1. Struktura a replikace DNA
Transkript
Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Čtvrtek 11:30 – 13:00 1. Struktura a replikace DNA (25.09.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D) 2. Metody molekulární biologie I (09.10.2014, Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D) 3. Metody molekulární biologie II (23.10.2014, Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D) 4. Transkripce genu a její regulace (06.11.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D) 5. Molekulární biotechnologie a transgenní organismy (20.11.2014, Doc. Mgr. P. Galuszka, Ph.D) 6. Translace a tvorba proteinů (04.12.2014, Mgr. M. Čudejková, Ph.D) 7. Test (11.12.2014) Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Mária Čudejková 1. Struktura a replikace DNA Literatura: Alberts a kol.: Základy buněčné biologie Espero Publishing, 2000 Garrett & Grisham: Biochemistry 2nd ed., Saunders College Publishing, 1999 Nositelem genetické informace je DNA • Griffith (1928) naočkoval baktérie způsobující penumónii do myší • Směs tepelně denaturovaného virulentního typu S a nevirulentního typu R myši usmrtila • Vysvětlení: typ R byl transformován typem S! • Avery (1944) prokázal, že transformaci způsobuje DNA! Griffithův pokus na myších Další důkazy • Lederberg a Tatum (1946) ukázali, že 2 kmeny E. coli lišící se autotrofií vůči aminokyselinám jsou schopny si vyměňovat geny Další důkazy • Hershey a Chase (1952) při studiu bakteriofágů, označili jeho DNA s 32P a proteiny s 35S • Další generace bakteriofága produkovaná po infekci baktérií obsahovala 32P (tedy DNA z původního bakteriofága), ale ne 35S (z původních proteinů)! Základní „dogma“ molekulární biologie Nukleové kyseliny, DNA a RNA (primární struktura) • Polymery spojené 3' - 5' fosfodiesterovou vazbou • Základní složky nukelových kyselin (monomery) tvoří: 1. fosfát – zbytek kyseliny ortofosforečné 2. ribonukleosid (RNA) / deoxyribonukleozid (DNA): - ribóza (RNA) / deoxyribóza (DNA) - dusíkatá báze: - purínové (A, G) - pyrimidínové (T, C, U) AMP - Adenosinmonofosfát Základní složky nukleových kyselin RNA vs. DNA • Sekvence se vždy čte od 5' -konce k 3' –konci • V sekvenci genu to odpovídá od N-konce k C-konci proteinu • DNA – jeden typ, jedna úloha – uložení genetické informace • RNA - 3 základní typy a úlohy - ribosomální RNA (rRNA) – struktura a funkce ribosomu - mediátorová RNA (mRNA) – přenáší informace o genech - transferová RNA (tRNA) – přenáší aminokyseliny • Další typy RNA – snRNA, snoRNA, mikro RNA, atd. Rozdíly mezi DNA a RNA Proč DNA obsahuje thymin? • Cytosin samovolně deaminuje a vytváří uracil • Enzymy opravující chyby v DNA jsou schopny rozpoznat tyto „mutace“ a nahrazují takovýto uracil cytosinem • Jak byl ale tyto enzymy rozpoznaly přirozený uracil od mutantního? • DNA tedy obsahuje thymin (5-methyl-uracil) namísto uracilu Proč je DNA 2'-deoxy a RNA není? • Vicinální -OH skupiny (2' a 3') v RNA způsobují její náchylnost k hydrolýze • DNA, která neobsahuje 2'-OH je stabilnější • Důvod – genetický materiál musí být stabilní • RNA je použita a poté degradována Dvoušroubovice DNA (sekundární struktura) • Erwin Chargaff měl data o párování bazí, ale nedokázal je interpretovat (A=T, G=C, zastoupení báz se mezi různymi organismy liší) • Rosalinda Franklinová získala difrakční X-ray data vlákna DNA • Francis Crick objevil, že je to šroubovice (helix) • James Watson odvodil princip párování bazí prostřednictvím vodíkových vazeb • Objev struktury DNA – 1953 Rentgenový difraktogram svisle orientovaného vlákna DNA. Antiparalelní dvoušroubovice • Existuje několik konformací DNA – Watson-Crickovská pravotočivá B-DNA, pravotočivá A-DNA, pravotočivá C-DNA, a levotočivá Z-DNA … http://biostudia.blogspot.cz/20 13/08/konformacni-rodinydna.html Struktura DNA a párování bazí • E. coli - průměr vlákna 2 nm, délka 1.6 x 106 nm, složená struktura (buňka E. coli má délku 2000 nm) • Lidská DNA ~2 metry, jádro buňky 5 µm, DNA uložena ve formě chromatinu, histony Struktura dvoušroubovice DNA Terciární struktura DNA • Prostorové uspořádání dvoušroubovice • Nadšroubovicové vinutí - superhelix DNA (a nebo např. dvoušroubovice uzavřená do kruhu, nebo lineární dvoušroubovice připevněná o podklad) • Terciární strukturu zabezpečují enzymy - topoisomerasy http://www.cliffsnotes.com/sciences/biology/biochemistryii/dna-structure-replication-and-repair/dna-and-rna-structures Buňka obsahuje kompletní genetickou informaci o organismu Strom života Bacteria, Archaea ~ 1.000-4.000 genes, Eukaryotes ~ 6.000-30.000 genes Prokaryota Struktura eukaryotní buňky Chromosomy u člověka Velikost genomů (bp – base pairs) Amoeba dubia ~ 670.000.000.000 Homo sapiens ~ 3.000.000.000 Paradox hodnoty C (velikost genomu není v souladu s komplexitou organismu) Velikost genomu Velikost genomu Porovnání velikostí různých genomů Replikace DNA Semikonzervativní model • Prokázali Matthew Meselson a Franklin Stahl (1958) pomocí izotopového značení • Replikace DNA vede k vytvoření dvou DNA molekul, ve kterých je jedno vlákno z původní a druhé zcela nové Replikace DNA • Syntéza DNA začína v replikačních počátcích (typická sekvence, bohatá na AT, bakterie – jeden rep. počátek, eukaryota – více rep. počátků, iniciační proteiny) • Syntéza DNA probíhá v tzv. replikačních vidličkách http://biochemhelp.com/dna-replication-in-prokaryotes.html Vlastnosti replikace DNA Nejlépe prozkoumány u E. coli, mnohé vlastnosti obecné • Replikace je obousměrná - probíhá ve dvou replikačních vidličkách, které se pohybují v opačných směrech • Dvoušroubovice musí být rozvinuta - helikasy • Překroucení (supercoiling) musí být kompenzován - DNA gyrasa (topoisomerasa typu II) • SSB proteiny (single strand binding) ochraňují jednovláknovou DNA před znovuspárováním • DNA replikace je semidiskontinuální: Vedoucí vlákno se replikuje průběžně Druhé vlákno se replikuje v protisměru prostřednictvím Okazakiho fragmentů, které musí být poté spojeny (Tuneko and Reiji Okazaki) Replikační vidlička • DNA-dependentní DNA-polymerázy syntetizují komplementární vlákno DNA jen jedním, a to 5´ - 3´ směrem! • DNA-polymeráza nedokáže začít syntetizovat nové vlákno – enzym primáza syntetizuje k DNA komplementární RNA primer, který pak DNA-polymeráza využije pro syntézu nového vlákna DNA • RNA-primery jsou odstraněny a DNA je dosyntetizována opravnou DNA-polymerázou • Okazakiho fragmenty jsou spojeny dohromady DNA-ligázou Replikační vidlička a replikační aparát http://bnzm.wordpress.com/what-are-retroviruses/ Důkaz obousměrné replikace DNA Enzymologie replikace DNA DNA polymerasa I (opravná DNA polymerasa) • U baktérie E. coli Arthur Kornberg (1957) prokázal existenci DNA polymerasy I • DNA pol I vyžaduje všechny 4 nukleotidy, templát a primer, který se páruje s templátem a vytváří krátký úsek dvoušroubovice • Replikace probíhá od 5' k 3' - konci, nukleotidy jsou připojovány od 3'-konce vlákna • DNA pol I katalyzuje kolem 20 cyklů polymerizace než se nové vlákno oddělí od templátu • Pol I z E. coli je monomer, 928 aminokyselin (109 kDa) • Kromě 5'-3' polymerásové aktivity, enzym má také 3'-5' a 5'-3' exonukleasové aktivity 3´ - 5´ exonukleasová funkce (odstraňuje chybný/nepárový nukleotid) 5´ - 3´ exonukleasová funkce (vyštepuje primery RNA) E. coli DNA Polymerasa I DNA Polymerasa III „Hlavní" polymerasa u E. coli = DNA-replikasa • Deset rozdílných podjednotek • „Jádro" enzymu má 3 podjednotky – - polymerasa – - 3´ - 5´ exonukleasa – - neznámá funkce • β – podjednotka vytváří prstenec kolem DNA • Procesivita - 5 millionů bazí! E. coli DNA Polymerasa III DNA replikace u eukaryot Stejný princip jako u E. coli, ale komplexnější • Lidská buňka: kopírování 6 miliard bp • Mnoho počátků replikace: 1 na 3 - 300 kbp • Známo několik DNA polymeras • DNA-polymerasa α - 4 podjednotky - polymerasová aktivita (procesivita = 200) - primasová aktivita - ne 3´ - 5´-exonukleasová aktivita Buněčný cyklus Jiný způsob vzniku DNA RNA-řízená DNA polymerasa • Howard Temin (1964) pozoroval, že inhibitory DNA syntézy zabraňují infekci buněk v kultuře RNA viry – DNA tedy zprostředkovává replikaci viru. • Temin a Baltimore (1964) nezávisle objevují RNA řízenou DNA polymerasu – „reverzní transkriptasu“ Opravy poškozené DNA Základní rozdíl oproti RNA, proteinům, lipidům, atd. • Všechny ostatní složky mohou být nahrazeny, ale DNA musí být zachována • DNA v buňkách podléhá kontinuálnímu poškozování • Buňky potřebují nástroje pro opravy chybějících, pozměněných nebo nesprávných bazí, opravy insercí a delecí, poškození UV zářením – pyrimidinové dimery, přerušení vlákna, cross-link • Existují dva základní mechanismy oprav: oprava chyb v párování bazí (mismatch repair) a opravy chemického poškození Mutace odpovědná za vznik genetické choroby – srpkové anémie Opravy chyb v párování bazí (Mismatch repair) • Opravné enzymové systémy kontrolují dvoušroubovici DNA a identifikují nesprávně párované báze, poté vyříznou chybný usek a nahradí jej. • Příkladem je methylační dráha u E. coli. • Methylace DNA probíhá po replikaci, takže tento systém identifikuje methylovaný řetězec jako původní a opraví nesprávně párovanou bázi na druhém řetězci. Restrikční endonukleasy • Baktérie dokážou zabránit ("restrict„) možnosti útoku cizí DNA pomocí restrikčních enzymů • Restrikční enzymy Typu II a III štěpí řetězce DNA na místech specifické sekvence • Tyto enzymy rozpoznávají sekvence 4, 6 nebo více bazí a štěpí je. • • Názvy těchto enzymů používají 3-písmenný kód (psaný kurzívou): 1. písmeno označuje rod, 2. a 3. písmeno druh organismu • Např. EcoRI je první restrikční enzym nalezený v kmeni R baktérie Escherichia coli. Opravy chemického poškození DNA Tvorba pyrimidinových dimerů působením UV záření Pyrimidinové dimery mohou být přímo opraveny enzymem fotolyasou Opravy chemického poškození DNA • Vystřihnutí a oprava: DNA glykosylasy odstraní poškozenou bázi a vytvoří AP místo. • AP (Apurinic/apyrimidinic) endonukleasa rozštěpí poškozený řetězec, endonukleasa odstraní několik residuí okolo a mezera je vyplněna pomocí DNA polymerasy a DNA ligasy. Oprava poškozené báze v DNA Mechanismus genové rekombinace (rekombinační oprava) • Obecná rekombinace: výměna homologních segmentů mezi dvěma molekulami DNA (crossing-over během meiozy) • Robin Holliday (1964) navrhl model využívající jednovláknového naštípnutí v homologních místech. • Dochází k rozvinutí dvoušroubovice a propojení (ligaci) dvou naštípnutých homologních řetězců – vzniká Hollidayovo spojení (Holliday junction) Holliday junction https://www.shef.ac.uk/mbb/ruva/ruva-020 http://www.learnerstv.com/animation/animat ion.php?ani=169&cat=Biology
Podobné dokumenty
Struktura a replikace
(a nebo např. dvoušroubovice uzavřená do kruhu, nebo
lineární dvoušroubovice připevněná o podklad)
• Terciární strukturu zabezpečují enzymy - topoisomerasy
Svět RNA a bílkovin
Trans-faktory důležité pro inserci/deleci v kRNA
Specifická inserce G do mRNA pro P protein kódovaný
RNA genomem paramyxovirů
1-6 vložených G -> vznik alternativních ORF
Analogicky: inserce A do mR...
stáhnout soubor
celému problému se snahou zjednodušit celou problematiku. Proti názoru, že člověk je vždy
ovlivňován celou řadou faktorů, které spolu navzájem souvisí, ovlivňují se a nelze je od sebe
oddělovat bez...
autotrofie buňkami single
přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou
informaci ve formě dsDNA (rezistence k antibiotikům, metabolismus
nezvyklých substrátů apod.) 2-100kb
Vybraná témata pro výuku chemie - Učitel chemie
partnerů (s podobnou energií a vhodnou symetrií). Překryvem atomových orbitalů
dojde ke vzniku nových molekulových orbitalů, které se rozprostírají přes dva a více
atomů (tedy přes vzniklou molekul...
H avaj aneb „Z horské vesničky až na konec světa“ (27.6
Kahoolawe a největším z nich Hawaii, který dal jméno celému souostroví. Rozloha těchto osmi
ostrovů je momentálně 16759 km². Momentálně proto, poněvadž sopky ostrov Hawaii stále ještě
„přistavují“....
Zobrazit dokument - Gymnázium Trutnov
Franzisceum Zerbst a Litherland High School v Liverpoolu ve Velké Británii. Nikoliv každoročně, ale spíše podle okamžitého zájmu našich žáků
a druhé strany výměny, konáme pro žáky zájezdy do Franci...