Svět RNA a bílkovin

Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Svět RNA a bílkovin
ZRÁNÍ pre-mRNA
C-terminální doména
Zrání pre-mRNA
Posttranskripční modifikace
Vytvoření čepičky (capping)
Polyadenylace
Sestřih
Editace
CTD platforma
1. Regulace aktivity RNAP II
¾ Defosforylovaná forma – asociace s
promotorem
¾ Fosforylace – iniciace konformačních
změn, stabilizace ternálního komplexu
2. Platforma pro asociaci komplexů
posttranskripčních modifikací
nascentního transkriptu
¾ Vytvoření čepičky, sestřih, rozštěpení,
polyadenylace
1
Zrání pre-mRNA
Zrání pre-mRNA
Posttranskripční modifikace
Posttranskripční modifikace
Čepička
Čepička
Struktura
Syntéza
Funkce
Struktura
Syntéza
Funkce
Úprava 3’-konce pre-mRNA
Úprava 3’-konce pre-mRNA
Polyadenylace
Úprava 3’-konce histonové mRNA
Polyadenylace
Úprava 3’-konce histonové mRNA
Editace pre-mRNA
Editace pre-mRNA
Typy editace
Mechanismus editace
Typy editace
Mechanismus editace
Čepička
Základní struktura čepičky: m7GpppN(m)pN(m)p
1974: mRNA několika eukaryotických virů
¾ na 5’-konci není trifosfát, ale čepička
Dnes:
¾ Čepička je na 5’-konci téměř všech eukaryotických mRNA
buněčného i virového původu
¾ Čepičce podobné struktury jsou i na 5’-konci většiny snRNA
¾ (U1, U2, U3, U4, U5)
Syntéza čepičky
¾ První „posttranskripční“ modifikace, předchází polyadenylaci i
sestřihu
¾ Kotranskripční proces započatý krátce po iniciaci transkripce
Typy čepičky:
¾ Typ 0: m7GpppN
¾ nižší eukaryota – kvasinky, houby, améby
¾ Typ 1: m7GpppN(m)
¾
Typ 2: m7GpppN(m)pN(m)
¾ vyšší organismy
2
Základní struktura čepičky: m7GpppN(m)pN(m)p
Základní struktura čepičky: m7GpppN(m)pN(m)p
Typy čepičky:
Typy čepičky:
¾ Typ 0: m7GpppN
¾ nižší eukaryota – kvasinky, houby, améby
¾
¾ Typ 1: m7GpppN(m)
¾ Typ 2: m7GpppN(m)pN(m)
¾ vyšší organismy
¾ Typ 1: m7GpppN(m)
¾ Typ 2: m7GpppN(m)pN(m)
¾ vyšší organismy
Modifikovaná čepička: 2,2,7m3GpppN(m)p
(TMG čepička)
Typ 0: m7GpppN
¾ nižší eukaryota – kvasinky, houby, améby
Zrání pre-mRNA
Posttranskripční modifikace
Čepička
Struktura
Syntéza
Funkce
Úprava 3’-konce pre-mRNA
Čepičce podobná struktura:
¾ U1, U2, U3, U4, U5 snRNA
¾ Účast při sestřihu pre-mRNA
¾ všechna eukaryota
Polyadenylace
Časování syntézy čepičky:
Úprava
3’-konce
histonové mRNA
¾ v jádře 5’-exonukleasy hydrolysující
nechráněné RNA
¾ kotranskripční, dokončena brzy po započetí transkripce
Editace pre-mRNA
¾ RNA <= 30 nukleotidů
Typy editace
Mechanismus editace
3
Kotranskripční syntéza čepičky mechanismem 1. typu
Čepičkující enzymy a jejich geny
RTasa
Vaccinia virus:
GTasa
Odštěpení γ-fosfátu z
nascentního transkriptu
RTasa
Přenos GMP z GTP
na difosforylovaný
5’-konec RNA přes
kovalentně vázaný
intermediát
MTasa Kvasinky: tři oddělené geny
¾ ScCET1 - RTasa (80 kDa)
¾ ScCEG1 - GTasa (52 kDa)
¾ ABD1 - MTasa (50 kDa)
¾ Heterodimerický a bifunkční komplex
¾ podjednotky RTasa a GTasa
GTasa
Přenos -CH3 z
S-adenosylmethioninu
na N7 guaninu
MTasa
Methylace 2’-O-ribosy
Cap I – jádro
Cap II - cytoplasma
130 kDa binární komplex (geny D1 a D12)
¾ 95 kDa – RTasa (N-konec), GTasa
(uprostřed) a MTasa (C-konec)
¾ 31 kDa – neznámá role, snad stimulátor
Cap I methyltransferasa
Cap II methyltransferasa
C. elegans: dva známé geny
¾ CEL1 – 574 aa
¾N-konec - RTasa (236 aa)
¾ C-konec - velká podobnost s
kvasinkovou a virovou GTasou
¾ C25A1.3 - MTasa (ABD1-like)
HeLa buňky: dva známé geny
¾ HCE (human capping enzyme) – 597 aa
¾ N-konec - RTasa
¾ C-konec - GTasa
¾ MTasa (55 kDa)
Čepičkující enzym mnohobuněčných živočichů je tvořen jednou
dvojfunkční dvoudoménovou bílkovinou
Méně obvyklé způsoby syntézy čepičky
Trans-sestřih
Zrání pre-mRNA
Bičíkovci (Trypanosoma, Euglena), Hlísti (C. elegans)
25% genů: operony obsahující polycistronické primární transkripty
¾ jednotlivé geny odděleny 100-400 bp spacery
Posttranskripční modifikace
Zrání polycistronické pre-mRNA:
¾ Rozštěpení a polyadenylace 3’-konce 5’-transkriptu
¾ Trans-sestřih 3’-transkriptu
¾ 22 bp SL RNA opatřená trimethylG čepičkou (jako U snRNA)
¾ Zdrojem SL RNA je 5’-konec 100 bp prekursorové RNA
transkribované RNA pol. II z repetitivní DNA (1kb repetice)
Polycistronický primární transkript
Rozštěpení
Polyadenylace
Zralá mRNA
SL RNA
Polyadenylace
Čepička
Struktura
Syntéza
Funkce
Úprava 3’-konce pre-mRNA
Polyadenylace
Úprava 3’-konce histonové mRNA
Editace pre-mRNA
Typy editace
Mechanismus editace
Trans-sestřih
„Intron“
4
Biologické funkce čepičky
Stabilizace pre-mRNA a mRNA
¾ Stabilizace pre-mRNA v jádře a mRNA v cytoplasmě
¾ Ochrana před aktivitou 5’-exonukleas
¾ Stimulace polyadenylace
CBP (cap-binding complex)
¾ Stimulace sestřihu pre-mRNA
¾ Transport mRNA z jádra do cytoplasmy
¾ Usnadnění a regulace translace
¾ Vývojová regulace v některých buňkách některých organismů
¾ Dimer CBP20 a CBP80
¾ Sestřih pre-mRNA
¾ Usnadnění navázání U1 snRNP k 5’-místu sestřihu
¾ Definice prvního (5’-) exonu
¾ Usnadnění polyadenylace
¾ Mechanismus souvisí s rozpoznáváním exonů
¾ Přítomnost čepičky a 3’-místa sestřihu má podobný efekt
¾ Nukleocytoplasmatický transport
Úprava 3’-konce pre-mRNA
Zrání pre-mRNA
¾ Nalezení polyadenylačního místa
Posttranskripční modifikace
¾ Polyadenylační signál
Čepička
¾ Odštěpení 3’-konce pre-mRNA
Struktura
Syntéza
Funkce
¾ Syntéza poly(A) řetězce
Úprava 3’-konce pre-mRNA
¾ Degradace 3’-fragmentu
Polyadenylace
Úprava 3’-konce histonové mRNA
Editace pre-mRNA
Typy editace
Mechanismus editace
¾ Endolytické (endonukleasa)
¾ Nezávisle na templátu
Význam poly(A) řetězce
¾ Export mRNA z jádra
¾ Translace
¾ Stabilizace mRNA v cytoplasmě
Výjimka – histonové mRNA
Alternativní polyadenylace
¾ Regulace degradace mRNA
5
Bílkovinné faktory podílející se na polyadenyalci
Specifikace místa polyadenylace - polyadenylační signál
Faktor
Mnohobuněční živočichové
variabilní
Zesilovač
10-30 nt
AAUAAA
Mnohobuněční živočichové
Podjednotky/Mw
Funkce
CPSF
Cleavage and
polyadenylation
specificity factor
160, 100, 73, 30
Štěpení a polyadenylace
Vazba k AAUAAA
Interakce s CstF, PAP a CF Im
CstF
Cleavage stimulation
factor
77, 64, 50
Štěpení
Vazba k downstream elementu
Interakce s CPSF
Výběr alternativních poly(A) míst
CF Im
Cleavage factor I
72/68/59 + 25
dimer - 25 kD + 1/3
velkých podj.
Štěpení
První kontakt s RNA
Vazba k CPSF
CF IIm
Cleavage factor II
Není známo
Štěpení, ???
PAP
Poly(A) polymerasa
82
Štěpení a polyadenylace
Katalyzuje polymerizaci AMP
Interakce s CPSF
PABP
Poly(A)-binding protein
33
Prodlužování poly(A)
Stimulace PAP
Kontrola délky poly(A) řetězce
10-30 nt
A
Polyadenylační signál
Oblast bohatá GU a U
DSE – downstream element
Kvasinky
UAUAUA
AAUAAA
Efficiency element
Positioning element
UAUAUA apod.
Neexistuje konsensus
PyA/Py(A)n
DSE
Nedůležité
Rostliny
U-rich
AAUAAA-like
Far upstream element Near upstream element
Neexistuje konsensus Neexistuje konsensus
PyA/Py(A)n
DSE
Nedůležité
Štěpící komplex
Poly(A) elongační komplex
Výsledek endonukleolytického štěpení: 3’-OH a 5’-fosfát
Není nutná účast
CstF, CFI a CFII
CPSF:
jádro
poly(A)osomu
Elongace poly(A) řetězce:
¾ Nezávislá na templátu, zdrojem A je ATP
¾ Klíčová role PABP
CFI – první kontakt
s RNA
Která z těchto bílkovin je vlastní endonukleasou???
Nezbytná podmínka:
vazba CPSF k AAUAAA
|
V
Předpoklad správného
navázání PAP
(PAP se špatně váže k
RNA, vazba spíše
prostřednictvím CPSF)
PABP:
¾ Váže se na rostoucí poly(A) každých 10-11 nt
¾ Spolu s CPSF zabraňuje disociaci PAP z RNA
¾ Kontrola délky rostoucího poly(A) řetězce – funkce pravítka???
6
PABP geny u rostlin
Polyadenylační faktory u rostlin
???
CPSF-like
CstF-like
PAP
Počet PABP genů:
1: S.cerevisiae, D.melanogaster
2: C.elegans, X.laevis
3: člověk
5: rýže
8: Arabidopsis thaliana
Větší množství evolučně divergentních genů
¾ Tři evoluční větve u dvouděložných i
jednoděložných
¾ Stáří nejméně 200 000 000 let
Tkáňově specifická exprese
Výrazná exprese pohlavních orgánech a
zejména v pylu
+ 1 OS
¾ Výsledek funkční nebo regulační
specializace ???
¾ Nové regulační funkce ?
¾ Úloha při skladování mRNA ???
Pozdní pylové geny
Pohlavní orgány
PABP3
Kořeny
více PABP genů
+ 1 OS
+ 3 OS
Konstitutivní, silné
Regulace délky poly(A) řetězce
Obvykle definovaná délka
Savci: cca 250 nt
Kvasinky: 60-70 nt
Polyadenylace u virů a bakterií
Viry
Rovnovážná populace mRNA
¾ dynamický jev
¾ variabilní délka poly(A) řetězce
Zrající oocyty, vajíčka a raná embrya: Translační regulace genové exprese
2 populace mRNA – translatovaná a translačně neaktivní (skladovaná)
2 Způsoby regulace délky poly(A) řetězce:
1. Zrající oocyty: aktivace nukleas –> degradace poly(A) –> translační inaktivace
2. Embrya: Kontrolované prodlužování krátkých oligo(A) řetězců během
cytoplasmatické polyadenylace -> translační aktivace
Cytoplasmatická polyadenylace
CPE (cytoplasmic polyadenylation element) a vazebné bílkoviny
Důležitá přítomnost AAUAAA
Aktivita CPSF a PAP (stejné bílkoviny jako v jádře)
Adenoviry, SV40 – využívají buněčný polyadenylační aparát
Vaccinia virus – kóduje vlastní poly(A) polymerasu
¾ Heterodimer - PAP + PABP v jednom
¾ katalytická podjednotka
¾ RNA-vazebná podjednotka
Různé viry - klouzání polymerasy po templátu (slippage)
¾ Syntéza poly(A) podle krátkých poly(U) sekvencí
Bakterie
Polyadenylace – jeden krok v procesu degradace mRNA
¾ Intaktní mRNA
¾ RNA fragmenty vzniklé endonukleolytickou degradací
Poly(A) řetězec umožňuje navázání komplexu degradujících enzymů
7
Metabolismus histonové mRNA
Zrání pre-mRNA
Replikace DNA
Posttranskripční modifikace
¾ S-fáze buněčného cyklu: syntéza DNA
Čepička
¾ koordinovaná syntéza množství histonů
Struktura
Syntéza
Funkce
Histonová mRNA –– 70 typů H mRNA (savci)
¾ fluktuace poločasu života během buněčného cyklu
¾ neobsahuje introny, není polyadenylovaná
Úprava 3’-konce pre-mRNA
¾ synchronizovaná regulace exprese všech H genů
Polyadenylace
Úprava 3’-konce histonové mRNA
¾ 35 x nárůst abundance H mRNA
Typy editace
Mechanismus editace
Formování 3’-konce
histonových pre-mRNA
konec S-fáze
S-fáze
Editace pre-mRNA
¾ úbytek H mRNA
¾ aktivace transkripce
¾ represe transkripce
¾ zvýšení stability (T1/2 = 45-60
min)
¾ destabilizace mRNA (T1/2 = 10
min)
Koordinace posttranskripční
regulace všech 70 H mRNA:
stejný 3’-konec;
vlásenka se smyčkou (SL)
stem-loop-binding protein (SLBP)
Vlásenka se smyčkou
• 6nt vlásenka, 4nt smyčka
31 kb SLBP
vážící se k vlásence
5’
ZFP100
(100 kDa zinc-finger protein)
Zodpovědný za správný průběh
zpracování 3’-konce histonové mRNA
jen v S-fázi buněčného cyklu
X
HDE (histone downstream element)
• purine-rich sekvence
• 10 nt oblast, 15 nt od vlásenky
3’
Formování 3’-konce
histonové mRNA
U7 snRNA
TMG
U7 snRNP
Místo endonukleolytického štěpení
??? Vlastní endonukleasa ???
8
Editace RNA
Zrání pre-mRNA
Posttranskripční modifikace
Čepička
Struktura
Syntéza
Funkce
Místně specifická změna
sekvence RNA odchylující
jí od sekvence DNA (RNA)
templátu, mimo změn
způsobených sestřihem a
polyadenylací RNA
Úprava 3’-konce pre-mRNA
Široce rozšířená
Polyadenylace
Úprava 3’-konce histonové mRNA
¾ Všechny skupiny organismů
¾ Bakterie, prvoci, houby, rostliny, živočichové
Editace pre-mRNA
¾ Všechny buněčné kompartmenty
¾ Jádro, mitochondrie, plastidy
Typy editace
Mechanismus editace
¾ Všechny hlavní typy RNA
¾ mRNA, tRNA, rRNA, 7SL RNA
Editace RNA
Celá řada posttranskripčních úprav RNA probíhajících
působením širokého spektra vzájemně nepříbuzných
molekulárních mechanismů
1. Místně specifická delece nukleotidů
2. Místně specifická inserce nukleotidů, které nejsou
kódovány genomovou DNA
3. Enzymatická modifikace chemické struktury
nukleotidů – konverze nukleotidů
Editace umožňuje expresi různých variant RNA bez
nutnosti změn v DNA genomu
Popsané typy editace RNA
Typ editace
Editovaná RNA
Organismus
Kde
Inserce/delece U
Různé mRNA (kRNA)
Bičíkovci (Trypanosoma, Leishmania,
Crithidia, Bodonis)
M
Delece N
Vasopressin mRNA
Hlodavci (GA)
J
Inserce N
mRNA, tRNA, SSU rRNA
Physarum a další hlenky
M
(C, U, AA, CU, GU, GC, UA),
paramyxoviry (G), Ebola (A)
Záměna N
tRNA (5’konc. 3 nt)
tRNA (3’konc. nt)
Améby, chytridiomycety
plži, hlavonožci, ptakopysk, kuře
M
Konverze C->U
ApoB mRNA
Různé mRNA, tRNA, introny
Cox1 mRNA
Savci
Vyšší rostliny
Hlenky (Physarum)
J
M, C
M
Konverze U->C
Různé mRNA
Vyšší rostliny, zejména játrovky
M, C
Konverze A->I
Glutamát receptor mRNA
Serotonin 2C receptor mRNA
Introny pre-mRNA
Mozek savců
Mozek savců
Vyšší rostliny
J
J
M
9
Zrání pre-mRNA
Posttranskripční modifikace
Čepička
Struktura
Syntéza
Funkce
Úprava 3’-konce pre-mRNA
Polyadenylace
Úprava 3’-konce histonové mRNA
Editace pre-mRNA
Typy editace
Mechanismus editace
Mechanismy inserční/deleční editace RNA
2 základní skupiny mechanismů
• posttranskripční inserce/delece
• kotranskripční inserce/delece
Posttranskripční inserce/delece U v kRNA bičíkovců
1986 – první popis editace (Benne et al., Cell 46: 819-826)
Inserce čtyř U do mRNA pro podjednotky II cytochrom oxidasy (cox) v
kinetoplastu Trypanosoma brucei a Crithidia fasciculata
Rozsah editace
• Mnohem častější inserce než delece
• Od několika nukleotidů po více než 50% výsledné mRNA (pan-editing)
Guide RNA (gRNA) – zdroj chybějící informace; 2 možné modely
• Enzymatické štěpení/ligace (cleavage/ligation model)
• Autokatalytická transesterifikace
Cleavage/ligation model
Kotva
duplex mezi gRNA a pre-mRNA
Analogie autokatalytického mechanismu sestřihu intronů
Endonukleolytické rozštěpení pre-mRNA na
konci dvoušroubovice – editační endonukleasa
Inserce – terminální uridylyl transferasa
(TUTasa)
Delece – U-specifická exonukleasa
Ligace – RNA ligasa
Komplexní mechanismus
mRNP částice - editosom
Pan-editing – více gRNA pro jednu pre-mRNA
10
Kotranskripční editace
Trans-faktory důležité pro inserci/deleci v kRNA
Specifická inserce G do mRNA pro P protein kódovaný
RNA genomem paramyxovirů
1-6 vložených G -> vznik alternativních ORF
Analogicky: inserce A do mRNA pro glykoprotein Ebola
viru
Polymerase stuttering (koktavá polymeráza):
mechanismus transkripce podle pseudotemplátu
gRNA – 50-70 bazí; obecná sekundární struktura, formování gRNP částice
3 důležité oblasti
1) kotva – homologie k editované pre-mRNA
2) vodící oblast (guide region) – templát pro editaci U
3) oligo(U) řetězec na 3’-konci – stabilizace 5’-produktu štěpící reakce
během editačního komplexu
Bílkovinné faktory – endonukleasa, TUTasa/exonukleasa, RNA ligasa,
RNA helikasa (disociace gRNA od pre-mRNA)
Mechanismus: přerušení transkripce, couvnutí mRNA po
templátu, opětovné nasednutí a pokračování transkripce
Editosom – velký multienzymový komplex
Kde: Klouzavé CnUn řetězce v RNA templátu
Mechanismy konverze nukleotidů během editace RNA
C->U: Apolipoprotein B obratlovců,
změna kodonu CAA (Glu) -> UAA (STOP)
Editosom – multiproteinový komplex;
27 kD enzym cytidin deaminasa
+ množství dalších proteinů
Mechanismy konverze nukleotidů během editace RNA
Arabidopsis
Hydrolytická deaminace
¾ po osekvenování popsáno 456 C -> U
konverzí během zrání pre-mRNA v
organelách, 441 z nich v ORF
Hydrolytická deaminace
Důležitý kontext místa editace,
regulační sekvence
Zejména:
Zejména:
C -> U
C -> U
A -> I
A -> I
11
Mechanismy konverze nukleotidů během editace RNA
A -> I
Kvasinková tRNA, introny pre-mRNA
rostlin a obratlovců (Glutamát receptor v
mozku savců)
V intronech často předcházejí sestřihu
Zrání pre-mRNA
Posttranskripční modifikace
Hydrolytická deaminace
Variabilní rozsah: 1 až >50% A v molekule
Nutné vysoce organizované struktury RNA
Čepička
Struktura
Syntéza
Funkce
Úprava 3’-konce pre-mRNA
Adenosin deaminasa aktivní na dsRNA
Polyadenylace
Úprava 3’-konce histonové mRNA
Rodiny ADAR a ADAT
Adenosin deaminasa
aktivní na RNA či tRNA
Editace pre-mRNA
Typy editace
Mechanismus editace
12