Makromolekuly v BS

Martin
Potocký
Buněčná
stěna
rostlin
Obsah
• Buněčná stěna jako integrální část rostlinné
buňky
• Sacharidy jako základní stavební složky BS
• Makromolekuly v BS
• Struktura buněčné stěny, typy
• Biosyntéza BS
• Buněčný růst a BS
• Diferenciace buněk, primární a sekundární BS
• Buněčná stěna lépe vystihuje svébytnost suchozemských rostlin
než plastidy a fotosyntéza.
• Je aspektem celé rostlinné buňky, ani syntéza celulózy se nedá
pojmout jako jednoduchá enzymatická reakce.
Funkce buněčné stěny
• Určuje vnější tvar a růst buňky
• Tvoří mechanické struktury v rámci celé rostliny
• Podílí se na funkční specializaci buněk a vývoji rostliny
• Tvoří ochranu před prostředím a patogeny
• Slouží jako zásobárna
• Zprostředkovává komunikaci – mezibuněčnou i z okolí dovnitř
buňky
• Účastní se rozpoznávání vlastní/cizí
Buněčná stěna je živá organela!
(většinou)‫‏‬
Od Roberta Hooka
k "atomic force
microscopy"
Složky buněčné stěny
• Polysacharidy
• Kalóza
• Celulóza
• Hemicelulózy (zvl. XyG a GAX, MGL)‫‏‬
• Pektiny (HG, RG-I a -II)‫‏‬
• Proteiny
• Extensiny, expansiny, AGPs, GRPs, PRPs
• Endoglukanasy, XET/XTH
Obsah
• Buněčná stěna jako integrální část rostlinné
buňky
• Sacharidy jako základní stavební složky BS
• Makromolekuly v BS
• Struktura buněčné stěny, typy
• Biosyntéza BS
• Buněčný růst a BS
• Diferenciace buněk, primární a sekundární BS
Stavební kameny stěny
C1 – anomerní uhlík (karbonyl)‫‏‬
Maltóza je redukující c.
Sacharóza je neredukjící c.
uridin di-fosfo glukóza = UDPG
Sukróza syntáza – dodává UDPG
pro syntézu celulózy i kalózy
Nejhojnější monosacharidy BS
G
X
L
F
A
maltosa (vazba α 1-4) (škrob)‫‏‬
cellobiosa (vazba β 1-4) (celulóza)‫‏‬
laminaribiosa (vazba β 1-3) (kalóza)‫‏‬
Obsah
• Buněčná stěna jako integrální část rostlinné
buňky
• Sacharidy jako základní stavební složky BS
• Makromolekuly v BS
• Struktura buněčné stěny, typy
• Biosyntéza BS
• Buněčný růst a BS
• Diferenciace buněk, primární a sekundární BS
Složky buněčné stěny
• Polysacharidy
• Kalóza
• Celulóza
• Hemicelulózy (zvl. XyG a GAX, MGL)‫‏‬
• Pektiny (HG, RG-I a -II)‫‏‬
• Proteiny
• Extensiny, expansiny, AGPs, GRPs, PRPs
• Endoglukanasy, XET/XTH
“Typická” buněčná stěna
Lokalizace syntézy složek buněčné stěny
kalóza
celulóza
zbytek stěn.
polymerů
Kalóza Zrození stěny
-1,3-glukan
• Tvoří se při poranění
• Při infekci patogenem
• Důležitá součást BS pylu
• Při cytokinezi se ukládá do rostoucí (nezralé) buněčné přepážky
FRAGMOPLAST = mikroskopická struktura vznikající při buněčném dělení rostlin
FRAGMOPLAST
The Arabidopsis Exocyst Complex Is
Involved in Cytokinesis
and Cell Plate Maturation
Fendrych M, Synek L, Pecenková T, Toupalová
H, Cole R, Drdová E, Nebesárová J, Sedinová
M, Hála M, Fowler JE, Zársky V
Plant Cell. 2010 Sep 24. [Epub ahead of print]
Figure 7. SEC6 and SEC8 Localize to the Cell Plate and Postcytokinetic
Wall.
(A) and (B) Time series showing SEC6-GFP (A) and GFP-SEC8 (B)
localization during cytokinesis of root meristem cells stained with FM464. Arrow denotes strong association of both proteins with the new cell
plate. Arrowhead points to cell plate insertion site labeled by SEC6-GFP
and GFP-SEC8. Single confocal laser scanning microscopy sections.
(C) The initial flash of SEC6-GFP signal (see text) is marked with an
arrow. Arrowhead points to SEC6-GFP postcytokinetic wall signal. The
position of the cell is indicated with red lines, three-dimensional reconstruction
of CLSM sections taken in a time series, slanted backwards.
Bars = 5 um.
Celulóza
• Celulóza je nejrozšířenějším bio-polymerem na zeměkouli.
• Který je druhý?
• A třetí??
Mikrofibrila
celulózy
základní stavební
prvek
- asi 3 nm silná
- je tvořena 18 nebo
36 individuálními
řetězci (STÁLE
NEJASNÉ!)
- může při počtu 14
000 glc jednotek
dosáhnout délky
7um.
Hemicelulózy
• Xyloglukany = I
• Glukuronoarabinoxylany = II
Xyloglukan (XG) - 1.
(fukogalakto) xyloglukan
Glukuronoarabinoxylany (GAX)
k.ferulová
Xyloglukan (XG) -Poales
Mixed-linkage (1→3),(1→4)-ß-D-glucan
PEKTINY
• Homogalakturonan (HG)
• Rhamnogalakturonan I (RGI)
• Rhamnogalakturonan II (RGII)
Pektin – homogalacturonan (HGA)
Ca2+ cross-link
Zvýšená hustota vápenatých můstků – vetší tuhost stěny
Pektin
Rhamnogalakturonan
RG-I
Pektin
Rhamnogalakturonan
RG-II
nejvíce kombinací
borátový cross-link (viz.
Dále)
Rhamnogalakturonan RG-II
borátový cross-link
Borátový diester – přes apiózu
Pektiny
Pektiny ve stěně mohou být kovalentně propojeny.
Pektinová matrix ustavuje
velikost „pórů“ ve stěně
Metody chemické analýzy b. stěny - mimořádně náročné
= Poměrné zast. cukrů.
Při analýze struktuty polysach. jsou nejprve modif. volné –OH
skupiny – methyljodidem.
Dnes je velmi populární
neinvazivní Fourierova
transformační
infračervená (FTIR)
mikrospektroskopie,
která je schopna
kvantitativně detekovat
řadu substituentů (př.
karboxyl.kys., estery,
fenoly, amidy…)
Je možné použít
monoklonální protilátky
rozpoznávající
specifické
(poly)sacharidové
antigeny
Stěnové strukturní bílkoviny
HRGPs; hydroxyprolin bohaté glykoproteiny)




AGPs (“Arabinogalactan Proteins” =
Arabinoproteoglykany)‫‏‬
Extensiny
PRPs (prolin bohaté proteiny)
GRPs (glycin bohaté proteiny)

Extensiny
příb. AGP (dále)‫‏‬
Odstranění arabinos z extensinu
(kambium)
vede ke ztrátě tyčinkovitého tvaru.
Prolinem bohaté bílkoviny
(xylem, kortex)
!
Glycinem bohaté bílkoviny
(primární xylem a floem)
Glycin Rich Prot.
Odstranění arabinos z extensinu
vede ke ztrátě tyčinkovitého tvaru.
Prolinem bohaté b.
Glycinem bohaté bílkoviny
!
Většinou zakotveny GPI
kotvou v membráně
(modifikace probíhá v ER katalyzována
transamidázou; po odštěpení peptidu na Ckonci je připojena
glykosylfosfatidylinositolová kotva inositolový ifosfolipid, s oligosacharidem
substituovaným fosfoethanolaminem)
jako inhibitor vážící AGP -Yariv reagent
(-D-gal)3
AGP kotví v membráně pomocí
GPI
Převážnou část molekuly
tvoří (poly)sacharidy
Funkce nejasná –
(lepidla, lubrikanty nebo
role v mezibuněčném rozpoznávání?
AGP kotví v membráně pomocí GPI
GRP mohou tvořit -list
– GRP - důležití nositelé mechanických
zátěží ve stěně ve zralém (tj. postapoptotickém) xylému.
Obsah
• Buněčná stěna jako integrální část rostlinné
buňky
• Sacharidy jako základní stavební složky BS
• Makromolekuly v BS
• Struktura buněčné stěny, typy
• Biosyntéza BS
• Buněčný růst a BS
• Diferenciace buněk, primární a sekundární BS
Co všechno tam je?
a jak uspořádané??
TEM - Příčný řez ukazující
kontakt dvou buněk
SEM – pohled “zezdola”
na uspořádání mikrofibril
Primary cell wall architecture
• There are two basic types of primary cell wall
• Type I
– Dicots and all flowering plants
• Type II
– Found in the monocot grass families
• Vary in structural make up and classes of
polysaccharide components present.
• NOT TO BE CONFUSED WITH SECONDARY CELL
WALLS
Type I cell walls
• Cellulose:
– Cellulosic microfibrils are
between 5 and 12 nm in
diameter spaced 20 to 40 nm
apart.
– There is room to house
approximately four layers, or
lamellae, of parallel-running
cellulosic microfibrils
between the plasma
membrane and middle
lamella.
Type I cell walls
• Cross linking glucans:
– The main one is xyloglucan
with molecular lengths of up
to 400 nm.
– These xyloglucans hydrogenbond to two or more
microfibrils to form a
network, as well as coating
the surface of the microfibril.
.
Type I cell walls
• Pectin Matrix:
– Made up of HGA, RG-I with
various side chains, and RG-II.
– Roughly the same amount of
methyl esterified & unesterified
HGA found throughout this
type of wall
– The junction zones contain
calcium cross-links
• Located mostly in the middle
lamella
– RG-II borate diesters are also
present in low levels in type I
plant cell walls.
Type II cell walls
• Cellulose:
– The same as in type-I walls.
• Cross linking glucans
– Small amounts of xyloglucan
bind to the cellulose microfibrils,
however GAXs are the principal
polymers which interlock the
microfibrils.
– Significant proportions of GAX
and xyloglucan bind to each other
or to the cellulose microfibrils via
hydrogen bonding.
– GAXs are also cross-linked in
walls by both esterified and
etherified phenolic substances.
Type II cell walls
• Pectin:
– Contain very little pectin.
Chemically these pectins are
composed of both HGA and RG,
but a highly substituted (HS)GAX is closely associated with
these pectins.
.
Obsah
• Buněčná stěna jako integrální část rostlinné
buňky
• Sacharidy jako základní stavební složky BS
• Makromolekuly v BS
• Struktura buněčné stěny, typy
• Biosyntéza BS
• Buněčný růst a BS
• Diferenciace buněk, primární a sekundární BS
Biosynéza celulózy
Celulóza syntáza
terminální komplex
Komplex transmembránových proteinů
6 podjednotek
+ asociované proteiny
Pohled na horní stranu
cytoplasmatické mmebrány
b. kořene kukuřice
6x6
8xTM
Terminální komplexy
Celulosa syntázy
10x u A.t.
MUTANTY např.
root swelling (rsw1) - CesA1
procruste
- CesA6
produkují méně celulosy
mikrofibrily jsou disorganizovány
miniaturní rostlinky
root swelling (rsw1)
CesA je konzervovný protein
Vedle CesA podjednotek je
důležitá pro syntézu celulózy
také endoglukanasa/celuláza
KORRIGAN
a další dosud neznámé bílkoviny
např. COBRA, KOBITO, RIC
SuSy
Pro fungování TK je třeba tří různých paralogů/podjednotek CESA.
CESA 1,3 a 2/6 (I)– primární stěna
CESA 4,7 a 8 (II)vysoce transkripčně
koordinovány – sekundární stěna.
Kortikální MT orientují ukládání mikrofibril celulosy
Kolokalizace MT s
mikrofibrilou
ASOCIACE Terminalního komplexu a mikrotubulů nejasná...
Jednou z možností jak interaguje (a „drží“ se) TK mikrotubulu je
konformace spojená s torzním tlakem při syntéze mikrofibrily.
Roli hrají pravděpodobně také některé kinesiny – MTs motory
mor1 - 215kDa MAP
u ts mutanta se v restriktivní
teplotě rozpadají kortikální MT a
dochází ke ztrátě polarity, ale
mikrofibrily orientovány jako u
WT.
• mor1 byl popsán nezávisle jako gem1
• mutace která vede k symetrickému dělení
buněk při mikrosporové=1. pylové mitóze.
Mikrotubuly u
WT
mor1
...ale nejen celulosa je důležitá pro správné fungování
buněčné stěny...
Např. mutant mur1 který neumí syntetizovat fukosu
v buňkách kořene – demostrace významu pektinu
pro buň stěnu.
Kalosa syntázy
CalS je blízce příbuzná -1,3,glukan syntáze kvasinky
– 12 x CalS isozymů v
Arabidopsis
Role kalózy
Kalóza při rozmnožování
Také meiocyty obaleny
kalózou - tetrády
Syntéza hemicelulos
Syntetizují CSL hemiceluózy podobně jako
CESA celuózu?
• CslA je glukomannansyntáza
• CslF a CslH syntetizuji „mixed
linkage glucan“
• CslC pravděpodobně backbone XyG
(anebo „bežící pás“
glykosyltransferáz?

Xylan asi syntetizován
glykosyltransferázami z rodiny GT43
Obsah
• Buněčná stěna jako integrální část rostlinné
buňky
• Sacharidy jako základní stavební složky BS
• Makromolekuly v BS
• Struktura buněčné stěny, typy
• Biosyntéza BS
• Buněčný růst a BS
• Diferenciace buněk, primární a sekundární BS
http://home.ueb.cas.cz/potocky/BUNKA
Jak to může fungovat všechno
najedou?
Modes of (plant) cell growth
isodiametric
expansion
polar growth
even cytokinesis
can be viewed as a special
case‫‏‬of‫„‏‬growth“
tip growth
Musí fungovat metabolická koordinace mezi syntézou celulózy a
syntézou a sekrecí! necelulózních složek buněčné stěny!
(A) Orientace mikrofibril se ve stěně během ukládání dalších
vrstev a růstu mění – pův. představa o pasivním natahování (B)
během dlouživého růstu vzniká ve stěně velké tangenciální napětí
(t), které roste příp. až k několika stovkám MPa, při turgoru
1MPa (C) názorný model pružiny
Orientace kortikálních mikrotubulů je řízena
vývojovými signály a sama reguluje směr růstu
buněk
Modré světlo
XET/XTH
xyloglukan
endotransglykosylasy/
hydrolasy
a
EXPANSINY
• Expansiny jsou aktivovány snížením pH a hrají klíčovou roli v tzv.
kyselém růstu indukovaném auxinem.
(IAA aktivuje H+-P-ATPázy)‫‏‬
Stěnové XET/XTH –
endotransglykosylázy/hydrolázy
• Nemění poměr mezi obsahem celulózy a XG.
• Pevnost a roztažnost zůstávají zachovány.
• Zřejmně zvyšují pevnostní vlastnosti stěny (stále nejasné)
Komplementarita účinků expansinů
a XET.
• Expansiny oslabují uniaxiální pevnost, ale XET ne.
• XET katalyzují roztahování/přeskupování stěnové sítě zatímco
expansiny ne.
• Proto často obě aktivity kolokalizují v místech růstu.
Stěnové hydrolázy – endoglukanázy
(celulázy)‫‏‬
• Hydrolyzují nekrystalické frakce celulózních
fibril a mění chemické složení stěny – možná
uvolňují xyloglukany zapletené do fibril
XET/XTH
xyloglukan
endotransglykosylasy/
hydrolasy
a
EXPANSINY
“Zacementování” BS po skončení
růstu
• Type I BS
– extensiny a jiné HRGPs
– deesterifikace pektinů PME
• Type II BS
– Thr bohaté proteiny
– cross-linking fenolických látek
Hydroxylové radikály (.OH)
vznikající ve stěně činností PRX a
O2 a NADH, Fentonovou reakcí
(Fe2+ a H2O2 =ROS) případně v
NOX, mohou neenzymaticky
štěpit stěnové polysacharidy – XG a
pektiny.
STÁLE NEJASNÉ !!!!!
• Apikální růst
Pylové láčky mají rostoucí špičku
tvořenou převážně metylovanými
pektiny.
V oblasti pod špičkou dochází k deesterifikaci
(demetylaci) a pektiny jsou křížově propojovány (cross-link)
Ca2+.
kalóza
celulóza
Pylová láčka a metylace pektinů
oba začínají až za špičkou
PME
JIM5
JIM7
JIM5
u g-i jsou pektiny na špičce demetylovány přidáním PME
JIM5 – deesterif. kys. p. ; JIM7 – metyl-esterifikované p.
B. stěna jako senzor mechanických
poměrů v buňce a okolí
WAKs = interakce a signalizace buněčné
stěny s plasmatickou membránou
Wall Associated Kinases
Obsah
• Buněčná stěna jako integrální část rostlinné
buňky
• Sacharidy jako základní stavební složky BS
• Makromolekuly v BS
• Struktura buněčné stěny, typy
• Biosyntéza BS
• Buněčný růst a BS
• Diferenciace buněk, sekundární BS, obrana
• Buněčná diferenciace u rostlin = velmi často
diferenciace ve složení b. stěny.
Asymetrické b. dělení – JIM8+ b. produkují pravděp.
oligosach. signál uvolňovaný z AGPs. Kondiciované médium
stačí k indukci u JIM8- buněk.
AGP spec. pro kortex
AGP spec. pro vaskul.a epid.
zel.: Met-pektin
žlut.:deesterif.pekt.
OVES kořen – A a B
Arabidopsis stonek – C, různě modifikované pektiny v téže buňce.
Buňky mají na svém povrchu
specializované mikrodomény
Buněčné Stěny =CW
• Př. Epidermální buňka
Povrch listu
Vnitřek listu
Rozdíly v
metabolismu
pektinů působí
rozdíly tuhosti
plodů
Polygalakturonázy
a pektolyázy
Galaktomanany slouží jako
zásobní polysacharidy ve stěnách
endospermu – př. luštěniny, datle
Sekundární buněčná stěna
Evolution of
plant cell walls
Model diferenciace xylemu in vitro u r. Zinnia
Různé tvary sekundárních tloustnutí
Lignin
Phenylpropanoidní metabolismus vedoucí ke vzniku monolignolů – pkumaryl alkoholu, koniferyl alkoholu, a sinapyl alkoholu.
Hydroxyfenyl
Lignin (H)
Guaiacyl lignin
(G)
Syringyl lignin (S)
Barvení kyselým fuchsinem(A),
phloroglucinolem(B,C) a Mäuleovým
činidlem (D,E) na lignin.
Syringyl lignin
Guaiacyl lignin
Ligning je komplexní struktura
(mnoho možností polymerace)
Stěnový cross-linking
Lignifikace v obraně
Colletotrichum atakuje b. kukuřice obranná papila akum. kalosu a lignin.
Důležitá
úloha
aktinu!
Caspariho proužky – impermeabilní bariera v
buněčné stěně - SUBERIN
Suberin
• KUTIKULA
• Hydrofobní kabát většiny nadzemních orgánů rostlin
• 2 základní složky - cutin (hydrofobní polymer z modifikovaných
VLCFA)
- epikutilární vosky
Kutikula

Zabraňuje nekontrolovanému průchodu vody, solutů a plynů

Zabraňuje vazbě nežádoucích látek



Chrání před UV radiací, napadením patogena a herbivora a
mechanickým poškozením
Pravděpodobně se účastní tvorby a distribuce signálů důležitých
pro vývoj orgánů (mutanti často fůzované orgány dohromady)
Pravděpodobně se účastní tvorby a distribuce signálů důležitých
pro interakci patogen-hostitel
SUDAN III
značení radioakt.
mastnými kyselinami!!
Kutikula – lipoidní polyester - Lipofilní polyalifatický.
Origin of Leaf Hydrophobicity
Cause: Waxy Outer Layer and Surface Roughness
•Wax Crystals on Epidermal Cells :Crystal Density determines
actual hydrophobicity.
•Long hair like structures (trichomes) and bumpy protrusions
induce surface roughness.
Effect: Nature’s Self Cleaning Mechanism
•Dirt particles (spores, disease fungi) adhere more strongly
to water than the leaf and are consequently washed away.
•Lack of water on surface prevents disease organisms from
germinating and growing as they cannot survive.
Prekurzory kutikuly jsou na povrch
epidermis „pumpovány“ ABC
transportery.
Suberinizace
Primárně v endodermis a exodermis kořene,
Caspariho proužcích a semených obalech
Suberin ukládán dovnitř buňky –
odděluje buněčnou stěnu od plasmatické membrány
Kutikula vs. suberin