TregFlowEx® Kit

TregFlowEx® Kit
(50 tests / testů / testov)
h
ED7417
of light from each fluorochrome on individual cells is collected
and analyzed by a flow cytometer.
ENGLISH
1. Manufacturer
5. Precautions
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz






2. Intended use
The TregFlowEx® Kit is designed for the detection of regulatory
T cells (CD4+CD25+FOXP3+ cells) in human peripheral blood or
human umbilical cord blood using flow cytometry.

Intended for research use only.
The flow cytometer should be calibrated on a routine basis
using fluorescent microbeads to ensure stable sensitivity
of detectors.
Do not use reagents after expiration date stated on vial
labels.
Avoid prolonged exposure of the reagents to light.
Avoid contamination of the reagents.
Any non-performance of assay procedure may produce
false results.
Human blood samples are considered as potentially
infectious and must be handled with care.
Warning: Fix and Lysing Solution component (ED7417-1)
contains diethylene glycol; methanol and formaldehyde.
3. Introduction
DANGER
Regulatory T-cells (Treg cells) are a subset of lymphocytes that
have immune suppressive properties and play a critical role in
the maintenance of self-tolerance. Their regulatory function
leads to protection of tissues from collateral damage triggered
by immune responses against microbes and allergens, they
facilitate maternal tolerance to allogeneic fetus during
pregnancy and maintain homeostasis with commensal
microbiota [1].
Tregs are usually characterized as CD4+ CD25high T-cells
expressing forkhead box transcription factor (FOXP3). Such
phenotype is found in 5-12% of human peripheral blood CD4+
T-cells [2]. Tregs can be further distinguished into the so-called
“natural” Tregs originating in thymus (tTreg cells) and the
peripherally induced Tregs (pTreg cells) [3]. The discrimination
between tTregs and pTregs is still disputable and several
markers were proposed to be the tTreg unique features: the
expression of Helios transcription factor and the expression of
Neutropilin-1, a receptor for members of the vascular
endothelial growth factor family [4].
H phrases
H302+312+332:Harmful if swallowed, in contact with skin or if
inhaled.
H315: Causes skin irritation.
H317: May cause an allergic skin reaction
H319 Causes serious eye irritation.
H335 May cause respiratory irritation.
H351 Suspected of causing cancer
H371 May cause damage to organs.
H373 May cause damage to organs (kidney) through
prolonged or repeated exposure if swallowed.
P phrases
P270 Do not eat, drink or smoke when using this product.
P280 Wear protective gloves / protective clothing / eye
protection / face protection.
P301+P312: IF SWALLOWED: Call a POISON Center or
doctor/physician if you feel unwell.
P302+P352: IF ON SKIN: Wash with plenty of soap and water.
P305+P351 + P338: IF IN EYES: Rinse cautiously with water
for several minutes. Remove contact lenses, if present
and easy to do. Continue rinsing.
4. Principle
This test is based on combined cell surface and intracellular
detection of CD4, CD25 and FOXP3 proteins that are
characteristic for the phenotype of regulatory T cells.
Blood samples are initially stained with a mixture of anti-CD4
(fluorescein labelled) and anti-CD25 (R-phycoerythrin labelled)
monoclonal antibodies which specifically bind to the antigenic
determinants expressed on the surface of leukocytes. Specific
staining of blood cells is followed by lysis of red blood cells.
Afterwards, leukocytes are permeabilized and stained with
monoclonal antibody against FOXP3 protein (allophycocyanine
labelled). The fluorochromes attached to the monoclonal
antibodies are excited by appropriate laser beam and emission
Refer to the TregFlowEx® Safety Data Sheet (SDS) for further
details.
1/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106
diluted solution is needed per reaction) and store the diluted
solution at 2-8 °C. The diluted solution is stable for 1 month.
6. Reagents provided





ED7417-1 Fix and Lysing Solution – 1 vial containing
10 ml of 10x concentrated reagent.
ED7417-2 Permeabilizing Solution – 1 vial containing
25 ml of reagent, ready-to-use.
ED7417-3 Blocking Buffer – 1 vial containing 2.5 ml of
reagent, ready-to-use.
ED7417-4 CD4 FITC/CD25 PE – 1 vial containing 0.50 ml
of cell surface staining reagent, a mixture of mouse
monoclonal antibody against CD4, FITC labelled (clone
MEM-241, isotype IgG1) and antibody against CD25, RPE labelled (clone MEM-181, isotype IgG1.
ED7417-5 FOXP3 APC – 1 vial containing 0.25 ml of
monoclonal antibody against FOXP3, APC labelled (clone
3G3, isotype IgG1).

Permeabilization Solution (ED7417-2)
Bring Permeabilization Solution to room temperature. Check for
SDS precipitation and if necessary, dissolve the SDS by
warming the vial to 37°C. Afterwards store the Permeabilizing
Solution at room temperature (15-25 °C). Storage at room
temperature does not affect its shelf life.

PBS buffer
Prepare PBS buffer according to recipe below (other recipes
may apply).
Dissolve:
8.0 g of Sodium Chloride (NaCl)
0.2 g of Potassium Chloride (KCl)
2.0 g of Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)
1.42 g of Sodium Phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4•2H2O)
in 800 ml of deionized H2O.
Adjust the pH to 7.4 with HCl.
Add deionized H2O to 1 liter.
Sterilize by autoclaving for 20 minutes at 15 psi or by filter
sterilization.
Store at 2 - 8 °C.
7. Storage
Store the TregFlowEx® Kit at 2-8 °C. Expiration date is stated
on vial labels and on the box.
8. Evidence of deterioration

1% formaldehyde in PBS
Prepare 1% formaldehyde in PBS buffer by mixing 1 part of
methanol stabilized 37% formaldehyde solution from SigmaAldrich (Cat. No. F1635) and 36 parts of PBS buffer.
Store at 2 - 8 °C. The solution is stable for 1 month.
Warning: The concentrated formaldehyde solution is classified
as acutely toxic substance. Refer to the safety precautions
provided by your formaldehyde supplier.
In case of reagent deterioration or if data obtained show any
performance alteration, please contact manufacturer using
following e-mail address: [email protected]
9. Necessary material not supplied









Suitable 5ml test tubes for blood staining
(e.g. 12 × 75 mm)
PBS buffer
Automatic pipettes with disposable tips
Vortex mixer
Refrigerated centrifuge with rotor suitable for test tubes
Flow cytometer - blue laser excitation at 488 nm, red laser
excitation at 633 nm and proper emission filters
1% formaldehyde solution in PBS
Liquid waste container with appropriate disinfectant
Pasteur pipettes and vacuum source for aspiration of
supernatants from test tubes
Surface antigen staining
1.
Add 10 l of CD4 FITC/CD25 PE antibody cocktail per
tube.
2.
3.
Add 100 l of human blood.
Mix well and incubate for 10 minutes in the dark in the
refrigerator (2−8 °C).
Wash cells by adding 2 ml of cold PBS buffer and
centrifuge at 300 g for 5 minutes at 4 °C. Aspirate
supernatant completely.
Proceed immediately to intracellular antigen staining.
4.
5.
10. Specimen
Human blood or human umbilical cord blood
Blood samples should be collected into tubes containing
anticoagulant, e.g. EDTA, citrate or heparin. It is recommended
to use freshly withdrawn samples. Cell viability decreases in
time after collection and may directly influence results due to
possible loss of specific cell subsets. A non-specific binding of
monoclonal antibody reagents to non-viable cells occurs and
may negatively influence test results. Store the blood samples
at room temperature.
Warning: Human biological samples and blood specimens and
any materials coming into contact with them are always
considered as biohazard.
Intracellular antigen staining
6. Add 1 ml of cold Fix and Lysing Solution (the 10x
diluted solution).
7. Mix well and incubate for 10 minutes in the dark in the
refrigerator (2−8 °C).
8. Add 0.5 ml of room temperature Permeabilizing
Solution.
9. Mix well and incubate for 10 minutes in the dark in the
refrigerator (2−8 °C).
10. Centrifuge the cells for 5 minutes at 400 g at 4°C.
(Do not add wash buffer to the Fix/Perm mixture)
11. Remove (decant) supernatant.
11. Assay procedure
12. Add 50 L of cold Blocking Buffer.
Reagents preparation

Fix and Lysing Solution (ED7417-1)
Fix and Lysing Solution is provided as 10x concentrated
solution that needs to be diluted with deionized water. Dilute
only the necessary amount of the concentrate (1 ml of the
13. Add 50 L of cold PBS buffer.
14. Mix well and incubate for 5 minutes in the dark in the
refrigerator (2−8 °C).
15. Add 5 μl of FoxP3 APC antibody.
16. Mix well and incubate for 30 minutes in the dark in the
refrigerator (2−8 °C).
2/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106
17. Wash cells twice by adding 2 ml of cold PBS buffer and
centrifuge at 400 g for 5 minutes at 4 °C. Aspirate/decant
supernatant completely.
15. Trademarks
FlowEx® is a registered trademark of EXBIO Praha.
18. Add 300 l of 1% formaldehyde in PBS.
Store the stained samples at 2−8 °C until measured in flow
cytometer. Analyze the processed samples within 4 hours.
12. Flow cytometry
Analyze the stained samples using flow cytometer equipped
with the 488 nm and 633 nm excitation lasers and an
appropriate filter set-up.
Refer to your cytometer specifications to identify the detectors
in which the fluorescence of the stained cells will be collected.
Set the voltage on light scatter detectors, forward angle light
scatter (FSC) and side (perpendicular) light scatter (SSC) so
that the events of interest are on scale.
Set the threshold on FSC so that only cells of interest are
recorded and most of the debris excluded.
Set the voltage on fluorescence detectors so that all measured
events are on scale.
Acquire at least 20 000 – 30 000 CD4+ lymphocytes per
sample.
Acquire data using software intended for sample analysis
supplied with cytometer.
13. Data analysis
Leukocyte scatter plot
Visualize measured data as a dot-plot, where forward-scatter
(FSC) is on the X-axis and side-scatter (SSC) is on the Y-axis
(Figure 1). Set the target cell population (lymphocytes) gate and
threshold in a similar way (Figure 1). Then visualize events from
the lymphocyte gate as a dot-plot, where the X-axis represents
forward-scatter area (FSC-A) and the Y-axis represents
forward-scatter height (FSC-H). Separate the singlets using a
diagonal gate (Figure 2).
CD4+ T cells
Visualize the lymphocyte singlets as a dot-plot, where X-axis
represents fluorescence intensity in FITC detector and the Yaxis represents side-scatter (SSC) (Figure 3). Carefully set the
gate around CD4+ lymphocytes.
CD4+CD25+FOXP3+ Treg cells
Visualize CD4+ lymphocytes as a dot-plot, where the X-axis
represents the FOXP3 signal (fluorescence intensity in APC
fluorescence detector) and the Y axis represents CD25 signal
(fluorescence intensity in PE fluorescence detector). Place the
gate that separates the CD4+CD25+FOXP3+events (Figure 4).
Use appropriate controls (APC- and PE-labelled isotype
antibodies) to set the discrimination lines correctly.
14. Limitations


Composition of components was optimized to offer the
best specific signal/non-specific signal ratio. Therefore, it
is important to adhere to the reagent volume/sample
volume ratio in every test.
Flow cytometer may produce false results if the device
has not been aligned and maintained appropriately.
3/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106

ČESKY
1. Výrobce

EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz
Nedodržení doporučeného postupu analýzy může ovlivnit
výsledky testů.
Vzorky lidské krve jsou považovány za potenciálně
infekční materiál, a proto s nimi musí být náležitě
nakládáno.
Varování: reagencie Fix and Lysing Solution
obsahuje formaldehyd, metanol a diethylenglykol.
(ED7417-1)
Nebezpečí
2. Použití soupravy
TregFlowEx® Kit je určen pro detekci regulačních T-lymfocytů
(CD4+ CD25+ FOXP3+ buněk) v periferní lidské krvi nebo lidské
pupečníkové krvi metodou průtokové cytometrie.
H-věty
H302+H312+H332: Zdraví škodlivý při požití, při styku s kůží
a při vdechování.
H315: Dráždí kůži.
H317: Může vyvolat alergickou kožní reakci.
H319: Způsobuje vážné podráždění očí.
H335: Může způsobit podráždění dýchacích cest.
H351: Podezření na vyvolání rakoviny.
H371: Může způsobit poškození orgánů.
H373: Může způsobit poškození ledvin při prodloužené nebo
opakované expozici.
3. Úvod
Regulační T-lymfocyty (Treg) jsou podskupinou lymfocytů, které
se vyznačují imunosupresivními vlastnostmi a hrají zásadní roli
při udržování autotolerance. Jejich regulační působení vede k
ochraně tkání před poškozením, které by provázelo, jako
vedlejší efekt, imunitní reakce namířené proti infekčním agens a
alergenům, umožňují toleranci allogenního plodu matkou
během těhotenství a udržují homeostázu s komenzálními
mikroorganismy [1].
Zpravidla jsou jako Treg označovány CD4+CD25high T-lymfocyty
exprimující transkripční faktor FOXP3. Buňky s tímto fenotypem
tvoří v lidské periferní krvi 5-12% z CD4+ T-lymfocytů [2]. Mezi
Treg buňkami lze dále odlišovat tzv. „přirozené“ Treg buňky,
vznikající v thymu (nazývané zkráceně tTreg), a Treg buňky
indukované v periferii (nazývané zkráceně pTreg) [3]. Odlišení
tTreg od pTreg lymfocytů pomocí specifických antigenů není
ujednoceno. Několik markerů bylo navrženo jako jedinečných
pro identifikaci tTreg lymfocytů: exprese transkripčního faktoru
Helios a exprese Neutropilinu-1, receptoru pro proteiny z rodiny
vaskulárního endotheliálního růstového faktoru [4].
P-věty
P270: Při používání tohoto výrobku nejezte, nepijte ani nekuřte.
P280: Používejte ochranné rukavice/ochranný oděv/ochranné
brýle/obličejový štít.
P301+312: PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte
TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo
lékaře.
P302+352: PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím
vody a mýdlem.
P305+351+338: PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně
vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li
nasazeny, a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve
vyplachování.
P501:Odstraňte obsah/obal v autorizovaném místě sběru
nebezpečných odpadů.
4. Princip
6. Obsah soupravy
Test je založen na kombinované detekci povrchových a
intracelulárních proteinů CD4, CD25 a FOXP3, které jsou
charakteristické pro regulační T-lymfocyty.
Vzorky krve jsou nejprve obarveny pomocí směsi
monoklonálních protilátek anti-CD4 (značená fluoresceinem a
anti-CD25 (značená R-phycoerythrinem), ty se specificky váží
na antigenní determinanty exprimované na povrchu leukocytů.
Po specifickém obarvení krevních buněk následuje lyze
erytrocytů. Následně jsou leukocyty permeabilizovány a
obarveny monoklonální protilátkou proti FOXP3 (značená
allophycocyaninem). Fluorochromy navázané na monoklonální
protilátky jsou excitovány laserovým paprskem a emisní světlo
excitovaných fluorochromů z jednotlivých buněk je zachyceno a
analyzováno v průtokovém cytometru.





5. Upozornění





Výrobek je určen pouze pro výzkumné účely.
Průtokový cytometr pravidelně kalibrujte pomocí
fluorescenčních kuliček, aby byla zajištěna stabilní citlivost
detektorů.
Nepoužívejte reagencie po uplynutí doby použitelnosti.
Reagencie nevystavujte dlouhodobému působení světla.
Chraňte obsah vialek před kontaminací.
ED7417-1 Fix and Lysing Solution – 1 vialka obsahující
10 ml 10x koncentrovaného roztoku.
ED7417-2 Permeabilizing Solution – 1 vialka obsahující
25 ml roztoku připraveného k použití.
ED7417-3 Blocking Buffer – 1 vialka obsahující 2,5 ml
roztoku připraveného k použití.
ED7417-4 CD4 FITC/CD25 PE – 1 vialka obsahující
0,50 ml roztoku pro obarvení povrchu buněk, jedná se o
směs myší monoklonální protilátky namířené proti CD4
označené fluoresceinem (klon MEM-241, izotyp IgG1) a
protilátky proti CD25 označené R-PE (klon MEM-181,
izotyp IgG1).
ED7417-5 FOXP3 APC – 1 vialka obsahující 0,25 ml
roztoku protilátky proti FOXP3, označené APC (klon 3G3,
izotyp IgG1).
7. Skladování soupravy
TregFlowEx® Kit skladujte při teplotě 2-8 °C. Doba použitelnosti
je vyznačena na jednotlivých reagenciích i na krabici soupravy.
4/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106

1% formaldehyd v PBS
Připravte roztok 1% formaldehydu v PBS pufru smícháním 1
dílu 37% roztoku formaldehydu (stabilizovaného methanolem)
od Sigma-Aldrich (Kat. č. F1635) a 36 dílů pufru PBS.
Skladujte při 2 - 8 °C. Roztok je stabilní 1 měsíc.
Varování: Koncentrovaný formaldehyd je akutně toxická látka.
Pro informace o zásadách bezpečnosti práce s formaldehydem
prostudujte bezpečnostní list od vašeho dodavatele
formaldehydu.
8. Změny kvality produktu
V případě pozorování jakéhokoliv zhoršení vlastností produktu,
prosíme, neprodleně informujte výrobce prostřednictvím
e-mailové adresy: [email protected]
9. Potřebné vybavení a materiál, který není
dodáván









Vhodné 5ml zkumavky pro barvení buněk
(např. 12 × 75 mm)
PBS pufr
Sada automatických pipet s jednorázovými špičkami
Vortex
Centrifuga s rotorem pro zkumavky
Průtokový cytometr - excitace modrým laserem 488 nm,
excitace červeným laserem 633 nm a vhodné emisní filtry
Roztok 1% formaldehydu v pufru PBS
Nádoba na tekutý odpad s příslušným desinfekčním
prostředkem
Pasteurovy pipety a zdroj vakua pro odsávání
supernatantu ze zkumavek
Obarvení povrchových antigenů
1.
Napipetujte 10 l CD4 FITC/CD25 PE směsi protilátek do
zkumavek.
2.
3.
Přidejte 100 l krve.
Promíchejte a nechte inkubovat po dobu 10 minut v temnu
při teplotě 2−8 °C.
Promyjte buňky přidáním 2 ml vychlazeného pufru PBS
a centrifugujte při 300 g po dobu 5 minut při 4 °C. Odsajte
supernatant pomocí Pasteurovy pipety do lahve s
desinfekcí.
Pokračujte intracelulárním barvením.
4.
5.
10. Testovaný vzorek
Intracelulární barvení antigenů
6. Přidejte 1 ml vychlazeného Fix and Lysing Solution
(naředěného roztoku).
7. Promíchejte a nechte inkubovat po dobu 10 minut v temnu
při teplotě 2−8 °C.
8. Přidejte
0,5
ml
Permeabilizing
Solution
vytemperovaného na laboratorní teplotu.
9. Promíchejte a nechte inkubovat po dobu 10 minut v temnu
při teplotě 2−8 °C.
10. Centrifugujte buňky při 400 g po dobu 5 minut při 4°C.
(Nepřidávejte pufr PBS k fixačně permeabilizační směsi)
11. Odstraňte (slijte) supernatant.
Lidská krev anebo lidská pupečníková krev
Vzorky krve by měly být odebírány do zkumavek obsahujících
antikoagulans, např. EDTA, citrát nebo heparin. Doporučujeme
používat čerstvě odebrané vzorky. Úměrně časové prodlevě po
odebrání vzorku krve klesá životnost buněk a pokles životnosti
může způsobit ztrátu vybraných buněčných subpopulací, a tím
ovlivnit výsledky testu. Mrtvé buňky nespecificky váží
monoklonální protilátky používané k obarvení buněk, to může
mít negativní vliv na výsledky testu. Vzorky skladujte při
laboratorní teplotě.
11. Postup testu
12. Přidejte 50 L vychlazeného Blocking Buffer.
Příprava reagencií

Fix and Lysing Solution (ED7417-1)
Fix and Lysing Solution je dodáván jako 10x koncentrovaný
roztok, který je třeba naředit před použitím deionizovanou
vodou. Nařeďte jen potřebné množství koncentrátu (1ml
naředěného roztoku na reakci) a skladujte naředěný roztok při
teplotě 2-8 °C. Naředěný roztok je stabilní 1 měsíc.
13. Přidejte 50 L vychlazeného pufru PBS.
14. Promíchejte a nechte inkubovat po dobu 5 minut v temnu
při teplotě 2−8 °C.
15. Přidejte 5 μl FoxP3 APC protilátky.
16. Promíchejte a nechte inkubovat po dobu 30 minut v temnu
při teplotě 2−8 °C.
17. Dvakrát buňky promyjte přidáním 2 ml vychlazeného
pufru PBS buffer a centrifugováním při 400 g po dobu 5
minutes při 4 °C. Odstraňte (slijte) supernatant.

Permeabilization Solution (ED7417-2)
Nechte Permeabilization Solution vytemperovat na laboratorní
teplotu. Zkontrolujte roztok, zda nedošlo k precipitaci SDS.
Nechte rozpustit precipitát zahřátím vialky na 37 °C. Po
rozpuštění skladujte Permeabilizing Solution za laboratorní
teploty (15-25 °C). Skladování roztoku za laboratorní teploty
nemá vliv na dobu použitelnosti reagencie.
18. Přidejte 300 l roztoku 1% formaldehydu v PBS pufru.
Obarvené vzorky skladujte při teplotě 2−8 °C až do analýzy
v průtokovém cytometru. Analyzujte vzorky během 4 hodin.

PBS pufr
Připravte pufr PBS podle předpisu uvedeného níže (můžete
použít i jiné předpisy přípravy PBS).
Rozpusť:
8,0 g Chloridu sodného (NaCl)
0,2 g Chloridu draselného (KCl)
2,0 g Dihydrogenfosforečnanu draselného (KH2PO4)
1,42 g Dihydrátu Hydrogenfosforečnanu sodného (Na2HPO4•2H2O)
v 800 ml deionizované vody.
Upravte pH na 7,4 pomocí HCl.
Doplňte deionizovanou vodou do 1 litru.
Sterilizujte autoklávováním při 15 psi po dobu 20 minut anebo
přefiltrujte přes filtr s póry o velikosti 0,22 m.
Skladujte při 2 - 8 °C.
5/11
12. Cytometrické měření
Analyzujte obarvené vzorky pomocí průtokového cytometru
vybaveného excitačním laserem 488 nm a 633 nm a vhodnými
filtry.
Podle specifikací cytometru určete detektory, které jsou vhodné
pro měření fluorescence obarvených buněk.
Nastavte napětí detektorů pro lineárně rozptýlené paprsky
světla (FSC) a bočně rozptýlené paprsky světla (SSC) tak, aby
cílové události spadaly do zobrazovaného rozsahu os grafu.
Nastavte prahovou hodnotu v FSC tak, aby byly
zaznamenávány pouze cílové události a odfiltrována většina
debrisu.
ED7417_EN_CZ_SK_160106
Nastavte napětí fluorescenčních detektorů tak, aby byly
všechny zaznamenávané události v zobrazovaném rozsahu os
grafů.
Nahrajte alespoň 20 000 – 30 000 CD4+ lymfocytů z každého
vzorku.
Zpracujte události pomocí softwaru dodávaného s cytometrem
určeného pro analýzu dat.
13. Analýza dat
Graf zobrazující leukocyty
Zobrazte naměřená data jako bodový graf, v němž je na ose X
vynesen signál pro lineárně rozptýlené paprsky světla (FSC) a
na ose Y signál pro bočně rozptýlené paprsky světla (SSC)
(Obrázek č. 1). Ohraničte cílovou populaci buněk (lymfocyty) a
nastavte prahovou hodnotu v FSC přibližně tak, jak je ukázáno
na obrázku č. 1. Poté zobrazte události ohraničené jako
lymfocyty jako bodový graf, ve kterém je na ose X plocha
signálu pro lineárně rozptýlené paprsky světla (FSC-A) a na
ose Y výška signálu pro lineárně rozptýlené paprsky světla
(FSC-H). Ohraničte oblast událostí představující jednotlivé
buňky (Obrázek č. 2).
CD4+ T-lymfocyty
Zobrazte události z lymfocytárního ohraničení odpovídající
jednotlivým buňkám v bodovém grafu, kde na ose X je intenzita
fluorescence v detektoru pro FITC na ose Y signál pro bočně
rozptýlené paprsky světla (SSC) (Obrázek č. 3). Ohraničte
populaci CD4+ lymfocytů.
CD4+CD25+FOXP3+ Treg lymfocyty
Zobrazte populaci CD4+ lymfocytů jako bodový graf, kde na
ose X je signál pro FOXP3 (intenzita fluorescence v detektoru
pro APC) a na ose Y je signál pro CD25 (intenzita fluorescence
v detektoru pro PE). Umístěte do grafu rozdělení tak, abyste
ohraničili populaci CD4+CD25+FOXP3+ událostí (Obrázek č. 4).
Pro správné nastavení hranice rozdělující pozitivní a negativní
události použijte vhodně zvolené kontroly (např. reakce
obarvené pomocí izotypově shodných protilátek označených
fluorochromy APC a PE).
14. Omezení metody


Složení komponent soupravy bylo optimalizováno s cílem
dosáhnout nejlepšího poměru specifického signálu k
nespecifickému signálu. Z tohoto důvodu je důležité
dodržovat doporučený poměr objemu reagencie a objemu
vzorku v každém testu.
Průtokový cytometr může poskytovat špatné hodnoty,
pokud není dobře seřízen a udržován.
15. Registrované obchodní značky
FlowEx® je registrovanou značkou společnosti EXBIO Praha.
6/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106


SLOVENSKY
1. Výrobca

EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz
Chráňte obsah vialiek pred kontamináciou.
Nedodržanie odporúčaného postupu analýzy môže
ovplyvniť výsledky testov.
Vzorky ľudskej krvi sú považované za potenciálne
infekčný materiál, a preto sa s nimi musí náležite
zaobchádzať.
Varovanie: reagencia Fix and Lysing Solution (ED7417-1)
obsahuje formaldehyd, metanol a dietylenglykol.
Nebezpečenstvo
2. Použitie súpravy
TregFlowEx® Kit je určený na detekciu regulačných Tlymfocytov (CD4+ CD25+ FOXP3+ buniek) v ľudskej periférnej
krvi alebo v ľudskej pupočníkovej krvi metódou prietokovej
cytometrie.
H-vety
H302+H312+H332: Zdraviu škodlivý pri požití, pri styku s kožou
a pri vdýchnutí.
H315: Dráždi kožu.
H317: Môže vyvolať alergickú kožnú reakciu.
H319: Spôsobuje vážne podráždenie očí.
H335: Môže spôsobiť podráždenie dýchacích ciest.
H351: Podozrenie na vyvolanie rakoviny.
H371: Môže spôsobiť poškodenie orgánov.
H373: Môže spôsobiť poškodenie obličiek pri predĺženej nebo
opakovanej expozícii.
3. Úvod
Regulačné T-lymfocyty (Treg) sú podskupinou lymfocytov, ktoré
sa vyznačujú imunosupresívnymi vlastnosťami a hrajú zásadnú
úlohu pri udržiavaní autotolerancie. Ich regulačné pôsobenie
vedie k ochrane tkanív pred poškodením, ktoré by sprevádzalo,
ako vedľajší efekt, imunitné reakcie namierené proti
mikroorganizmom a alergénom, umožňujú toleranciu
allogénneho plodu matkou počas tehotenstva a udržujú
homeostázu s komenzálnymi mikroorganizmami [1].
Zvyčajne sú ako Treg označované CD4+CD25high T-lymfocyty
exprimujúce transkripčný faktor FOXP3. Bunky s týmto
fenotypom tvoria v ľudskej periférnej krvi 5-12 % z CD4+ Tlymfocytov [2]. Medzi Treg bunkami je možné ďalej rozlišovať
tzv. „prirodzené“ Treg bunky, vznikajúce v týmuse (nazývané
skrátene tTreg), a Treg bunky indukované v periférii (nazývané
skrátene pTreg) [3]. Odlišovanie tTreg od pTreg lymfocytov
pomocou špecifických antigénov nie je zjednotené. Niekoľko
markerov bolo navrhnutých ako jedinečných pre identifikáciu
tTreg lymfocytov: expresia transkripčného faktoru Helios a
expresia Neutropilinu-1, receptoru pre proteíny z rodiny
vaskulárneho endoteliálneho rastového faktoru [4].
P-vety
P270: Pri používaní tohto výrobku nejedzte, nepite ani nefajčite.
P280: Používajte ochranné rukavice/ochranný odev/ochranné
okuliare/tvárový štít.
P301+312: PRI POŽITÍ: Pokiaľ sa necítite dobre, volajte
TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÉ STREDISKO alebo
lekára.
P302+352: PRI KONTAKTE S KOŽOU: Omyte veľkým
množstvom vody a mydlom.
P305+351+338: PRI ZASIAHNUTÍ OČÍ: Niekoľko minút opatrne
vyplachujte vodou. Vyberte kontaktné šošovky, pokiaľ sú
nasadené a je možné ich jednoducho vybrať. Pokračujte
vo vyplachovaní.
P501:Zneškodnite obsah/obal v autorizovanom mieste zberu
nebezpečných odpadov.
4. Princíp
6. Obsah súpravy
Test je založený na kombinovanej detekcii povrchových a
intracelulárnych proteínov CD4, CD25 a FOXP3, ktoré sú
charakteristické pre regulačné T-lymfocyty.
Vzorky krvi sú najskôr inkubované so zmesou monoklonálnych
protilátok anti-CD4 (značená fluoresceínom) a anti-CD25
(značená R-phycoerytrínom), ktoré sa špecificky viažu na
antigénne determinanty exprimované na povrchu leukocytov.
Po špecifickom naznačení krvných buniek nasleduje lýza
erytrocytov. Následne sú leukocyty permeabilizované
a inkubované s monoklonálnou protilátkou proti FOXP3
(značená allophycocyanínom). Fluorochrómy naviazané na
monoklonálne protilátky sú excitované laserovým lúčom a
emisné svetlo excitovaných fluorochrómov z jednotlivých buniek
je zachytené a analyzované pomocou prietokového cytometru.





ED7417-1 Fix and Lysing Solution – 1 vialka
obsahujúca 10 ml 10x koncentrovaného roztoku.
ED7417-2 Permeabilizing Solution – 1 vialka
obsahujúca 25 ml roztoku pripraveného k použitiu.
ED7417-3 Blocking Buffer – 1 vialka obsahujúca 2,5 ml
roztoku pripraveného k použitiu.
ED7417-4 CD4 FITC/CD25 PE – 1 vialka obsahujúca
0,50 ml roztoku na nafarbenie povrchu buniek, jedná sa o
zmes myšej monoklonálnej protilátky proti CD4 označenej
fluoresceínom (klon MEM-241, izotyp IgG1) a protilátky
proti CD25 označenej R-PE (klon MEM-181, izotyp IgG1).
ED7417-5 FOXP3 APC – 1 vialka obsahujúca 0,25 ml
roztoku protilátky proti FOXP3, označenej APC (klon 3G3,
izotyp IgG1).
5. Upozornenia




7. Skladovanie súpravy
Výrobok je určený len pre výskumné účely.
Prietokový cytometer pravidelne kalibrujte pomocou
fluorescenčných guličiek, aby bola zaistená stabilná
citlivosť detektorov.
Nepoužívajte reagencie po uplynutí doby použiteľnosti.
Reagencie nevystavujte dlhodobému pôsobeniu svetla.
TregFlowEx® Kit skladujte pri teplote 2-8 °C. Doba použiteľnosti
je vyznačená na jednotlivých reagenciách a na krabici súpravy.
7/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106
Skladujte pri 2 - 8 °C.

1% formaldehyd v PBS
Pripravte roztok 1% formaldehydu v PBS pufre zmiešaním
1 dielu 37% roztoku formaldehydu (stabilizovaného metanolom)
od Sigma-Aldrich (Kat. č. F1635) a 36 dielov pufru PBS.
Skladujte pri 2 - 8 °C. Roztok je stabilný 1 mesiac.
Varovanie: Koncentrovaný formaldehyd je akútne toxická látka.
Pre informácie o zásadách bezpečnosti práce s formaldehydom
si preštudujte bezpečnostný list od Vášho dodávateľa
formaldehydu.
8. Zmeny kvality produktu
V prípade pozorovania akéhokoľvek zhoršenia vlastností
produktu,
prosíme,
okamžite
informujte
výrobcu
prostredníctvom e-mailovej adresy: [email protected]
9. Potrebné vybavenie a materiál, ktorý sa
nedodáva









Vhodné 5ml skúmavky na farbenie buniek
(napr. 12 × 75 mm)
PBS pufor
Sada automatických pipiet s jednorazovými špičkami
Vortex
Chladená centrifúga s rotorom pre skúmavky
Prietokový cytometer - excitácia modrým laserom 488 nm,
excitácia červeným laserom 633 nm a vhodné emisné
filtre
Roztok 1% formaldehydu v pufre PBS
Nádoba na tekutý odpad s príslušným dezinfekčným
prostriedkom
Pasteurove pipety a zdroj vákua pre odsávanie
supernatantu zo skúmaviek
Nafarbenie povrchových antigénov
19. Napipetujte 10 l CD4 FITC/CD25 PE zmesi protilátok
do skúmaviek.
20. Pridajte 100 l krvi.
21. Premiešajte a nechajte inkubovať 10 minút v tme pri
teplote 2−8 °C.
22. Premyte bunky pridaním 2 ml vychladeného pufru PBS
a centrifugujte pri 300 g po dobu 5 minút pri 4 °C. Odsajte
supernatant pomocou Pasteurovej pipety do fľašky
s dezinfekciou.
23. Pokračujte intracelulárnym farbením.
10. Testovaná vzorka
Intracelulárne farbenie antigénov
24. Pridajte 1 ml vychladeného Fix and Lysing Solution
(nariedeného roztoku).
25. Premiešajte a nechajte inkubovať 10 minút v tme pri
teplote 2−8 °C.
26. Pridajte
0,5
ml
Permeabilizing
Solution
vytemperovaného na laboratórnu teplotu.
27. Premiešajte a nechajte inkubovať 10 minút v tme pri
teplote 2−8 °C.
28. Centrifugujte bunky pri 400 g po dobu 5 minút pri 4°C
(Nepridávajte pufor PBS k fixačno permeabilizačnej
zmesi).
29. Odstráňte (zlejte) supernatant.
Ľudská krv alebo ľudská pupočníková krv
Vzorky krvi by mali byť odobraté do skúmaviek obsahujúcich
antikoagulačné činidlo, napr. EDTA, citrát nebo heparín.
Odporúčame používať čerstvo odobraté vzorky. Postupne
s časom od odobratia vzorky krvi klesá životnosť buniek, čo
môže viesť k strate niektorých bunkových subpopulácií a tak aj
k ovplyvneniu výsledkov testu. Mŕtve bunky nešpecificky viažu
monoklonálne protilátky používané na farbenie buniek, čo môže
negatívne ovplyvniť výsledky testu. Pred meraním skladujte
vzorky pri laboratórnej teplote.
11. Postup testu
Príprava reagencií

Fix and Lysing Solution (ED7417-1)
Fix and Lysing Solution je dodávaný ako 10x koncentrovaný
roztok, ktorý je potreba pred použitím nariediť deionizovanou
vodou. Narieďte len potrebné množstvo koncentrátu (1 ml
nariedeného roztoku na reakciu) a skladujte nariedený roztok
pri teplote 2-8 °C. Nariedený roztok je stabilný 1 mesiac.
30. Pridajte 50 L vychladeného Blocking Buffer.
31. Pridajte 50 L vychladeného pufru PBS.
32. Premiešajte a nechajte inkubovať 5 minút v tme pri teplote
2−8 °C.
33. Pridajte 5 μl FoxP3 APC protilátky.
34. Premiešajte a nechajte inkubovať 30 minút v tme pri
teplote 2−8 °C.
35. Dvakrát bunky premyte pridaním 2 ml vychladeného
pufru PBS a centrifugovaním pri 400 g po dobu 5 minút
pri 4 °C. Odstráňte (zlejte) supernatant.

Permeabilization Solution (ED7417-2)
Nechajte Permeabilization Solution vytemperovať na
laboratórnu teplotu. Skontrolujte roztok, či nedošlo k precipitácii
SDS. Prípadný precipitát nechajte rozpustiť zahriatím vialky na
37°C. Po rozpustení skladujte Permeabilizing Solution pri
laboratórnej teplote (15-25 °C). Skladovanie roztoku pri
laboratórnej teplote nemá vplyv na exspiráciu.
36. Pridajte 300 l roztoku 1% formaldehydu v PBS pufre.

PBS pufor
Pripravte pufor PBS podľa návodu uvedeného nižšie (môžete
použiť aj iné návody prípravy PBS).
Rozpustite:
8,0 g Chloridu sodného (NaCl)
0,2 g Chloridu draselného (KCl)
2,0 g Dihydrogenfosforečnanu draselného (KH2PO4)
1,42 g Dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného (Na2HPO4•2H2O)
v 800 ml deionizovanej vody.
Upravte pH na 7,4 pomocou HCl.
Upravte objem roztoku na 1 liter pridaním deionizovanej vody.
Sterilizujte autoklávovaním pri 15 psi po dobu 20 minút alebo
prefiltrujte cez filter s pórmi o veľkosti 0,22 m.
8/11
Nafarbené vzorky skladujte pri teplote 2−8 °C až do analýzy
na prietokovom cytometri. Analyzujte vzorky počas
nasledujúcich 4 hodín.
12. Cytometrické meranie
Analyzujte nafarbené vzorky pomocou prietokového cytometru
vybaveného excitačným laserom 488 nm a 633 nm a vhodnými
filtrami.
Podľa špecifikácií cytometru určite detektory, ktoré sú vhodné
pre meranie fluorescencie nafarbených buniek.
Nastavte napätie detektorov pre lineárne rozptýlené lúče svetla
(FSC) a bočne rozptýlené lúče svetla (SSC) tak, aby cieľové
udalosti spadali do zobrazovaného rozsahu osí grafu.
ED7417_EN_CZ_SK_160106
Nastavte prahovú hodnotu v FSC tak, aby boli zaznamenávané
iba cieľové udalosti a väčšina debrisu bola odfiltrovaná.
Nastavte napätie fluorescenčných detektorov tak, aby boli
všetky zaznamenávané udalosti v zobrazovanom rozsahu osí
grafov.
Zaznamenajte aspoň 20 000 – 30 000 CD4+ lymfocytov
z každej vzorky.
Spracujte udalosti pomocou softwaru určeného na analýzu dát
dodávaného s cytometrom.
13. Analýza dát
Graf zobrazujúci leukocyty
Zobrazte namerané dáta ako bodový graf, v ktorom je na osi X
vynesený signál pre lineárne rozptýlené lúče svetla (FSC) a na
osi Y signál pre bočne rozptýlené lúče svetla (SSC) (Obr. 1).
Ohraničte cieľovú populáciu buniek (lymfocyty) a nastavte
prahovú hodnotu v FSC (Obr. 1). Potom zobrazte ohraničenú
populáciu lymfocytov ako bodový graf, v ktorom je na osi X
plocha signálu pre lineárne rozptýlené lúče svetla (FSC-A) a na
osi Y výška signálu pre lineárne rozptýlené lúče svetla (FSC-H).
Ohraničte oblasť udalostí predstavujúcich jednotlivé bunky
(Obr. 2).
CD4+ T-lymfocyty
Zobrazte
udalosti
z
lymfocytárneho
ohraničenia
odpovedajúceho jednotlivým bunkám v bodovom grafe, kde na
osi X je intenzita fluorescencie v detektore pre FITC a na osi Y
je signál pre bočne rozptýlené lúče svetla (SSC) (Obr. 3).
Ohraničte populáciu CD4+ lymfocytov.
CD4+CD25+FOXP3+ Treg lymfocyty
Zobrazte populáciu CD4+ lymfocytov ako bodový graf, kde na
osi X je signál pre FOXP3 (intenzita fluorescencie v detektore
pre APC) a na osi Y je signál pre CD25 (intenzita fluorescencie
v detektore pre PE). Umiestnite do grafu krížové rozdelenie tak,
aby ste ohraničili populáciu CD4+CD25+FOXP3+ udalostí
(Obr. 4). Pre správne nastavenie hranice rozdeľujúcej pozitívne
a negatívne udalosti použite vhodne zvolené kontroly (napr.
reakcie nafarbené pomocou izotypovo totožných protilátok
označených fluorochrómami APC a PE).
14. Obmedzenia metódy


Zloženie komponentov súpravy bolo optimalizované
s cieľom dosiahnuť najlepší pomer špecifického signálu k
nešpecifickému signálu. Z tohto dôvodu je dôležité
dodržiavať doporučený pomer objemu reagencie
a objemu vzorky v každom teste.
Prietokový cytometer môže poskytovať nesprávne
hodnoty, pokiaľ nie je dobre nastavený a udržiavaný.
15. Registrované obchodné značky
FlowEx® je registrovanou značkou spoločnosti EXBIO Praha.
9/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106
ENGLISH / ČESKY / SLOVENSKY
16. Example of data analysis / Vzorové
vyhodnocení / Vzorové vyhodnotenie
Fig. 4 CD4+ gated lymphocytes displayed according to their
CD25 and FOXP3 expression. The Treg cells
(CD25+FOXP3+) are found in the upper right quadrant.
Obr. 4 Zobrazení CD4+ lymfocytů v závislosti na expresi
CD25 a FOXP3. Treg lymfocyty (CD25+FOXP3+) se
nacházejí v pravém horním kvadrantu (E).
Obr. 4 Zobrazenie CD4+ lymfocytov v závislosti na expresii
CD25 a FOXP3. Treg lymfocyty (CD25+FOXP3+) sa
nachádzajú v pravom hornom kvadrante (E).
Fig. 1 Leukocyte scatter plot with the visualization of the
threshold setting (A) and the lymphocyte gate (B)
Obr. 1 Graf zobrazující leukocyty se zvýrazněním nastavení
prahové hodnoty (A) a ohraničením lymfocytů (B).
Obr. 1 Graf zobrazujúci leukocyty so zvýraznením
nastavenia prahovej hodnoty (A) a ohraničením
lymfocytov (B).
Fig. 2 Separation of singlets (C) from aggregates.
Obr. 2 Ohraničení oddělující události odpovídající
jednotlivým buňkám (C) od buněčných aggregátů.
Obr. 2 Ohraničenie oddeľujúce udalosti odpovedajúce
jednotlivým bunkám (C) od bunkových agregátov.
Fig. 3 Separation of CD4+ lymphocytes (D) from CD4+
monocytes and CD4 negative cells.
Obr. 3 Ohraničení CD4+ lymfocytů (D) a jejich vymezení
oproti CD4+ monocytům a CD4 negativním buňkám.
Obr. 3 Oddelenie CD4+ lymfocytov (D) od CD4+ monocytov a
CD4 negatívnych buniek.
10/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106
17. References / Literatura / Literatúra
[1] Sakaguchi S, Miyara M, Constantino CM, Hafler DA.
FOXP3+ regulatory T cells in the human immune system. Nat
Rev Immunol (2010) 10:490–500.
[2] Churlaud G, Pitoiset F, Jebbawi F, Lorenzon R, Bellier B,
Rosenzwajg M, Klatzmann D. Human and Mouse
CD8(+)CD25(+)FOXP3(+) Regulatory T Cells at Steady State
and during Interleukin-2 Therapy. Front Immunol. 2015 Apr
15;6:171.
[3] Abbas AK, Benoist C, Bluestone JA, Campbell DJ, Ghosh S,
Hori S, Jiang S, Kuchroo VK, Mathis D, Roncarolo MG,
Rudensky A, Sakaguchi S, Shevach EM, Vignali DA, Ziegler
SF. Regulatory T cells: recommendations to simplify the
nomenclature. Nat Immunol. 2013 Apr;14(4):307-8.
[4] Lin X, Chen M, Liu Y, Guo Z, He X, Brand D, Zheng SG.
Advances in distinguishing natural from induced Foxp3(+)
regulatory T cells. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6(2):116-23.
18. Explanation of symbols / Vysvětlení symbolů
/ Vysvetlenie symbolov
11/11
ED7417_EN_CZ_SK_160106