Svět RNA a bílkovin Transport a stabilita RNA Transport a stabilita

Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Svět RNA a bílkovin
TRANSPORT A
STABILITA mRNA
Transport a stabilita RNA
Transport a stabilita RNA
hnRNP/mRNP
hnRNP/mRNP
Jaderný export
Jaderný export
Jaderné póry
Transport komplexem jaderného póru
Export RNA
Jaderné póry
Transport komplexem jaderného póru
Export RNA
Stabilita RNA
Stabilita RNA
Degradační dráhy
Motivy ovlivňující stabilitu RNA
Umlčování genů
Degradační dráhy
Motivy ovlivňující stabilitu RNA
Umlčování genů
1
RNA vazebné motivy v RBP
Heterogenní jaderné RNP (hnRNP)
Heterogenní skupina RNA-vazebných bílkovin často asociovaných s chromatinem
Původně 6 („jádro“), dnes cca 30 polypeptidů (není konečné)
Modulární struktura RNA-vazebných bílkovin
Motiv
Délka (aa)
Konsensus
Struktura
RBP
Funkce
RNP motiv
~ 80-100
K/RGF/YG/AFVXF/Y
βαββαβ
RNP1 + RNP2
8aa
6aa
/IF/YV/IG/KN/GL/M
Aromatické a
alifatické aa
hnRNP
PABP
snRNP U1A
biogeneze mRNA
translace, stabilita
sestřih
~ 10-20
Arg-rich
variabilní
HIV Rev
HIV Tat
export HIV mRNA
transkripce
RGG box
~ 20-300
RGG repetice
β spirála,
doplňkový
motiv
hnRNP U
nucleolin
biogeneze mRNA
biogeneze rRNA
KH motiv
~ 50
IGXXGXXI
βααββα
Mer-1 (kvasinky)
rp S3
hnRNP K
alternativní sestřih
translace
biogeneze mRNA
~ 65-68
hydrofobní aa,
nepravidelně
αββα
Drosophila Staufen
DAI kinasa
Vaccinia virus E3L
vývojová regulace
regulace translace
regulace translace
Společné vlastnosti:
¾ přítomnost RNA-vazebného motivu
ARM
¾ rozličné doplňkové domény
L
Arginine-rich
motif
¾ neobvyklé rozložení aminokyselin
¾ interakce protein-protein
¾ množství isoforem
K-homology
motif
¾ alternativní sestřih
¾ posttranslační modifikace
DSRM
dsRNAbinding motif
hnRNP – komplexní a dynamická struktura
¾ velká množina bílkovin vážících se k nascentnímu transkriptu
hnRNP
RNA-vazebné motivy
A1/A1*
2 x RBD, RGG
sestřih, polyadenylace, transport mRNA, biogeneze telomer
Předpokládaná funkce
A2/B1
2 x RBD, RGG
sestřih, transport mRNA
C1/C2
1 x RBD
balení transkriptu, sestřih, stabilita mRNA
D1/D2
2 x RBD, RGG
transkripce, rekombinace, turnover mRNA
E1/E2
3 x KH
translační regulace (silencing), stabilita mRNA
F
3 x RBD
sestřih (intronový zesilovač), interakce s CBP
G
1 x RBD, RGG
H
3 x RBD
sestřih (intronový zesilovač)
H’
3 x RBD
polyadenylace
I (PTB)
4 x RBD
sestřih (intronový zesilovač/represor), polyadenylace
K
3 x KH, RGG
transkripce, translační regulace (silencing)
L
4 x RBD
stabilita mRNA, export mRNA
M
3 x RBD
sestřih, odpověď na tepelný šok
P2
1 x RBD, RGG
onkogenese
R
3 x RBD, RGG
U
1 x RBD
HAP/SAF-B
1 x RBD
transkripce, modelování chromatinu, odpověď na tepelný šok
A0
2 x RBD, RGG
sestřih
CUG-BP
3 x RBD
sestřih (intronový zesilovač), translace
HuR
3 x RBD
stabilita mRNA, transport mRNA
Export mRNA z jádra
Bílkoviny
hnRNP komplexu
Jaderný pór – strukturovaná a přesně definovaná cesta pro bílkoviny a RNA
2
Jaderný obal
Transport a stabilita RNA
Vnější jaderná membrána (ONM)
¾ jeden kompartment s ER
¾ asociované ribosomy
hnRNP/mRNP
Vnitřní jaderná membrána (INM)
¾ kontakt s chromatinem
¾ jaderná lamina
Jaderný export
Jaderné póry
Transport komplexem jaderného póru
Export RNA
Stabilita RNA
Degradační dráhy
Motivy ovlivňující stabilitu RNA
Umlčování genů
Komplex jaderného póru - nuclear pore complex
Jaderná lamina
¾ vnitřní kostra jaderných
obalů
¾ interakce (komunikace)
INM a chromatinu
Komplex jaderného póru
(NPC)
¾ multiproteinový kanál
¾ transport
¾ 1 000 – 10 000 / jádro
Hustota pórů na povrchu
jádra oocytu Xenopus laevis
Komplex jaderného póru
Celý komplex
¾ průměr 120 nm
Průměr kanálu
¾ 9 nm v klidu
¾ 26 nm v aktivním stavu
Centrální kanál uzavřený mezi několika prstenci
Centrální transportér
1 000 – 10 000 jaderných pórů
na jednom jádře
Obratlovci (Xenopus) – 125 MDa (30 x velikost ribosomu);
odhad: původně 50-100 bílkovin, dnes cca 30-40
Čtyři prstence spojené paprsky
Jaderný košík
Komplexy fibril
Proximální filamenta
Cytoplasmatická filamenta
Kvasinky – 50 MDa (základní struktura); 30-40 bílkovin
3
Bílkoviny jaderného
póru
Komplex
jaderného
póru
Nukleoporiny
(Nup)
Obratlovci
Odhad 100/40 bílkovin
Charakterizováno 15-20
Kvasinky
Odhad 30-40 bílkovin
Char. téměř všechny
Repetitivní sekvence FXFG, GLFG, FG
¾ Obecný znak mnoha nukleoporinů
¾ Nup153, Tpr, Nup159p, Nup116p, Nup100p, Nsp1p, Nup53p
¾ Neslouží lokalizaci
¾ Regulační úloha při transportu
FEISEM,
Rekonstituce NPC in vitro
(Goldberg et al. 1996, 1997)
¾ Interakce s transportními faktory (importiny α i β, RanGTPasa)
Bílkoviny jaderného
póru
Komunikace NPC s okolím
Kontinuita buněčného skeletu
Nukleoporiny
(Nup)
¾ interakce cytoplasmatických
filament s cytoskeletem
¾ interakce vnitřních filament s
laminou
¾ interakce jaderného koše s
filamentózními bílkovinami v jádře
(nukleoskelet?)
NPC – dynamická struktura
¾ stacionární nukleoporiny
¾ kostra struktury komplexu
¾ mobilní nukleoporiny
¾ transport nákladu
¾ pohyb mezi jádrem a cytoplasmou
Nukleoporiny
¾ integrální membránové bílkoviny
¾ rozpustné bílkoviny
Teorie:
Filamentní struktury NPC představují fyzickou spojku mezi
cytoskeletální sítí v cytoplasmě a nukleoskeletálními strukturami v jádře
a tvoří tak třetí složku komplexní sítě buněčného skeletu
4
Transport a stabilita RNA
Transport jaderným pórem
Komplexní proces
Celá řada nezávislých mechanismů
hnRNP/mRNP
Jaderný export
Jaderné póry
Transport komplexem jaderného póru
Export RNA
Difuse (metabolity)
–
Aktivní transport
(včetně RNP,
ribosomální podjednotek či
částic Balbianiho prstenců)
Horizontální transport
v membráně
(integrální membránové bílkoviny)
Stabilita RNA
Degradační dráhy
Motivy ovlivňující stabilitu RNA
Umlčování genů
Faktory
Pasivní difuse
Aktivní transport látek komplexem jaderného póru
¾ koncentrační spád
¾ vzdálenost přenosu (200 nm)
¾ vlastnosti přenášených látek
Teoreticky až do průměru 9 nm / Mw 60-70 kDa
Malé molekuly
BSA (68 kDa, Ø 7 nm)
¾ metabolity
¾ difuse extrémně pomalá
¾ menší bílkoviny
Ovalbumin (46 kDa, Ø 6 nm)
1982: Nukleoplasmin (Xenopus laevis)
¾ pentamerický jaderný protein
¾ jádro (resistentní vůči proteasám) a ocásek (citlivý vůči proteasám)
¾ mikroinjekce -> rychlá akumulace v buněčném jádře
¾ samotné jádro: mikroinjekce -> pentamer, akumulace v cytoplasmě
¾ samotný ocásek: mikroinjekce -> rychlá akumulace v buněčném jádře
¾ ocásek – jaderný lokalizační signál (NLS)
¾ difuse velmi pomalá
Jednotlivé molekuly
Prakticky jen do průměru 4-5 nm / Mw 20-30 kDa
Histony (20-30 kDa) a tRNA transportovány pomocí přenašečů
? kontrola množství přenesených molekul ?
Makromolekulární komplexy (i 1000x větší než při difusi)
¾ ribosomální podjednotky (1.4 a 2.8 MDa, 40S a 60S)
¾ ribonukleové částice (mRNP, snRNP)
¾ mRNP komplexy Balbianiho prstenců (> 10 MDa, 75S, Ø až 50 nm)
5
Aktivní transport látek komplexem jaderného póru
Jaderný lokalizační signál
Receptory
¾ importní (NLS) receptor
¾ importiny (Impα) (karyopherin α)
¾ exportní (NES) receptor
Teorie: posun transportovaných
komplexů po sérii po sobě
následujících vazebných míst;
„Serial-binding complexes“
¾ exportiny
¾ přenašečový receptor
¾ nadrodina importinu β (karyopherin β)
¾ systém RanGTPasy (RanGTPasa, NTF2 (nuclear transport factor2))
24 kDa
15 kDa, homodimer, import receptor pro Ran
Jednotlivé molekuly
Makromolekulární komplexy (i 1000x větší než při difusi)
¾ ribosomální podjednotky (1.4 a 2.8 MDa, 40S a 60S)
pyruvát kinasa
NLS::pyruvát kinasa
¾ ribonukleové částice (mRNP, snRNP)
¾ mRNP komplexy Balbianiho prstenců (> 10 MDa, 75S, Ø až 50 nm)
Kalderon et al. (1984) Cell 39: 499
Import přes NPC
Export přes NPC
¾ Rozpoznání NLS nákladu
importinem α
¾ Rozpoznání NES nákladu
exportinem
¾ Přenos Impα a nákladu do jádra
prostřednictvím importinu β
¾ Tvorba trimerického komplexu
exportinu a nákladu s Ran-GTP
¾ Disociace nákladu od importinu α
¾ Přenos nákladu do cytoplasmy
¾ Navázání Ran-GTP a CAS k
importinu α
¾ Hydrolýza Ran-GTP -> Ran-GDP
¾ Recyklace importinu α do
cytoplasmy
¾ Hydrolýza Ran-GTP -> Ran-GDP
¾ Disociace nákladu a Ran-GDP od
exportinu
¾ Recyklace exportinu do jádra
prostřednictvím Impβ
¾ Disociace Ran-GDP a CAS od
importinu α
Recyklace RanGTP
Recyklace RanGTP
Recyklace exportinu
Recyklace importinů α a β
6
RanGTPasový cyklus
Transportní cykly
¾ Přenos Ran-GTP v komplexu s
importinem α či exportinem do
cytoplasmy
importinů a exportinů
v koordinaci
s RanGTPasovým
¾ Navázání RanBP1
systémem (cyklem)
¾ Hydrolýza GTP -> GDP
zprostředkovaná RanGAP
¾ Disociace Ran-GDP od TR
¾ Navázání Ran-GDP k NTF2
¾ Recyklace Ran-GDP do jádra
¾ Disociace Ran-GDP od NTF2
¾ Ran GDP/GTP exchange
prostřednictvím RanGEF (RCC1)
Ran může také pasivně difundovat
¾ neúčinné
Importinový cyklus
Importinový cyklus - VIDEO
Allen – video na URL článku
Recyklace importinů α i β
7
RanGTPasový cyklus
Netradiční formy
jaderného transportu
a) Import nezávislý na Ran
¾ cyklin B1-CDC2 / Impβ
¾ přímá interakce nákladu s Impβ
¾ RanGTP není potřeba pro žádný krok
RanGTPasový cyklus - VIDEO
Allen – video na URL článku
b) Jeden receptor pro import i export
¾ Msn5 (kvasinky, homolog Impβ)
¾ export Pho4 a Mig1 (TF) a Far1 (CDK inhibitor)
¾ import Rpa komplexu (DNA repair)
¾ jeden receptor – import a export různých bílkovin
¾ různé domény rozpoznávané různými náklady
c) Transportní receptory mimo nadrodinu Impβ
¾ kalretikulin (CRT) – popsaný jako Ca-vazebný protein asociovaný s ER
¾ CRT-specifické náklady – export glukokortiokoid receptoru
¾ přímá interakce s nákladem; RanGTP systém: přenos ve formě trimeru CRT/RanGTP/náklad
Transport a stabilita RNA
Export různých typů RNA z jádra
hnRNP/mRNP
Jaderný export
Jaderné póry
Transport komplexem jaderného póru
Export RNA
Stabilita RNA
Degradační dráhy
Motivy ovlivňující stabilitu RNA
Umlčování genů
8
Export mRNA z jádra
Export tRNA
Hlavní exportní dráha – nezávislá na systému RanGTP
„Klasická“ Impβ dráha s přímou
vazbou receptoru k nákladu
Účast transportních receptorů mimo nadrodinu Impβ
První popsaná exportní dráha zprostředkovaná saturovatelným přenašečem
mRNA exporter
Exportin-t (Xpo-t)
heterodimer
¾ homolog Imp β, RanGTP vazebná bílkovina
¾ váže přímo tRNA, ne bílkovinný faktor
¾ vazba k tRNA v přítomnosti RanGTP
¾ vazba jen ke zralé tRNA
Malá podjednotka
Zrání tRNA
¾ Homolog NTF2
¾ Transport
¾ odštěpení 3’ a 5’-konců
¾ přidání CCA na 3’-konec
Velká podjednotka
¾ modifikace bazí
Malé molekuly -> tRNA může pasivně
difundovat -> VELMI malá účinnost
¾ M+C – transport
¾ N+M – vazba k RNA
a RNP bílkovinám
¾ sestřih (není monitorován)
Export mRNP z jádra
Slinné žlázy larev
Chironomus tentans
Propojení exportu mRNA
se sestřihem
Hlavní exportní dráha
nezávislá na systému RanGTP
Hlavní zúčastněné bílkoviny:
Obrovská mRNA
~ 75 kb, > 10 MDa, Ø 50 nm
Kvasinky
Obratlovci
Tap
P15/NXT
mRNA exporter
Aly/Ref
EJC
UAP56
Mex67
Mtr2
Yra
interakce se
sestřihovým aparátem
EJC
Sub2
Účast transportních
receptorů mimo
nadrodinu Impβ
9
Alternativní dráhy transportu mRNA
Alternativní dráhy transportu mRNA
mRNA obsahující ARE (adenosine/uridine-rich
elements) v 3’-UTR
¾ early response genes
¾ cytokiny, lymfokiny, protoonkogeny
¾ nestabilní transkripty
HuR – RNA-vazebná bílkovina
¾ váže se k ARE
¾ pendlující faktor
¾ váže se i k transportinu 2
RanGTP-dependentní cesta
HuR – rodina ELAV
pp32 – fosfoprotein
¾ zprostředkovává vazbu HuR k Crm1
Transport prostřednictvím
Impβ-like receptorů
Trn2 (transportin2) a Crm1
Ran-dependentní cesta:
?? výjimka či pravidlo ??
Stabilita mRNA
Transport a stabilita RNA
Abundance mRNA – poměr rychlosti syntézy a degradace
hnRNP/mRNP
Jaderný export
Jaderné póry
Transport komplexem jaderného póru
Export RNA
Stabilita RNA
Degradační dráhy
Motivy ovlivňující stabilitu RNA
Umlčování genů
Transkripty
Extrémně stabilní - skladované mRNA
Stabilní - konstitutivní geny
Nestabilní – regulační bílkoviny
¾ transkripční faktory, geny buněčného cyklu, geny stresové odpovědi
¾ regulace stability mRNA – změna poločasu života dané mRNA až 10x
¾ fyziologická – vývojové stadium, rychlost růstu, diferenciace
¾ podněty okolí – stres, výživa, hormony
Poločas života mRNA
Escherichia coli – desítky vteřin až téměř hodina
Savci – minuty až několik dní
10
Stabilita mRNA
Degradace
bakteriálních
mRNA
Faktory ovlivňující délku života (stabilitu) mRNA
Cis-elementy
Trans-faktory
Primární sekvence mRNA
Ribosomy
Strukturní elementy
RNA-vazebné bílkoviny
Čepička (5’-5’ trifosfátová vazba)
Poly(A) řetězec
Degradosom
Stabilizační vlásenky se
smyčkami v 5’ i 3’ UTR
Ribonukleasy
Antisense RNA
Endonukleolytické štěpení
Exonukleolytické štěpení – jen 3’->5’
¾ RNasa E
¾ Poly(A) polymerasa
¾ 1061 aa
¾ syntéza 10-40 nt poly(A)
¾ N-konec – katalytická doména
¾ destabilizace RNA, značka pro degradaci
¾ C-konec: formování degradosomu
¾ RNasa III
¾ kotva pro navázání exonukleas
¾ RNasa II, PNPasa (polynukleotid fosforylasa)
¾ 226 aa
¾ potřebují ss 3’-konec RNA
¾ štěpí ds v mRNA a rRNA
¾ autoregulační smyčka
¾ RNasa P
¾ vzájemně funkčně zastupitelné
¾ Oligoribonukleasa
¾ degradace oligoribonukleotidů
¾ štěpení 5’-konce tRNA
mRNA degradační dráhy eukaryot
Hlavní degradační dráha
(1) Deadenylace
deadenylasa
PAN (kvasinky)
PARN, DAN (savci)
(2) Odštěpení čepičky
endonukleasa
Dcp1p/Dcp2p (kvasinky)
(3) Degradace RNA
Značná variabilita mazi kvasinkami a živočichy;
2 základní směry exonukleas: 5’->3’ a 3’->5’
Faktory ovlivňující odštěpení čepičky
¾ interakce konců mRNA (disociace)
¾ přítomnost eIF4F (zejména eIF4E)
exonukleasa
Xnr1p, Rat1p (kvasinky) 5’->3’
exosom (kvasinky) 3’->5’
11
Hypotetická endonukleolytická
dráha
Hlavní
degradační
dráha kvasinek
Odštěpení čepičky
Exosom – 10-11 bílkovin
300-400 kDa
Ski2p – ATP-dep. RNA helikasa,
RNasy, GTPasa
Transport a stabilita RNA
hnRNP/mRNP
Motivy v 3’-UTR ovlivňující stabilitu mRNA
ARE/AURE element
Jaderný export
Jaderné póry
Transport komplexem jaderného póru
Export RNA
IRE element
Stabilita RNA
Degradační dráhy
Motivy ovlivňující stabilitu RNA
Umlčování genů
Histonová mRNA
12
ARE / AURE
(AU/U-rich element)
Funkce HuR
Konsensus AUUUA
Regulace genové
exprese během
buněčného růstu
a vývoje
Destabilizační signál v 3’-UTR
Stimulace odstranění čepičky
(Dcp1p)
Stimulace aktivity exosomu
(přes TTP, KSRP)
Cílové místo pro endonukleasy
Stabilizace/export mRNA za stresu – úloha HuR
Stabilizace mRNA
4 známé bílkovinné ligandy
¾ SET α/β, pp32, APRIL
¾ inhibitory PP2A (protein
fosfatasa 2A)
Export mRNA (ARE)
¾ prostřednictvím pp32
¾ vazba k Crm1 nebo k
transportinu 2
¾ alternativní dráha závislá
na Ran
Stresové
granule
Specifické RNP komplexy
¾ vznik po působení
stresu
¾ fosforylace eIF2α v
ternálním komplexu
eIF-GTP-tRNAMet ->
STOP iniciace translace
¾ navázání TIA-1 a TIAR
¾ agregace stresových
granulí
¾ revertovatelné HSP70
Normální podmínky
Stresové podmínky
¾ export mRNP, pendlování HuR
¾ export stresových komplexů
¾ ochrana mRNA v jádře i cytoplasmě
¾ akumulace HuR v cytoplasmě, snad ve
stresových granulích
¾ HSP70 mRNA netvoří
stresové granule
13
Iron-responsive
element
IRE:
Transferrin receptor (TfR)
¾ vlásenka (23-27 nt)
exprimován při nedostatku železa
¾ smyčka (6 nt)
mRNA pro
transferrin receptor
¾ 5 IRE elementů
¾3 nutné pro regulaci
T1/2 TfR mRNA
IRP
(IRE-binding
protein)
¾ volný – enzym
akonitasa
¾vazba k IRE
stabilizuje TR mRNA
Rostlinné RBP
¾ regulace železem
ABH1
(ABA hypersensitive 1)
¾ homolog CBP80
¾ iniciace translace
¾ stabilisace mRNA
SAD1
(supersensitive to ABA and drought 1)
¾ ortolog Lsm5 (kvasinky)
¾ degradace mRNA
14
Transport a stabilita RNA
HYL1
(hyponastic leaves 1)
¾ neexistuje blízký homolog
¾ snad stabilisace a translační
regulace mRNA
¾ snad součást MAPK dráhy
hnRNP/mRNP
Jaderný export
Jaderné póry
Transport komplexem jaderného póru
Export RNA
Stabilita RNA
Degradační dráhy
Motivy ovlivňující stabilitu RNA
Umlčování genů
Umlčování genů / gene silencing
¾ Petunia (1990): změny barev květů po transformaci genem pro
chalcon synthasu za 35S promotorem
TGS (transkripční umlčování genů)
¾ změny v přístupnosti genu pro transkripční komplex
¾ homologie antisense RNA k promotoru cílového genu
¾ změny chromatinu a methylace DNA
PTGS (post-transkripční umlčování genů)
¾ destabilisace cílového transkriptu
¾ homologie antisense RNA k transkribované oblasti cílového genu
¾ Obranná strategie – kontrola virové infekce
¾ umlčování cizorodých genů
Protismyslná RNA
RNA komplementární k cílové RNA, reguluje její funkci
¾ ovlivnění stability cílové RNA
¾ inhibice nebo zesílení exprese
¾ chemická modifikace cílové RNA/DNA
Délka 22 nt až >10 kb
Dva základní typy: cis- a trans-kódované RNA
Všechny známé říše – Eubacteria, Archaebacteria, Eukaryota
Umělé protismyslné molekuly – antisense DNA oligonukleotidy
terapeutické užití
štěpeny RNasou H (štěpí DNA/RNA hybrid)
15
Antisense RNA u rostlin
Gene silencing
malé RNA (21-25 nt)
¾ produkty úprav prekurzorové dsRNA
¾ CARPEL FACTORY (homolog DICER)
siRNA (small interfering RNA)
¾
¾
¾
¾
¾
úplná homologie s cílovou RNA
destabilizátory
ds úsek -> rozštěpení
RISC (RNA-induced silencing complex)
objeveny jako původci umlčování
transgenů rostlin (gene silencing)
miRNA (micro RNA)
¾ neúplná homologie s cílovou RNA
¾ antisense translační represory
¾ objeveny u C. elegans jalko stRNA
(small temporal RNAs)
Normální situace: syntéza mRNA -> transkripce
siRNA
miRNA
Nenormální situace: vadná RNA rozpoznána specifickými bílkovinami, import do jádra
Gene silencing
Gene silencing
Jádro:
Cytoplasma:
¾ interakce DNA a komunikátorové RNA
¾ kritická koncentrace RNA/DNA hybridu
¾ navázání antisense RNA k cílové RNA
¾ vznik RNA/DNA hybridu mezi RNA a
obnaženým transkribovaným chromatinem
¾ substrát pro RNA-dep. RNA polymerasu
Indukce silencingu:
¾ STOP komplexu RNA pol.II
¾ syntéza krátkých antisense RNA
¾ methylace DNA
¾ asociace degradosomu
¾ degradace
¾ maskovaná RNA
¾ chráněná před degradací
RNP komplex aberantní RNA
a spec. bílkovin
16