblasť
fázového prechodu každej zo sledovaných zmesí
(DMPC-DLPC 50 mol%, DMPC-DPPC 50 mol%,
DMPC-DSPC 50 mol%). Ako vidieť z obrázka 1,
inkrement rýchlosti [u] s teplotou monotónne klesá
pre zmes DMPC-DSPC. Pre zmesi DMPC-DLPC
a DMPC-DPPC inkrement rýchlosti [u] konkávne
klesá, prechádza inflexom, v ktorom sa mení jeho
pokles na konvexný. Ďalej pokračuje v prechode
lokálnym minimom, za ktorým opäť prechádza
inflexným bodom, aby konkávne nadobudol lokálne
maximum, z ktorého opäť pokračuje v ďalšom poklese. Dôležitou črtou pre priebehy inkrementu
rýchlosti [u] všetkých troch skúmaných binárnych
lipidových zmesí je zmena znamienka [u] pri určitej
charakteristickej teplote T[u]=0 (tab. I).
Zmes fosfolipidov 50 mol%
DMPC-DLPC
DMPC-DPPC
DMPC-DSPC
TT, °C
14
30
35
∆TT, °C
24.6
18
31.5
2/ Závislosť inkrementu absorbcie [αλ] ultrazvuku od
teploty T pre DMPC-DLPC 50 mol% (), DMPC ( ),
DMPC-DPPC 50 mol% (), DPPC (), DMPC-DSPC
50 mol% ( )
Hodnoty inkrementu absorbcie [αλ] pre každý
z troch binárnych lipidových systémov (DMPCDLPC 50 mol%, DMPC-DPPC 50 mol%, DMPC-DSPC
50 mol%) dosahujú jedno absorbčné maximum
(obr. 2), ktorého tvar a parametre sú pre každý systém iné.
Na základe získaných výsledkov môžeme analyzovať fázové prechody binárnych lipidových zmesí
a porovnať ich so správaním v oblasti fázového prechodu čistých lipidových zmesí, ako aj s nematickoizotropnými fázovými prechodmi, ktoré prejavujú
podobné charakteristiky. Pre binárne lipidové
zmesi, rovnako ako aj pre lipozómy z jedného druhu
lipidov (obr. 1) a roztoky n-alkánov [30], má inkrement rýchlosti [u] minimum v kritickom bode
s teplotou TC, čo je dôsledkom anomálneho zníženia
rýchlosti ultrazvuku a relaxačného času v okolí kritického bodu v blízkosti teploty fázového prechodu.
V blízkosti bodu fázového prechodu medzi nematickou fázou a izotropnou tekutou fázou nematických
tekutých kryštálov vykazuje rýchlosť ultrazvuku
ostré minimum v bode s kritickou teplotou TC [31].
Toto správanie podobné feromagnetickým kryštálom v blízkosti bodu fázového prechodu druhého
druhu potvrdzuje, že gelovo – tekuto kryštalický
fázový prechod lipidových dvojvrtiev je slabý fázový
prechod prvého druhu. Ako vidieť z obrázku 1, závislosť [u] od teploty T pre zmesi DMPC-DLPC
a DMPC-DPPC v okolí teploty fázového prechodu
∆TK, °C
5
1.7
19.3
N1
21±1
18±2
12±1
N2
43±2
18±3
8±1
σ1
0,007
0,003
0,002
σ2
0,016
0,003
0,001
Tabuľka I/ Parametre fázových prechodov binárnych zmesí fosfolipidov. TT – teplota v maxime píku, ∆TT – rozdiel
teplôt fázových prechodov čistých komponent, ∆TK – rozdiel teplôt fázových prechodov komponent v zmesi,
N1 – veľkosť kooperatívnej jednotky prvej komponenty zmesi, N2 – veľkosť kooperatívnej jednotky druhej komponenty
zmesi, σ1 – stupeň kooperativity prvej komponenty zmesi, σ2 – stupeň kooperativity druhej komponenty zmesi.
308
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
23.10.2006
8:58
Page 309
ŠTÚDIUM FYZIKÁLNYCH VLASTNOSTÍ ZMESÍ FOSFOLIPIDOV METÓDOU ULTRAZVUKOVEJ VELOCIMETRIE
dosahuje anomálny pokles. Tento jav odráža štrukturálne zmeny v usporiadaní lipidov a zodpovedá
zväčšeniu objemovej adiabatickej stlačiteľnosti.
V porovnaní s lipozómami z čistého DMPC je hodnota minima [u] čistého DMPC nižšia o 0,07 ml/g
voči minimu [u] zmesi DMPC-DLPC a o 0,03 ml/g
vyššia voči minimu [u] zmesi DMPC-DPPC. Tento
pokles minima inkrementu rýchlosti [u] poukazuje
na nárast fluktuácií v lipidovej dvojvrstve a teda
zníženie stupňa usporiadania membrány, čo súvisí
so vzťahom
, v ktorom modul pružnos-
1
ti E= ß charakterizuje rigiditu uhľovodíkových
S
reťazcov zvyškov mastných kyselín. Ostrý pokles [u]
v oblasti teploty fázového prechodu TT čistých syntetických fosfatidylcholínov sa rozširuje a zaniká
v binárnom lipidovom systéme [27]. Anomálny pokles inkrementu rýchlosti [u] zmesi DMPC-DLPC sa
v porovnaní so zmesou DMPC-DPPC zjavne rozširuje a zaniká. Od predchádzajúcich dvoch zmesí sa
svojim charakteristickým priebehom [u] líši tretia
skúmaná zmes DMPC-DSPC. Inkrement rýchlosti
[u] v tomto prípade neprejavuje žiadny anomálny
pokles charakteristický pre suspenzie lipozómov
z jedneho druhu lipidov. Magnitúdy [u] všetkých
vzoriek konvergujú do jednej a tej istej krivky
v oblasti teplôt ďaleko od fázového prechodu, teda
objemová stlačitežnosť v týchto vzdialenostiach je
nezávislá od lipidového zloženia. Táto skutočnosť je
v zhode s výsledkami meraní akustických parametrov zmesi DMPC-DPPC v rôznych molárnych
pomeroch [27]. Lipozómy z jedného druhu lipidov sú
charakteristické svojim relatívne úzkym (~2-5 °C)
teplotným intervalom prudkých zmien [u] [14].
V prípade binárnych lipidových zmesí DMPC-DLPC
a DMPC-DPPC sú zmeny [u] menej výrazné a pokles
[u] je v tomto prípade širší (~6-8 °C).
Ďalšia veličina charakterizujúca fázové prechody
lipidových dvojvrstiev získaná pomocou metódy
ultrazvukovej velocimetrie je inkrement absorbcie
ultrazvuku na vlnovú dĺžku [αλ]. Táto veličina
vykazuje v oblasti teploty fázového prechodu TT
maximum pre lipozómy z jedneho druhu lipidov
(obr. 2), rovnako ako aj pre nematicko – izotropný
prechod nematických tekutých kryštálov. Anomálna
absorbcia ultrazvuku v blízkosti TC je dôsledkom
tzv. kritického spomaľovania fluktuácií orientačného usporiadania [31]. Inými slovami, správanie
pochádza zo situácie, keď fázový prechod prvého
druhu je blízko prechodu druhého druhu, teda TC je
v blízkosti TT. Anomálny pík [αλ] zmesi syntetických fosfatidylcholínov je výrazne širší než pre čisté
fosfatidylcholíny. Ako vidieť z obr. 2, absorbčný pík
zmesi DMPC-DSPC, ktorej nasýtené uhľovodíkové
reťazce mastných kyselín sa líšia o štyri atómy uhlíka, je výrazne širší než u zmesi DMPC-DPPC.
Priebeh [αλ] pre zmes DMPC-DLPC svojím tvarom
tvorí prechodový stupeň medzi tvarom [αλ] pre
zmesi DMPC-DSPC a DMPC-DPPC, hoci rozdiel
v počte uhlíkov v reťazcoch zvyškov mastných
kyselín je rovnaký ako v prípade DMPC-DPPC.
Z tvaru teplotných závislostí [αλ] pre binárne lipidové zmesi je možné predpokladať, že ich fázový
prechod je daný lineárnou kombináciou fázových
prechodov (absorbčných píkov) jednotlivých lipidových komponent. Vychádzajúc z faktu, že sa jedná
o silné prechody druhého druhu v kritickej oblasti,
pre ktoré boli pozorované anomálie pri náraste
štrukturálnych fluktuácií a z Landauovej koncepcie
parametra usporiadania <s> ako strednej hodnoty
fluktuácií v neusporiadanej mezofáze, môžeme
uplatniť Centrálny limitný teorém matematickej
teórie pravdepodobnosti [32] (Ak xi , i = 1, 2 ,3 ,..., n
sú nezávislé náhodné premenné s nejakou pravde-
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
podobnostnou distribúciou, potom suma
sa asymptoticky s rastom n blíži k normálnemu
(Gaussovmu) rozdeleniu. Následne aritmetický
priemer
sa s rastúcim n tiež asympto-
ticky blíži k normálnemu (Gaussovmu) rozdeleniu.).
Na základe tohoto teorému sme urobili dekompozície závislostí [αλ] od teploty T do dvoch
Gaussových píkov, lebo predpokladáme, že každá
komponenta zmesi prispieva do fázového prechodu
jedným absorbčným píkom, na ktorý sa uplatňuje
centrálny limitný teorém (obrázky 3-5).
Z obrázkov 3-5 vidieť, že fit závislosti [αλ] ako
lineárna kombinácia dvoch Gausssových píkov
dobre vystihuje experimentálne získané výsledky,
o čom svedčí aj hodnota χ2 (chí kvadrát), ktorá je
rádovo 10-6 – 10-5. Dve maximá inkrementu absorbcie
[αλ] fázového prechodu binárnych lipidových zmesí
môžu odrážať existenciu dvoch separovaných fáz,
spôsobených neideálnou miešateľnosťou molekúl
3/ Dekompozícia závislosti inkrementu absorbcie [αλ]
binárnej lipidovej zmesi DMPC-DLPC 50 mol% od
teploty T lineárnou kombináciou dvoch Gaussových
funkcií.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
309
23.10.2006
8:58
Page 310
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
4/ Dekompozícia závislosti inkrementu absorbcie [αλ]
binárnej lipidovej zmesi DMPC-DPPC 50 mol% od
teploty T lineárnou kombináciou dvoch Gaussových
funkcií
5/ Dekompozícia závislosti inkrementu absorbcie [αλ]
binárnej lipidovej zmesi DMPC-DSPC 50 mol% od
teploty T lineárnou kombináciou dvoch Gaussových
funkcií
oboch komponent, čo je v zhode s dvoma maximami
relaxačných časov τ a dvoma maximami relaxačnej
amplitúdy A [24] zodpovedajúcim dvom píkom
v tepelnej kapacite Cp(T). V prípade zmesi DMPCDPPC sú maximá jednotlivých komponent blízko
(1,7 °C), čo súhlasí s tým, že maximá relaxačných
časov a relaxačných amplitúd nie sú veľmi separované, takže vytvárajú v prechodovej oblasti medzi
maximami plató [24]. Existencia dvoch absorbčných
píkov môže odrážať aj efekty formovania klastrov
v lipidovej dvojvrstve počas procesu fázového prechodu. Formovanie klastrov potom môže byť charakterizované veľkosťou kooperatívnej jednotky N,
danej ako pomer Van´t Hoffovej entalpie ∆HVH ku
kalorimetrickej entalpii ∆Hcal, alebo veľkosťou
stupňa kooperativity σ = N2. Hodnotu ∆HVH vieme
vypočítať z výsledkov meraní [αλ] podľa vzťahu [33]
∆HVH = 6,9 TT2 / ∆T1/2 ,
(8)
kde TT a ∆T1/2 sú teplota v maxime píku a pološírka
píku fázového prechodu v Kelvinoch, a konštanta
310
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
6,9 má rozmer kcal/mol. Veľkosti kooperatívnych
jednotiek N a stupňov kooperativity σ, počítané
s využitím vzťahu (8), sú uvedené v tab. I.
Na základe hodnôt veľkostí kooperatívnych jednotiek (alebo stupňov kooperativity) môžeme usudzovať o veľkosti laterálnej fázovej separácie jednotlivých
komponent binárnych lipidových zmesí. Môžeme
vidieť, že ak majú komponenty rôznu dĺžku
uhľovodíkových reťazcov zvyškov mastných kyselín
(štyri a viac atómov uhlíka) alebo veľký rozdiel TT
(>20 °C) čistých komponent, tak aj veľkosť kooperatívnych jednotiek pre jednotlivé komponenty lipidových zmesí je rôzna. To môže byť dôvodom
monotektického správania sa binárnych lipidových
zmesí, ktoré potvrdzujú aj kalorimetrické merania [2],
[34]. Oproti tomu komponenty s podobnou dĺžkou
uhľovodíkových reťazcov zvyškov mastných kyselín
(napr. DMPC-DPPC) a nie veľkým rozdielom TT
(<20 °C) čistých komponent majú veľmi podobnú
veľkosť kooperatívnych jednotiek. To je v zhode
s výsledkami získanými pomocou spinovej značky
TEMPO [2], ktoré naznačujú, že fázová separácia je
charakterizovaná formovaním oblastí tekuto kryštalickej fázy obklopených oblasťami fázy gelovej.
Väčšina energie zvukového zväzku disipuje na formovanie a rozpad klastrov, alebo na ich relaxáciu [35].
Charakteristický relaxačný čas pre lipidy leží nad
frekvenciou použitou pri našich experimentoch
(7,2 MHz) [36, 37]. Presné porovnanie hodnôt [αλ]
preto vyžaduje porovnanie maximálnych hodnôt
absorbcie na vlnovú dĺžku (αλ) určených prostredníctvom širokopásmovej ultrazvukovej spektroskopie.
Efekty na zmesiach syntetických fosfatidylcholínov s rôznou dĺžkou reťazca študované metódou DSC [1] hovoria o tom, že ak sú dĺžky reťazcov
podobné, komponenty sa navzájom miešajú a kryštalizujú spolu. Ak je dĺžka reťazca rôzna, nastáva
fázová separácia a bolo pozorované monotektické
správanie sa [1]. Naše výsledky získané pomocou
ultrazvukovej velocimetrie potvrdzujú túto teóriu
laterálnej fázovej separácie. Vzhľadom na to, že
v zmesiach DMPC-DPPC a DMPC-DLPC je rozdiel
v počte uhlíkov v reťazcoch zvyškov mastných
kyselín rovnaký a rozdiel teplôt fázových prechodov
jednotlivých komponent je rôzny (1,7 °C respektíve
5 °C), vyjadrenie úmery medzi rozdielom v počte
uhlíkov uhľovodíkových reťazcov zvyškov masných
kyselín a veľkosťou laterálnej fázovej separácie nie
je dostatočné.
Z dekompozícií závislostí [αλ] od T (obr. 3–5)
vidieť, že fázový prechod komponenty s nižším
bodom topenia sa rozširuje a teplota prechodu tejto
komponenty narastá. Toto správanie možno prisúdiť
vyššej usporiadanosti uhľovodíkových reťazcov
komponenty s vyššou TT, ktorá obmedzuje nárast
kinetických pohybov fázového prechodu neusporiadanejších reťazcov prvej komponenty. Teplota
23.10.2006
8:58
Page 311
ŠTÚDIUM FYZIKÁLNYCH VLASTNOSTÍ ZMESÍ FOSFOLIPIDOV METÓDOU ULTRAZVUKOVEJ VELOCIMETRIE
fázového prechodu zmesí narastá s koncentráciou
komponenty s vyššou TT, čo potvrdzujú aj experimenty s rôznym molárnym pomerom komponent
[27]. Na základe analýzy správania sa akustických
parametrov [u] a [αλ] u čistých (monokomponentných) a binárnych lipidových systémov môžeme ich
porovnaním s výsledkami získanými pomocou DSC
zovšeobecniť na niekoľko základných čŕt typických
pre monokomponentné, dvojkomponentné a do istej
miery polykomponentné lipidové systémy.
1. Zmena znamienka [u] (prechod [u] do záporných
hodnôt) naznačuje, že v systéme prebiehajú určité
termotropné zmeny, ktoré môžu byť predzvesťou
hlavného fázového prechodu.
2. Minimum [u] je znakom anomálneho nárastu fluktuácií v kritickej oblasti a jeho poloha určuje kritickú teplotu systému TC.
3. Teplota, pri ktorej má v kritickej oblasti (pod kritickou teplotou TC) inkrement rýchlosti [u]
najväčší sklon, čiže teplota zodpovedajúca minimu δ[u]/δT, je teplota fázového prechodu z gelu
do tekuto kryštalického stavu.
Tieto základné, charakteristické črty nám dávajú
možnosť zhodnotiť fyzikálne správanie zložitejších
biologických systémov, ktoré by vzhľadom na ich
značnú komplikovanosť nebolo inak možné, napríklad lipoproteínov krvnej plazmy.
ZÁVER
Meranie rýchlosti a absorpcie ultrazvuku spolu
s meraním hustoty poskytuje novú informáciu
o fyzikálnych vlastnostiach binárnych lipidových
zmesí. Nami získané výsledky poukazujú na vhodnosť metódy molekulárnej akustiky ako užitočného
nástroja pre štúdium fyzikálnych vlastností
binárnych lipidových zmesí. Existencia dvoch
absorbčných píkov závislosti koeficientu absorbcie
ultrazvuku od teploty pravdepodovbe odráža efekty
formovania klastrov v lipidovej dvojvrstve počas
procesu fázového prechodu. Na základe vypočítaných hodnôt veľkostí kooperatívnych jednotiek
môžeme usudzovať o veľkosti laterálnej fázovej separácie jednotlivých komponent binárnych lipidových zmesí. Z tvaru teplotných závislostí [αλ] pre
binárne lipidové zmesi je možné predpokladať, že
ich fázový prechod je daný lineárnou kombináciou
fázových prechodov (absorbčných píkov) jednotlivých lipidových komponent.
Poďakovanie
Táto práca bola vykonaná vďaka finančnej podpore grantovej agentúry VEGA, číslo projektu
1/1015/04 a Agentúry na podporu výskumu a vývoja,
číslo projektu APVT-51-013904.
Literatúra
[1] M. C. Philips, B. D. Ladbrooke, D. Chapman:
Biochim. Biophys. Acta 196, 35 (1970).
[2] E. J. Shimshick, H. M. McDonnell, Biochemistry 12,
2351 (1973).
[3] S. Mambrey, J. M. Sturtenvant, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 73, 3862 (1976).
[4] S. Mambrey, P. L. Mateo, J. Sturtevant, Biochemistry
17, 2464 (1978).
[5] F. Jähnig, J. Chem. Phys. 70, 3279 (1979).
[6] S. Mitaku, T. Jippo, R. Kataoka, Biophys. J. 42, 137 (1983).
[7] H. J. Hinz, J. M. Sturtevant, J. Biol. Chem. 247, 6071
(1972).
[8] J. F. Nagle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 3443 (1973).
[9] J. L. Lippert, W. L. Peticolas, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 68, 1572 (1971).
[10] S. K. Kawato, J. Kinosita, A. Ikegami, Biochemistry
17, 5026 (1978).
[11] A. Seelig, J. Seelig, Biochemistry 13, 4839 (1974).
[12] Y. Inoko, T. Mitsui, J. Phys. Soc. Japan 44, 1918 (1978).
[13] E. S. Wu, K. Jacobson, D. Papahadjopoulos,
Biochemistry 16, 3936 (1977).
[14] S. Mitaku, A. Ikegami, A. Sakanishi, Biophys. Chem.
8, 195 (1978).
[15] S. Mitaku, Mol. Cryst. Liq. Cryst. 70, 1299 (1981).
[16] D. Papahadjopoulos, K. Jacobson, S. Nir, T. Isac,
Biochim. Biophys. Acta 31, 330 (1973).
[17] T. Y. Tsong, Biochemistry 16, 2674 (1977).
[18] S. Mitaku, T. Date, Biochim. Biophys. Acta 688, 411
(1982).
[19] O. Albrecht, H. Gruler, E. Sackman, J. Physiol.
(Paris) 39, 301 (1978).
[20] S. Doniach, J. Chem. Phys. 68, 4912 (1978).
[21] L. D. Landau, E. M. Lifshitz, Statistical Physics.
Pergamon Press, London, 1959, s. 100.
[22] H. Ikeda, Progr. Theor. Phys. 61, 1023 (1979).
[23] M. C. Philips, H. Hauser, F. Paltauf, Chem. Phys.
Lipids. 8, 127 (1972).
[24] R. L. Biltonen, Q. Ye, Progress in Colloid & Polymer
Sci. 93, 112 (1993).
[25] W. van Osdol, M. L. Johnson, Q. Ye, R. L. Biltonen,
Biophys. J. 59, 775 (1991).
[26] Q. Ye: Phase transition kinetics of multicomponent
lipid membranes, Ph.D. dissertation. University of
Virginia, Charlottesville VA, 1992.
[27] S. Mitaku, K. Okano, Biophys. Chem. 14, 147 (1981).
[28] H. Tielch, H. Tanneberger, Z. Physik 137, 256 (1954).
[29] J. Stuehr, E. Yeager: The Propagation of Sound in
Electronitic Solutions., v Physical Acoustics, vol. 2,
ed. W. P. Mason (Academic Press, New York,
London, 1965), s. 351.
[30] V. F. Nozdrev: The Use of Ultrasonics in Molecular
Physics, Pergamon Press, Oxford, 1965, s. 167.
[31] Y. Kavamura, Y. Maeda, K. Okano, S. Ivayanagi, Jap.
J. Appl. Phys. 12, 1511 (1973).
[32] H. Cramér: Mathematical Method of Statistics,
Princeton University Press 1966, s. 208.
[33] P. R. Strom-Jensen, R. L. Magin, F. Dunn, Biochim.
Biophys. Acta 769, 179 (1984).
[34] M. C. Philips, B. D. Ladbrooke, D. Chapman,
Biochim. Biophys. Acta 196, 35 (1970).
[35] E. G. Richardson: Ultrasonic Physics, Elsevier
Publishing Company, Amsterdam 1962, s. 220.
[36] F. Eggers, Th. Funck, Naturwissenschaften 63, 280
(1976).
[37] U. Kaatze, M. Brai, Chem. Phys. Lipids 65, 5 (1993).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
311
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:58
Page 312
ŠTÚDIUM INTERAKCIE MODELOVÝCH
α-HELIKÁLNYCH PEPTIDOV S LIPIDOVÝMI
DVOJVRSTVAMI POMOCOU MOLEKULOVEJ DYNAMIKY
Milan Melicherčík, Ján Urban, Tibor Hianik,
Katedra jadrovej fyziky a biofyziky FMFI UK,
Mlynská dolina F1, 842 48 Bratislava
Študovali sme interakcie α-helikálneho peptidu acetyl-K2-L24-K2-amid (L24)
s lipidovými dvojvrstvami z dimyristoylfosfatidylcholínu (DMPC) v gélovom
(T = 288 K) a tekutokryštalickom (T = 310 K) stave za použitia metód molekulovej
dynamiky. Ukázali sme, že napriek veľkým fluktuáciám v koncových oblastiach
polárnych častí membrány, v hydrofóbnom jadre membrány zostalo α-helikálne
usporiadanie peptidu zachované. Peptid spôsobil zvýšenie neusporiadanosti v gélovom
stave, kým v tekutokryštalickom stave došlo k zvýšeniu usporiadania membrány
v porovnaní so stavom lipidov vzdialených od peptidu. Tieto rozdiely sú typické
pre prvú polovicu membrány, kým v centrálnych častiach nedošlo k zmenám
v usporiadaní. Na konci 10 ns simulácie bol peptid naklonený ku kolmici na povrch
membrány pod uhlom 13° v gélovom a 33° v tekutokryštalickom stave. Simulácie
vykonané v časoch 5 ns, respektíve 10 ns sa výrazne nelíšili.
Vzájomné interakcie lipidov a proteínov majú zásadný význam pre pochopenie tak štrukturálnej integrity, ako aj funkcie biologických membrán. Integrálne
proteíny majú špeciálne postavenie medzi membránovými proteínmi, z dôvodu širokého spektra
funkcií, ktoré uplatňujú v bunkách ako napríklad
receptorová aktivita, prenos energie alebo aktívny
transport. Aj napriek rozsiahlemu experimentálnemu a teoretickému výskumu je obraz proteín-lipidových interakcií stále neúplný (pozri aktuálny
prehľad v [1, 2]). Vzhľadom na zložitú štruktúru integrálnych proteínov, ich izolácie a čistenia, sa
v biofyzikálnych štúdiách proteín-lipidových interakcií často používajú chemicky syntetizované
peptidy, ktorých vlastnosti modelujú reálne integrálne proteíny. Napríklad α-helikálny peptid
acetyl-K2-L24-K2-amid (L24) bol často použitý ako
model hydrofóbnej časti transmembránových proteínov [3]. Tento peptid obsahuje dlhú hydrofóbnu
časť pozostávajúcu z leucínových zvyškov ukončenú
na oboch koncoch kladne nabitými čiastočne polárnymi lyzínovými zvyškami. Centrálna polyleucínová oblasť je navrhnutá tak, aby tvorila maximálne
stabilný α-helix, ktorý sa začlení do hydrofóbneho
prostredia lipidového jadra, kým oba polárne
dilyzínové konce ukotvujú peptid v polárnom
prostredí dvojvrstvy a zabraňujú laterálnej agregácii
týchto peptidov.
Podrobné biofyzikálne štúdie interakcií P24, L24
alebo WALP peptidov [5] s dvojvrstvovými membránami ukázali, že zabudovanie týchto peptidov do
312
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
membrán spôsobilo pokles usporiadania v gélovom
stave a jeho nárast v tekutokryštalickom stave.
Veľkosť zmeny štruktúrnych a termodynamických
parametrov membrány bola vysvetlená na základe
tzv. „matracového“ modelu založeného na rozdieloch vo veľkostiach hydrofóbnych oblastí peptidu
a membrány [6].
Naše nedávne výskumy pomocou precíznej denzitometrie a ultrazvukovej velocimetrie ukázali, že
L24 peptid vyvolal zmeny v lipidových membránach
rôznej hrúbky [7]. V gélovom stave lipidovej membrány boli získané výsledky v súlade s výsledkami
zistenými pomocou diferenciálnej skenovacej
kalorimetrie (DSC). V tekutokryštalickom stave
však výsledky neboli jednoznačné. Kým špecifický
objem fosfolipidov s relatívne vysokým objemom
peptidov bol nižší v porovnaní s čistým dimyristoylfosfatidylcholínom (DMPC), objemová stlačiteľnosť
bola vyššia v porovnaní s čistým DMPC. Tieto vlastnosti pravdepodobne súvisia s anizotropiou
mechanických vlastností membrán [8].
Ďalšie informácie o štruktúre a dynamike lipidových dvojvrstiev, ako aj o mechanizme proteínovo-lipidových interakcií na molekulovej úrovni,
možno získať pomocou metódy molekulovej
dynamiky (MD). MD už bola mnohokrát úspešne
použitá na štúdium proteín-lipidových interakcií
(pozri [9, 10] a odkazy tam uvedené). MD simulácie
ukázali naklonenie peptidu vzhľadom k normále
k povrchu membrány do 20° pre WALP21 [10] a do
25° pre peptid Flu34 [11]. Teoretická práca Li [12]
23.10.2006
ŠTÚDIUM
8:58
Page 313
INTERAKCIE MODELOVÝCH
α-HELIKÁLNYCH
PEPTIDOV S LIPIDOVÝMI DVOJVRSTVAMI
POMOCOU MOLEKULOVEJ DYNAMIKY
založená na teórii poľa predpovedá vzrast naklonenia peptidu so vzrastom hydrofobicity helixu. Ale
štúdie založené na rozptyle rőntgenových lúčov fosfatidylcholínových membrán obsahujúcich WALP
peptidy ukazujú, že peptid je orientovaný takmer
kolmo na membránu s maximálnym sklonom 4°
[13]. Iné štúdie uskutočnené pomocou 15N a 31P NMR
spektroskopie v orientovaných membránach ukazujú vzrast uhla naklonenia peptidu s poklesom
hrúbky membrány [14].
V tejto práci sme použili metódu molekulovej
dynamiky na systém DMPC-L24 v gélovom, ako aj
v tekutokryštalickom stave, pričom sme sa zamerali
na zodpovedanie nasledujúcich otázok: 1. Ovplyvňuje štruktúra lipidovej membrány (v stave gélu
alebo v tekutokryštalickom stave) vlastnosti
α-helixu? 2. Vplýva α-helix na usporiadanie lipidovej
membrány v gélovom a tekutokryštalickom stave?
Ak áno, ako tento vplyv závisí na vzdialenosti od
povrchu peptidu? 3. Aká je orientácia peptidu v lipidovej membráne, ak existuje rozdiel medzi hydrofóbnou hrúbkou peptidu a membrány?
METÓDA MOLEKULÁRNO-DYNAMICKEJ
SIMULÁCIE
lipidov a 3655 molekúl vody [17], bol použitý ako
modelová membrána. V tejto membráne bola
uprostred vytvorená cylindrická diera odstránením
lipidov vo vzdialenosti 0,23 nm od centrálnej osi
cylindra. Do tejto diery bol vsunutý L24. Výsledný
systém (peptid L24, 124 DMPC molekúl
a 3655 molekúl vody) pozostával zo 16853 atómov nachádzajúcich sa v krabici o veľkosti
6,17×6,17×6,66 nm. Energia systému bola minimalizovaná počas 1 ns simulácie, počas ktorej bol peptid
fixovaný. Nasledovala samotná 10 ns MD simulácia
pri dvoch teplotách T = 288 K a T = 310 K, ktoré zodpovedajú teplotám pod a nad fázovým prechodom,
t.j. gélovému a tekutokryštalickému stavu. Simulácie boli uskutočnené za nasledovných podmienok:
konštantný tlak 1 bar vo všetkých troch rozmeroch
(τP = 1,0 ps), konštantná teplota udržiavaná
samostatne pre vodu, lipidy a proteín (τT = 0,1 ps),
dvojité useknutie potenciálov: 1 nm pre van der
waalsovské interakcie a 1,8 nm pre elektrostatické
interakcie (algoritmus PME), časový krok 2 fs. Na
obmedzenie dĺžok kovalentných väzieb bol použitý
algoritmus LINCS. Tieto podmienky sú podobné
tým, ktoré boli použité Bergerom a spol. [18].
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
VÝSLEDKY A DISKUSIA
Použili sme počítačové modelovanie a molekulovú
dynamiku pre určenie možných zmien v geometrii
peptidu L24 ako aj zmien v lipidovej membráne
vyvolaných vložením peptidu do lipidovej dvojvrstvy. Štruktúru peptidu v membráne sme porovnali s jeho štruktúrou vo vákuu. Simulácie boli uskutočnené pomocou softvérového balíka Gromacs
3.1.4 [15]. Systém, ktorý sme použili pre simuláciu,
bol tvorený simulačnou krabicou za použitia periodických hraničných podmienok. Počiatočný model
α-helixu L24 peptidu bol vytvorený v balíku
HyperChem 5.02 [16] a následne optimalizovaný vo
vákuu. Membránový fragment zložený z DMPC,
v rovnovážnom stave pozostávajúci zo 128 molekúl
Študovali sme správanie peptidu L24 v DMPC membráne v gélovom a v tekutokryštalickom stave. Fázový
prechod DMPC je približne 297 K (24 °C), a preto boli
vybrané teploty 288 K a 310 K, ktoré sú pod a nad
touto hodnotou prechodu. Zaujímalo nás, nakoľko
ovplyvnia okolité lipidy štruktúru peptidu, a či peptid
zmení usporiadanie lipidov vo svojom tesnom okolí
a vo vzdialenejšej vrstve. Pretože dĺžka hydrofóbnej
oblasti peptidu je približne 3,1 nm [3, 4], čo sa líši od
hrúbky hydrofóbnej oblasti membrány v gélovom skupenstve (3,42 nm), ako aj v tekutokryštalickom stave
(2,28 nm) [3], analyzovali sme geometriu systémov
nachádzajúcich sa v oboch fázach.
1/ Závislosť dĺžky aminokyselinového zvyšku ako funkcia času v DMPC dvojvrstve v (a) gélovom (T = 288 K)
a (b) tekutokryštalickom stave (T = 310 K). Biele čiary znázorňujú priemerné hodnoty.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
313
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 314
2/ Závislosť uhlov Ψ a Φ ako funkcia času v DMPC dvojvrstve v (a) gélovom (T = 288 K) a (b) tekutokryštalickom
stave (T = 310 K). Biele čiary znázorňujú priemerné hodnoty.
Najprv sme analyzovali štruktúrne parametre peptidu, dĺžku na aminokyselinový zvyšok, dihedrálne
uhly skeletu ako funkcie času simulácie. Obr. 1
ukazuje závislosť dĺžky pripadajúcej na jednu
aminokyselinu v závislosti od času. Je vidieť, že
v oboch prípadoch (gél – obr. 1a; tekuté kryštály –
obr. 1b) sa táto hodnota pohybovala v intervale 0,14
až 0,15 nm, čo je blízke ideálnej teoretickej hodnote
pre α-helix (0,15 nm [10]). Tieto fluktuácie, tak ako
sme očakávali, vzrastali s teplotou. Počas simulácie
neboli pozorované podstatné zmeny dihedrálnych
uhlov hlavného reťazca, ktoré fluktuovali o menej
ako 3° pre Ψ a o menej ako 5° pre Φ uhly. Tieto závislosti sú znázornené na obr. 2 pre obe teploty.
Priemerné hodnoty pre Ψ a Φ sú v dobrom súhlase
so simuláciami uskutočnenými s inými α-helix
peptidmi [10]. Preto peptid v membráne preukázal
stabilné štruktúrne parametre, ktoré sú blízko
k hodnotám neporušeného α-helixu.
Analýza dynamických vlastností polárnych častí
a hydrofóbnej časti zahŕňala výpočet strednej
kvadratickej odchýlky fluktuácií (RMSD) peptidu
v gélovom a v tekutokryštalickom stave od stavu vo
vákuu. Zmeny v štruktúre peptidu počas simulácie
3/ Odchýlka (RMSD) priemerných pozícií Cα
aminokyselinových zvyškov L24 peptidu k stavu
vo vákuu v (a) gélovom (T = 288 K)
a (b) tekutokryštalickom stave (T = 310 K).
314
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
dosahovali veľkosti 0,2 nm. Obr. 3 znázorňuje veľkosť
fluktuácií Cα atómov zodpovedajúcich aminokyselinovým zvyškom. V oboch prípadoch dochádzalo
k fluktuáciám prevažne na oboch koncoch peptidu
(prvé 3 a posledné 4 aminokyselinové zvyšky). Tieto
fluktuácie sú spojené s pohybmi –NH3+ skupín
lyzínov, ktoré kotvia peptid v oblasti hlavičiek fosfolipidov. Hydrofóbne jadro pozostávajúce z leucínov nevykonávalo také veľké pohyby. Rovnako je
možné pozorovať, že nedošlo k signifikantným
zmenám vo fluktuáciách medzi gélovým a tekutokryštalickým stavom membrány. Značné fluktuácie koncových skupín sa dajú vysvetliť interakciami
–NH3+ skupín s polárnymi hlavičkami fosfolipidov,
ale rovnako aj s okolitými molekulami vody.
Dôležitou veličinou charakterizujúcou štrukturálny stav membrány je parameter usporiadania. Tento
parameter korešponduje so stupňom usporiadania
hydrofóbnych reťazcov fosfolipidov závisiacich na
usporiadaní atómov v nich. Z trajektórií získaných
simuláciami je možné vypočítať parametre usporiadania podľa nasledovného vzťahu:
(1)
kde Θ(t) je uhol medzi vektorom CH a osou kolmou
na rovinu lipidovej dvojvrstvy v čase t, pričom sú
všetky hodnoty spriemerované. Maximálna hodnota
usporiadania k osi kolmej na povrch je 1 a minimálna je 0. Vypočítali sme parametre usporiadania pre
dve vrstvy fosfolipidov: prvá sa nachádza do vzdialenosti 0,8 nm od povrchu peptidu a druhá medzi
0,8 a 1,6 nm. Tieto vrstvy zodpovedajú prvej a druhej
vrstve lipidov okolo peptidu. Výsledky výpočtov sú
zobrazené na obr. 4 pre gél (a) a pre tekutokryštalický stav (b). Ako je možné vidieť na tomto obrázku,
parametre usporiadania monotónne klesajú k centru
dvojvrstvy, čo je spojené so vzrastom pravdepodobnosti trans-gauche prechodov v centrálnej časti. Je
evidentné, že v gélovom stave sú reťazce v centrálnej
časti menej usporiadané ako v koncových oblastiach. V koncových častiach sú uhľovodíkové reťazce
23.10.2006
ŠTÚDIUM
8:59
Page 315
INTERAKCIE MODELOVÝCH
α-HELIKÁLNYCH
PEPTIDOV S LIPIDOVÝMI DVOJVRSTVAMI
POMOCOU MOLEKULOVEJ DYNAMIKY
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
4/ Závislosť parametrov usporiadania ako funkcia pozície uhlíkových atómov hydrofóbnych reťazcov v blízkosti
povrchu peptidu (0–0,8 nm) () a vo vzdialenosti (0,8–1,6 nm) () pre membránu v gélovom (a)
a tekutokryštalickom (b) stave. Atóm 1 je karbonyl a 14 patrí do koncovej metylovej skupiny.
usporiadané podobne a usporiadanie nezávisí od
vzdialenosti (obr. 4a). Parametre usporiadania
v tekutokryštalickom stave naznačujú, že uhľovodíkové reťazce v blízkosti peptidu sú usporiadanejšie
ako vo vzdialenejších oblastiach po 7. uhlík. Pre
nasledujúce uhlíky k stredu membrány nie sú
rozdiely medzi gélovým a tekutokryštalickým
stavom a prejavuje sa pokles hodnoty. Toto je
v dobrej zhode s doteraz získanými údajmi [17].
Nami uvádzané hodnoty parametrov usporiadania sú
porovnateľné s hodnotami publikovanými Tielemanom et al. [9]. Pravdepodobne v gélovom stave, kde
je hydrofóbna časť peptidu (3,1 nm [3]) menšia ako
hrúbka hydrofóbnej oblasti membrány (3,42 nm [3]),
peptid pôsobil rušivo na hydrofóbne reťazce vo svojej blízkosti, pričom vplyv klesal so vzdialenosťou.
V tekutokryštalickom stave došlo k opačnej situácii
– hrúbka hydrofóbnej časti membrány (2,28 nm [3])
bola menšia ako hrúbka peptidu, a preto došlo
k efektu usporiadania blízkych lipidov. V zásade sú
tieto hodnoty v súhlase s experimentálnymi údajmi
[3–5], ktoré ukazujú rušivý efekt v gélovom stave,
kým v tekutokryštalickom stave dochádza k usporiadaniu. Pokles usporiadania lipidovej vrstvy k stredu
membrány je spojený so vzrastom trans-gauche prechodov (obr. 5). Je zjavné, že počet trans-gauche prechodov je vyšší v tekutokryštalickom stave ako
v gélovom. MD simulácie umožňujú určiť zmeny
dĺžok uhľovodíkových reťazcov fosfolipidov ako
funkcie času. Výsledky sú znázornené na obr. 6 pre
membránu v gélovom (a) a v tekutokryštalickom (b)
stave. Dĺžka je uvádzaná pre dvojicu vrstiev: prvá do
vzdialenosti 0,8 nm a druhá medzi 0,8 a 1,6 nm. Ako
je možné vidieť, v gélovom stave, kde je dĺžka
hydrofóbnej časti peptidu menšia ako hrúbka membrány, sú po 10 ns simulácii dĺžky uhľovodíkových
reťazcov lipidov rovnaké v oboch monovrstvách
a dosahujú v priemere 1,2 nm. Preto je hrúbka
hydrofóbnej časti membrány približne 2,4 nm. Táto
veličina je menšia ako hrúbka pôvodnej membrány
bez peptidu v gélovom stave (3,4 nm). Preto existuje
tendencia zúžiť membránu v tesnej blízkosti proteínu, čo je v dobrej zhode s „matracovým“ modelom
lipid-proteínových interakcií a s pozorovaným
narušujúcim vplyvom peptidu na svoje okolie
v membráne (pozri obr. 4). V tekutokryštalickom
stave je dĺžka uhľovodíkových reťazcov fosfolipidov
v druhej vrstve počas prvých 6 ns v priemere väčšia
ako v prvej vrstve v blízkosti peptidu. Ale po 10 ns sa
tieto dĺžky nelíšia a dosahujú približne hodnotu
1,11 nm. Z toho vyplýva hrúbka hydrofóbnej časti
membrány: 2,22 nm, ktorá je takmer identická
s hrúbkou pôvodnej membrány. Preto v tekutokryštalickom stave neboli pozorované zmeny hrúbky,
ktoré bolo možné očakávať z „matracového“ modelu
proteín-lipidových interakcií. Existujúce rozdiely
medzi dĺžkou peptidu a hrúbkou membrány boli
odstránené pomocou naklonenia peptidu o 33°
vzhľadom na os kolmú na membránu. Dokonca aj
v stave gélu bol peptid naklonený o uhol 13°, čo
môže byť dôsledkom teplotných fluktuácií hrúbky
[8]. Obr. 7 ukazuje systém v jednotlivých časových
intervaloch simulácie pre lipidy v gélovom skupen-
5/ Počet trans-gauche prechodov ako funkcia
pozície v reťazci fosfolipidov v gélovom (a)
a tekutokryštalickom (b) stave.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
315
23.10.2006
8:59
Page 316
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
6/ Priemerné dĺžky uhľovodíkových reťazcov fosfolipidov DMPC dvojvrstvy v blízkosti povrchu peptidu
(0–0,8 nm) (hrubá čiara) a vo vzdialenosti (0,8–1,6 nm) (tenká čiara) pre membránu v gélovom (a)
a tekutokryštalickom (b) stave.
7/ Obrázky DMPC dvojvrstvy v gélovom stave so zabudovanou molekulou peptidu L24 na začiatku (t = 0 ns)
a počas MD simulácie v časoch 1, 2, 4, 6, 8 a 10 ns.
stve. Obr. 8 znázorňuje rovnaké momenty pre systém
v tekutokryštalickom stave. Ako bolo uvedené
vyššie, v prípade gélu dosahuje naklonenie peptidu
hodnotu 13°, v tekutokryštalickom stave je to 33°.
Obr. 9 ukazuje naklonenie helixu v závislosti od času
pre oba systémy. V prípade gélového stavu sú na
začiatku simulácie veľké fluktuácie uhla naklonenia,
ktoré sa ale postupne zmenšujú a v čase väčšom ako
5 ns dochádza len k malým zmenám uhla okolo
rovnovážnej polohy. V tekutokryštalickom stave sú
väčšie zmeny fluktuácií pozorovateľné počas prvých
4 ns, počas ktorých vzrastá naklonenie helixu. Po
4 ns simulácie sa naklonenie stabilizuje a nasledujú
už len malé odchýlky od rovnovážneho stavu. Väčšie
naklonenie α-helixu je pravdepodobne spôsobené menšou hrúbkou membrány v tekutokryštalickom stave.
V predchádzajúcich prácach bolo pozorované
naklonenie α-helikálnych peptidov zložených
z iných aminokyselín v lipidových membránach.
Napr. Tieleman a spol. [11] uskutočnili 2 ns MD
simuláciu α-helixu s dlhými hydrofóbnymi časťami
316
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
(Flu26 a Flu34) v POPC membránach. Pozorovali
vzrast hrúbky membrány okolo peptidu Flu26 a jeho
naklonenie o 10°. V prípade Flu34 s dlhšou
hydrofóbnou časťou neboli pozorované zmeny
hrúbky membrány, ale peptid sa naklonil o 25°.
Systematické štúdie uskutočnené Petrache a spol.
[10] svedčia o existencii naklonenia WALP21 peptidu (dĺžka hydrofóbnej časti 2,7 nm) o 20°. Títo
autori sa zaoberali aj nevýhodami MD simulácií.
Jednou z nich je ich krátke trvanie (rádovo ns).
Treba však poznamenať, že rovnaké výsledky získali
v prípade 5 ns a 10 ns simulácií. Je však zrejmé, že
charakteristické časy relaxácií dipólových momentov fosfolipidov nasledujúcich po napäťovom skoku
sa pohybujú v oblasti mikro- až milisekúnd. Dlhšie
časy pravdepodobne zodpovedajú kolektívnym
pohybom celých lipidových zhlukov [19]. Zabudovanie krátkych peptidov však podstatne ovplyvňuje
tento relaxačný čas [20]. Preto môžeme očakávať, že
relaxačné časy krátkych peptidov ako je L24 budú
porovnateľné alebo dokonca väčšie ako relaxačné
23.10.2006
ŠTÚDIUM
8:59
Page 317
INTERAKCIE MODELOVÝCH
α-HELIKÁLNYCH
PEPTIDOV S LIPIDOVÝMI DVOJVRSTVAMI
POMOCOU MOLEKULOVEJ DYNAMIKY
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
8/ Obrázky DMPC dvojvrstvy v tekutokryštalickom stave so zabudovanou molekulou peptidu L24 na začiatku
(t = 0 ns) a počas MD simulácie v časoch 1, 2, 4, 6, 8 a 10 ns.
9/ Naklonenie peptidu k osi kolmej na membránu ako
funkcia času pri oboch teplotách 288 K a 310 K.
časy fosfolipidov. Preto simulácia potrebná na dosiahnutie rovnovážneho stavu mala trvať aspoň
niekoľko µs. Tieto časy sú však vzdialené od
možností súčasných výpočtových techník. Naklonenie peptidu počas krátkej simulácie môže byť len
jedným z možných nerovnovážnych stavov.
Napríklad, štúdium WALP peptidov v DMPC membránach pomocou difrakcie Röntgenových lúčov
ukázalo prakticky nulové naklonenie peptidu a takmer žiadne zmeny hrúbky membrány [13]. Je zrejmé,
že v tomto prípade možno považovať peptidovomembránový systém za rovnovážny. Treba však poznamenať, že ani nami pozorované naklonenie o 33°
nedokázalo plne odstrániť rozdiel medzi hrúbkami
hydrofóbnych častí peptidu a membrány. Pri hodnotách dĺžky hydrofóbnej časti peptidu 3,1 nm
a membrány 2,28 nm, by bolo potrebné dosiahnuť
naklonenie o 42° pre vyrovnanie týchto rozdielov.
Navyše MD simulácie neumožňujú zhodnotiť
drsnosť membrány (pozri napr. [8]) a väčšie tepelné
fluktuácie hrúbky. Drsnosť membrány môže dosaho-
vať veličiny porovnateľné s hrúbkou membrány, teda
môže ľahko eliminovať rozdiel 1,32 nm v dĺžkach
medzi hydrofóbnymi časťami L24 a DMPC dvojvrstvou v tekutokryštalickom stave.
Ďalším nedostatkom MD simulácií, diskutovaným
taktiež v literatúre [10, 17], je fakt, že simulácie boli
uskutočnené na lipidovej dvojvrstve s konštantnou
plochou na molekulu fosfolipidu. Naše nedávne
štúdie vplyvu L24 na vlastnosti lipidových
monovrstiev ukázali, že peptid indukuje značný
nárast plochy na fosfolipidovú molekulu [21].
Pozorované zmeny v parametroch usporiadania
DMPC v dôsledku interakcie s L24 môžu byť
považované za určitú aproximáciu. Pri konštrukcii
systému peptid-membrána je potrebné odstrániť
niektoré molekuly lipidov z membrány pre vytvorenie
cylindrickej diery. Preto existujú určité obmedzenia
vo výbere najbližších lipidov k peptidu, aby bolo
možné peptid správne zabudovať do membrány.
Aj napriek existujúcim obmedzeniam sú MD
simulácie hodnotným nástrojom pre štúdium rýchlych konformačných zmien peptidov a fosfolipidov
v membráne. Výsledky získané MD simuláciami sú
v zhode s experimentálnymi údajmi svedčiacimi
o raste špecifického objemu fosfolipidov v dôsledku
interakcie s peptidmi v gélovom stave. V tekutokryštalickom stave spôsobil peptid rast usporiadania hydrofóbnych reťazcov fosfolipidov v tesnej
blízkosti svojho povrchu v porovnaní so vzdialenejšími oblasťami membrány, čo je v zhode s 2H NMR
štúdiami podobných systémov [4, 5].
ZÁVER
Pomocou molekulovej dynamiky bolo možné
analyzovať interakciu α-helikálneho peptidu
acetyl-K2-L24-K2-amid (L24) s lipidovou dvojvrstvou
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
317
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 318
zloženou z DMPC pri teplotách 288 K (gélový stav)
a 310 K (tekutokryštalický stav). Ukázali sme, že aj
napriek rozsiahlym fluktuáciám v koncových oblastiach peptidu, α-helikálna štruktúra hydrofóbnej
časti peptidu uprostred membrány zostala
zachovaná. Fluktuácie parametrov helixu také ako
dĺžka na aminokyselinový zvyšok a dihedrálne uhly
boli vyššie v tekutokryštalickom stave ako
v gélovom, ale priemerné hodnoty sa v oboch prípadoch blížili k hodnotám ideálneho α-helixu.
Peptid spôsobil narušenie usporiadania lipidovej
dvojvrstvy v gélovom stave a zvýšil usporiadanie
dvojvrstvy v tekutokryštalickom stave v porovnaní
s molekulami fosfolipidov, ktoré sa nachádzajú vo
vzdialenejších častiach membrány. Na konci 10 ns
simulácie bol peptid naklonený k osi kolmej na
povrch membrány o 13° pre gélový stav a 33° pre
tekutokryštalický stav dvojvrstvy. Nepozorovali sme
zásadné zmeny usporiadania systému peptid-membrána pre rôzne časy simulácií: 5 až 10 ns.
Poďakovanie
Táto práca bola finančne podporovaná agentúrou
NATO (projekt číslo LST.CLG.978567), INTAS (projekt číslo 01-0224) a VEGA (projekt číslo 1/1015/04).
Literatúra
[1] A. G. Lee, Biochim. Biophys. Acta 1612, 1 (2003).
[2] T. Gil, J. H. Ipsen, O. G. Mouritsen, M. C. Sabra,
M. M. Sperotto, M. J. Zuckermann, Biochim. Biophys.
Acta 1376, 245 (1998).
[3] Y.-P. Zhang, R. N. A. H. Lewis, R. S. Hodges,
R. N. McElhaney, Biochemistry 31, 11579 (1992).
[4] C. Paré, M. Lafleur, F. Liu, R. N. A. H. Lewis,
R. N. McElhaney, Biochim. Biophys. Acta 1511, 60
(2001).
318
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
[5] M. R. R. de Planque, D. V. Greathous, R. E. Koeppe II.,
H. Schäfer, D. Marsh, J. A. Killian, Biochemistry 37,
9333 (1998).
[6] O. G. Mouritsen, M. Bloom, Biophys. J. 46, 141
(1984).
[7] P. Rybar, R. Krivanek, T. Samuely, R. N. A. H. Lewis,
R. N. McElhaney, T. Hianik, Biochim. Biophys. Acta,
poslané.
[8] T. Hianik, V. I. Passechnik, Bilayer Lipid
Membranes: Structure and Mechanical Properties,
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston,
London, 1995.
[9] S. Feller, Molecular Dynamics Simulation of
Phospholipid Bilayers. V: (Red. J. Katsaras,
T. Gutgerlet) Lipid Bilayers. Structure and
Interactions, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg,
New York, 2001, s. 89.
[10] H. I. Petrache, D. M. Zuckerman, J. N. Sachs,
J. A. Killian, R. E. H. Koeppe II, T. B. Woolf,
Langmuir 18, 1340 (2002).
[11] P. D. Tieleman, L. R. Forest, M. S. P. Samsom,
H. J. C. Berendsen, Biochemistry 37, 17554 (1998).
[12] L. Li, Biophys. Chem. 86, 79 (2000).
[13] T. M. Weiss, P.C.A. van der Wer, J.A. Killian,
R.E. Koeppe II, H.W. Huang, Biophys. J. 84, 379
(2003).
[14] U. Harzer, B. Bechinger, Biochemistry 39, 13106
(2000).
[15] E. Lindahl, B. Hess, D. van der Spoel, J. Mol. Mod. 7,
306 (2001).
[16] HYPERCHEM HyperCube, Inc. 1992.
[17] D. P. Tieleman, S. J. Marrink, H. J. C. Berendsen,
Biochim. Biophys. Acta 1331, 235 (1997).
[18] O. Berger, O. Edholm, F. Jähnig, Biophys. J. 72, 2002
(1997).
[19] D. F. Sargent, J. Membr. Biol. 23, 227 (1975).
[20] T. Hianik, R. Krivánek, D.F. Sargent, L. Sokolíková,
K. Vinceová, Progr. Coll. Polym. Sci. 100, 301 (1996).
[21] P. Vitovič, S. Kresák, R. Naumann, S. M. Schiller,
R. N. A. H. Lewis, R.N. McElhaney, T. Hianik,
Bioelectrochemistry 63, 169 (2004).
23.10.2006
8:59
STUDIUM
Page 319
OLIGONUKLEOTIDŮ POKROČILÝMI
TECHNIKAMI OPTICKÉ SPEKTROSKOPIE
Daniel Němeček1, Eva Kočišová, Petr Praus,
Josef Štěpánek, Fyzikální ústav MFF UK, Ke Karlovu 5, 121 16 Praha 2
Jednu z důležitých a rozsáhlých oblastí biofyzikálního výzkumu představuje sledování
tvorby specifických komplexů mezi biomolekulami, případně mezi biomolekulami
a syntetickými molekulami cíleně připravenými jako molekulární značky, strukturní
sondy nebo aktivátory či supresory biochemických reakcí. Látky posledního typu jsou
často uvažované i jako nové typy chemoterapeutik. Charakteristickým prvkem v této
oblasti výzkumu v posledních letech je snaha o rozšíření používaných
experimentálních technik na metody, které umožní získat detailnější informace
o tvorbě těchto komplexů. Konkrétně to znamená, že kromě informací o tom, zda
a s jakým výtěžkem se za daných podmínek komplex tvoří a jaké má jeho tvorba
důsledky pro probíhající vnitrobuněčné pochody, je žádoucí i zjišťovat detaily
geometrického uspořádání molekul v komplexu, sledovat kinetiky asociačních
i disociačních pochodů a při studiích na buněčných systémech sledovat časový vývoj
lokalizace komplexů. Vhodným nástrojem pro tato studia mohou být různé formy
pokročilých optických metod využívajících elektronovou a vibrační optickou
spektroskopii v kombinaci s prostorovým a časovým rozlišením a s komplexními
matematickými metodami vyhodnocování.
V tomto příspěvku je ilustrován tento trend na příkladu krátkých syntetických úseků
nukleových kyselin, oligonukleotidů, studovaných v naší skupině se zaměřením na
jejich potenciální terapeutické využití. Rozebíráme zde aplikaci dvou typů optických
technik, Ramanovy spektroskopie se statistickou analýzou spektrálních sérií
a fluorescenční mikrospektroskopie s časovým rozlišením.
OLIGONUKLEOTIDOVÁ TERAPIE
Oligonukleotidy jsou synteticky připravené krátké
řetězce deoxyribonukleové (DNA) nebo ribonukleové (RNA) kyseliny. Jejich základní stavební jednotkou je nukleotid, který se skládá z dusíkaté báze,
cukru a fosfátové skupiny. Na obr. 1 je znázorněna
chemická stavba nukleotidu včetně standardního
číslování atomů. U DNA se vyskytují převážně čtyři
typy molekul bází, a sice adenin (A), thymin (T),
guanin (G) a cytosin (C), u RNA je thymin nahrazen
uracilem (U). Při tvorbě řetězce jsou molekuly
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
cukru spojeny přes fosfátovou skupinu diesterickou
vazbou mezi 5' a 3' uhlíky sousedních cukrů.
Nejdůležitějším typem interakcí mezi řetězci nuk-
Seznam nejčastěji používaných zkratek
A
DNA
NA
RNA
SVD
T
U
1
adenin
deoxyribonukleová kyselina
nukleová kyselina
ribonukleová kyselina
singular value decomposition
thymin
uracil
1/ Deoxynukleotid – stavební jednotka DNA. Je
vyznačeno standardní číslování uhlíkových atomů
cukru. V případě RNA je na uhlíku 2' připojena OH
skupina. Čárkovaně jsou vyznačeny vazby, kterými se
nukleotidy spojují v molekulách nukleových kyselin.
Současná adresa: University of Missouri, School of Biological Sciences, 5100 Rockhill Road, Kansas City, Missouri
64110-2499
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
319
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 320
leových kyselin (NA) je tvorba duplexů mezi dvěma
antiparalelními úseky vláken s komplementárním
bázovým složením. Požadavek komplementarity
znamená, že proti sobě postavené báze jsou pouze
v párech AT nebo GC. Tak vzniká poměrně stabilní
komplex, který se uplatňuje při uchovávání genetické informace v DNA, při její replikaci a expresi
nebo stabilizaci strukturních motivů jednořetězcové
RNA. Tvorba tohoto komplexu oligonukleotidem se
obvykle označuje jako hybridizace.
Hlavní myšlenkou oligonukleotidové terapie je
využití tendence nukleových kyselin tvořit spontánně komplexy stabilizované vazbami mezi komplementárními dvojicemi bází. V průběhu posledních
pětadvaceti let, kdy se oligonukleotidy z tohoto
pohledu studují, se ukázalo, že zavedení uměle připravených oligonukleotidů s definovanou sekvencí
do buňky poskytuje zajímavé možnosti cíleného
ovlivňování genové exprese [1]. Míru specifičnosti
oligonukleotidového působení nejlépe ilustruje fakt,
že již posloupnost sedmnácti nukleotidů se v celém
lidském genomu vyskytuje v průměru jen jednou.
V principu každý krok přenosu genetické informace v procesech replikace, translace i transkripce
může být takto cíleně ovlivňován. V současné době
je nejbližší širšímu klinickému použití takzvaná
antisenzní strategie [2]–[4], při které se jednořetězcové „antisenzní“ oligonukleotidy váží k cílové
komplementární („senzní“) sekvenci na mRNA.
Molekula mRNA přenáší příslušnou genetickou
informaci od DNA k ribosomům, kde dochází
k syntéze odpovídajícího proteinu. Navázáním antisenzního oligonukleotidu však vznikne na mRNA
lokální hybridní duplex, který syntézu proteinů
zablokuje (obr. 2) nebo dokonce při navázání enzymu RNázy H na tento duplex vede k degradaci
molekuly mRNA, zatímco antisenzní oligonukleotid
zůstane aktivní.
2/ Schéma antisenzního mechanismu zablokování
exprese nežádoucího genu
320
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
Bohužel, synteticky připravené krátké řetězce
s přirozeným chemickým složením nukleových
kyselin nejsou v živých buňkách obvykle dostatečně
stabilní. Buněčné enzymy, endo- a exonukleázy, tyto
látky zpravidla degradují dříve, než se může projevit
jejich účinek na buňku. Jednou z možných cest, jak
zvýšit stabilitu oligonukleotidů v buněčném prostředí, je použití chemicky modifikovaných molekul,
které by na jedné straně díky chemické změně byly
stabilní vůči štěpícím enzymům a na straně druhé si
zachovaly schopnost specifické vazby ke komplementární sekvenci bází v nukleové kyselině.
Patrně nejrozšířenější typ chemické modifikace
antisenzních oligonukleotidů představují fosforothioáty, u kterých je nahrazen jeden nevazebný kyslík na fosfátové skupině sírou [5]. Při této modifikaci
se dosahuje podstatně větší enzymatické stability
oligonukleotidu, ale schopnost aktivovat činnost
RNázy H zůstává zachována. Na druhé straně však
tato modifikace má za následek možnost nespecifické vazby fosforothioátového oligonukleotidu
k proteinům [6], [7], což vede k určité toxicitě
preparátu [8]. Další použitelné možnosti jsou modifikace molekul cukru, například připojením methylové skupiny na 2’-kyslík ribózy nebo vytvořením
methylenového můstku mezi 2’-kyslíkem a 4’-uhlíkem. Tyto modifikace je však možné umisťovat jen
na okrajové části oligonukleotidu [9]-[11]. V současnosti je několik desítek preparátů na bázi modifikovaných antisenzních oligonukleotidů ve stadiu
klinických zkoušek a jeden z nich, Vitravene™, byl
již americkou FDA uvolněn pro léčbu pacientů s cytomegalovirovým zánětem oční sítnice [3], [12].
Přesto ani tento, ani ostatní testované typy
oligonukleotidů nemají zdaleka ideální vlastnosti –
použité modifikace například podporují vznik
nespecifických vazeb na jiné sekvence mRNA nebo
na buněčné proteiny, což oslabuje léčebný účinek
a vede k částečné toxicitě preparátu pro léčený organismus [13]. Tato situace stimuluje hledání vhodnějších typů modifikací oligonukleotidů. V tuzemsku se
návrhům a syntéze nových typů těchto modifikovaných oligonukleotidů věnuje skupina Ing. Ivana
Rosenberga, CSc., z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR. Jednou z poměrně nadějných zde
nalezených modifikací je izopolární prodloužená
internukleotidová spojka 3'-O-P-CH2-O-5', která
zachovává schopnost specifické vazby na komplementární sekvenci, ale přitom má vysokou rezistenci v buněčném prostředí a aktivuje RNázu H [14].
Při hledání nových molekulárních řešení v oblasti
oligonukleotidové terapie hraje primární roli sledování tvorby specifických komplexů mezi
oligonukleotidy a cílovými sekvencemi nukleových
kyselin. Existuje celá řada experimentálních technik, umožňujících sledovat úroveň vazebné afinity
(UV absorpce, mikrokalorimetrie, NA senzory), ale
23.10.2006
8:59
Page 321
STUDIUM
OLIGONUKLEOTIDŮ POKROČILÝMI TECHNIKAMI OPTICKÉ SPEKTROSKOPIE
většina z nich nemůže podat informaci o strukturních
detailech tvořeného komplexu, a tedy ani o důvodech, proč si konkrétní modifikace vede hůře nebo
lépe z hlediska komplexace s přirozeným úsekem
NA. V tomto směru mají vysoký potenciál metody
vibrační, především Ramanovy spektroskopie.
Dalším aspektem oligonukleotidové terapie, který
vyžaduje studia na molekulární úrovni, je doprava
oligonukleotidů do živých buněk. Základním problémem je totiž malá schopnost oligonukleotidů
procházet plazmatickou membránou, která představuje bariéru pro větší a nabité molekuly. Jsou proto
vyvíjeny a testovány různé umělé systémy pro stimulaci vstupu do buněk, podobně jako u jiných hydrofilních léčebných preparátů. V současné době jsou pro
oligonukleotidy rozpracovávány dvě hlavní strategie.
První spočívá v uložení oligonukleotidu do lipidické
nebo i nelipidické schránky. V tomto případě se
oligonukleotid dostává do buňky mechanismem endocytózy, kdy je uvnitř váčku vytvořeného z plazmatické
membrány, a je třeba, aby došlo k jeho uvolnění do
cytosolu buňky [15]–[17]. Ve druhém případě je
vytvářen komplex mezi oligonukleotidem a molekulou, která kompenzuje jeho záporný náboj (například
oligopeptid nebo kationický porfyrin). Po průchodu
membránou se tento komplex rozpadá a oligonukleotid může reagovat s cílovou molekulou [18], [19].
Pro sledování vlivů transport podporujících systémů na vstup oligonukleotidů do buněk a jejich
další osud v buňkách je významné použití fluorescenčního značení, které umožňuje mapovat
okamžité rozložení oligonukleotidu pomocí fluorescenční mikroskopie. Je ovšem možné získávat
i další důležité informace – měření dob dohasínání
fluorescence umožňuje kontrolovat integritu sondy
a oligonukleotidu i monitorovat vazbu oligonukleotidu k vnitrobuněčným biomolekulám.
STUDIUM KOMPLEXŮ OLIGONUKLEOTIDŮ
POMOCÍ RAMANOVA ROZPTYLU
Ramanova spektroskopie
Spektroskopie Ramanova rozptylu je optická spektroskopická technika používaná především pro sledování přechodů mezi molekulárními vibračními
stavy, případně vzniku a zániku optických fononů
v pevných látkách. Jedná se o dvoufotonový jev, kdy
ve vzorku ozářeném fotonem o energii hν0 dojde
k přechodu mezi dvěma stacionárními stavy, jejichž
energetický rozdíl ∆E = Ekonečný – Epočáteční je podstatně nižší, a zbývající energie je vyzářena v podobě
fotonu Ramanova rozptylu o energii hνR:
hνR = hν0 – E.
(1)
Rozlišuje se Stokesova a anti-Stokesova větev
Ramanova rozptylu, které se nacházejí v opačných
frekvenčních oblastech vzhledem k ν0 a odpovídají
kladnému nebo zápornému znaménku ∆E. Měření se
téměř výhradně provádějí v oblasti Stokesovy větve,
kde je signál díky přednostnímu obsazení základních
vibračních stavů podstatně vyšší než v anti-Stokesově
oblasti. Ramanovo spektrum se zobrazuje jako závislost intenzity rozptýleného záření na rozdílu frekvencí
ν0 – νR ve vlnočtové škále. V případě nejčastějších fundamentálních přechodů je pak poloha Ramanova píku
přímo úměrná frekvenci příslušné vibrace.
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
3/ Porovnání Ramanova spektra duplexu vzniklého
ve vodném roztoku směsi komplementárních
polyribonukleotidů polyA a polyU (černá)
s matematickým součtem spekter obou složek ve
volném stavu (šedá). Rozdíly ukazují vliv vzniku
komplexu na Ramanovo spektrum. Šipky vyznačují
nejvýraznější změny zahrnující snížení vibrační
frekvence v důsledku tvorby specifických vodíkových
můstků (černá), pokles intenzity v důsledku
uspořádání bází (šedá) a vznik silného vibračního
pásu díky pravidelné geometrii v oblasti fosfátových
skupin (tmavošedá).
Vzhledem k citlivosti vibračních frekvencí a intenzit
Ramanových pásů na strukturu chemických vazeb,
molekulární geometrii a slabé vnitro- i mezimolekulární interakce je Ramanovo spektrum
spolehlivým indikátorem porušení chemických
vazeb, změn protonačního stavu, konformací
molekul a tvorby komplexů od jednoduchých iontů
přes malé ligandy až po tvorbu makromolekulárních
komplexů. Ramanova spektroskopie se proto významně uplatňuje i při studiu biomolekul. Obr. 3 ilustruje citlivost Ramanova spektra na tvorbu duplexu
dvou komplementárních vláken RNA. Oproti standardním metodám určování struktury biomolekul
má Ramanova spektroskopie výhodu poměrně snadného měření ve vodném prostředí, menších nároků
na množství vzorku a nižší časové náročnosti
měření. To umožňuje sledovat změny struktury nebo
mezimolekulárních interakcí v závislosti na různých
vnitřních i vnějších parametrech.
Nové možnosti pro použití Ramanova rozptylu
přineslo zavedení citlivých mnohokanálových CCD
detektorů, které nyní prakticky zcela nahrazují dříve
používanou jednokanálovou detekci pomocí fotonásobičů. Při užití mnohokanálových detektorů se
totiž díky paralelnímu měření optického signálu
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
321
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 322
v tisíci i více spektrálních bodech současně podstatně snižuje měřicí doba potřebná pro dosažení
určitého poměru signál/šum. To umožňuje nejen
měřit biomolekulární systémy s časově omezenou
stabilitou, ale získávat i rozsáhlé série spekter
zachycující změny ve vzorku v reakci na řízenou
úpravu vybraných fyzikálně-chemických podmínek,
jako je teplota, pH, koncentrační poměry ve směsných roztocích, koncentrace vybraných iontů atd.
Faktorová analýza sérií Ramanových spekter
V sériích spekter Ramanova rozptylu je zachycena
informace nejen o strukturních změnách, ale také
o fyzikálně-chemických parametrech probíhajících
procesů, například termodynamické charakteristiky
tvorby a rozpadu komplexů. V naší skupině se systematicky zabýváme globální analýzou sérií
Ramanových spekter tak, aby bylo možné objektivně získat strukturní i termodynamické údaje
o studovaných biomolekulárních systémech. Tento
přístup není zatím běžný ani pro Ramanovu spektroskopii mnohem jednodušších molekul, neboť
vyžaduje eliminaci celé řady artefaktů, které mohou
výsledky analýzy výrazně znehodnotit.
Sledování tvorby komplexů mezi oligonukleotidem a cílovou (z hlediska experimentu) molekulou
se děje na základě měření závislostí spekter na koncentračních poměrech interagujících látek (spektroskopická titrace) nebo závislostí spekter na
teplotě. Cílem analýzy je určení koncentrací volných
složek a složek vázaných v komplexech u jednotlivých měření a získání Ramanova spektra komplexu
(komplexů), a to i v případech, kdy se komplex za
všech experimentálních podmínek nachází ve směsi
jen spolu s volnými složkami nebo jinými komplexy.
Pokud se jedná o komplex, jehož struktura není
rigidní, potřebujeme získat i teplotní závislost jeho
spektra. Základní matematickou procedurou, kterou
používáme, je faktorová analýza, konkrétně algoritmus Singular Value Decomposition (SVD). V tomto
případě se série naměřených spekter rozkládá do
báze ortonormálních komponent (subspektra).
Obsah jednotlivých subspekter v daném změřeném
spektru je vyjádřen pomocí matice normovaných
koeficientů a singulárními hodnotami vyjadřujícími
statistickou váhu jednotlivých subspekter. Jestliže
tedy máme sérii N spekter Yi(ν), i = 1, ..., N, metoda
SVD nám poskytne N vzájemně ortonormálních subspekter Sj(ν), j = 1, .., .N; unitární matici koeficientů
V (N×N) a nerostoucí posloupnost nezáporných singulárních čísel Wj, j = 1, ..., N, které reprezentují
danou sadu spekter podle vztahu
v sumaci na pravé straně vztahu (2) omezíme jen na
M (M < N) prvních členů, dostaneme nejlepší
možnou aproximaci dané série spekter, kterou lze
získat kombinací M spektrálních tvarů. Velmi často
vystihují subspektra s nejvyššími čísly pouze šum,
a proto jejich vynechání pomáhá zlepšit poměr
signál/šum bez ztráty užitečné informace.
Smysluplný počet subspekter, který vystihuje
dostatečně spektrální sérii, se nazývá faktorovou
dimenzí. Lze ji odhadnout na základě průběhu poklesu v posloupnosti singulárních hodnot, nárůstu
šumu v subspektrech nebo případně ztráty korelace
řádků matice V s postupně se měnícími podmínkami, za kterých byla spektra v sérii měřena. Dalším
možným kritériem je zlom v poklesu tzv. reziduální
chyby, tedy standardní odchylky mezi původní sérií
spekter a jejich aproximací pomocí vztahu (2) při
omezeném počtu sčítaných členů.
Příklad SVD série Ramanových spekter je uveden
na obr. 4. Jedná se o titrační měření, kdy byla měřena spektra série směsných vodných roztoků
polyuridylové kyseliny (polyU), tj. řetězce RNA s jediným typem báze – uracilem, a adeninových dinukleotidů s modifikovanou internukleotidovou spojkou
(označení (S)-ApCOHA(2'-5'), chemický vzorec na
obr. 5). U všech vzorků byla stejná celková koncentrace v jednotkách nukleotidů, ale měnil se stechiometrický poměr uracil/adenin. Faktorová dimenze je
zřejmě rovná třem, neboť čtvrté singulární číslo je již
velmi malé a také úroveň po použití tří sčítanců v (2)
klesne na úroveň plata daného úrovní šumu. První
(2)
Výsledky SVD umožňují ze série spekter extrahovat
hlavní informační obsah. Platí totiž, že pokud se
322
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
4/ Výsledky faktorové analýzy (SVD) série
Ramanových spekter směsí polyU
a (S)-ApCOHA(2'-5') a poly(rU). Podrobnosti v textu.
23.10.2006
8:59
Page 323
STUDIUM
OLIGONUKLEOTIDŮ POKROČILÝMI TECHNIKAMI OPTICKÉ SPEKTROSKOPIE
5/ Výsledky studia tvorby komplexu mezi adeninovým
dinukleotidem s modifikovanou internukleotidovou
spojkou (S)-ApCOHA(2'-5') (nahoře vlevo) a polyU
pomocí Ramanovy spektroskopie. Vlevo nahoře je
závislost efektivity tvorby triplexu na teplotě a složení
směsi (S)-ApCOHA(2'-5') a polyU. Dole je spektrum
triplexu při 14 °C (černá) porovnané se spektrem
analogického komplexu tvořeného dinukleotidem
s přirozenou spojkou (šedá). Šipky vyznačují štěpení
pásu dýchací vibrace adeninu, které indikuje různost
orientace dvou adeninových bází modifikovaného
dinukleotidu.
subspektrum představuje vážené průměrné spektrum
celé série a jemu odpovídající koeficient reflektuje
slabou závislost danou změnami celkové intenzity
spektra. Druhé subspektrum reflektuje hlavní rozdíl
mezi Ramanovými spektry obou látek ve směsi
a příslušný koeficient se mění lineárně s rostoucím
relativním podílem jedné složky. Hlavní informace
o tvorbě komplexu je zachycena ve třetím subspektru, čemuž odpovídá závislost na složení směsi
s jedním výrazným maximem. Na základě těchto
výsledků lze konstatovat, že ve směsi se tvoří pouze
jeden stechiometrický typ komplexu; vzhledem
k poloze maxima v blízkosti hodnoty 1/3 adeninu lze
usuzovat na tvorbu triplexu, tedy trojšroubovice,
jejíž krajní vlákna tvoří dvě molekuly polyU a střední
pseudovlákno tvoří seřazené molekuly adeninových
dinukleotidů.
Kvantitativní rozbor výsledků faktorové analýzy
Samotná faktorová analýza nedává přímo požadované výsledky, ale poskytuje jejich zhuštěnou
interpretaci a redukuje statistickou dimenzi
řešeného problému. Dalším zpracováním výsledků
SVD je pak možné získat požadované kvantitativní
údaje. Například zpracováním závislosti koeficientů
na složení směsi byly určeny koncentrace komplexů. Tyto koncentrace, vynesené jako efektivita
vazby (relativní poměr mezi vytvořenými komplexy
a maximálním množstvím komplexů, které by mohly
v dané směsi vzniknout), jsou pro systém polyU
a (S)-ApCOHA(2'-5') ukázané na obr. 5. Měření byla
prováděna nejen při různém složení směsi, ale i při
různé teplotě. Výsledky zřetelně ukazují na kooperativní charakter vazby. To znamená, že pro vytvoření
stabilního komplexu se musí seřadit dostatečné
množství molekul dinukleotidů do středového
pseudovlákna. Proto při teplotě 14 °C dochází při
snížení podílu adeninu pod 10 % k prudkému poklesu efektivity vazby, ačkoli se relativní množství
vazebných míst pro adenin zvyšuje. Na druhé straně
je vidět, že zvýšení podílu adeninových dinukleotidů
komplex stabilizuje, neboť se zvyšuje teplotní hranice, do níž jsou komplexy přítomné. Pro charakterizaci tohoto způsobu tvorby komplexů byl vytvořen
matematický model, který umožnil charakterizovat
vliv modifikace internukleotidové spojky na schopnost dinukleotidů vytvářet daný triplexový komplex
[20n]. Bylo ukázáno, že modifikace, které neumožňují vznik dostatečně dlouhého centrálního pseudovlákna, nemají dobré hybridizační vlastnosti.
Dalším kritériem kompatibility modifikovaného
oligonukleotidu s přirozenou NA je Ramanovo spektrum samotného komplexu. Spektrální odchylky
v Ramanových pásech adeninu citlivých na jeho
interakce s okolím ukazují na změněnou geometrii
v poloze této báze vůči situaci s přirozenou spojkou
a tedy v případě dané modifikace na strukturní
nekompatibilitu. Výsledky těchto studií jsou podrobně zpracovány v [20], [21].
S určitými modifikacemi je výše uvedený přístup
používán i na složitější systémy, jako je studium
tvorby komplexů mezi delšími oligonukleotidy
a molekulárními modely molekuly RNA [22].
Významné je i sledování specificity vazby mezi
oligonukleotidy, to znamená sledování strukturních
rozdílů v komplexech, kde není složení interagujících řetězců zcela komplementární. V tomto případě se vychází především z diferenčních spekter,
která citlivě ukazují, jaký je vliv záměny jedné báze
v komplexu za jinou [23], [24].
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
MIKROFLUORESCENČNÍ METODY
SLEDOVÁNÍ VSTUPU OLIGONUKLEOTIDŮ
DO BUNĚK
Fluorescenční zobrazování distribuce oligonukleotidů
Fluorescenční mikroskopické zobrazování podává
jednoznačný důkaz o přítomnosti antisenzního
oligonukleotidu uvnitř buňky. Síla této techniky
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
323
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
324
23.10.2006
8:59
Page 324
spočívá v možnosti sledovat postup oligonukleotidu,
jeho průchod membránou i následnou distribuci
v cytoplazmě a jádře. Pro tento typ experimentu je
k oligonukleotidu třeba připojit spolehlivou
chemickou vazbou fluorescenční značku. V našich
experimentech používáme rhodamin (tetramethylrhodamin) z důvodu jeho výraznější fotostability
oproti fluoresceinu a nezávislosti jeho charakteristik na pH prostředí, ve kterém se nachází.
Pro studium transportu oligonukleotidů do buněk
se používá široká paleta především savčích
buněčných linií, a to jak buněk zdravých (například
3T3 – myší fibroblasty), tak i nádorových. Buňky se
pěstují v kultivačních lahvích při teplotě 37 °C a 5 %
CO2 ve speciálním médiu, které je doplněno o antibiotika a telecí fetální sérum. Přibližně 24 hodin před
samotným experimentem jsou buňky přeočkovány
do Petriho misek tak, aby růstem pokryly asi 80 %
povrchu misky. Dále se buňky nechají inkubovat
v médiu za přítomnosti značených modifikovaných
oligonukleotidů samotných nebo v komplexu s podpůrným prostředkem, který by měl ulehčit jejich
průnik dovnitř buněk. Pro pozorování v mikroskopu
jsou ideální adhezivní buněčné linie rostoucí na
povrchu Petriho misky. V případě buněk volně
plovoucích v médiu je nutná jejich fixace na povrch
misky. Tato procedura však může ovlivnit proces
průniku oligonukleotidů přes buněčnou membránu.
Metoda fluorescenčního zobrazování primárně
odhalí charakter „obarvení“ buněčného prostředí
značeným modifikovaným oligonukleotidem. Z něho
lze usuzovat na proniknutí oligonukleotidu do
buněčného prostředí a způsob jeho vnitrobuněčné
distribuce. Žádoucí je stejnoměrné „obarvení“
v oblasti cytoplazmy a nejlépe jádra, které svědčí
o volném difuzním pohybu oligonukleotidu a jeho přítomnosti v oblasti předpokládané biochemické aktivity. Naopak shluky oligonukleotidů, pozorovatelné
v mikroskopu jako jasné tečky poblíž plazmatické
membrány svědčí o tom, že k průniku dochází pouze
mechanismem endocytózy, přičemž oligonukleotidy
zůstávají uzavřené v membránových váčcích.
V našem studiu se zabýváme použitím prostředků,
které podporují přímý difuzní vstup oligonukleotidů
membránou bez účasti endocytózy. První pozitivní
výsledky byly dosaženy při použití derivátu amfotericinu B, jehož přítomnost vedla již po čtyřhodinové inkubaci s modifikovanými oligonukleotidy
k homogennímu fluorescenčnímu signálu především
z buněčného jádra [25]. Vzhledem k nevhodné interakci této látky v přítomnosti inkubačního média
jsme obrátili pozornost ke kationickým derivátům
porfyrinů. Obr. 6 demonstruje úspěšný průnik
oligonukleotidu, rhodaminem značeného fosforothioátu o délce 15 bází, do 3T3 buněk (myší
fibroblasty) za pomoci 5,10,15,20-tetrakis [4-(trimethylammonio)phenyl]-21H,23H-porfinu. Snímek
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
z fluorescenčního mikroskopu ukazuje homogenní
distribuci oligonukleotidu v cytoplazmě a podstatně
vyšší přítomnost v jádře s výraznou akumulací
v jadérkách. Podrobnosti experimentu jsou popsány
v práci [26].
Časově rozlišená mikrospektrofluorimetrie
Kromě základního mikroskopického obrazu rozložení fluorescenčně značených oligonukleotidů je
možné získávat další informace ze změn parametrů
fluorescence značky – emisního spektra a dohasínání
fluorescence. Zejména dohasínání fluorescence
charakterizuje jedinečným způsobem stav fluorescenčně značeného oligonukleotidu. Má zpravidla
exponenciální charakter s časovou konstantou ležící
v intervalu od jednotek až po desítky ns a je velice
citlivé vůči různým fyzikálně-chemickým vlivům,
které působí na elektronové stavy fluorescenční
značky. Ve vnitrobuněčném prostředí, kdy je tato
molekula vystavena různým vlivům podle místa
v buňce a interakce oligonukleotidu s buněčnými biomolekulami, může být celková fluorescence složena
z několika složek lišících se dobou dohasínání a případně i spektrální polohou emisního pásu.
K určování dob dohasínání se používají techniky
časově rozlišené fluorimetrie pracující ve frekvenční nebo časové oblasti. V mikrofluorescenčních
aplikacích převažují metody frekvenční. Jejich základním principem je excitace vzorku zářením,
jehož intenzita je částečně sinusově modulována na
frekvenci zpravidla od 1 do 250 MHz. V důsledku
konečné doby dohasínání fluorescence dochází
k tomu, že intenzita emitovaného záření je sice
rovněž modulována se stejnou frekvencí, ale
s fázovým posunem úměrným době dohasínání
a sníženou hloubkou modulace. Pokud má fluorescence jedinou časovou složku, pak lze dobu doha-
6/ Fluorescenční snímek buňky 3T3 inkubované
rhodaminem značeným fosforothioátovým
oligonukleotidem o délce 15 bazí za přítomnosti
5,10,15,20-tetrakis[4-(trimethylammonio)phenyl]21H,23H-porfinu jako podpůrného prostředku
23.10.2006
8:59
Page 325
STUDIUM
OLIGONUKLEOTIDŮ POKROČILÝMI TECHNIKAMI OPTICKÉ SPEKTROSKOPIE
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
8/ Příklad experimentálního fluorescenčního spektra
získaného z jádra buňky linie B16 po vstupu
rhodaminem značeného oligonukleotidu
s vypočtenými dobami života a spektrálními průběhy
jeho dvou složek
ze složek neodpovídá volnému značenému
oligonukleotidu ve vodném prostředí ani odpojené
samotné fluorescenční značce, ale s velkou
pravděpodobností se jedná o dva různé způsoby
interakcí oligonukleotidu v jádře buňky.
7/ Blokové schéma mikrospektrofluorimetru
s časovým rozlišením
sínání snadno určit z hodnot demodulace i fázového
posuvu podle jednoduchých vztahů [27].
Pro současné měření časových a spektrálních
charakteristik fluorescence z buněk byla na
Univerzitě Paříž VI ve spolupráci s naší skupinou
postavena speciální aparatura, jejíž blokové schéma
je uvedené na obr. 7. Základem je konfokální fluorescenční mikroskop používající k excitaci záření
argonového laseru, jehož intenzita je modulována
pomocí Pockelsovy cely. Fluorescenční záření
sbírané z přesně vymezeného místa ve vzorku
(o rozměrech menších než 1 µm) prochází spektrografem, na jehož výstupu je pomocí mnohokanálového detektoru a modulační elektroniky
získán spektrální průběh intenzity fluorescence,
fázového posunu a úrovně demodulace. Podrobnější
popis aparatury může čtenář nalézt v [28].
Aby bylo možné analyzovat fluorescenci složenou
z několika spektrálních a časových komponent, je
nutné provést řadu měření pro různé modulační
frekvence a výsledky zpracovat pomocí speciálních
fitovacích metod (tzv. globální analýzou). Příklad
takto získaného časově rozlišeného fluorescenčního
spektra je na obr. 8. Jedná se o fluorescenci z jádra
buňky linie B16 (buňka myšího melanomu) po
vstupu rhodaminem značeného thyminového
homooligonukleotidu o délce 15 bází s modifikací
3'-O-P-CH2-O-5', která obsahuje dvě složky s dobami
dohasínání 1,4 a 4,9 ns a s rozdílným spektrálním
průběhem. Podrobnější rozbor ukázal [29], že žádná
ZÁVĚR
Popsaná experimentální studia rozšiřují poznatky
o molekulárních mechanismech uplatňovaných při
vstupu oligonukleotidů do buněk a při jejich interakcích s cílovou biomolekulou. Přispívají tak
k pochopení souvislostí mezi molekulární stavbou
analog oligonukleotidů a doprovodných látek podporujících jejich vstup do buněk a mezi jejich
účinkem na živou buňku. To dává možnost jednak
mezi různými návrhy molekulárního řešení vybírat
nejnadějnější varianty a jednak zpětně využívat tyto
znalosti při návrhu nových molekulárních struktur
pro oligonukleotidovou terapii. Samozřejmě v procesu vývoje nových terapeutik představují fyzikální
měření pouze jeden stupeň při jejich charakterizaci
a testování vedle metod chemických a biochemických, biologických experimentů a konečně klinických testů a zkoušek.
Poděkování
Studia zmiňovaná v této práci jsou podporována
v rámci Výzkumných záměrů MŠMT a výzkumných
projektů GAČR – v současné době projektem
MSM 0021620835 a granty GAČR 202/05/0628
a 203/05/0827.
Literatura
[1] J. Goodchild, Curr. Opin. Mol. Ther. 6, 120 (2004).
[2] C. A. Stein, J. Clin. Invest. 108, 641 (2001).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
325
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
326
23.10.2006
8:59
Page 326
[3] J. Kurreck, Eur. J. Biochem. 270, 1628 (2003).
[4] H. Cerutti, Trends Genet. 19, 39 (2003).
[5] F. Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10,
117 (2000).
[6] M. A. Guvakova, L. A.Yakubov, I. Vlodavsky,
J. L. Tonkinson and C. A. Stein, J. Biol. Chem. 270,
2620 (1995).
[7] P. Rockwell, W. J. O'Connor, K. King, N. I. Goldstein,
L. M. Zhang and C. A. Stein, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 94, 6523 (1997).
[8] A. A. Levin, Biochim Biophys Acta 1489, 69 (1999).
[9] S. Agrawal, Q. Zhao, Antisense Nucleic Acid Drug
Dev. 8, 135 (1998).
[10] M. Petersen, J. Wengel, Trends Biotechnol. 21, 74
(2003).
[11] H. Wu, W. F. Lima, S. T. Crooke, J. Biol. Chem. 274,
28270 (1999).
[12] K. F. Pirollo, A. Rait, L. S. Sleer, E. H. Chang,
Pharmacol. Ther. 99, 55 (2003).
[13] J. P. Brody, P. Yager, R. E. Goldstein, R. H. Austin,
Biophysical Journal 71, 3430 (1996).
[14] D. Rejman, J. Snášel, R. Liboska, Z. Tocik, O. Pačes,
Š. Králíková, M. Rinnová, P. Kois, I. Rosenberg,
Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 20, 819
(2001).
[15] E. Fattal, P. Couvreur, C. Dubernet, Adv Drug Deliv.
Rev. 56, 931 (2004).
[16] S. Simoes, J. N. Moreira, C. Fonseca, N. Duzgunes,
M. C. de Lima, Adv Drug Deliv. Rev. 56, 947 (2004).
[17] Q. Hu, C. R. Shew, M. B. Bally, T. D. Madden,
Biochim. Biophys. Acta 1, 1514 (2001).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
[18] P. Jarver, U. Langel, Drug Discov. Today 9, 395
(2004).
[19] D. Lochmann, E. Jauk, A. Zimmer, Eur. J. Pharm.
Biopharm. 58, 237 (2004).
[20] J. Hanuš, I. Barvík, Jr., K. Ruszová, J. Štěpánek,
P.-Y. Turpin, J. Bok, I. Rosenberg, M. Petrová-Endová,
Nucleic. Acid. Res. 29, 5182 (2001).
[21] J. Hanuš, D. Němeček, J. Štěpánek, P.-Y. Turpin,
Š. Králíková, J. Bok, I. Rosenberg, J. Raman. Spectr.
35, 418 (2004).
[22] D. Němeček, J. Štěpánek, P.-Y. Turpin, in: WDS ´02
Proceedings of contributed papers part III
(J. Šafránková, Ed.), MATFYZPRESS, Praha 2002,
s. 497.
[23] D. Němeček, J. Štěpánek, P.-Y. Turpin, I. Rosenberg,
Biopolymers 74, 110 (2004).
[24] D. Němeček, H. Vaisocherová, J. Štěpánek,
P.-Y. Turpin, Biopolymers 79, 1 (2005).
[25] E. Kočišová, P. Praus, I. Rosenberg, O. Seksek,
F. Sureau, J. Štěpánek, P.-Y. Turpin, J. Mol. Struct.
744-747, 151 (2005).
[26] E. Kočišová, P. Praus, P. Mojzeš, F. Sureau,
J. Štěpánek, O. Seksek, P.-Y. Turpin, Biopolymers 82,
325 (2006).
[27] J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence
Spectroscopy. Kluwer Academic/Plenum Publishers:
New York 1999.
[28] P. Praus F. Sureau, J. Fluor. 10, 361 (2000).
[29].E. Kočišová, P. Praus, I. Rosenberg, O. Seksek,
F. Sureau, J. Štěpánek, P.-Y. Turpin, Biopolymers 74,
115 (2004).
23.10.2006
8:59
Page 327
CHARAKTERISTIKY A
MEROCYANÍNU 540
APLIKÁCIE
Libuša Šikurová, Katedra jadrovej fyziky a biofyziky, FMFI UK, Mlynská dolina,
842 48 Bratislava
Prezentovaný príspevok uvádza hlavné charakteristiky fluorescenčného farbiva
merocyanínu 540 (MC 540), jeho interakciu s biologickými membránami a prehľad
jeho biofyzikálnych a biomedicínskych aplikácií. Dôraz je kladený na najnovšie
možnosti aplikácií MC 540, a to v cytometrickej detekcii kapacitácie spermií
a prokoagulačnej aktivite trombocytov, v elektroforetickej analýze alifatických
karboxylových kyselín a peptidov a v optických senzoroch pre stanovenie amónia
v pôde a vodných sedimentoch.
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
V posledných desaťročiach sa intenzívne skúmajú
fluorescenčné farbivá pre biofyzikálny a biomedicínsky výskum, ale aj pre klinické aplikácie.
Medzi nimi merocyanín 540 (MC 540) prešiel
značnými obmenami vo využití pre niekoľko oblastí
výskumu aj praxe. Ich prehľad, s dôrazom na nové
aplikácie, uvádzame v predloženom príspevku.
ŠTRUKTÚRA A VLASTNOSTI
MEROCYANÍNU 540
Merocyanín 540 (MC 540) patrí do skupiny benzoxazolových merocyanínových farbív s heterocyklickými
aromatickými skupinami prepojenými nenasýteným
uhľovodíkovým reťazcom (obr. 1). Konjugovaný
triénový systém v molekule oddeľuje elektróndonorové a elektrón-akceptorové skupiny na
opačných heterocyklických jadrách. Separácia
nábojov v molekule umožňuje vznik dvoch
mezomérnych foriem – nepolárnej quinoidovej
a polárnej zwitteriónovej a udáva vnútornú polaritu
merocyanínu [1, 2]. Polarita molekuly určuje rozpustnosť a správanie sa farbiva v roztokoch. MC 540
je dobre rozpustný v rozpúšťadlách s dostatočne
vysokou relatívnou elektrickou permitivitou
(εr > 4,8), zatiaľ čo v organických rozpúšťadlách
s veľmi nízkou polaritou (εr < 2,0) je prakticky
nerozpustný [3]. MC 540 existuje v kryštalickom
stave vo forme soli (komerčne je dostupná jeho
sodná soľ), ktorá vo vodnom prostredí disociuje na
katión (Na+) a anión (MC 540-) so záporným nábojom lokalizovaným na SO3- skupine [2].
Uvedená štruktúra spôsobuje, že molekula MC
540 silno absorbuje viditeľné (VIS) svetlo a následne
emituje VIS fotóny fluorescenciou aj fosforescenciou. Spektrálne charakteristiky merocyanínov sú
vo všeobecnosti veľmi citlivé na zmeny okolitých
faktorov, ako viskozita, teplota a polarita [1]. MC 540
vykazuje silný hypsochrómny posun absorpčných
1/ Merocyanin 540 (MC 540)
spektrálnych pásov [3]–[5], t.j. s nárastom polarity
rozpúšťadla dochádza k posunu absorpčných pásov
ku kratším vlnovým dĺžkam. Konkrétne sa posúva
vlnová dĺžka absorpčného maxima merocyanínu 540
z λA = 565 nm v rozpúšťadle s relatívnou elektrickou
permitivitou εr = 2,21 (dioxán) na hodnotu 530 nm
pre εr = 78,4 (voda) [3]. Fluorescenčné spektrá tiež
vykazujú hypsochrómny posun, ale významne slabší
v porovnaní s absorpčnými spektrami. Fluorescenčné maximum MC 540 sa posúva z 589 nm v chloroforme na 573 nm vo vode [5]. Rozsiahla analýza
spektier vzhľadom na rôzne rozpúšťadlá ukázala, že
k stabilizácii MC 540 prispievajú predovšetkým
interakcie dipól-dipól, dipól-ión, ión-ión a vodíkové
väzby [5]–[6].
Absorpčné spektrum MC 540 v alkoholoch a organických rozpúšťadlách s nižšou polaritou poskytuje vo
VIS oblasti jediný dominantný pás s vibračným
výbežkom pri kratších vlnových dĺžkach. Tieto spektrá nie sú koncentračne závislé v širokom intervale
koncentrácií. Naproti tomu MC 540 vo vodných
prostrediach poskytuje koncentračne závislé absorpčné spektrum tvorené superpozíciou monomérového
(530 nm) a dimérového (500 nm) absorpčného pásu
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
327
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 328
[7]. Vodné molekuly totiž znižujú repulzívne sily
medzi rovnako nabitými iónmi a umožňujú tak
agregáciu farbiva. Fluorescenčné spektrum MC 540
vo vode ukazuje len jeden pík (573 nm), pochádzajúci od fluoreskujúcich monomérov, kým fluorescencia
dimérov je zanedbateľná [7,8].
Zvyšovanie koncentrácie katiónov (H+, Na+, K+,
Ca2+, Mg2+) vo vodnom roztoku merocyanínu spôsobilo vytváranie nového absorpčného píku (517 nm),
zatiaľ čo pôvodné „vodné“ píky zanikali [9].
Prítomnosť katiónov nemenila tvar ani polohu fluorescenčného spektra, ale zhášala fluorescenčnú
intenzitu. Rovnaké spektrálne zmeny boli
pozorované aj pri kyslom pH. Zistené zmeny spektier boli vratné, a teda boli priradené interakcii
aniónu farbiva s vodným protónom, čo následne
uľahčilo tvorbu merocyanínových dimérov. Bola
stanovená hodnota pK = 1,6 medzi neutrálnou protonizovanou formou a aniónovou formou MC 540.
Absorpčné ani fluorescenčné spektrá sa takmer
nemenili v rozsahu pH 1,7 – 7,6. Zvýšenie pH nad 7,6
spôsobilo nevratné spektrálne zmeny, a to formovanie nového širokého pásu v absorpčných
(390 nm) aj fluorescenčných (500 nm) spektrách
a úplné vymiznutie pôvodných spektrálnych pásov.
To bolo zrejme spôsobené rozložením pôvodnej štruktúry molekuly MC 540 hydroxylovými iónmi [10].
Všetky prezentované charakteristiky merocyanínu 540 boli určované pri izbovej teplote.
MC 540 V BIOLOGICKÝCH VZORKÁCH
Amfifilný charakter molekúl MC 540 spôsobuje, že
toto farbivo má vysokú afinitu k lipidovej časti biologických (bunkových aj subbunkových) a modelových membrán. V membránach zotrváva nabitá
skupina SO3- na vonkajšom vodnom rozhraní membrány, bez významného preniknutia do vnútra membrány. Naproti tomu dva butylové reťazce majú
tendenciu ťahať tento koniec molekuly do hydrofóbneho vnútra membrány. Proti tomu však pôsobí
polarita amidových prepojení v chromofóre a výskyt
čiastkového záporného náboja na karbonylových
kyslíkoch. Výsledným efektom je rovnovážna distribúcia paralelného alebo kolmého zoradenia
molekúl MC 540 v membráne so sulfátovou
skupinou pôsobiacou ako čap otáčania [2, 11].
Experimenty s biologickými vzorkami potvrdzujú,
že MC 540 sa zabudováva preferenčne, ak nie
výlučne, do vonkajšej strany plazmatickej membrány intaktných buniek bez preniknutia do vnútra
intaktných buniek [12]. Vodné molekuly prítomné
v biologických aj modelových membránach uľahčujú dimerizáciu farbiva, preto sa v absorpčných
spektrách MC 540 naviazaného na membrány
objavujú v závislosti od koncentrácie MC 540 píky
monomérov a dimérov. Oba sú v porovnaní s vodný-
328
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
mi roztokmi posunuté do dlhších vlnových dĺžok
približne o 30 – 40 nm v závislosti od vlastností
membrán. Posun spektier naznačuje, že lokalizácia
MC 540 vo fosfolipidových membránach je v oblasti
reťazcov mastných kyselín v blízkosti polárnych
skupín fosfolipidov [3, 13]. Zastúpenie monomérov
a dimérov MC 540 v membránach závisí nielen od
koncentrácie MC 540, ale aj od charakteristík membrán, a to: od zloženia a fázového stavu lipidov, od
teploty, od veľkosti vezikúl, od membránového
potenciálu [3, 13]. Interakciu MC 540 s membránami
pochopiteľne významne určuje aj coulombická
repulzia medzi aniónom farbiva a záporne nabitými
skupinami na povrchu membrán [13]–[20], ktorá je
ovplyvnená prítomnosťou iónov a pH vonkajšieho
prostredia [21].
PREHĽAD APLIKÁCIÍ MC 540
Fluorescenčné farbivo MC 540 bolo pôvodne určené
pre fotografické emulzie. Pre aplikáciu na biologickom objekte bolo prvýkrát použité v roku 1974, kedy
bolo spolu s ďalšími 130 farbivami skúšané ako sonda
pre fluorescenčné monitorovanie akčného potenciálu
na axóne sépie [22]. MC 540 vyšiel z tejto skúšobnej
série fluorescenčných sond víťazne a v spojení s fluorescenčnou spektroskopiou odštartoval novú nedeštruktívnu metódu merania transmembránového
potenciálu nervových a svalových buniek. Doplňujúce
výskumy však v tom čase ukázali, že zároveň spôsobuje fotodynamické poškodenie skúmaných membrán, a preto sa od jeho pôvodnej aplikácie upustilo.
V ďalších experimentoch sa vedci zamerali práve
na možnosť využitia jeho deštruktívneho účinku. MC
540 sa totiž prednostne akumuluje, ako mnoho
iných farbív, v rakovinových bunkách, v niektorých
vírusoch obalených lipidovou vrstvou, v niektorých
baktériách, bunkách napadnutých vírusmi, parazitom malárie a inak poškodených bunkách, a tiež
v hematopoitických progenitorových bunkách
[23–28]. Intenzívne výskumy preukázali, že MC 540
v kombinácii so zeleným alebo bielym svetlom
účinne ničí neoplastické bunky, a následne bolo farbivo klinicky testované a aj používané (až do roku
2003) pre fotodynamické čistenie autotransplantátov kostnej drene pre pacientov s leukémiou, lymfómami, metastázujúcimi neuroblastómami a na
inaktiváciu vírusov [29]. Neskôr sa objavili účinnejšie farbivá a tiež kombinácie MC 540 s inými farbivami alebo liekmi pre klinické aplikácie [30]–[32].
Paralelne s klinickým použitím MC 540 sa skúmali
fotofyzikálne a fotochemické vlastnosti MC 540
v snahe objasniť mechanizmy merocyanínom sprostredkovanej fotodynamickej terapie. To poskytlo
ďalšie možnosti využívania MC 540 ako fluorescenčnej sondy, a to najmä pre výskum dynamickej
štruktúry membrán [13]–[20], [33]–[38].
23.10.2006
8:59
Page 329
CHARAKTERISTIKY
NOVÉ MOŽNOSTI VYUŽITIA MC 540
Dobre dokumentované spektrálne, fotofyzikálne
a niektoré fotochemické charakteristiky fluorescenčného farbiva MC 540 podnietili skúšanie
nových možností uplatnenia MC 540 v biofyzike aj
medicíne. Perspektívne aplikácie umožnilo najmä
využitie moderných vysokocitlivých metód v spojení
s výpočtovou technikou, medzi ktoré patrí najmä
prietoková cytometria, kapilárna elektroforéza, konfokálna mikroskopia a ďalšie. Uvedené metódy
umožňujú aplikáciu len slabých svetelných intenzít
v krátkodobých časových intervaloch pri nízkych
koncentráciách farbiva (menej ako 10-6 mol/l), čo
prakticky eliminuje fotobieliaci a fotodynamický
efekt merocyanínu 540, ktorý bol nepriaznivým
sprievodným javom experimentov v začiatkoch jeho
výskumných aplikácií (70. roky minulého storočia).
Aplikácie MC 540 v prietokovej cytometrii
MC 540, vzhľadom na svoje spektrálne vlastnosti
a schopnosť zabudovávať sa výlučne do vonkajšej
vrstvy lipidovej dvojvrstvy plazmatickej membrány
intaktných buniek bol aplikovaný ako perspektívne
farbivo v prietokovej cytometrii. Fluorofór merocyanínu 540 je možné v membránach excitovať
v širokom intervale vlnových dĺžok (470 – 570 nm)
dostupných v mnohých súčasných prietokových
cytometroch, kde sa ako svetelné zdroje používajú
predovšetkým argónové, hélium-neónové, NdYAG
alebo polovodičové lasery. Prietoková cytometria
umožňuje analýzu niekoľko stoviek až tisíc buniek
každú sekundu z veľmi malých objemov a s vysokou
experimentálnou reprodukovateľnosťou. Je tiež
schopná detegovať viacnásobné značenie fluorofórmi. Tieto vlastnosti sú obzvlášť prospešné pre jej
využitie v klinických aplikáciách, kde v súčasnosti
vytláča prácne, časovo náročné a subjektívne
vyšetrovanie svetelnou mikroskopiou.
Testovanie kapacitácie spermií
MC 540 bol s úspechom testovaný ako fluorescenčné farbivo v prietokovej cytometrii pre
analýzu kapacitácie spermií. Nedávne publikácie
[39]–[41] ukázali, že práve cytometrická detekcia
merocyanínom sfarbených spermií je schopná zaznamenať veľmi skoré signály zmien (2–10 min),
ktoré nastávajú v akrozómovej časti membrány
počas kapacitácie indukovanej in vitro kyslým
uhličitanom. Zmeny detegovateľné MC 540 predchádzali vtoku vápnika stanoveného pomocou
chlórtetracyklínu a boli priradené zníženiu usporiadanosti lipidov (lipid packing) v skorých fázach
kapacitácie. Žiaľ uvedené priradenie nebolo podporené ďalšími experimentálnymi dôkazmi. Bolo
však ukázané, že dobre koreluje s kolapsom
priečnej asymetrie fofolipidov (fosfatityletanol-
A APLIKÁCIE MEROCYANÍNU
540
amínu a fosfatidylserínu) plazmatickej membrány
spermií v oblasti akrozómu. Kyslý uhličitan navyše
spôsobuje laterálnu redistribúciu cholesterolu hrotovej časti membrány spermie [42].
Zvýšenie spoľahlivosti informácie získanej metódou prietokovej cytometrie umožňuje paralelná
analýza viacerých fluorofórov. Pre ohodnotenie procesu kapacitácie sa ukázala zatiaľ najvhodnejšia
trojkombinácia fluorescenčných farbív MC 540,
anexin-V-fluorescein a Ro-SA -Fluorescein [40].
Kombináciu iných troch fluorofórov (MC 540,
Yo-Pro 1 a Hoechst 33342) v spojení s prietokovou
cytometriou navrhli a úspešne odskúšali Hallap
a kolektív [43] aj pre analýzu stability membrány
spermií po cykle zamrazenia a následného rozmrazenia, ktorý môže stimulovať proces analogický
kapacitácii s destabilizujúcimi účinkami na plazmatickú membránu spermie v podmienkach uskladnenia, čo však znižuje plodnosť spermií.
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
Monitorovanie aktivácie trombocytov
Aktivácia trombocytov (krvných doštičiek) má významnú úlohu v primárnej hemostáze (zrážaní krvi).
V cytoplazmatickej membráne aktivovaného trombocytu dochádza k narušeniu pôvodnej asymetrie
membránových fosfolipidov a následnému exponovaniu negatívne nabitých fosfolipidov (hlavne fosfadidylserínu, v menšej miere fosfatidyletanolamínu
a sfingomyelínu) vo vonkajšom liste plazmatickej
membrány trombocytov, ako aj k vápnikovej
mobilite. Prokoagulačná aktivita môže byť monitorovaná prietokovou cytometriou s rutinným
využitím anexínu V, ktorého použitie však má aj
nedostatky (vysoká závislosť od obsahu vápnikových iónov a nízka špecificita). Vlastnosti merocyanínu 540, ako aniónovej fluorescenčnej sondy
s vysokou afinitou k lipidom, podnietili autorov
Watala a kolektív [44] k skúmaniu, či je vhodné
použiť túto sondu v prietokovej cytometrii na monitorovanie aktivácie trombocytov. Experimentálne
výsledky ukázali, že cytometrická analýza početnosti merocyanínom sfarbených trombocytov je vysoko
významne citlivá na zmeny obsahu fosfatidylserínu
vyvolané aktiváciou trombocytov, z menšej časti na
variabilitu transmembránového potenciálu [45]
a nesignifikantný sa tu ukázal vplyv fluidity
membrán krvných doštičiek. Použitie MC 540
charakterizuje zlepšenie diagnostickej precíznosti
a spoľahlivosti v porovnaní s anexínom V a predstavuje tak alternatívnu alebo paralelnú metódu pre
monitorovanie aktivácie krvných doštičiek.
MC 540 ako farbivo pre nepriamu laserom indukovanú fluorescenciu v kapilárnej elektroforéze
Kapilárna elektroforéza, tak ako bola pôvodne
použitá [46], je významný analytický nástroj pre separáciu vo vode rozpustných látok, pre nepolárne
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
329
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 330
látky je však nepoužiteľná. Pre ne bola vyvinutá
nevodná kapilárna elektroforéza (nonaqueous capillary electrophoresis, NACE), ktorá vďaka použitiu
organického rozpúšťadla zároveň umožňuje zvýšiť
intenzitu elektrického poľa, zväčšiť objem skúmanej
vzorky, a tým dosiahnuť vyššiu citlivosť v porovnaní
s vodnou kapilárnou elektroforézou. Týmto spôsobom by bolo možné analyzovať značnú rozmanitosť biologických vzoriek. Problémom však zostáva
tradičné spojenie s UV spektroskopiou, pretože mnohé biologicky zaujímavé látky majú len veľmi nízky
mólový absorpčný koeficient (< 50 mol-1 l cm-1). Pre
dosiahnutie vyššej citlivosti sa ukázala vysoko perspektívnou detekcia nepriamej laserom indukovanej
fluorescencie (indirect laser-induced fluorescence,
IDLIF) z farbív zvonku dodaných k skúmanej
vzorke. Fluorescenčné farbivo tu musí poskytovať
predovšetkým vysokú stabilitu, vysoký kvantový
výťažok fluorescencie v použitom organickom
rozpúšťadle a samozrejme musí mať afinitu k skúmanej látke. Práve MC 540 spĺňa uvedené atribúty,
a preto bolo s úspechom otestované pre analýzu
alifatických karboxylových kyselín a peptidov
[47]–[48]. Okrem toho, detekcia IDLIF poskytuje
potenciál aj pre aplikáciu v mikrofluidických čipoch
[49], čo je sľubná technológia intenzívne skúmaná
len posledných pár rokov.
MC 540 v optickom senzore pre amónium
Intenzívne používanie priemyselných hnojív počas
posledných dekád často spôsobuje, že sa prebytočný dusík vo forme amónia alebo dusičnanov
dostáva nielen do rastlinnej biomasy, ale vo veľkej
miere aj do okolitého ekosystému. Preto vznikol
environmentálny tlak na vývoj metód pre rýchle,
citlivé a spoľahlivé monitorovanie amónia v zeminách a vodách. V podstate v súčasnosti existuje
jediná komerčne dostupná technika pre spojité
reverzibilné určovanie amónia, a to iónselektívne
elektródy, ktoré sú však krehké, komplikované na
manipuláciu vo vzorkách ako pôda alebo vodné sedimenty a poskytujú nízke priestorové rozlíšenie [50].
Alternatívna technika je teda potrebná. Progres sa
uberá smerom k senzorom malých rozmerov. Veľmi
perspektívny v tomto smere je návrh a predbežná
realizácia optického senzora fluorescencie v spojení
s CCD kamerou pre rýchlu 2D zobrazovaciu techniku. Stromberg a Hulth [51] pre uvedený fluorosenzor zvolili fluorescenčné farbivo MC 540, pretože
preukazuje vysokú afinitu k NH4+ katiónom a má
spektrálne charakteristiky citlivé na polaritu
prostredia. Senzor treba v kontakte so vzorkou
osvetliť a následne detegovať fluorescenciu emitovanú molekulami MC 540. Kalibrácia koncentrácie
NH4+ iónov je realizovaná ratiometricky, t.j. využíva
duálnu excitáciu a duálnu emisiu fluorofóra MC 540,
pričom zmena parametrov fluorescencie nastane pri
330
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
interakcii merocyanínu s NH4+ iónmi amónia a komplex MC 540 - – NH4+ je prenesený koextrakciou nonaktínom z polárneho (hydrogél) do nepolárneho
(éter) prostredia [52, 53].
Navrhnutý zobrazovací fluorosenzor pre chemické
rozpoznávanie NH4+ iónov predstavuje rýchlu, citlivú
a ľahko manipulovateľnú metódu s vysokým
priestorovým rozlíšením. Tvorí tak alternatívnu alebo
paralelnú techniku k iónselektívnym elektródam.
ZÁVER
Dôkladný základný výskum spektrálnych, fotofyzikálnych a fotochemických vlastností fluorescenčného farbiva MC 540 umožnil sústavnú
inováciu jeho aplikácií vo výskume, klinickej praxi
a tiež jeho uplatnenie v moderných technológiách.
Práca bola finančne podporená grantami VEGA
1/3037/06 a APVT 51-0274040.
Literatúra
[1] L. G. S. Brooker, A. C. Crain, D.W. Haseltine,
P. W. Jenkins, L. L. Lincoln, Amer. Chem. Soc. 87,
2443 (1965).
[2] P. R. Dragsten, W.W. Webb, Biochemistry 17, 5228
(1978).
[3] L. Šikurová, T. Janíková, Stud Biophys 118, 189
(1987).
[4] P. I. Lelkes, I. R. Miller, J. Membrane Biol. 52, 1
(1980).
[5] B. Čunderlíková, L. Šikurová, Chem. Phys. 263, 415
(2001).
[6] P. Mach, J. Urban, J. Leszcynski, Int. J. Quantum
Chem. 75, 741 (1999).
[7] L. Šikurová, I. Habán, D. Chorvát, Studia Biophysica
125, 197 (1988).
[8] A. S. Waggoner, C. H. Wang, R. L. Tolles, J. Membr.
Biol. 33, 109 (1977).
[9] L. Šikurová, B. Čunderlíková, J. Turisová,
I. Waczulíková, Analyt. Chim. Acta 303, 79 (1995).
[10] L. Šikurová, B. Čunderlíková, Spectrochim.
Acta A 53, 293 (1997).
[11] L. M. Loew, G. W. Bonneville, J. Surow, Theory
Biochemistry 17, 4065 (1978).
[12] J. M. O'Brien, D. K. Gaffney, T. O. Wang. F. Sieber,
Blood 80, 277 (1992).
[13] P. I. Lelkes, D. Bach, I. R. Miller, J. Membr. Biol. 54,
141 (1980).
[14] P. Williamson, K. Mattocks, R.A. Schlegel, Biochim.
Biophys. Acta 732, 387 (1983).
[15] A. S. Verkman, M. P. Frosh, Biochemistry 24, 7117
(1985).
[16] D. Bernik, E. Tymczyszyn, M. E. Daraio, R. M. Negri,
Photochem. Photobiol. 70, 40 (1999).
[17] L. Šikurová, R. Franková, D. Chorvát, Studia
Biophysica 133, 67 (1989).
[18] L. Šikurová, I. Habán, R. Franková, Studia
Biophysica 128, 163 (1988).
[19] L. Šikurová, R. Franková, Studia Biophysica 140, 21
(1991).
23.10.2006
8:59
Page 331
CHARAKTERISTIKY
[20] A. Mateasik, L. Šikurová, D. Chorvát, Jr.,
Bioelectrochemistry 55, 173 (2002).
[21] B. Čunderlíková, L. Šikurová, J. Moan,
Bioelectrochemistry 59, 1 (2003).
[22] L. B. Cohen, B.M. Salzberg, H. V. Davila, W. N. Ross,
D. Landowne, A. S. Waggoner, C. H. Wang,
J. Membrane Biol. 19, 1 (1974).
[23] T. G. Easton, Valinsky J. E., Reich E., Cell 13, 478
(1978).
[24] J. E. Valinsky , T. G. Easton, E. Reich, Cell 13, 487
(1978).
[25] O. M. Smith, D. L. Traul, L. McOlash, F. Sieber,
J. Infect. Dis. 163, 1312 (1991).
[26] F. Sieber et al. , Blood 68, 292 (1986).
[27] D. K. Gaffney, J. M. O'Brien, F. Sieber, Photochem.
Photobiol. 53, 85 (1991).
[28] K. Bednarska, P. Kaššák, R. Fudala,I. Waczulíková,
W. Kaca, C. Watala, L. Šikurová, Laser Physics. 13,
1212 (2003).
[29] F. Sieber, J. Hematology 2, 43 (1993).
[30] J. Y. Chen, N. Mak, W. Leung, J. Environmental
Pathology Toxicology Oncology 25, 217 (2006).
[31] S. Pervaiz, M. Olivo, Clinical and Experimental
Pharmacology and Physiology 33, 551 (2006).
[32] I. Tsujino, K. Miyagi, R.W. Sampson, F. Sieber,
Photochem. Photobiol. 82, 458 (2006).
[33] J. Arroyo, A. B. C. Delopez, D. L. Bernik,
E. A. Disalvo, Journal of Colloid and Interface
Science 203, 106 (1998).
[34] D. Bernik, E. Tymczyszyn, M. E. Daraio, R. M. Negri,
Photochem. Photobiol. 70, 40 (1999).
[35] D. A. Garcia, M. A. Perillo, Colloids and Surfaces
B-Biointerfaces 37, 61 (2004).
[36] M. A. Bahri, B. J. Heyne, P. Hans, A. E. Seret,
M. D. Hoebeke, Biophysical Chemistry 114, 53
(2005).
A APLIKÁCIE MEROCYANÍNU
540
[37] L. Šikurová, G. Ruttkay-Nedecký, A. Cabánik,
Pharmazie 56, 974 (2001).
[38] P. Kaššák, L. Šikurová, P. Kasnička, M. Bryszewska,
Physiol. Research 55, 189 (2006).
[39] B. M. Gadella, R. A. Harisson, Biol. Reprod. 67, 340
(2002).
[40] L. Gillan, G. Evans, W. M. C. Maxwell,
Theriogenology 63, 445 (2005).
[41] G. Martin, O. Sabido, P. Durand, R. Levy, Human
Reproduction 20, 3459 (2005).
[42] F. M. Flesch, J. Brouwers, P. F. Nievelstein,
A. J. Verkleij, L. M. G. van Golde, B. Colenbrander,
B. M. Gadella, J. Cell Science 114, 3543 (2001).
[43] T. Hallap, S. Nagy, U. Jaakma, A. Johannisson,
H. Rodriguez-Martinez, Theriogenology 65, 1122 (2006).
[44] C. Watala, I. Waczulíková, B. Wieclawska,
M. Rozalski, P. Grešner, K. Gwoździński, A. Mateašik,
L. Šikurová, Cytometry 49, 119 (2002).
[45] I. Waczulikova, M. Rozalski, J. Rievaj, K. Nagyova,
M. Bryszewska, C: Watala, Biochim. Biophys.
Acta-Biomembranes 1567, 176 (2002).
[46] C. Heller, Electrophoresis 22, 629 (2001).
[47] T. C. Chiu, M. F. Huang, C. C. Huang, M. M. Hsieh,
H. T. Chang, Electrophoresis 23, 449 (2002)
[48] T. C. Chiu, Y. W. Lin, C. C. Huang, A. Chrambach,
H. T. Chang, Electrophoresis 24, 1730 (2003).
[49] R. Chen, H. Z. Guo, Y. W. Shen, Y. Z. Hu, Y. Q. Sun,
Sensors and Actuators B-Chemical 114, 1100 (2006).
[50] J. Schwarz, H. Kaden, G. Pausch, Fresenius, J. Anal.
Chem. 367, 396 (2000).
[51] N. Stromberg, S. Hulth, Sensors and Actuators
B-Chemical 90, 308 (2003).
[52] N. Stromberg, S. Hulth, Analytica Chimica Acta 550,
61 (2005).
[53] N. Stromberg, S. Hulth, Sensors and Actuators
B-Chemical 115, 263 (2006).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
331
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 332
FLUORESCENČNÍ
SONDY A MĚŘENÍ
MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
Jaromír Plášek a Dana Gášková, Fyzikální ústav MFF UK,
Ke Karlovu 5, 12116 Praha 2
Významným fyziologickým parametrem živých buněk i řady jejich organel je
membránový potenciál. K jeho sledování se často používá fluorescenčních sond,
které se akumulují uvnitř buněk až do vyrovnání jejich intra- a extracelulárních
elektrochemických potenciálů. Obsahem tohoto článku je přehled optických metod
sloužících k tomuto účelu, jenž zahrnuje spektrofluorimetrii, proudovou cytometrii
a konfokální mikroskopii a je prezentován jako průřez aktivitami biofyzikálního
oddělení Fyzikálního ústavu UK na Matematicko-fyzikální fakultě UK.
Veškeré živé buňky, živočišné, rostlinné i jednobuněčné organismy, jsou od vnějšího prostředí
odděleny plazmatickou membránou.1 Přes tuto
membránu vstupují do buňky živiny a odcházejí ven
produkty metabolismu. Plazmatická membrána
navíc působí jako senzor chemických podnětů
přicházejících z vnějšího prostředí a přenáší tyto
signály do buňky. V neposlední řadě pak udržuje gradienty koncentrací malých anorganických iontů
(především K+, Na+, Cl-, Ca2+) nebo protonů, v jejichž
důsledku existuje mezi vnější a vnitřní stranou membrány rozdíl elektrických potenciálů, který nazýváme membránový potenciál.
Velikost membránového potenciálu se podle typu
a aktuálního stavu buňky pohybuje od –20 do
–200 mV, přičemž vnitřek buňky je záporně nabitý
oproti jejímu okolí. Udržování transmembránového
gradientu koncentrací anorganických iontů slouží
primárně k zajištění osmotické rovnováhy buněk,
u které je charakteristická vysoká koncentrace
organických metabolitů v jejich vniřním prostředí –
cytoplazmě. Membránový potenciál, jehož existence
je s tímto gradientem svázána, však současně slouží
jako zdroj energie pro řadu významných buněčných
procesů. Pohání transmembránový transport živin
a metabolitů (např. cukrů a aminokyselin). V neuronech, individuálních buňkách nervových sítí,
hraje roli při šíření vzruchů v podobě tzv. akčních
1
332
potenciálů, s jejichž projevy se můžeme setkat od
případů prosté koordinace pohybu celých organismů až po kognitivní procesy probíhající v lidském
mozku. V buněčných organelách mitochondriích
a chloroplastech je membránový potenciál součástí
tzv. protonmotivní síly, která pohání syntézu
adenosin trifosfátu (ATP), který je bezprostředním
zdrojem snadno uvolnitelné chemické energie.
Abychom mohli pochopit podstatu membránového
potenciálu, potřebujeme vědět, jak vypadá struktura
buněčných membrán. Základem všech biologických
membrán, jak plazmatických, tak těch, které
ohraničují jednotlivé organely uvnitř buněk, je dvojný
film amfifilních molekul lipidů. Jejich hydrofilní
polární hlavičky tvoří rozhraní mezi membránou
a okolním vodním prostředím (rozumí se extracelulárním médiem na jedné straně a tekutým
buněčným obsahem na straně protější), zatímco
hydrofobní uhlovodíkové řetězce lipidů se nacházejí
uvnitř dvojného filmu. Díky svému nepolárnímu jádru
jsou dvojné lipidní filmy velice solidní bariérou volné
difuze malých anorganických iontů.
Dvojný lipidní film má kromě zmíněné bariérové
funkce i roli fluidní matrice, v níž jsou zakotveny
bílkoviny, které zajišťují veškeré transportní, signální a další enzymatické funkce buněčných membrán.
Vznik transmembránových iontových gradientů
a tím i membránového potenciálu umožňují elektro-
Více informací k tématům zmíněným v úvodu tohoto článku lze najít v on-line učebnicích biochemie a buněčné biologie, které jsou po jednotlivých kapitolách volně přístupné prostřednictvím služby PubMed (U.S. National Library of
Medicine). Tyto učebnice najdeme na adrese http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=books,
kde je třeba zadat na liště „Search [book] for“ klíčové slovo reprezentující téma, jež nás zajímá. Konkrétně je
možné zadat např. resting membrane potential (klidový membránový potenciál), action potential (akční po
potenciál), cell membrane (buněčná membrána), lipid bilayer (dvojný lipidní film). Z poměrně rozsáhlé nabídky
kapitol v učebnicích, která se pak objeví, lze pro zjednodušení výběru doporučit monografii Molecular Biology
of the Cell [1]. Četbě této monografie může eventuálně předcházet velmi solidní úvod do biologie, jímž je MIT
Biology Hypertextbook, viz http://web.mit.edu/esgbio/www/. K několika stručně vyloženým tématům membránové
biofyziky se lze dostat též prostřednictvím projektu HyperPhysics (Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA),
viz http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/hframe.html. Poměrně podrobný učební text buněčné biologie nabízí
M. Farabee (Estrella Mountain Community College, USA),
http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookCELL2.html.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
23.10.2006
8:59
Page 333
FLUORESCENČNÍ
genní iontové pumpy. V membránách všech živočišných buněk je to Na+/K+-ATPáza, která s využitím
energie získané štěpením molekul ATP pumpuje
proti směru gradientů elektrochemických potenciálů tři ionty Na+ ven z buňky a současně dva ionty
K+ do buňky. V membránách buněk rostlin, bakterií
a hub je hlavní elektrogenní pumpou protonová
ATPáza. Výslednou hodnotu membránového potenciálu však neurčují elektrogenní pumpy, nýbrž
vysoce selektivní iontové kanály, na jejichž množství
a parametrech závisí elektrické vlastnosti
buněčných membrán. Tyto kanály nastaví konečnou
hodnotu tzv. klidového membránového potenciálu
skrze ustálené hodnoty iontových proudů, jež v podstatě směřují ke zrušení iontových gradientů
a dosažení termodynamicky rovnovážného stavu.
MĚŘENÍ MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
Klasickou metodou stanovení membránového
potenciálu živých buněk je přímé měření transmembránového napětí pomocí mikroelektrody zapích-
SONDY A MĚŘENÍ MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
nuté do buňky. Používají se skleněné kapiláry
vytažené do podoby duté jehly se špičkou o průměru
cca 1 µm a naplněné koncentrovaným roztokem
KCl, které se zavádějí do buňky pod mikroskopem
pomocí mikromanipulátoru. Tímto způsobem lze
bez problémů měřit i rychlé změny velikosti membránového potenciálu, jaké se pozorují v případě
akčních potenciálů neuronů. Nevýhodou měření
pomocí mikroelektrod je riziko zkratování membrány nedokonalým kontaktem mezi povrchem
elektrody a membránou, což může výrazně zkreslit
hodnotu měřeného klidového membránového
potenciálu. Kromě toho je prakticky téměř nemožné
získat touto metodou velké soubory dat na mnoha
buňkách určité buněčné populace. Navíc v případě
buněčných organel (jako jsou například mitochondrie), jakož i v případě malých buněk o rozměrech
řádu 10-6 m, nelze mikroelektrody použít pro jejich
relativně velký průměr.
Jestliže měření pomocí mikroelektrod nepřichází
v úvahu z některého z výše uvedených důvodů, lze
použít metod nepřímých, konkrétně metod založených na redistribuci malých lipofilních kationtů
z buněčného média dovnitř buněk. Prototypem
takových potenciometrických sond je tetrafenylfosfonium (TPP+), obr. 1. Obecně se jedná o látky ve
vodě rozpustné, avšak s výrazným obsahem hydrofobních chemických struktur, díky nimž jsou tyto
kationty schopny procházet skrze hydrofobní nitro
dvojného lipidního filmu. Po přidání do média se
akumulují v buňkách, do kterých proudí tak dlouho,
dokud není dosaženo rovnosti elektrochemických
potenciálů sondy v médiu a uvnitř buněk. Za této
situace je poměr intracelulárních a extracelulárních
koncentrací kationické sondy, [c]in a [c]ex, dán
Nernstovou rovnicí
[c]in = [c]ex exp (-FΨ/RT),
1/ Strukturní vzorce nejdůležitějších látek zmíněných
v tomto článku: 1) tetrafenyl fosfonium jodid,
2) tetramethylrhodaminmethylester perchlorát –
TMRM, 3) dipropythidikarbocyanin jodid – diSC3(3),
4) digitonin, 5) adenosintrifosfát – ATP,
6) karbonylkyanid-p-trifluorometoxyfenylhydrazon –
FCCP.
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
(1)
kde F je Faradayova konstanta, Ψ membránový
potenciál, R plynová konstanta a T absolutní teplota.
Rovnovážný poměr koncentrací [c]in / [c]ex je pak mírou membránového potenciálu testovaných buněk.
V případě TPP+ byl tento poměr původně
stanovován pomocí radioaktivních izotopů sondy,
a to měřením jejich relativních množství v peletě
centrifugovaných buněk a ve zbylé kapalině.
V současnosti se používá elektrochemické měření
úbytku sondy v buněčném médiu pomocí iontově
selektivní TPP+ elektrody. TPP+ sonda je používána
převážně k monitorování změn mitochondriálního
membránového potenciálu v suspenzích izolovaných mitochondrií. Při měření na celých buňkách
narážíme na potíže plynoucí z toho, že při měření
poklesu koncentrace sondy v buněčném médiu
nelze poznat, do jaké míry k němu vedle efektu
závislého na potenciálu plazmatické membrány při-
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
333
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 334
spívá též vazba sondy na povrch buněk a na
intracelulární makromolekuly nebo její dodatečná
akumulace v buněčných organelách, jmenovitě
mitochondriích. Podobným problémům se lze mnohdy úspěšně vyhnout, použijeme-li místo TPP+ některý z fluorescenčních lipofilních kationtů.
Fluorescenční lipofilní kationty (na obr. 1 jsou
jako příklad uvedeny 3,3'-dipropylthiakarbocyanin,
diS-C3(3), a tetramethylrhodaminmethylester, TMRM)
odpovídají po přidání k buňkám na jejich membránový potenciál v zásadě stejným způsobem jako
TPP+. Protože k dosažení rovnovážné intracelulární
koncentrace je zpravidla třeba několika minut, říká
se tomuto druhu redistribučních fluorescescenčních
sond membránového potenciálu někdy též sondy
pomalé. Pro úplnost dodejme, že existují také rychlé elektrochromní fluorescenční sondy, jejichž odezva je dostatečně rychlá i pro sledování časových
průběhů akčních potenciálů. Podrobný přehled fluorescenčních sond membránového potenciálu lze
nalézt např. v [2].
Monitorování membránového potenciálu pomocí
redistribučních fluorescenčních sond se provádí
více způsoby. Poměrně časté bývá fluorimetrické,
resp. spektrofluorimetrické měření v suspenzích
buněk v kyvetách. Další možností je měření distribuce intenzity fluorescence v individuálních
buňkách velkých souborů realizované pomocí
proudové cytometrie. Pokud chceme získat též
informaci o lokalizaci sondy v jednotlivých
buňkách, používá se fluorescenční mikroskopie.
fakulty UK nezabýváme, neboť vysoké koncentrace
sondy jsou zpravidla pro buňky toxické.
Platí-li přímá úměra mezi koncentrací sondy
a intenzitou fluorescence, můžeme Nernstovu rovnici (1) převést do podoby
MĚŘENÍ POMOCÍ REDISTRIBUČNÍCH
FLUORESCENČNÍCH SOND
kde PA a PB jsou koeficienty úměrnosti, zahrnující
součiny molárních absorpčních koeficientů a kvantových výtěžků fluorescence jednotlivých forem
sondy (A zde značí sondu volnou, B vázanou).
Pro intenzitu intracelulární fluorescence v tomto
přiblížení nadále platí, že je úměrná [c]in. Její poměr
k intenzitě fluorescence sondy v médiu však už na
rozdíl od rovnice (2) není přímo roven nernstovskému faktoru exp (–FΨ/RT). Platí
Vztah mezi akumulací sondy a intenzitou fluorescence
Při vhodně zvolených nízkých koncentracích redistribučních fluorescenčních sond (koncentrace
sondy v médiu < 10-8 až 10-7 mol/dm3) platí přímá
úměra mezi jejich koncentrací a pozorovanou intenzitou fluorescence. Někdy se však záměrně volí koncentrace sondy tak vysoká, že při akumulaci
v buňkách a organelách dochází ke vzniku nefluoreskujících agregátů, a tudíž ke zhášení fluorescence při hyperpolarizaci (zvětšení záporného
napětí vnitřku buněk oproti jejich okolí) studovaných objektů. Takový experimentální protokol se
používá například při monitorování plazmatického
membránového potenciálu pomocí sondy diS-C3(5)
nebo při monitorování změn mitochondriálního
potenciálu pomocí Rhodaminu 123, viz [2] a reference tam uvedené. Tímto druhem experimentů se
však v oddělení biofyziky Matematicko-fyzikální
2
334
Fin = Fex exp (-FΨ/RT),
(2)
kde Fin a Fex jsou intenzity fluorescence pozorované
uvnitř a vně buněk. Reálná experimentální situace
však bývá podstatně složitější, než taková přímočará
transformace Nernstovy rovnice naznačuje. Dochází
totiž k vazbě akumulované sondy na proteiny
nacházející se uvnitř buněk i na samotnou buněčnou
membránu. Celkové množství sondy uvnitř buněk,
a tím také pozorovaná intenzita fluorescence, jsou
proto vyšší, než Nernstova rovnice předpovídá.
Ukazuje se však, že pokud koncentrace sondy
v médiu nepřesáhne určitou mez (jedná se o parametr, který se v konkrétním experimentu dá snadno
ověřit), je koncentrace sondy vázané na proteiny
a membrány s dostatečnou přesností přímo úměrná
koncentraci volné sondy ve vodním prostředí buňky,
tj. hodnotě [c]in vystupující v Nernstově rovnici (1),
viz [3].
Celková koncentrace sondy v buňkách je pak přibližně rovna [c]tot ≈ [c]in + K [c]in, kde K je konstanta, jejíž velikost neznáme. Výsledná intenzita
intracelulární fluorescence pak bude rovna
Ftot = PA [c]in + K PB [c]in,
Ftot = Fex P exp (–FΨ/RT),
(3)
(4)
kde P = (PA + K PB)/ξ PA, v kterémžto výrazu je
korekční faktor popisující eventuální rozdíl kvantových výtěžků volné sondy v médiu a uvnitř buněk.
Abychom však mohli rovnici (4) prakticky využít,
potřebujeme měřené intenzity fluorescence vztáhnout k objemům jak intracelulárního prostředí, tak
vnějšího média, z nichž reálně snímáme emitované
záření. Rovnici (4) lze proto přímo aplikovat pouze
při konfokální fluorescenční mikroskopii (viz např.
[4], nebo www stránky výrobců2), kdy intenzita
Informace o moderních mikroskopických technikách lze nalézt například na www.microscopyu.com nebo www.olympusmicro.com, nebo speciálně o konfokální mikroskopii na www.olympusfluoview.com pod odkazem Confocal Theory.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
23.10.2006
8:59
Page 335
FLUORESCENČNÍ
emise pozorovaná v jednotlivých obrazových
bodech v podstatě odpovídá dobře definovaným
a stejně velikým objemovým elementům zobrazovaných objektů (voxelům). Při proudové cytometrii3
(anglicky flow cytometry) měříme integrální emisi
z individuálních buněk, které jedna za druhou postupně prolétají v proudu nosné kapaliny skrz
laserový paprsek excitující fluorescenci, přičemž
amplitudy jednotlivých záblesků fluorescence jsou
samozřejmě úměrné též objemu konkrétních buněk.
Při fluorimetrii buněčných suspenzí v kyvetách
musíme vzít v úvahu i koncentrace buněk v těchto
suspenzích. Navíc potřebujeme najít způsob, jak od
sebe oddělit příspěvky emise z buněk a z média.
Monitorování membránového potenciálu v buněčných suspenzích
V buněčných supenzích je pozorovaná fluorescence
redistribuční sondy součtem emisních příspěvků
z buněk a z média. Nejčastěji používaný experimentální protokol spočívá v prostém měření změn intenzity fluorescence při vysoké koncentraci sondy, při
níž se hyperpolarizace buněk projeví zvýšenou tvorbou nefluoreskujících agregátů sondy uvnitř buněk
a v důsledku toho poklesem celkové intenzity fluorescence suspenze. Případné zvýšení intenzity fluorescence je naopak bráno jako kvalitativní příznak
2/ Příklad posuvu emisního spektra fluorescence
redistribuční sondy po její vazbě na intracelulární
makromolekuly: sonda diSC3(3) o koncentraci
3,75×10-8 mol/dm3 přidána k suspenzi A4 buněk (klon
FDCP-Mix, koncentrace 106 buněk/ml) v Hepes pufru
obsahujícím 5×10-3 mol/dm3 KCl a 1,5×10-6 mol/dm3
valinomycinu. Spektrum Fc odpovídá celkové
fluorescenci emitované obarvenou buněčnou
suspenzí, spektrum Fa je příspěvek emise volné
sondy v médiu a Fb je příspěvek vázané sondy.
Převzato z práce [3].
3
SONDY A MĚŘENÍ MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
depolarizace buněk [2]. Někdy bývá tento základní
postup podpořen stanovením koncentrace volné
sondy v médiu po centrifugaci suspendovaných
buněk.
V oddělení biofyziky Fyzikálního ústavu UK se
systematicky snažíme využívat ke stanovení podílu
extracelulární a intracelulární emise sond diS-C3(3)
a TMRM spektrálních změn jejich emisních spekter
po vazbě na proteiny. Prakticky u všech redistribučních fluorescenčních potenciometrických
sond totiž dochází po vazbě na proteiny k posunu
jejich emisních maxim směrem k větším vlnovým
délkám (J. Plášek, nepublikovaná data), přičemž
u diS-C3(3) činí tento posuv 12 nm, obr. 2, u TMRM
10 nm [3], [5]. Tyto malé spektrální rozdíly jsou
v principu postačující ke stanovení příspěvků emise
volné a vázané sondy v experimentálních spektrech.
Jestliže známe spektrum volné sondy ve vodním
médiu, Fa(λ), i spektrum sondy vázané, Fb(λ), které
lze změřit třeba v koncentrovaném (cca 5%) roztoku
albuminu, viz [3], pak pro libovolné experimentální
spektrum sondy v buněčné suspenzi, F(λ), platí
F(λ) = a Fa(λ) + b Fb(λ),
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
(5)
kde a, b jsou amplitudy příspěvků volné a vázané
sondy, Fa(λ) a Fb(λ) jsou normovaná emisní spektra
těchto složek. Rozklad konkrétního emisního spektra na kombinaci volné a vázané složky lze
jednoduše provést pomocí některého z fitovacích
nástrojů, které jsou dnes běžnou součástí programů
na malování grafů, resp. programů statistických (viz
např. SigmaPlot).
Typická emisní spektra redistribučních fluorescenčních sond však mají podobu nestrukturních
pásů o pološířce kolem 30 nm, viz např. obr. 3.
Rozklad emise buněčných suspenzí na dvě takové
spektrálně velmi blízké komponenty se snadno
může dostat na hranici realizovatelnosti. Abychom
zlepšili přesnost spektrálních rozkladů dvousložkové emise buněčných suspenzí, využili jsme
relativně málo rozšířenou metodu synchronního
skenování (synchroscan spectroscopy – SSS, známou též jako synchronous excitation spectroscopy
– SES), jejíž princip spočívá v současném skenování
vlnových délek emise a excitace fluorescence, λexc
a λem, při zachování konstantního rozdílu ∆λ mezi
nimi [6]. SES spektra se vyznačují výrazným
snížením pološířky oproti standardním emisním
spektrům, což umožňuje zvýšit přesnost analýzy
součtových spekter. Optimálního zúžení SES spekter se obvykle dosáhne, když je ∆λ rovno rozdílu
vlnových délek maxim emisních a excitačních spekter fluorescence dané látky.
Výklad principu proudové cytometrie se nachází například na www.cyto.purdue.edu nebo na
http://biology.Berkeley.edu/crl/flow_cytometry_basic.html.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
335
23.10.2006
8:59
Page 336
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
∆Ψ, vůči určitému (v podstatě arbitrárně zvolenému) referenčnímu stavu, pak konstantu P vůbec
nepotřebujeme znát. Z rovnice (6) zjevně plyne
∆Ψ = Ψref – Ψ = (RT/F) ln [(b/a) / (b/a)ref].
3/ Spektra fluorescence roztoku sondy diSC3(3)
v Hepes pufru (pH 7,4), koncentrace roztoku
2×10-6 mol/dm3: plná čára vlevo – excitační spektrum
měřené při λem = 615 nm; plná čára vpravo – emisní
spektrum měřené při λexc = 505 nm; čárkovaně –
SES spektrum měřené při ∆λ = λem – λexc = 12,5 nm
a vynášené proti λem. Převzato z práce [3].
V experimentech s fluorescenčními sondami bývá
celkový objem buněk v suspenzi menší než 0,1 %
objemu média, což souvisí s tím, že se snažíme vyhnout potížím s rozptylem světla. Při takto nízkých
relativních objemech buněk je zanedbatelný i příspěvek intracelulární fluorescence volné sondy
k celkové emisi. Spektroskopicky stanovenou intenzitu fluorescence volné sondy lze proto ztotožnit
s intenzitou fluorescence volné sondy v médiu.
Opakováním argumentů, které vedly k rovnici (4),
snadno dospějeme k závěru, že změřený poměr b/a,
tj. poměr intenzity fluorescence vázané sondy
k intenzitě fluorescence volné sondy (v médiu), je
úměrný [c]in / [c]ex, přičemž koeficient úměrnosti P
je opět veličina, jejíž velikost neumíme určit. Tento
fakt vylučuje možnost stanovit membránový potenciál přímo ze změřeného poměru b/a intenzit fluorescence volné a vázané sondy, neboť po započtení
koeficientu P dostaneme
ln (b/a) = lnP + ln ([c]in / [c]ex) = lnP – (F/RT)Ψ,
(6)
kde převrácená hodnota výrazu F/RT je při pokojové
teplotě t = 23 °C rovna 25,5 mV. Nicméně rovnice (6)
nám říká, že spektrální analýza dvousložkové fluorescence buněčných suspenzí nabízí možnost
převést pozorované změny fluorescence redistribučních sond na lineární škálu změn membránového potenciálu, na němž akumulace těchto
sond v buňkách závisí. Je také zřejmé, že pokud se
místo absolutních hodnot membránového potenciálu spokojíme pouze se stanovením jeho změn,
336
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
(7)
Schůdnost tohoto postupu jsme demonstrovali na
příkladu změn membránového potenciálu krysích
hemopoietických buněk (linie FDCP-Mix, klon A4,
[7]), a to s použitím sondy diS-C3(3) [3].
Kompletní spektrální analýza emise fluorescence
potenciometrických sond v buněčných suspenzích
je však relativně pracná. Proto v případech, kdy
kvantifikování změn membránového potenciálu
v lineární škále nepředstavuje podstatný přínos
oproti kvalitativní interpretaci odezvy sondy
v pojmech „hyperpolarizace versus depolarizace“,
resp. oproti elementárnímu porovnání velikosti
změn potenciálu na úrovni „větší/menší“, se zpravidla nadále berou za míru akumulace sondy v buňkách
prosté rozdíly v intenzitě fluorescence. Relativně
nová metoda kvalitativního hodnocení míry akumulace redistribučních sond v buňkách vychází ze
skutečnosti, že s rostoucím podílem sondy
v buňkách roste také podíl fluorescence vázané
sondy v celkové emisi suspenzí. To znamená, že při
hyperpolarizaci se pozoruje posun spektrálního
maxima výsledné fluorescence směrem k větším
vlnovým délkám, přičemž při depolarizaci je tomu
naopak. Výhodou tohoto přístupu je to, že vlnová
délka emisního maxima závisí pouze na poměru
koncentrací sondy vně a uvnitř buněk. Na rozdíl od
prosté intenzity fluorescence není tudíž při daném
membránovém potenciálu citlivá na případné
kolísání celkového množství dostupné sondy,
například v důsledku jejího nekontrolovatelného
usazování na stěnách kyvet [8]. Večeř a kol. použili
tuto metodu k měření membránového potenciálu
modelových liposomů, což jsou sférické membránové váčky zhotovené z chemicky čistých lipidů
nebo z jejich směsí [9]. Dále byla zmíněná metoda
v kombinaci s fluorescenční sondou diSC3(3)
úspěšně využita při sledování změn membránového
potenciálu kvasinek S. cerevisiae. Jednalo se o sledování účinku různých stresových faktorů: konkrétně
působení killer toxinu K1 na citlivé buňky S. cerevisiae S6/1 [10], [11], aktivních komponent dezinfekčních prostředků (biocidů) [12], protonoforu
CCCP a antibiotika nystatin [11], [13], inhibitoru
H+-ATPázy [13] a tepelného šoku [14]. Pomocí této
metody byl rovněž prokázán přechodný pokles
membránového potenciálu během přechodu buněk
na oxidační metabolismus (tzv. diauxická růstová
fáze) po vyčerpání glukózy z růstového média [15]
nebo rozdílná velikost membránového potenciálu
u buněk divokých kmenů odlišného genetického
základu a rozdíly ve velikosti membránového poten-
23.10.2006
8:59
Page 337
FLUORESCENČNÍ
ciálu u respirujících kvasinek rostoucích na fermentovatelných (glukóza, fruktóza) a nefermentovatelných (etanol, glycerol) zdrojích uhlíku [16].
Ukazuje se však, že zatímco v případě liposomů
trvá ustavení rovnovážné redistribuce sondy po
změně membránového potenciálu řádově pouze
sekundy, v suspenzích kvasinek se může jednat
o 20 až 30 minut. Tento rozdíl je způsobený tím, že
v plazmatických membránách kvasinek jsou přítomny tzv. ABC-transportní proteiny, analogické membránovým transportním proteinům zajišťujícím
transport toxinů ven z řady rostlinných a živočišných buněk (speciálně se to týká toxinů, které
jsou z fyzikálního hlediska neutrálními nebo negativně nabitými amfifilními molekulami). Za pozornost stojí, že takové transportní proteiny jsou
například zodpovědné i za mnohačetnou lékovou
rezistenci savčích buněk, která mimo jiné představuje nepříjemnou komplikaci při chemoterapii
nádorových onemocnění. ABC-pumpy kvasinek
samozřejmě komplikují měření membránového
potenciálu tím, že působí proti intracelulární akumulaci redistribučních fluorescenčních sond.
Podrobná analýza takto složitého jevu je ovšem za
hranicemi možností tohoto krátkého přehledu.
Zmíníme se proto pouze o tom, že se podařilo vhodným uspořádáním experimentů učinit z této komplikace měření membránového potenciálu nástroj
monitorování aktivity ABC-pump plazmatických
membrán kvasinek. Konkrétně byla takto studována
jejich kinetika [17] i závislost jejich aktivity na růstové fázi buněk [15] nebo obsahu nutrientů v médiu
[16], [18].
Proudová cytometrie
Specifické rysy měření pomocí proudové cytometrie
budeme ilustrovat na příkladu membránového
potenciálu mitochondrií v buňkách vypěstovaných
z lidských fibroblastů získaných z kůže pacientů
trpících různými poruchami oxidativní fosforylace4.
Před měřením pomocí sondy TMRM byly tyto buňky
permeabilizovány digitoninem5, čímž byl vynulován
potenciál jejich plazmatické membrány. Ten by
v intaktních buňkách ovlivňoval koncentraci sondy
v cytosolu (tekutý vnitřek buňky), jenž hraje roli
vnějšího prostředí mitochondrií, a v důsledku toho
též intenzitu mitochondriální fluorescence.
Při proudové cytometrii měříme relativní intenzitu integrální emise z individuálních buněk, která je
v případě mitochondrií nacházejících se v permeabilizovaných buňkách úměrná jak nernstovskému
faktoru exp(-FΨm/RT), kde je Ψm mitochondriální
membránový potenciál, tak celkovému objemu
4
5
SONDY A MĚŘENÍ MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
všech mitochondrií konkrétní buňky. Při proudové
cytometrii, která v podstatě sbírá velké soubory dat
z mnoha buněk, používáme jako míru akumulace
sondy v mitochondriích a potažmo i Ψm střední hodnotu intenzity fluorescence získanou z histogramu
amplitud individuálních signálů.
Podobně jako při měření potenciálů plazmatických membrán v buněčných suspenzích vystupuje
i ve vztahu mezi intenzitou fluorescence mitochondrií
a koncentrací sondy v nich konstanta úměrnosti,
jejíž hodnotu opět nelze určit. V případě mitochondrií v permeabilizovaných buňkách však není možné
jednoduše vytvořit ani lineární škálu pro měření
změn ∆Ψm. S fluorescencí sondy akumulované v mitochondriích se totiž míchá emise sondy nacházející
se v cytosolu, FC, kterou musíme odečíst od celkové
emise buňky, Ftot(Ψm), abychom dostali hledanou
intenzitu emise z mitochodrií. To znamená, že místo
rovnice (7), kterou jsme použili pro měření ∆Ψ
v buněčných suspenzích, musíme použít její modifikaci představovanou následujícím vztahem:
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
∆Ψm = Ψref – Ψm =
= (RT/F) ln[(Ftot(Ψm) – FC) / (Ftot(Ψm)ref – FC)]. (8)
Na rozdíl od potenciálu plazmatických membrán
nelze tedy v případě mitochondrií nacházejících se
v buňkách měřit ani změny jejich potenciálu, aniž
bychom napřed provedli kalibrační měření umožňující odhadnout příspěvek fluorescence sondy
akumulované v cytosolu. K tomuto účelu slouží
porovnání intenzit fluorescence sondy ve dvou
experimentálních situacích, které se od sebe liší
definovaným rozdílem ∆Ψm: můžeme například
měřit intenzitu fluorescence před a po depolarizaci
mitochondrií protonoforem karbonylkyanidemp-trifluorometoxyfenylhydrazonem (FCCP), kdy
v ideálním případě Ψm klesne z cca -150 mV na nulu.
V práci [19] jsme pomocí počítačových simulací
ukázali, že pokud se omezíme na mírné změny ∆Ψm,
jež jsou však zpravidla nejzajímavější z praktického
hlediska, pak eventuální odchylky skutečné kalibrační diference potenciálů (∆Ψm)cal od předpokládané hodnoty 150 mV způsobí jen přijatelně malé
chyby měření. Konkrétně pro ∆Ψm ≤ 60 mV je simulovaná relativní chyba měření menší než 5 %, přestože „reálná“ hodnota (∆Ψm)cal činí pouhých 110 mV
místo očekávaných 150 mV. Pro ∆Ψm ≤ 20 mV je
předpovězená chyba měření způsobená touto
nesprávnou kalibrací dokonce menší než 2 %.
Teoretickou předpověď potvrdilo měření ∆Ψm při
depolarizaci mitochondrií lidských fibroblastů po
přidání adenosinu difosfátu (ADP), kterým se
Oxidativní fosforylace je proces, při kterém v mitochondriích vzniká ATP. Je vyvrcholením série energetických přeměn,
známých jako buněčné dýchání.
Digitonin, viz obr. 1, je přírodní detergent, jenž rozpouští membránové lipidy. Získává se z náprstníku (Digitalis purpurea).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
337
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
338
23.10.2006
8:59
Page 338
spouští syntéza ATP, jež spotřebovává transmembránový gradient protonů. Hodnota ∆Ψm měřená
TPP+ elektrodou v suspenzi izolovaných mitochondrií činí 25,0 ± 3,5 mV a výsledek měření pomocí
proudové cytometrie a TMRM je ∆Ψm = 24,2 ± 1,6 mV.
Když jsme při zpracování naměřených fluorescenčních dat pro kontrolu použili (∆Ψm)cal = 180 mV
místo (∆Ψm)cal = 150 mV, nová vypočtená hodnota ∆Ψm
se od původní lišila jen nepatrně: ∆Ψm = 24,4 ± 1,6 mV.
Konfokální fluorescenční mikroskopie
Připomeňme si, že fluorescencenční mikroskopie
nám nabízí možnost oddělit od sebe příspěvky emise
sondy nacházející se v médiu, v cytosolu a v jednotlivých organelách. Její konfokální verze navíc
zaručuje, že zobrazené voxely (objemové elementy)
trojrozměrného objektu, v nichž měříme intenzitu
emise, mají konstantní velikost. Tím je ovšem
současně zajištěno, že intenzita fluorescence v jednotlivých bodech mikroskopického obrazu je přímo
úměrná koncentraci sondy v odpovídajícím místě
vzorku – bez chyb měření, které v klasické fluorescenční mikroskopii vznikají sčítáním intenzit
fluorescence ze zaostřené roviny a rozostřených
rovin mimoohniskových.
Je zřejmé, že pokud bychom pomocí konfokální
mikroskopie mohli navíc selektivně měřit intenzity
fluorescence volné a vázané sondy uvnitř buněk, šlo
by z poměru těchto intenzit spočítat pomocí rovnice
(2) příslušný membránový potenciál. V práci [5]
jsme ilustrovali, že zmíněného cíle lze dosáhnout
pomocí konfokálního mikroskopu kombinovaného
s mikrospektrofluorimetrem se spektrálním rozlišením cca 2 nm. Zařízení použité v citované práci
však neumožňovalo skenovat vzorek a z jeho
celkového obrazu pak vizuálně vyloučit z dalšího
zpracování příspěvky sondy akumulované v organelách. Kromě toho bylo možné podobné mikrospektrofluorimetrické experimenty realizovat pouze
na spolupracujícím pracovišti v Paříži. Mikrospektrofluorimetrickou analýzou odezvy redistribučních
sond jsme se proto přestali zabývat. Vracíme se k ní
však poté, co se objevily komerčně dostupné konfokální mikrospektrofluorimetry, viz [20]. Například
konfokální mikroskop Olympus FluoView 1000
umožňuje rychle a pohodlně sejmout několik
desítek konfokálních snímků fluoreskujících vzorků
se spektrálním krokem rovnajícím se 2 nm, což je
zcela postačující k rozkladu fluorescence námi
používaných sond TMRM a diSC3(3) na příspěvky
volné a vázané sondy.
Na rozvoj této biofyzikální metody navazují
pokusy vypracovat metodiku měření membránového potenciálu kořenových vlásků mladých rostlin huseníčku polního (Arabidopsis thaliana)
v rámci spolupráce s katedrou rostlinné fyziologie
Přírodovědecké fakulty UK. Membránový potenciál
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
4/ Fluorescence sondy TMRM v kořenových vláscích
Arabidopsis thaliana. Koncentrace sondy v médiu
10-6 mol/dm3, konfokální mikroskop Olympus
FluoView 1000, objektivy PlanApo 20x a 40x.
A) Náhled kořene s vlásky získaný počítačovým
složením 102 konfokálních řezů snímaných
s vertikálním krokem 2 µm. Modrá barva odpovídá
autofluorescenci preparátu, žlutá je fluorescence
TMRM. B) Fluorescence TMRM v jednom
konfokálním řezu vzorkem. Levý snímek ukazuje
celkovou intenzitu fluorescence, snímek vpravo
odpovídá rozložení volné sondy, získané jako
výsledek rozkladu celkové emise na volnou
a vázanou komponentu (k této spektrální analýze
jsme použili 100 snímků tohoto řezu snímaných
se spektrálním krokem 2 nm). Větší část každého
z kořenových vlásků je vyplněna vakuolou. V jedné
z částí vlásku s cytosolem obsahujícím sondu jsme
se pokusili odhadnout membránový potenciál
a dospěli k realistické hodnotě 48 mV.
těchto velkých buněk, jež jsou důležitou součástí
kořenových systémů všech rostlin, by měl být sledován jako jeden z parametrů reakce rostlin na
chemický stres. Na obr. 4A vidíme ukázku kořenových vlásků A. thaliana obarvených sondou
TMRM a pozorovaných konfokálním mikroskopem,
obr. 4B ukazuje rozložení intenzit fluorescence
volné sondy uvnitř a vně kořenových vlásků,
k němuž jsme dospěli rozkladem série spektrálních
obrazů daného vzorku, a z toho vyplývající odhady
membránového potenciálu.
23.10.2006
8:59
Page 339
FLUORESCENČNÍ
Poděkování
Tento přehled byl sepsán v souvislosti s řešením
výzkumného záměru MŠMT 113200001 a s finanční
podporou z toho plynoucí.
Literatura
[1] B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts,
P. Walter: Molecular Biology of the Cell. 4th ed.,
Garland Publishing, New York 2002.
[2] J. Plášek, K. Sigler, J. Photochem. Photobiol. B:
Biology 33, 101 (1996).
[3] J. Plášek, R. E. Dale, K. Sigler, G. Laskay, Biochim.
Biophys. Acta 1196, 181 (1994).
[4] J. Plášek, Vesmír 74, 508 (1995).
[5] J. Plášek, B. Denksteinová, F. Sureau,
J. Fluorescence 3, 175 (1993).
[6] T. Vo-Dinh: (1981) in Modern Fluorescence
Spectroscopy. Vol. 4, Wehry, E.C., ed., Plenum Press,
New York 1981, s. 167
[7] E. Spooncer, C. M. Heyworth, A. Dunn, T. M. Dexter,
Differentiation 31, 111 (1986).
[8] D. Gášková, B. Brodská, P. Heřman, J. Večeř,
J. Malínský, K. Sigler, O. Benada, J. Plášek, Yeast 14,
1189 (1998).
SONDY A MĚŘENÍ MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
[9] J. Večeř, P. Heřman, A. Holoubek, Biochim. Biophys.
Acta 1325, 155 (1997).
[10] D. Gášková, H. Kurzweilová, B. Denksteinová,
P. Heřman, J. Večeř, K. Sigler, J. Plášek, J. Malínský,
Folia Microbiol. 39, 516 (1994).
[11] M. Eminger, D. Gášková, B. Brodská, A. Holoubek,
N. Stadler, K. Sigler, Folia Microbiol. 44, 283 (1999).
[12] K. Chládková, T. Hendrych, D. Gášková,
P. Goroncy-Bermes, K. Sigler K, Folia Microbiol. 49,
718 (2004).
[13] D. Gášková, B. Brodská, A. Holoubek, K. Sigler,
Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999 31, 575 (1999).
[14] D. Gášková, R. Čadek, R. Chaloupka, J. Plášek,
K. Sigler, Biochim. Biophys. Acta 1511, 74 (2001).
[15] R. Čadek, K. Chládková, K. Sigler, D. Gášková,
Biochim. Biophys. Acta 1665, 111 (2004).
[16] J. Maláč, E. Urbánková, K. Sigler, D. Gášková,
Int. J. Biochem. Cell Biol. 37, 2536 (2005).
[17] D. Gášková, R. Čadek, R. Chaloupka, V. Vacata,
J. Gebel, K. Sigler, Int. J. Biochem. Cell Biol. 34, 931
(2002).
[18] J. Maláč, K. Sigler, D. Gášková, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 337, 138 (2005).
[19] J. Plášek, A. Vojtíšková, J. Houštěk, J. Photochem.
Photobiol. B: Biology 78, 99 (2005).
[20] J. Plášek, Vesmír 83, 586 (2004).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
339
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 340
MIKROSKOPIE
ATOMÁRNÍCH SIL
V BIOLOGICKÝCH APLIKACÍCH
Kateřina Tománková, Hana Kolářová, Ústav lékařské biofyziky
Lékařské fakulty UP, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc
Roman Kubínek, Milan Vůjtek, Hana Dušková,
Katedra experimentální fyziky Přírodovědecké fakulty UP,
Tř. Svobody 26, 771 46 Olomouc
Mikroskopie atomárních sil je moderní experimentální metoda užívaná k získávání
obrazu jak vodivých, tak nevodivých vzorků, proto mohou být zobrazovány kromě
vodičů také organické materiály, izolátory, keramické látky, skla, polymery, biologické
makromolekuly nebo žijící i nežijící buňky. Některé z těchto materiálů mohou být
zobrazovány v různých prostředích, jako je vzduch, kapaliny, roztoky, vakuum
či nízké teploty. To nám dává možnost pozorovat dynamické jevy v buňkách
a probíhající buněčné procesy v reálném čase za podmínek, které zcela odpovídají
jejich přirozenému prostředí [1], [2].
Běžně bývá možno současně vyhodnotit tření mezi
sondou a povrchem vzorku, odezvu povrchu na
velikost působící síly, v dalších módech se můžou
zkoumat magnetické vlastnosti či tepelná vodivost,
vše v téměř atomárním rozlišení. Jednou z hlavních
metod je zobrazení topografie vzorku, fázové
(amplitudové) zobrazení vzorku či zkoumání
mechanických (Z-piezo) vlastností daného vzorku
[3]. Použitím Liquid skeneru je možné zobrazovat
vzorky in vivo, což nám dovoluje regulovat vnější
podmínky (teplota, pH, relativní vlhkost vzduchu),
nebo přímo pracovat s různými plyny, a můžeme tak
sledovat různé změny nebo standardní chování
buněk. Spojením AFM s jinými zobrazovacími metodami (fluorescenční mikroskopie, konfokální
mikroskopie a jiné optické metody) je možné získat
různé druhy informací o vzorku [4], [5].
PRINCIP MIKROSKOPIE AFM
Základem měřicí jednotky u rastrovacích mikroskopů je sonda, která skenuje povrch vzorku. Získaný
signál pak pochází z detekce interakcí mezi touto
sondou a zkoumaným povrchem. Interakce jsou
obecně založeny na nejrůznějších vlastnostech
vzorku (magnetických, elektrických, teplotních, vodivostních, topografických, elastických). Prostorová
distribuce velikosti signálu měřeného ve skenované
oblasti pak poskytuje opět prostorově závislý signál,
který slouží jako základ pro vytvoření obrazu. V závislosti na typu senzoru a módu, ve kterém daný přístroj
pracuje, skeny (obrázky) zobrazují topografii, elektronovou strukturu nebo mechanické, termální či jiné
vlastnosti zkoumaného povrchu.
340
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
Na rozdíl od STM je v mikroskopii AFM zapotřebí
nejen hrotu, ale i raménka, na jehož konci se hrot
nachází. Hrot snímá atomární sílu a raménko dává
informaci o síle do okolí. Parametry hrotu představují několik mikrometrů v jeho délce,
s průměrem špičky hrotu okolo 10 nm pro atomární
rozlišení. Hrot je umístěn na konci raménka
dlouhého 100–200 µm. Odklon a ohyb raménka způsobuje vzájemné silové působení mezi hrotem
a povrchem vzorku [4].
Materiály, ze kterých jsou hroty a raménka
vyráběny, jsou často totožné; nejčastěji se jedná o
křemík, popř. jeho nitrid, wolframový zahnutý
drátek nebo stříbrný pásek s diamantovým hrotem.
Tvar hrotu je pro každý materiál závislý na výrobním
procesu a vlastnostech materiálu. Speciálním typem
hrotů jsou nanotrubičky. Nejedná se přímo o hrot,
ale nasazují se na klasický AFM hrot. Jsou vyhledávané hlavně pro svou štíhlost a malou adhezi ke
vzorkům a nespornou výhodou je jejich pružnost při
zatížení bez toho, že by se hrot zlomil. Nanotrubičky
jsou vyráběny z uhlíku, WS2, Co [1].
Hroty se po určitém čase užívání opotřebí a je
potřeba je vyměnit za nové. Použitý hrot, zvláště je-li
poškozený, se již nedá použít k získání kvalitního
skenu. Kvalita hrotu se zjišťuje buď pomocí optické
nebo elektronové mikroskopie, nebo naskenováním
standardního vzorku dodávaného přímo s AFM
mikroskopem. Zobrazením takového vzorku např.
kovové mřížky (obr. 1), získáme informace o kvalitě
hrotu, tvaru hrotu a rozlišení, které nám může poskytnout. Testováním tvaru hrotu zjistíme důležitý
údaj – poloměr křivosti [6]. Skenovací systém slouží
k vlastnímu posunu hrotu po vzorku, tedy k rastrová-
23.10.2006
8:59
Page 341
MIKROSKOPIE
ATOMÁRNÍCH SIL V BIOLOGICKÝCH APLIKACÍCH
občas dojde ke kontaktu s povrchem vzorku. Povrch
je zde opět mapován ze změny rezonanční frekvence.
Tato modifikace je výhodnější než dotyková, kde
dochází ke smýkání, tření a tažení vzorku hrotem po
povrchu substrátu; dojde tak k poškození vzorku.
Poklepový režim je také vhodnější než bezdotykový,
protože zahrnuje větší rozpětí v ose z [7], [8].
PODMÍNKY PRO ZOBRAZENÍ ŽIVÝCH
BUNĚK
1/ Standardní mřížka ke stanovení kvality a poloměru
křivosti skenovacího hrotu, zobrazení topografie
pomocí Liquid skeneru 100 µm ve vodě, velikost
100 x 100 µm, rozlišení 300 x 300 pixelů, použitý hrot
Veeco Si 1650-00.
ní povrchu. Jádrem je piezoelektrická keramika, která v závislosti na přivedeném napětí vratně mění svou
velikost. Tento pohyb je reprodukovatelný a piezokeramika tak zajišťuje pohyb raménka na požadované
místo v rastru na povrchu vzorku. Měřitelné posuny
po ploše vzorku mohou být menší než 0,1 nm.
Prostřednictvím přivedeného napětí se pak v každém
měřeném bodě stanoví soubor dat, které jsou následně vyhodnoceny. Základem detekce signálu je vzájemné silové působení mezi hrotem a povrchem
vzorku. Toto silové působení způsobuje ohyb
a odklon nosníku z jeho počáteční polohy, kdy právě
tento odklon je detekován. První AFM mikroskopie
používaly tunelový proud k detekci ohybu raménka,
nyní jsou však rozšířeny nejrůznější optické metody,
běžně s citlivostí 0,01 nm. Nejběžnější je metoda, ve
které je laserový paprsek fokusován na konec raménka a odtud se odráží na fotodiodový detektor. Hrot
interakcí se vzorkem mění svůj stav, který je snímán
senzorem, a přes obvod zpětné vazby je ovlivňováno
prodloužení piezokeramiky. Změna délky je přenášena změnou napětí na piezokeramice do počítače, kde
je rekonstruován obraz. Pro zobrazování biologického materiálu je vhodné použít nekontaktní režim,
který je založen na tom, že raménko vibruje v blízkosti povrchu vzorku s frekvencí 200–400 KHz.
Detekovány jsou změny v rezonanční frekvenci nebo
amplitudě kmitů raménka při přibližování či oddalování hrotu od vzorku. Rozestup mezi hrotem
a povrchem vzorku je několik nm. Dalším režimem
užívaným při mapování biologických vzorků je poklepový režim. Tento režim je velice podobný nekontaktnímu, s tím rozdílem, že rozkmit hrotu je tak velký, že
Buňky, které jsou relativně rovné a mají mnoho míst
pro uchycení k substrátu (např. fibroblasty, gliové
buňky), bývají zobrazovány nejčastěji. Oproti tomu
vysoké či kulaté buňky s málo adhezivními místy
pro uchycení k substrátu jsou obtížněji zobrazitelné
[9]. Tyto buňky často poškozují skenující hrot. Lépe
je pak zobrazit monovrstvu vytvořenou z těchto
buněk. V tomto případě se však musíme omezit na
buněčnou morfologii. Protože mikroskopie AFM je
relativně nedestruktivní vůči živým buňkám,
můžeme vzorky zobrazovat opakovaně.
Buňky uchycené k pěsticímu substrátu se zobrazují nejsnáze. Obvykle jsou buňky zobrazovány na
skleněném sklíčku pokrytém poly-L-lysinem nebo
extracelulárním materiálem (kolagen). Substrát, na
který chceme uchytit vzorky pozorované AFM, musí
být dostatečně rovný (vzhledem k velikosti
zkoumaných molekul), čistý, levný a snadno
připravitelný. Běžně se pro AFM používají substráty,
jako je slída – oblíbenost je dána hlavně její dokonalou štěpností, pružností a chemickou stálostí. Pro
AFM metody má uplatnění hlavně Muskovit
KAl2(Si3Al)O10(OH,F)2. Slída je ve vodných roztocích negativně nabita. Dalším typem substrátu je
sklo – obvykle se jedná o leštěná krycí sklíčka, která
se používají při zobrazování velkých vzorků (např.
celé buňky). Skleněný povrch ve vodných roztocích
nese také negativní náboj, nevýhodou je nízká
adheze buněk ke sklu. Aplikace grafitu v AFM je
nižší, uplatňuje se zejména tam, kde jsou vedle AFM
měření simultánně i STM měření. U křemíkových
destiček se jedná o dobrý podklad pro zobrazování
DNA. V neposlední řadě se používají také plastová
sklíčka typu Thermanox, která mají výborné adherentní vlastnosti pro různé typy buněk.
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
IMOBILIZACE VZORKU
Pro zobrazování biomolekul AFM byly vyvinuty příslušné metody imobilizace molekul na rovný povrch.
Obecně je možno použít některou z následujících
čtyř metod: 1) Vysušení roztoku se vzorkem na
daném povrchu. 2) Fyzikální připoutání molekul =
adsorpce. 3) Chemické navázání nebo zesítění
molekul k povrchu. 4) Usazení jednotlivých molekul
v 2D řadách [10].
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
341
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 342
Jedny z prvních biologických postupů popisujících uchycení vzorku k substrátu vycházely
z jednoduché adsorpce biomolekuly na substrát,
kdy po uplynutí určité inkubační doby byl roztok se
substrátem vysušen. Takto připravené vzorky jsou
obvykle imobilní a zobrazují se ve vzduchu (vakuu).
Nevýhodou je, že buňky po takovéto přípravě budou
mrtvé a ztratí své biologické vlastnosti a často i morfologii. Většina biologických vzorků má velkou afinitu k vodě a v její přítomnosti se stává mobilní. Místo
jednoduché adsorpce molekul na substrát (např.
slídu) je možné také substrát různě modifikovat
a tím zvýšit fixaci zkoumaného vzorku [11]. Při
zobrazování celých buněk v kapalině je potřeba
navázat buňky k povrchu substrátu. To se provádí
přidáním kolagenu, entaktinu apod., čímž je možné
adhezi podpořit [12], [13].
ARTEFAKTY A PROBLÉMY SKENOVÁNÍ
Artefakty vytvářejí objekty, které jsou na snímku
zobrazeny, avšak ve skutečnosti neexistují. Mezi ně
patří například vznik hřebenů, stínů atd. Tyto objekty lze většinou odlišit změnou způsobu snímání (jiná
rychlost, otočení o 90 °). Není-li vzorek dostatečně
pevný, mohou při jeho zobrazování vznikat problémy. Může dojít k jeho poškození nebo utržení
materiálu a jeho smýkání po povrchu, což se projeví
v obraze rozmazanou čarou, která nemá sobě
odpovídající rys v opačném směru skenování; jde
o tzv. rigiditu vzorku. Dochází k tomu při
dlouhodobém skenování a nízké adhezi vzorku
k povrchu. Dalším rysem může být stlačování
povrchu hrotem (grafit) a v mikroskopii AFM jsou
pak zachyceny jen podložené atomy a ostatní chybějí. Zvláštní struktura se potom může objevit při
skenování podlouhlých objektů (nanotrubičky), ty
mohou vibrovat v rovině rovnoběžné s podložkou
(obr. 2). Protože skenování a kmitání nejsou zfá-
2/ Ukázka artefaktů zdvojení měření pomocí skenující
sondy
342
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
zovány, budou řádky postupně zachycovat trubičky
v různých polohách [1].
Na kvalitě zobrazení se může podepsat i nesymetrie
hrotu, která vytváří zkreslený obraz v závislosti na
směru skenování. Zpravidla se to projeví prodloužením objektu v jednom skenu. Velice častý artefakt je
zrcadlení hrotu; vzniká, když se zobrazuje povrch
s ostrými hroty, dojde k záměně funkcí a tím
k zobrazení hrotu povrchem, ne povrchu hrotem.
Další komplikací může být interference mezi vzorkem
a další odrážející se částí. Projeví se to vznikem
proužků v obraze → tmavá a světlá místa pak ovlivňují množství světla dopadajícího do detektoru, který jej
chybně interpretuje jako signál z raménka [4].
Je zásadní použít pomalou skenovací rychlost. Při
vyšších skenovacích rychlostech působí setrvačnost
a zobrazované buňky vypadají jako kousky želatiny
na vibrujícím podkladě, často také způsobují pohyb
v opačném směru. Poslední možný typ artefaktu je
způsoben lidským faktorem při softwarovém zpracování naměřených dat.
SOUČASNÝ STAV UŽITÍ AFM
V BIOLOGICKÝCH APLIKACÍCH
Aplikace AFM v biologii je velmi rozsáhlá. Výzkumy
se zabývají zobrazením a pozorováním jednotlivých
molekul až k celým rozsáhlým tkáním [14]. Velká
oblast se zabývá výzkumem biomateriálů [15], [16],
[17]. V pokročilém stadiu výzkumu je zobrazování
krystalů, buněčných membrán, biopolymerů [nukleové kyseliny, proteiny (lysozymy, proteázy, albumin, globuliny, aktin, fibronektin, kolagen), polysacharidů (hyaluronová kyselina)]. Zde byl získán
poznatek, že použití alkoholů jako látky okolního
3/ Pseudomonas aeruginosa bakterie, sken
10 x 10 µm a 4 x 4 µm, zobrazení ve fázi,
nekontaktní režim, vytvořeno: T. Beveridge
a J. Dutcher, Univ. Guelph [32].
23.10.2006
8:59
Page 343
MIKROSKOPIE
ATOMÁRNÍCH SIL V BIOLOGICKÝCH APLIKACÍCH
Dále se aplikuje AFM na zobrazování chondrocytů na matrici nanovlákna. Dá se tak zjistit kvalita
uměle vytvořené chrupavky a porovnat se zdravou
lidskou chrupavkou [27], [28], [29], [30], [31].
BIOLOGICKÉ APLIKACE AFM
V LABORATOŘÍCH ÚLB LF A KEF PřF UP
V OLOMOUCI
4/ T98 buněčná linie, jedná se o buňky mozkového
nádoru, zobrazení pomocí fázového rozdílu
v nekontaktním režimu na vzduchu, 80 x 80 µm,
vytvořili H. L. Fillmore a I. Chasiotis, Univ. Virginia
[24], [25].
prostředí přináší vyšší rozlišení. Zobrazovaní celých
buněk vyžaduje, aby buňky byly adherentní. Mohou
být zobrazovány i vysušené vzorky a fixované
buňky, avšak pro lepší zobrazení reálných vlastností
v simulovaných přirozených podmínkách je lepší
zobrazovat v kapalném prostředí živných médií
in vivo [18]. Pokud chceme zobrazovat tkáně a celé
buňky, musíme počítat s tím, že jsou velice měkké
a členité a můžou zachytit hrot [19].
Pro zobrazení co největšího množství detailů je
vhodné použití zobrazení ve fázi, tím se zobrazí
i detaily, jako jsou např. bičíky bakterií [20]. Pokud by
se zobrazovala topografie, je pravděpodobné, že
jemné detaily se nezobrazí na úkor velikosti zbylé
části buňky (obr. 3). Dále se jako vhodnější ukazuje
zobrazení imobilizovaného vzorku vysušením (krevní
destičky, adherentní buňky) než v kapalině (žijící
buňky, nukleové kyseliny), pro stejné důvody [21].
Mikroskopie AFM se užívá ve velké řadě výzkumů
a dále i v diagnostice, kde je nutné zobrazení jemných detailů tkáně, buněk nebo krevních elementů
[22], [23]. Práce se zabývají např. výzkumem
různých typů rakoviny, jako jsou mozkové nebo
kožní nádory (obr. 4), zkoumá se chování
nádorových buněk mezi sebou nebo se zjišťuje
chování nádorových buněk v kontaktu se zdravými
buňkami [24], [25].
Pracuje se také na studii kvality vlasů pomocí
mechanických simulací zkoušených na vlasových
buňkách pomocí AFM. Dá se tak zjistit kvalita vlasů
v závislosti na prostředí, ve kterém žije osoba, od níž
vzorek vlasu pochází, popřípadě kvalita užívaných
kosmetických přípravků [26].
Laboratoř má k dispozici mikroskop atomárních sil AFM Explorer
(obr. 5) s přikládací
hlavou ve spojení se
světelným inverzním
mikroskopem Olympus.
V naší laboratoři se
užívá Liquid skener pro
zobrazení biologických
preparátů v kapalném
prostředí in vivo, tím se
lze vyhnout celé řadě
artefaktů způsobených
5/ Mikroskop AFM
dehydratací
vzorku.
Explorer, s přikládací
S použitím Liquid skehlavou od firmy
neru je možné zobrazit
Thermomicroscope
relativně velký skeno(nyní Veeco).
vaný povrch (velké
buňky), snadno se dá
vyměnit hrot, který může být kontaminovaný nebo
poškozený. Získané skeny jsou softwarově zpracovávány programem SPMLab.
Laboratoř používá dva typy hrotů pro skenování
povrchu biologického vzorku (obr. 6 a, b): bezdotykový hrot a raménko ze stejného materiálu – Si
1650-00 s rezonanční frekvencí 210–430 KHz, konstantou tuhosti 20–80 N/m a nominálním poloměrem
hrotu ≤ 10 nm, výška hrotu je 10–15 µm a dotykový
hrot z nitridu křemíku MLCT-EXMT-A s rezonanční
frekvencí 200–400 KHz, konstantou tuhosti 20–80 N/m
a nominálním poloměrem hrotu 20–60 nm, výška
hrotu je 2,5–3,5 µm. Oba jsou dodávané firmou Veeco
(dříve Thermomicroscope).
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
6/ AFM hroty pro skenování povrchu vzorku užívané
v laboratoři KEF PřF UP Olomouc, a – bezdotykový
hrot z nitridu křemíku MLCT-EXMT-A, b – dotykový
hrot z křemíku od firmy Thermomicroscope
(nyní Veeco).
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
343
23.10.2006
8:59
Page 344
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
7/ Ukázka typu sebraných signálů: zobrazení
topografie buněčné linie T98 pomocí Liquid skeneru
100 µm v DMEM živném médiu – buňky mozkového
nádoru, 100 x 100 µm, rozlišení 300 x 300 pixelů,
výška vzorku je 1,1 µm, hrot Si 1650-00, rychlost
skenování 150 µm/s, nekontaktní mód.
V současné době se snažíme zavést do praxe reprodukovatelnou metodu biologických aplikací AFM,
a to hlavně zobrazení buněčné linie G361 a T98
v DMEM živném médiu. Další možnou aplikací je
zobrazování matric na bázi z hyaluronové kyseliny či
netkaných textilií, na kterých se pěstují autologní
chondrocyty určené k transplantaci kloubních chrupavek, kde je nezbytné přiblížit se k vlastnostem
nativní tkáně. V budoucnu se plánuje studium
mechanických vlastností uměle vytvořené chrupavky
na makroskopické i mikroskopické úrovni. Snažíme
se stanovit nejvhodnější metodu fixace buněk k substrátu, potřebnou ke kvalitnímu získání skenu bez
artefaktů a jiných rušivých prvků v obraze. Posuzujeme věrnost zobrazení vzorku pomocí AFM s jinými
zobrazovacími metodami (fluorescenční a světelná
mikroskopie). V neposlední řadě je cílem naší práce
zobrazení povrchu původní buňky, poté buňku se
senzitiserem navázaným na povrchu, dále buňku po
fotodynamické terapii a samotný senzitiser, popřípadě senzitiser navázaný na cyklodextrin. Pro zobrazení těchto vzorků používáme nejčastěji nekontaktní,
popř. poklepový mód. Příprava vzorků probíhá standardně v laboratoři tkáňových kultur. Buněčná linie
se kultivuje na vhodném substrátu nejméně 24 hodin
v živném médiu při 37 °C a 5 % CO2.
V práci jsou prezentovány získané snímky z naší
laboratoře, a to obr. 7, kde je zobrazena buněčná
linie T98 mozkového nádoru pomocí 100 µm Liquid
skeneru na skleněném substrátu v DMEM živném
médiu. Používal se nekontaktní režim s bezdotykovým AFM hrotem, rychlost skenování byla
344
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
8/ 3D zobrazení 1 generace matric vytvořených
z hyaluronové kyseliny pro uchycení chondrocytů,
zobrazena je 8a – topografie a 8b – Z-piezo
(elastické vlastnosti), nekontaktní mód, skener 2 µm,
hrot Si 1650-00, velikost 2 x 2 µm, výška 100 nm
(topografie), 0,02 – 1,67 nA/A° (Z-piezo), rychlost
skenování 100 µm/s.
150 µm/s. Velikost skenu je 100 x 100 µm s rozlišením 300 x 300 pixelů. Výška vzorku je 1,1 µm.
Obr. 8 a, b představuje zobrazení první generace
matrice vytvořené z hyaluronové kyseliny vhodné
pro uchycení autologních chondrocytů. Zobrazena
je topografie vzorku a jeho mechanické (elastické
vlastnosti, Z-piezo). Užíval se nekontaktní režim,
skener 2 µm, rychlost skenování je 100 µm/s. Na
obrázku vidíme linii vlákna hyaluronové kyseliny
zapleteného mezi ostatní vlákna do jednoho celku.
Ze skenu Z-piezo vidíme elastické vlastnosti jednotlivých částí vlákna, které přímo odpovídají
topografii. Velikost skenu je 2 x 2 µm s rozlišením
300 x 300 pixelů. Výška vzorku je 100 nm.
Obr. 9 zobrazuje buněčnou linii G361 kožního
melanomu, substrátem je plastové sklíčko Thermanox. Vzorek byl pořízen kultivací linie po dobu
24 hodin při teplotě 37 °C, poté byl vysušen. Používal
se kontaktní režim s dotykovým hrotem. Skenování
probíhalo na vzduchu bez přítomnosti živného
média. Krystaly, které se vyskytují kolem buňky, jsou
vykrystalizované komponenty DMEM živného
média. Skenovací rychlost byla 100 µm/s, použit
100 µm skener. Velikost skenu je 72,5 x 72,5 µm
s rozlišením 300 x 300 pixelů. Jedná se o zoom z velikosti skenu 100 x 100 µm. Výška vzorku je 1,7 µm.
23.10.2006
8:59
Page 345
MIKROSKOPIE
ATOMÁRNÍCH SIL V BIOLOGICKÝCH APLIKACÍCH
brazování biologických preparátů stejně jako jiné
mikroskopické metody.
Poděkování
Tento projekt byl umožněn za podpory grantu MSM
6198959216 a FRC© 20110291.
Literatura
9/ Zobrazení topografie buněčné linie G361 v DMEM
živném médiu, použil se kontaktní mód, skener
100 µm, hrot z nitridu křemíku MLCT-EXMT-A, velikost
72,5 x 72,5 µm, zoom ze 100 x 100 µm, rozlišení
300 x 300 pixelů, rychlost skenování 100 µm/s.
Obr. 10 prezentuje stejně připravený vzorek jako
obr. 9. Sken byl pořízen v nekontaktním režimu
pomocí dotykového hrotu. Zobrazena je topografie
buněk linie G361 na vzduchu, skenovací rychlost
byla 100 µm/s. Velikost skenu je 100 x 100 µm s rozlišením 300 x 300 pixelů. Výška vzorku je 1,7 µm.
Z výsledků vyplývá, že při zobrazování pomocí
Liquid skeneru je třeba odstranit stávající problémy,
jako jsou artefakty při skenování a uchycení vzorku
k substrátu. Výhledově se tato metoda vypracuje na
úroveň reprodukovatelného zobrazení různých biologických vzorků v požadované kvalitě. V současné
době není v ČR laboratoř, kde by se tato metoda
stala reprodukovatelnou a často využívanou k zo-
10/ Zobrazení topografie buněčné linie G361 na
vzduchu, nekontaktní mód, použitý skener 100 µm,
dotykový hrot z nitridu křemíku MLCT-EXMT-A,
velikost skenu 100 x 100 µm, rozlišení
300 x 300 pixelů, rychlost skenování 100 µm/s.
Výška vzorku je 1,7 µm.
[1] R. Kubínek, M. Vůjtek: Mikroskopie skenující
sondou, Olomouc 2003, ISBN 80-244-0602-0.
[2] D. Fotiadis, S. Scheuring, Micron 33, 385 (2002).
[3] Y. F. Dufrene, Ch. J. P. Boonaert, Ultramicroscopy
86, 113 (2001).
[4] V. J. Morris, A. R. Kirby: Atomic Force Microscopy
for Biologist, London 1999, ISBN 1-86094-199-0.
[5] F. Kienberger, C. Stroh, Ultramicroscopy 97, 229
(2003).
[6] J. P. Spatz, S. S. Sheiko, Ultramicroscopy 75, 1 (1998).
[7] P. P. Lehenkari, G. T. Charras, Ultramicroscopy 82,
289 (2000).
[8] A. V. Bolshakova, O. I. Kiselyova, Ultramicroscopy
86, 121 (2001).
[9] Z. Yingge, J. Xia, Journal of Structural Biology 144,
327 (2003).
[10] M. Moloney, L. McDonnell, Ultramicroscopy 91, 275
(2002).
[11] A. Vinckier, I. Heyvaert, Ultramicroscopy 57, 337
(1995).
[12] P. Wagner, FEBS Letters 430, 112 (1998).
[13] H. Kim, H. Arakawa, Ultramicroscopy 97, 359 (2003).
[14] A. Mendez-Vilas, I. Corbacho, Applied Surface
Science 238, 51 (2004).
[15] M. Yu, A. Ivanisevic, Biomaterials 25, 3655 (2004).
[16] T. Tätte, K. Saal, Surface Science 532–535, 1085
(2003).
[17] R. Kubínek, M. Vůjtek, Čs. čas. fyz. 53, 109 (2003).
[18] N. C. Santos, M. Castanho, Biophysical Chemistry
107, 133 (2004).
[19] H. X. You, J. M. Lau, Ultramicroscopy 82, 297 (2000).
[20] M. J. Doktycz, C. J. Sullivan, Ultramicroscopy 97,
209 (2003).
[21] M. Fujita, W. Mizutani, Ultramicroscopy 91, 281
(2002).
[22] R. Nowakowski, P. Luckham, Biochi. et Bioph. Acta
1514, 170 (2001).
[23] M. O. O´Reilly, L. McDonnell, Ultramicroscopy 86,
107 (2001).
[24] H. L. Fillmore, I. Chasiotis, Nanotechnology 14, 73
(2003).
[25] I. Chasiotis, H. L. Fillmore, Nanotechnology 14, 557
(2003).
[26] M. G. Langer, A. Koitschev, Ultramicroscopy 82, 269
(2000).
[27] R. Krishnan, M. Caligaris, Osteoarthritis and
Cartilage 12, 947 (2004).
[28] G. A. Hutcheon, C. Messiou, Biomaterials 22, 667
(2001).
[29] S. Park, D. K. Costa, Journal of Biomechanics 37,
1679 (2004).
[30] T. Ahrens, M. Lambert, Journal of Molecular Biology
325, 733 (2003).
[31] J. S. Jurvelin, D. J. Miller, Journal of Structural
Biology 117, 45 (1996).
[32] http://www.asylumresearch.com/News/News.shtml#VFM
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
345
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
JAK
8:59
Page 346
ROSTOU NÁDORY
Vladimír Dvořák, Fyzikální ústav AV ČR, Na Slovance 2, 182 21 Praha 8
Fraktální analýza růstu zhoubných nádorů ukázala, že růst má univerzální charakter,
stejný pro všechny druhy nádorů zkoumaných in vivo či kultivovaných in vitro.
Škálovací zákony pro růst nádorů jsou stejné jako pro růst epitaxních vrstev
z molekulárních svazků. Z toho vyplývá, že nejdůležitějším mechanismem růstu
nádoru je difuze rakovinných buněk po jeho povrchu do míst, ve kterých se mohou
nejsnáze dále dělit. Nádory se zvětšují lineárně s časem a mají superhrubý povrch.
Stimulací imunitní odpovědi lze změnit dynamiku růstu nádorů a nakonec i jejich
další růst zastavit. Tato nová, nadějná terapie nádorů se osvědčila na pokusných
zvířatech a v jednom případě i na člověku. Z mechanismu růstu nádorů vyplývají
některé závěry o účinnosti chemoterapie.
Nedávno skupina španělských fyziků a klinických
lékařů zveřejnila výsledky svého výzkumu růstu
zhoubných nádorů [1]–[3]. Lze je shrnout následovně:
- dynamika růstu nádorů je univerzální (tj.
nezávisí na druhu nádoru) a řídí se stejnými
zákony jako růst epitaxní vrstvy z molekulárních
svazků (angl. molecular beam epitaxy – MBE);
- pro růst nádoru je rozhodující difuze rakovinných buněk po jeho povrchu do míst, kde jsou
vystaveny co nejmenšímu tlaku hostitelské
tkáně a buněk imunitního systému;
- nádory rostou – rakovinné buňky se dělí – v podstatě jen na jejich površích;
- růst nádorů s časem je lineární a ne exponenciální, jak se doposud předpokládalo;
- stimulací imunitní odpovědi je možné měnit
dynamiku růstu nádorů, příp. jejich růst zastavit.
V tomto referativním článku se pokusíme tyto
závěry osvětlit. Zaměříme se především na fyzikální
stránku problematiky. Čtenáře, který by se zajímal
i o stránku biologickou, tj. o podrobný popis typů
nádorů, jak byly preparovány a kultivovány,
o dosavadních modelech růstu nádorů apod.,
odkazujeme na uvedenou literaturu [1]–[3].
Doufáme, že čtenáře zaujme podobnost tak různých
přírodních jevů, jako je růst nádorů a epitaxních
vrstev. Oběma je společné to, že jejich hrubý (angl.
rough) povrch – rozhraní mezi objektem samým
a jeho okolím – je fraktál [4]. Připomeňme si, že
fraktál je objekt, jehož morfologie je v různých
měřítkách velikosti (škálách) stejná – je invariantní
vůči změně škálování. Jinými slovy, fraktál je
soběpodobný útvar, na kterém při různém rozlišení,
např. pozorujeme-li jej prostým okem či mikroskopem, zjišťujeme stejný charakteristický tvar.
Pojem fraktálu zavedl v roce 1975 matematik
B. Mandelbrot a od té doby se nacházejí téměř
všude: ve větvení stromů, žil a nervů v lidském těle,
346
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
v rozdělení hmoty v galaxiích, ve struktuře vírů
v turbulentním proudění kapaliny, při růstu krystalů
či kolonie bakterií, při pohybu rozhraní v neuspořádaném prostředí, jako je např. prosakování kapaliny
listem papíru, hranice hořícího lesa anebo při usazování sněhových vloček na okně, při naprašování
tenkých vrstev, při růstu epitaxní vrstvy z molekulárních svazků atd. Fraktály mají na všech škálách
složitý tvar, který nelze popsat obvyklými matematickými metodami; k jejich popisu byla vyvinuta tzv.
fraktální geometrie.
Z koncepce fraktální geometrie vyplývá pozoruhodná skutečnost, že morfologie a časový vývoj
rozhraní nezávisí na „detailech“ systémů a že je
možné je charakterizovat pouhými třemi čísly, totiž
exponentem hrubosti α, růstovým exponentem ß
a dynamickým exponentem z. Ukazuje se, že
velikosti exponentů popisující morfologii a růst epitaxní vrstvy a nádoru jsou stejné, a oba tyto zdánlivě
různé procesy patří proto do stejné tzv. třídy univerzality. Pro pohodlí čtenáře si připomeňme některé základní pojmy fraktální geometrie, se kterými se
již patrně setkal v čistě fyzikální problematice.
ŠKÁLOVACÍ RELACE A FRAKTÁLNÍ
DIMENZE
Ukážeme si na velmi jednoduchém modelu růstu
vrstvy částic, jak se uvedené exponenty zavádějí.
Z náhodně vybraných poloh dopadají kolmo na
podložku částice a zachytí se na prvním volném
místě bezprostředně sousedícím s místem již jinou
částicí obsazeným (tzv. balistický model). Postupně
se vytvářejí různě vysoké sloupce částic; označme
jejich počet L. Tento proces lze dobře simulovat na
počítači a výsledek takové simulace je na obr. 1. Je
dobře patrné, že hrubost rozhraní (mezi oblastí
zaplněnou částicemi a prázdnou oblastí nad ní)
s časem narůstá. Hrubost rozhraní se charakterizuje
23.10.2006
8:59
Page 347
JAK
ROSTOU NÁDORY
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
2/ Závislost šířky rozhraní w na čase t (časová
jednotka odpovídá době potřebné k depozici L částic)
vynášená v logaritmických stupnicích pro různé
hodnoty L (podle [4]): L = 100 (), L = 200 ( ),
L = 400 ( ) a L = 800 ( ). Jelikož w(L.t) ~ tß,
směrnice čárkované přímky určuje velikost růstového
exponentu ß. Ke zlomu časového průběhu w
(od exponenciálního růstu k nasycené hodnotě)
dochází v čase ts. Např. pro křivku je ts ≈ 100.
a budeme vynášet w(L,t)/wsat(L) jako funkci t/ts
(v logaritmických stupnicích), všechny křivky na
obr. 2 splynou v jedinou univerzální křivku vyjádřenou vztahem
1/ Časový vývoj souboru nahromaděných částic
v balistickém modelu růstu podle [4]. Každý šedý
a tmavý pruh obsahuje 2500 postupně dopadnuvších
částic. Počet sloupců L ve vodorovném směru je 200.
,
(3)
kde f je tzv. škálovací funkce s těmito vlastnostmi:
jeho šířkou w(L,t) definovanou jako střední kvadratická odchylka
(1)
Vyjádříme-li ve vztahu (3) wsat a ts pomocí škálovacích relací, dostaneme škálovací relaci
(4)
kde h(i,t) je výška i-tého sloupce v čase t a střední
výška sloupců 〈h〉 je
Ukazuje se, že hrubost rozhraní nejprve roste s mocninou času a splňuje tzv. škálovací relaci w(L.t) ~ tß.
Po určité tzv. saturační době ts dochází ale k nasycení a hrubost se již dále nemění [4] (viz obr. 2).
Nasycená hodnota wsat a saturační čas ts jsou funkcí
L a splňují škálovací relace
.
kterou postulovali Family a Vicsek (F.V.) [4].
Ve fraktální geometrii je důležitý pojem fraktální
dimenze df fraktálu. Uvažujme plošný objekt
vnořený do dvojrozměrného euklidovského (dE = 2)
prostoru. Jeho plochu lze pokrýt N(j) čtverečky
o straně j. Pro čtverec (o straně 1) samozřejmě platí
N(j) = j–2; exponent 2 je právě rozměr čtverce.
Představme si nyní fraktál, např. sněhovou vločku,
a definujme jeho rozměr df v analogii se čtvercem
vztahem N(j) ~ j–df, odkud
(2)
,
Exponenty α, ß a z nejsou nezávislé, jak vyplývá
z následující úvahy: hodnotu w(ts) lze vyjádřit buď
jako tsß ~ Lzß, anebo jako w(ts) ~ Lα, odkud plyne
z = α/ß. Z tvaru závislosti w(L,t) lze očekávat – a tak
tomu skutečně je –, že když změníme škálování
(5)
kde N(j) je počet čtverečků o straně j, kterými lze
fraktál pokrýt. Existují počítačové programy,
pomocí nichž je možné naskenovaný tvar fraktálu
tímto způsobem analyzovat a vypočítat tak podle (5)
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
347
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 348
fraktální dimenzi (tzv. box-counting, metoda výpočtu df). Dá se očekávat, že df < dE = 2, protože fraktál
nevyplňuje celý dvourozměrný euklidovský prostor,
je „potrhaný“. Podmínkou df < dE je fraktál definován. Rozhraní rostoucí vrstvy je fraktální křivka,
která je tak zohýbaná, „hrubá“ (viz obr. 1), že se
spíše podobá ploše než křivce, a má proto rozměr
větší než 1. Je vnořena do dvourozměrného prostoru, ale nevyplňuje jej celý: 1 < df < 2.
LINEÁRNÍ TEORIE MBE
Růst vrstvy metodou MBE je složitější proces, než jaký
jsme doposud uvažovali (balistický model). Kromě
depozice částic je třeba ještě uvažovat desorbci –
odpařování – částic a zejména jejich difuzi po povrchu.
Za obvyklých podmínek růstu je desorbce zanedbatelná a nebudeme se jí dále zabývat. Při popisu difuze částic budeme považovat rozhraní za spojité [4].
Difundující částice vytvářejí lokální makroskopický
proud j částic, což má za následek lokální změnu výšky
h vrstvy v čase. Jelikož počet částic zůstává stejný,
musí být splněna rovnice kontinuity, tj. kolik částic
z místa x odteče, o tolik se sníží výška h:
.
(6)
Proud částic je úměrný lokální změně chemického
potenciálu, j(x,t) ~ – µ(x,t); částice proudí do míst
s minimálním µ, to je tam, kde mohou vytvářet co
největší počet vazeb se sousedními částicemi. Počet
sousedů v určitém místě závisí na lokálním průběhu
h(x,t) a bude velký v „dolíkách“ rozhraní, tj. kde je
2
h(x,t) > 0. Můžeme tedy v prvním přiblížení1 psát
µ(x,t) ~ – 2h(x,t) a rovnice (6) nabude tvar [4]
.
348
FRAKTÁLNÍ ANALÝZA RŮSTU NÁDORŮ
Obraťme se nyní k problematice růstu nádorů.
V práci [1] jsou uvedeny výsledky pěstování in vitro
čtyř mozkových nádorů (glioma) rostoucích z krysích astrocytových (hvězdicovitých) gliových buněk
(gliové buňky jsou podpůrné buňky, které společně
s neurony jsou hlavními stavebními kameny
mozku). Zhruba 103–104 rakovinných buněk (RB)
bylo umístěno na Petriho misku (o průměru 35 mm),
ve které nádor rostl po jejím dně, a může být proto
považován za dvourozměrný systém. Ve vložce do
obr. 3 jsou tvary jednoho z nádorů ve čtyřech
různých časech, ze kterých lze usoudit, že se jedná
o fraktály. Skutečně, jestliže se pomocí vzorce (5)
vypočte fraktální dimenze, vyjde df = 1,21 ± 0,05, a to
pro všechny čtyři nádory a nezávisle na čase (viz
obr. 3). Tato hodnota je pro nádory typická: v práci
[2] se uvádí, že u patnácti dalších druhů nádorů,
z toho u šesti lidských (např. u nádoru tlustého střeva, kosti, děložního čípku), byly nalezeny hodnoty df
v rozmezí 1,09–1,34. Tyto rozdíly mohou být způsobeny různým prostředím (in vivo versus in vitro),
ve kterém nádory rostly. Fraktální dimenze zřejmě
nezáleží na morfologii jednotlivých RB, ale spíše
odráží mechanismus růstu nádorů.
(7)
Na pravou stranu této rovnice je ještě připojen střední tok dopadajících částic F a jeho fluktuace
η ≡ δF. Veličina η představuje tepelný šum, jehož
střední hodnota je rovna nule a o němž se předpokládá, že není zkorelován ani v různých časech, ani v různých místech. Z této rovnice je možné odvodit
hodnoty exponentů α, ß, z. Využije se toho, že rozhraní
má fraktální vlastnosti (přesněji řečeno je self-afinním
fraktálem, který se sobě podobá při různém přeškálování x a h) a že se tedy rovnice (7) nesmí změnit při
přeškálování proměnných: x → x' ≡ bx, h → h' ≡ bαh
(připomeňme si, že α je vlastně kvantitativní mírou
hrubosti veličiny h), t → t' ≡ bzt (hrubost rozhraní se
1
mění s časem, a proto se musí současně přeškálovat
i čas dynamickým exponentem z). Po uvedené
záměně proměnných nesmí žádný člen rovnice (7)
záviset na koeficientu b a z tohoto požadavku vyplývají (v jednoduchém případě čárového rozhraní) hodnoty exponentů α = 3/2, ß = 3/8 a z = 4.
3/ Závislost počtu čtverečků N(j) na jejich straně j, ze
které je možné určit podle vzorce (5) fraktální dimenzi
df. Body odpovídají času nula, body času
21 hod., body 29 hod. a body 52 hod.
Ve vložce do obrázku jsou rozhraní nádorů
odpovídající uvedeným časům. Podle práce [1].
n
Na pravé straně rovnice je jen první člen rozvoje v mocninách
h, který se uplatňuje v balistickém modelu růstu
vrstvy doplněném o difuzi částic po jejím povrchu. Jestliže se v balistickém modelu uvažuje relaxace deponovaných
2
4
částic do míst s nejmenší výškou h sloupců, prvním členem rozvoje je
h (a člen
h se stává irelevantním), což
vede na Edwardsovu-Wilkinsonovu rovnici [4].
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
23.10.2006
8:59
Page 349
JAK
K popisu dynamiky růstu nádoru použijeme
pojmy fraktální geometrie, jež byly připomenuty
výše. Nádory mají kruhový a nikoli lineární tvar jako
rozhraní rostoucí vrstvy, nicméně pokud jsou fluktuace vzdálenosti r(i,t) i-tého místa na rozhraní
nádoru od jeho těžiště malé ve srovnání se střední
hodnotou jeho poloměru 〈r〉
můžeme rozhraní nádoru považovat přibližně za
lineární. (N značí počet míst na rozhraní.)
Šířka rozhraní definovaná vztahem (1) charakterizuje jeho hrubost v globálním měřítku, tj. hrubost
celého rozhraní délky L. Exponent α budeme proto
v dalším nazývat globálním exponentem hrubosti.
Kromě globální hrubosti se zavádí ještě lokální hrubost rozhraní v jeho části („okně“) délky l a lokální
exponent hrubosti αloc. Pro nádor je příslušná lokální šířka rozhraní definována vztahem [1]
ROSTOU NÁDORY
Pokud v systému existuje jen jedna charakteristická
délka, totiž rozměr systému, chování w bude na
všech škálách stejné a αloc = α [5]. Popis rozhraní
v globálním a lokálním měřítku nemusí však být
vždy ekvivalentní.
Tak např. když se jedná o tzv. superhrubá
rozhraní, která mají α > 1 – a to je právě případ
rozhraní vrstvy pěstované metodou MBE –, ukazuje
se [5], že k nasycení lokální šířky wsat superhrubého
rozhraní nedochází pro t>>lz. Zpočátku, v časovém
intervalu t << ts(l) ~ lz, lokální šířka w(l,t) roste „normálně“ jako tß. V přechodovém časovém intervalu
lz << t << Lz šířka sice nadále roste, ale s jiným růstovým exponentem: ß* = ß – αloc/z. K nasycení lokální šířky w(l,t) dochází až v časech, kdy je nasycena
globální šířka w(L,t), tj. v časech t>>ts(l) = Lz.
Škálování, kterým se řídí lokální šířka superhrubého rozhraní, se označuje jako anomální a pomocí
škálovací funkce g(l/t1/z) jej lze napsat ve tvaru
w(l,t) = lα g(l/t1/z), kde
(8)
,
(9a)
kde 〈•〉l značí střední hodnotu přes oblouk rozhraní
délky l a { • }L označuje středování přes všechny
oblouky délky l, které vyplňují celý obrys nádoru
délky L (viz obr. 4). Dá se očekávat, že pro nasycenou hodnotu lokální šířky bude platit škálovací
relace podobná vztahu (2)
.
(9b)
4/ Část rozhraní nádoru s vyznačením (tečkovaně)
oblouků stejné délky l (podle [2]). Při výpočtu lokální
šířky rozhraní podle (8) se nejprve vystředují
fluktuace (jejich kvadráty) šířky rozhraní od její
střední hodnoty na oblouku dané délky l a posléze se
vypočte střední hodnota přes všechny stejně dlouhé
oblouky délky l; součet délek všech těchto
oblouků je roven L.
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
Ze vztahu (9a) plyne, že v časech l << t1/z << L platí
w(l,t) ~ lα loc tβ* a že je tedy možné určit αloc ze závislostí w na l vynášených v logaritmických stupnicích
pro různé časy, jak je vidět na obr. 5. Při vhodné volbě
exponentů, totiž α = 1,5 a z = 4,0, přeškálované šířky
w/lα v závislosti na l/t1/z přejdou (v logaritmických
stupnicích) v jednu univerzální křivku (viz vložka do
obr. 5), což potvrzuje správnost škálovací hypotézy.
K určení globálního exponentu hrubosti α se
často používá tzv. strukturní faktor
5/ Závislost log w na log l v časech 48 hod.(),
72 hod. ( ), 144 hod. ( ), 168 hod. (+)
a 311 hod. (*) podle [1]. Z počáteční směrnice
vyplývá hodnota αloc = 0,87 ± 0,05.
Univerzální křivka ve vložce do obrázku má dvě
přímkové části, ze kterých lze podle (9) určit
α – αloc = 0,55 ± 0,1 a α = 1,4 ± 0,1.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
349
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 350
kde r(k,t) je Fourierův obraz fluktuací {r(i,t) – 〈r〉}.
Zhruba řečeno, strukturní faktor je Fourierův obraz
obrysu rozhraní. Lze jej vypočítat, stejně jako ostatní veličiny fraktální geometrie, počítačovou analýzou naskenovaných fotografií nádoru. Strukturní
faktor, který v sobě obsahuje všechny globální
charakteristiky hrubnutí rozhraní, se škáluje podle
vztahu [5]
,
(10)
přičemž škálovací funkce s(kt1/z) se chová jako
což je ve skutečnosti ekvivalentní F.V. relaci (4). Na
obr. 6 je v logaritmických stupnicích vynesena závislost S na k pro jeden ze zkoumaných nádorů – který
nejdéle rostl. Ze směrnice přímky v oblasti kt1/z >> 1
lze určit exponent hrubosti α = 1,5±0,1. Ukazuje se,
že lze zvolit exponenty α a z tak, totiž α = 1,5
a z = 4,0, že křivky pro různé časy přejdou (při příslušném přeškálování – viz obr. 6) v jednu univerzální křivku ve shodě se škálovací hypotézou (10). Ze
vztahu ß = α/z dostáváme ß = 3/8 ± 0,03.
Růst nádorů je tedy charakterizován exponenty
α = 1,5 ± 0,1; ß = 3/8 ± 0,03; z = 4,0; αloc = 0,87 ± 0,05
a jejich hodnoty jsou kompatibilní s teoretickými
hodnotami exponentů v modelu růstu vrstvy
metodou MBE. Pouze hodnota αloc pro nádor se
poněkud liší od teoretické hodnoty 1 pro
superhrubé rozhraní [5], což může být důsledkem
toho, že nádor je kruhový a ne lineární objekt a že
6/ Závislost log S na log k v časech 48 hod. (),
72 hod. ( ), 144 hod. ( ), 168 hod. (+) a 311 hod.
(*) podle [1], ze které lze určit α. Ve vložce do
obrázku je univerzální křivka, na kterou přejdou
všechna přeškálovaná data vynášená v logaritmických
stupnicích při volbě α = 1,5 a z = 4,0.
350
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
jeho velikost se s časem mění; u vrstvy je L konstantní. Růst nádorů a růst vrstev metodou MBE
patří tedy do stejné třídy univerzality. Jinými slovy,
růst nádoru se řídí rovnicí typu (7), kde v případě
růstu nádoru má veličina F význam rychlosti dělení
RB. Dynamika růstu je stejná pro nádory různých
typů, z různých orgánů, zkoumaných in vitro či in
vivo [2].
Z platnosti rovnice (7) pro růst nádoru vyplývá
následující důležitý závěr: pro růst nádoru je rozhodující difuze RB do „dolíků“ (míst s velkou lokální
křivostí) na povrchu nádoru, tj. do míst s velkým
počtem sousedů, kteří RB chrání před tlakem hostitelské tkáně a buněk imunitního systému. To se zdá
být v rozporu s dosavadní představou, že pro růst
nádoru je rozhodující přísun kyslíku a živin; ten je
totiž k „dolíku“ znesnadněn a navíc, ve srovnání
s vyvýšeninami na povrchu, je v něm nepříznivý,
podstatně kyselejší pH faktor jako důsledek velkého
počtu RB, které svým metabolismem produkují
kyselinu mléčnou. Rozhodující je ale skutečnost, že
v „dolíku“ je nejmenší tlak, který vyvíjejí hostitelské
a imunitní buňky na RB, což zvyšuje rychlost jejich
dalšího dělení. Superhrubý povrch nádoru je pro
jeho růst velmi výhodný, jelikož na něm existuje
7/ Difuze RB v kolonii buněk z nádoru tlustého střeva
podle [2]. Šipkou je označena sledovaná buňka;
(a) buňka, která právě vznikla dělením, (b-e) pohyb
buňky po okraji kolonie, (e) konečná poloha buňky.
23.10.2006
8:59
Page 351
JAK
8/ Rozmístění neutrofil v „dolících“ rozhraní
(vyznačené červeně) hostitelská tkáň (A) – nádor
(B), které potlačuje růst nádoru. Podle práce [3].
velké množství „dolíků“, které difundující RB vyhledávají, aby se v nich mohly dále dělit. Tento závěr
byl v podstatě experimentálně prokázán na jednom
typu RB (viz obr. 7).
Z mechanismu růstu nádoru se dá usoudit, že potlačením difuze RB po jeho povrchu se dá zabránit
jeho dalšímu růstu. Skutečně se prokázalo, že
podávání látek, které stimulují imunitní odpověď
myši na implantovaný nádor zvýšením počtu neutrofil (druh bílých krvinek ze skupiny tzv. granulocytů),
podstatně změní dynamiku růstu nádoru [3].
Ukazuje se, že neutrofily přednostně zaplňují
„dolíky“ na povrchu nádoru (viz obr. 8), ve kterých
by se RB mohly rychle dělit. Neutrofily tedy znesnadňují difuzi RB do pro ně výhodných míst
a současně zvyšují tlak na potenciálně dělící se RB,
čímž se zpomaluje růst nádoru. U myší, které byly
„léčeny“ tímto způsobem, docházelo k systematickému zmenšování globálního exponentu hrubosti α
– po dvou měsících až na hodnotu 1,1 (exponent αloc
zůstával na stejné hodnotě 0,9 ± 0,1). Během pokusů
byly nádory buď vyoperovány, nebo zobrazovány
jadernou magnetickou rezonancí a pak analyzovány.
Pokles hodnoty α nasvědčuje, že neutrofily změnily
dynamiku růstu nádoru, která je nyní lépe popsána
Edwardsovou-Wilkinsonovou rovnicí se statickou
neuspořádaností (angl. quenched Edwards-Wilkinson [QEW] equation) [4]
.
(11)
Tato rovnice popisuje pohyb rozhraní v neuspořádaném prostředí. První člen na pravé straně představuje elastickou sílu, která je důsledkem lokální
křivosti rozhraní a která se jej snaží vyhladit (ν se
obvykle nazývá koeficient povrchového napětí). F je
vnější hybná síla působící na rozhraní a η(x,h) je tzv.
zamrzlý šum (angl. quenched noise), generovaný
statickými nehomogenitami neuspořádaného pro-
ROSTOU NÁDORY
středí. (Tepelný šum se v této rovnici zanedbává.)
Tyto nehomogenity představují pro rozhraní upínací
síly (angl. pinning forces), které brání jeho pohybu.
Zamrzlý šum se mění od místa k místu a závisí
explicitně také na h, tj. na výšce rozhraní (v důsledku toho je rovnice (11) nelineární a nelze ji analyticky řešit); ve střední hodnotě (přes všechna možná
neuspořádání) je zamrzlý šum roven nule a je zkorelován jen na velmi krátké vzdálenosti.
Pokud je hybná síla F menší než kritická hodnota
Fc – uvolňující síla (angl. depinning force), rozhraní
se nemůže pohybovat a zůstává upnuté na zamrzlých nehomogenitách – upínacích centrech.
Jakmile hybná síla překoná sílu upínací (F ≥ Fc),
rozhraní se začne pohybovat. Numerické řešení
rovnice (11) vede na hodnoty α = 1,2 a αloc ≈ 1 [6],
ke kterým se blíží experimentální hodnoty pro myší
nádory po stimulaci imunitní odpovědi [3]. V případě nádorů F představuje rychlost dělení RB.
Neutrofily hrají roli upínacích center, neboť znemožňují difuzi RB a současně na ně působí tlakem, čímž
zmenšují rychlost dělení, tj. velikost F. Při dostatečném množství neutrofil bude tedy F < Fc,
rozhraní zůstane upnuté a nádor neporoste [3].
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
NOVÁ NÁDOROVÁ TERAPIE?
Výše zmiňované pokusy na myších ukázaly, že stimulace imunitního systému vedoucí k zvýšení počtu
neutrofil v okolí nádoru mělo za následek podstatné
prodloužení doby jejich přežití (až asi 16krát)
a někdy i úplné zničení nádoru [3]. Tato terapie byla
úspěšně použita i u člověka [7]. Šestapadesátiletému
muži, který trpěl rakovinou jater (hepatocellular
carcinoma) v pokročilém stadiu (a navíc měl ještě
cirhózu – „tvrdnutí jater“) byl podáván neupogen
(obchodní název pro glykoprotein filgrastim), což je
látka, která v lidském organismu stimuluje produkci
granulocytů – neutrofil. Léčba probíhala ve dvou
osmitýdenních cyklech (denní dávka 10 µg/kg)
a kromě sporadicky se vyskytující zvýšené teploty
neměla žádné vedlejší účinky. Již po prvním cyklu
byla hladina α-proteinu (antigen produkovaný při
rakovině jater) normální a na obrázcích z jaderné
magnetické rezonance bylo zřetelné zmenšení
původní rakovinné oblasti jater. Jelikož z obrázků
nebylo zřejmé, zda se jedná o zánětlivou, či maligní
oblast (normální biopsie vzhledem k podstatnému
zmenšení oblasti nemohla být provedena), a pacient
léčbu dobře snášel, byl pro jistotu uskutečněn ještě
druhý cyklus. Hladina α-proteinu zůstala normální
a pacient byl ve velmi dobrém fyzickém stavu. Po
čtyřech měsících byla provedena tenkojehlová biopsie a cytologický rozbor ukázal, že ve sledované
jaterní oblasti se sice vyskytují abnormální buňky,
ale nikoliv RB. Pacient byl z nádorového onemocnění vyléčen a navrátil se do zaměstnání.
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
351
/ FYZIKÁLNÍ METODY V BIOLOGII /
vnitrek_5-06.qxd
23.10.2006
8:59
Page 352
K ÚČINNOSTI CHEMOTERAPIE
ZÁVĚR
V dosavadních modelech růstu nádoru se předpokládalo, že k dělení RB dochází v celém objemu
nádoru, což by vedlo k jeho exponenciálnímu růstu;
ve skutečnosti ale nádory rostou s časem lineárně
(obr. 9). Jednoduchou úvahou lze ukázat [1], že
pokud dochází k dělení RB převážně jen na povrchu
nádoru, potom poroste s časem lineárně a ne exponenciálně. Při dělení RB dochází k dalším genovým
mutacím, což ještě zvyšuje schopnost RB proliferovat – prudce se dělit. Na povrchu nádoru se proto
vyskytují nejzhoubnější RB a jelikož právě z nich se
vytvářejí metastáze, jsou zhoubnější než samotný
primární nádor. Buněčná proliferace klesá dále od
povrchu, protože uvnitř nádoru není dostatek místa,
aby se RB mohly dále dělit – působí na ně tlak, který
dělení zabraňuje. Tato skutečnost může vést k chybným závěrům při biopsii, protože rakovinná tkáň,
která se obvykle odebírá ze středu nádoru [2], není
tak zhoubná.
Uvedené experimentální a teoretické poznatky
o růstu nádorů vedou k několika závěrům o účinnosti chemoterapie [2]. Cytostatika nepochybně
zničí všechny rychle se dělící RB na povrchu
nádoru, nikoli však pod jeho povrchem, kde se RB
prakticky nemohou dále dělit. Po zničení povrchové
vrstvy se objeví na povrchu nové RB, začnou se dělit
a celý proces se opakuje. Jinými slovy, cytostatika
sice zmenší nádor, ale musejí zabít větší počet RB,
než kdyby byly náhodně rozloženy po celém objemu
nádoru; chemoterapie je v důsledku toho méně účinná, než by se dalo očekávat. Je známo, že buňky,
které trpí hypoxií (neadekvátním přísunem kyslíku),
jsou odolné vůči cytostatikům; analýza růstu nádoru
ukázala, že RB se stěhují právě do míst – do „dolíků“
na povrchu nádoru –, ve kterých je hypoxie
pravděpodobnější, což dále snižuje účinnost
chemoterapie.
Fraktální analýza růstu nádorů ukázala, že se jejich
růst řídí stejnými pravidly jako růst krystalických
tenkých vrstev pěstovaných metodou MBE. Stejně
jako tenká vrstva nádor roste na povrchu, zvětšuje
se lineárně s časem a rozhodujícím dějem pro jeho
růst je difuze RB po povrchu do míst – „dolíků“ –,
s velkým počtem sousedů (velkou lokální křivostí),
kde se RB mohou nejsnadněji dále dělit. Povrch je
superhrubý a má fraktální dimenzi 1,21. Dynamika
růstu nádoru se podstatně mění při zavedení neutrofil do okolí nádoru, které znesnadňují difuzi RB po
povrchu nádoru a při jejich dostatečném počtu
vedou k upnutí povrchu, tj. znemožňují růst nádoru.
Stimulace imunitní odpovědi se tedy jeví jako účinná nádorová terapie, dokonce i pro člověka;
potvrzení tohoto závěru ovšem vyžaduje další klinické zkoušky. Závěry o mechanismu růstu nádorů
naznačují, proč chemoterapie není tak účinná, jak
by se dalo očekávat.
9/ Závislost střední hodnoty poloměru nádoru 〈r〉 na
čase pro čtyři nádory podrobené škálovací analýze
(viz obr. 5, 6) podle [1]. Ve vložce do obrázku jsou
průběhy při počátečních časech.
352
Čs. čas. fyz. 56 /2006/
Literatura
[1] A. Brú, J. M. Pastor, I. Fernaud, I. Brú, S. Melle,
C. Berenguer: Super-rough dynamics on tumor
growth, Phys. Rev. Lett. 81, 4008 (1998).
[2] A. Brú, S. Albertos, J. L. Subiza,
J. A. López García-Asenjo, I. Brú: The universal
dynamics of tumor growth, Biophys. J. 85, 2948
(2003).
[3] A. Brú, S. Albertos, J. A. López García-Asenjo, I. Brú:
Pinning of tumoral growth by enhancement of the
immune response, Phys. Rev. Lett. 92, 238101-1
(2004).
[4] A.-L. Barabási, H. E. Stanley: Fractal Concepts
in Surface Growth, Cambridge University Press,
Cambridge, 1995.
[5] J. M. López, M. A. Rodríguez, R. Cuerno: Power
spectrum scaling in anomalous kinetic roughening
of surfaces, Physica A 246, 329 (1997).
[6] J. M. López, M. A. Rodríguez: Interface dynamics at
the depinning transition, J. Phys. I 7, 1191 (1997).
[7] A. Brú, S. Albertos, F. Garcia-Hoz, I. Brú: Regulation
of Neutrophilia by Granulocyte Colony-stimulating
Factor: A new cancer therapy that reversed a case of
terminal hepatocellular carcinoma, J. of Clinical
Research 8, 9 (2005).