autotrofie buňkami single

Základy klonování a genového
inženýrství
KBC/BAM - Pokročilé biochemické a biotechnologické metody
KLONOVÁNÍ
Molekulární klonování:
• multikrokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA
• spojení vybraných DNA fragmentů (většinou jednoho genu) se speciálním
nosičem – vektor
• přenos vzniklého konstruktu do živých buněk (často baktérie)
• mnohonásobné namnožení vložených DNA fragmentů replikaci v živé buňce –
DNA KLONY
Buněčné klonování:
• vytváření geneticky identických buněk (organismů)
• v živé přírodě přirozené:
kolonie baktérii
řízkování rostlin
jednovaječná dvojčata
umělé ►
k4
Využití molekulárního klonování
• uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cDNA a genomové knihovny)
• produkce proteinů pro různorodé využití
• vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)
farmaceutika
zemědělství
základní výzkum
průmysl
medicína
Snímek 3
k4
retinis pigmentosa
5 milionu lidi na svete
photoreceptor glycoprotein peripherin
kokos; 18.4.2010
Příprava knock-out organismu
inserční vektor
substituční vektor
pozitivní selekce na neomycin (gen M)
knockoutovaná myš
•
•
•
•
•
gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do inzertního vektoru
gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k neomycinu)
do jeho ORF
transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na neomycinu
vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do hostitelské matky
selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu)
inzerční vektor
gen v genomu EKB
2
on
1
on
4
on
Ex 3
on
Ex
Ex
Ex
homologní rekombinace a
přerušení genu
knockoutovaná myš
• PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NESPECIFICKÉ
REKOMBINACE (antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen)
• možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci
• do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus thymidin kinasa)
mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné rekombinaci, přenese se do
genomu EKB také tento gen
• selekce GANGCYKLOVIREM prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk
• náhodně rekombinované buňky po přídavku gangcykloviru umírají
homologní rekombinace
linearizovaný substituční vektor
se
gm
en
t
2
HSVtk
Ge
ne
Ge
ne
se
gm
en
t
1
NeoR
náhodná integrace
NeoR
NeoR+/ HSVtk-
NeoR+/ HSVtk+
ZINC FINGER NUCLEASES
CÍLENÁ MANIPULACE V GENOMU
příprava knockoutovaných linií organismů
PŘIROZENÁ
REKOMBINACE
oprava dvouřetězcových zlomů
reakce na poškození DNA
HR – homologní rekombinace
NHEJ – nehomologní lepení konců
pg5
ZINC FINGER NUCLEASES
chimerické proteiny vytvořené spojením Fok I nukleasy a specifických sekvencí zvaných „zinkové prsty“
Snímek 9
pg5
The enzyme FokI, naturally found in Flavobacterium okeanokoites, is a bacterial type IIS restriction endonuclease consisting of an N-terminal
DNA-binding domain and a non-specific DNA cleavage domain at the C-terminal.[1] Once the protein is bound to duplex DNA via its
DNA-binding domain at the 5'-GGATG-3': 5'-CATCC-3' recognition site, the DNA cleavage domain is activated and cleaves non-specifically
between nine and 13 nucleotides downstream of the recognition site.
galuszka; 21.4.2010
ZINC FINGER NUCLEASES
Testování specifity ZFN
pg6
pg7
Knock-out genu pomocí ZFN
Shukla et al (2009): Precise genome modification in the crop species using ZFN. Nature 459
Snímek 12
pg6
CCR5 - chemokinovy receptor
klinicke testy 18 pacientu
deletovany homozygot je immunni vuci AIDS
galuszka; 21.4.2010
pg7
alela pouze u kavkazoidni rasy, zafixovala se zřejmě během morovych pandemii
galuszka; 21.4.2010
KLONOVACÍ VEKTORY
A) Bakteriální a kvasinkové – PLASMIDY
•
přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou
informaci ve formě dsDNA (rezistence k antibiotikům, metabolismus
nezvyklých substrátů apod.) 2-100kb
•
replikují se nezávisle na baktérii
•
vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených
1970 - pBR (Bolivar a Rodriguez)
•
•
•
•
•
4.36 kb menší než je přirozeně se
vyskytující v E.coli
oriV vlastní počátek replikace
rezistence k Amp a Tc
unikátní restrikční místa
kapacita pro inzertovou DNA 1-5 kb
ori
MCS (multiple
cloning site - polylinker)
(
Unikátní synteticky vytvořená
sekvence, obsahující za sebou
jdoucí restrikční místa
frekventovaných restrikčních
endonukleas
počátek replikace oriV
• cca 300 bp
• kóduje sekvenci „antisense“ RNA,
která iniciuje DNA replikaci (slouží
jako primer)
• regulace: „high copy plasmid“ např.
ColE1
• vzájemná inkompatibilita
agarosová elektroforesa plasmidové DNA
ccc – covalently closed circle
oc – open circle
genomická DNA
oc forma plasmidu
ccc forma plasmidu
linearizovaný plasmid
8 kb
6 kb
4 kb
3 kb
ccc
oc
izolace plasmidové DNA
• metoda alkalické denaturace
• ccc plasmidová DNA je stabilnější v alkalickém pH
• linearní genomická DNA se při pH 12 - 12.5 denaturuje a pak při rychle
neutralizaci precipituje
• v přítomnosti SDS a neutralizaci octanem sodným se precipitují i proteiny a RNA
izolace plasmidové DNA
pg4
Kolony s křemičitým nosičem nebo aktivními DEAE skupinami
DEAE matrice
Výtěžky: 1ml LB média 10μg DNA (high-copy plasmid)
1ml LB média 0.5μg DNA (low-copy plasmid)
křemičitá matrice
+ chaotropní sůl
Snímek 18
pg4
DEAE cistci pro transfekce
chaotropni sul jsou obecně iontové sloučeniny, které snižují strukturovanost vody. Ve vodě v tekutém stavu totiž vznikají přechodně vodíkové
můstky mezi kyslíkem a vodíkem sousedních molekul, takže je určitým způsobem "strukturovaná". V molekulární genetice je využíván fakt, že
molekuly DNA v přítomnosti chaotropních solí adherují na SiO2, tedy obecně na skleněný povrch. ionty guanidinu.
galuszka; 20.4.2010
k8
KLONOVACÍ VEKTORY
F) bakteriální - BAC umělé bakteriální chromosomy
(bacterial artificial chromosomes)
odvozené od E.coli F-plasmidu (fertility plasmid), „low copy“ 1-2 kopie na
buňku
VÝHODY oproti YAC:
- stabilita (cirkulární)
- snadná manipulace
- potlačení rekombinace
Vhodné fragmenty genomické DNA pro ligaci
jsou získány pulsní gelovou elektroforesou
VELKÝ VÝZNAM PŘI MANIPULACI S CELÝMI GENOMY
INVITROGEN
Snímek 19
k8
par A B C dulezite pro rozdelovani do dcerinych bunek
repE helikasa
musi se rust v bakteriich s deletovanyma rekombinasama
kokos; 22.4.2010
SCREENING BACových knihoven pomocí „3D-poolování“
Heterologní expresní systémy
• Bakteriální
• Kvasinkové
• Hmyzí buňky
• Savčí buňky
• Transgenní rostliny
charakteristika
E. coli
kvasinky
hmyzí buňky
savčí buňky
buněčný růst
rapidní (30min)
rapidní (90min)
pomalý (18-24h)
pomalý (24 h)
požadavky na růstové
medium
minimální
minimální
komplexní
medium
komplexní
medium
cena růstového media
nízká
nízká
vysoká
vysoká
množství exprimovaného
proteinu
velké
malé až velké
malé až velké
malé nebo
střední
extracelulární exprese
sekrece do
inkluzních tělísek
sekrece do
media
sekrece do
media
sekrece do
media
obvykle nutné
dodatečné složení
v některých
případech
nutné
dodatečné
složení
řádně složené
proteiny
řádně složené
proteiny
N-glykosylace
-
vysoký obsah
manosy
jednoduché,
bez sialové
kyseliny
komplexní
O-glykosylace
-
+
+
+
fosforylace
-
+
+
+
acetylace
-
+
+
+
acylace
-
+
+
+
γ-karboxylace
-
-
-
+
posttranslační modifikace
skládání proteinů
rekombinatní genetická informace je vklonována do
vhodného expresního plasmidu, nedochází k integraci
do genomu
TA klonování
Taq polymerasy bez 3´- 5´ samoopravné aktivity přidávají na 3´konce dATP
pg8
TA TOPO klonování
linearizovaný vektor ošetřen DNA topoisomerasou I
rychlá reakce bez účasti T4 DNA ligasy
Snímek 25
pg8
The key to TOPO® cloning is the enzyme DNA topoisomerase I, which functions both as a restriction enzyme and as a ligase. Its biological
role is to cleave and rejoin DNA during replication. Vaccinia virus topoisomerase I specifically recognizes the pentameric sequence
5´-(C/T)CCTT-3´ and forms a covalent bond with the phosphate group attached to the 3´ thymidine. It cleaves one DNA strand, enabling the
DNA to unwind. The enzyme then relegates the ends of the cleaved strand and releases itself from the DNA. To harness the religating activity
of topoisomerase, TOPO® vectors are provided linearized with topoisomerase I covalently bound to each 3´ phosphate
galuszka; 21.4.2010
rekombinační klonování
• místně specifický rekombinační systém bakteriofága lambda – slouží k integraci do
genomu hostitele (aktivuje lysogenní cyklus)
attB x attP ↔ attL x attR (“x” znamená rekombinaci).
rekombinační klonování
• rekombinace probíhá v obou směrech a je katalýzována proteiny z λDNA i
bakteriálními.
• selekce antibiotikum a gen ccdB mezi rekombinantními místy, protein ccdB
inhibuje bakteriální DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk nesoucí prázdný vektor
vstupní vektor
destinační vektor
• Invitrogen dodá
dodává všechny typy vektorů
vektorů kompatibilní
kompatibilních pro rekombinantní
rekombinantní klonová
klonování
• reakce trvá
trvá 1 hodinu př
při laboratorní
laboratorní teplotě
teplotě
• zachová
zachovávání čtecí
tecích rá
rámců
mců (ORF), žádné
dné slož
složité
ité plá
plánová
nování
Klasické klonování do vstupního vektoru:
• pENTR vektory udržované v E.coli kmen DB3.1 (mutovaná gyrasa tak, že je
necitlivá na ccdB inhibici)
• po rekombinaci dvojitá selekce (1) na antibiotikum a (2) v sensitivním kmeni
k ccdB – nerostou nezrekombinované plasmidy
• 100% účinné není třeba selektovat pozitivní klony
přímá amplifikace s primery obsahující rekombinační sekvence:
attB1
attB2
rekombinace do donorového vektoru:
• pENTR a pDONR: pomocné vektory
• pDEST: cílové vektory k použití
LR reakce
se účastní integrasa a ekscionasa (αDNA)
a IHF (integration host factor) z bakterie
BP reakce
se účastní IHF a integrasa
rekombinační klonování
PG2
N-terminal 6xHis tag
umožňuje velice účinnou purifikaci
proteinu
pomocí
metal-chelatační
chromatografie popř. detekci pomocí
Anti-HisG protilátky
EK
rozpoznávací sekvence pro specifickou
enterokinasu, odštěpuje His-tag
T7 transcription termination region
silný terminační systém T7 bacteriofága
T7
promotor
přesná
heterogenního proteinu
a
silná
exprese
Ribosome binding site
TOPO klonovací
klonovací místo pro PCR produkt
Xpress™
Xpress™ epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-AspLys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí
Anti-Xpress™ protilátky
gen pro rezistenci k ampicilinu
umožňuje selekci plasmidu v E. coli
pUC origin zajišťuje vysokou replikaci
plasmidu a růst E. coli
C-terminal V5 epitope tag
umožňuje detekci fúzního
pomocí Anti-V5 protilátky
proteinu
Snímek 32
PG2
T7 bakteriofág, nejsilnější známy promotor, T7 RNA polymerasa je v baktérii pod IPTG inducibilním promotorem
galuszka; 11.3.2007
exprimovaný protein
reverse primerTAG
„“
signální peptid
exprimovaný protein
V5 epitop
his tag
ATGforward primer
detekce
izolace
reverse primerTAG

his tag
x-press
„“
signální peptid
exprimovaný protein
forward primer
izolace
detekce
PG3
usnadnění izolace rekombinantního proteinu
koncové značky
nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy):
 His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni)
 FLAG epitope - tag DYKDDDDK
(Sigma; specifická protilátka)
 CBP - calmodulin binding peptide
(26 AK)
 CBD - cellulose binding domain
Snímek 34
PG3
FLAG hydrofilní epitop rozpoznatelný specifickou protilátkou
celulosa váže aromatické residua AK
galuszka; 11.3.2007
izolace proteinu z bakteriální kultury:
• pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek, rozbití buněk tepelným
šokem, případně sonifikací nebo lysozymem
IB
wash I
wash II
100mM
200mM
imidazol
0.5mM
1M
IB
marker
• poté je nutno protein renaturovat - SLOŽITÉ!!!!
bakt.extrakt
• pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a
denaturace 9M močovinou nebo guanidium chloridem
k1
tagy založené na sacharid-vazebných proteinech
k2
k3
MBP - maltosa binding protein - amylosa
CBP - intein – chitin binding protein - chitin
Snímek 36
k1
inteiny - proteinové introny
kokos; 17.4.2010
k2
The most likely mutation is in the rop gene because rop mutants have increased plasmid copy number, and temperature sensitive mutations
are most often due to changes in protein structure. An alternative explanation is that the mutation destablizes a stem-loop structure in the RNA
which plays a role in regulation. (It is possible to obtain temperature sensitive mutations that decrease the stability of nucleic acid hybrids but,
since most nucleic acid hybrids involve a considerable number of base pairs, a single nucleotide substitution is unlikely to have a substantial
effect on the Tm of the hybrid. Furthermore, in this case the hybrid is between complementary strands so a nucleotide substitition would result
in a different base pair at that position, not mispairing at that position.)
kokos; 17.4.2010
k3
15 -30
uvolneni represe az 1000 kopii
kokos; 17.4.2010
Který kmen E.coli zvolit?
tonA
tonA mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony
lacZ
lacZ.M15 částečná delece wild-typového lacZ genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci
potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal
endA1
endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA
lacIq
lacIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru; zrušení přídavkem IPTG
mcrA
mcrA, mcrBC
mcrBC,, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA
recA1
recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA
F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli
Nejpoužívanější laboratorní kmeny E.coli
kmen
mutace
účel
firma
BL21(DE3)
deficientní
deficientní na
proteasy
obecná
obecná exprese
Stratagene
BL21 (DE3)
pLysS
deficientní
deficientní na
proteasy,
proteasy, exprese
lysosymu
přesně
esně řízená
zená exprese
Novagen
BL21 Star
(DE3)
RNaseE mutant
exprese s redukovanou degradací
degradací
RNA
Invitrogen
DB3.1
gyrA462
gyrA462 alela
propagace GATEWAY vektorů
vektorů
s toxickým genem ccdB
ccdB
Invitrogen
DH5λ
DH5λ
první
první laboratorní
laboratorní
kmen
propagace plasm
plasmidu,
idu, klonová
klonování.
Life
Technologies
Origami (DE3) trxB a gor mutant
exprese, tvoř
tvoří disulfidické
disulfidické můstky
v cytoplasmě
cytoplasmě
Novagen
Rosetta
Geny pro argU,
argU,
argW,
argW, glyT,
glyT, IleX,
IleX,
leuW,
leuW, metT,
metT, proL,
proL,
thrT,
thrT, thrU,
thrU, and
tyrU
exprese eukaryotní
eukaryotních genů
genů
Novagen
Top10
ara mutant
propagace plasmi
du,, klonová
plasmidu
klonování.
Invitrogen
regulace exprese pod T7 promotorem
• exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným
promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10
pro obalový protein
• pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA
polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou
expresi.
• v sytému pCR®T7 TOPO® TA Expression je exprese T7 RNA
polymerasy indukována lacZ promotorem pomocí IPTG a tento
systém je uložen v genomu hostitelských buněk
kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS
•
před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je
exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se
pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein
•
kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod
lacZ promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož
inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti
pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený do
genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG)
•
někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a
pokud je pod T7 promotor vložen gen produkující toxický produkt pro
E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě
plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym
(produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou
expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol.
•
T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat
bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA
polymerasa se dostane z této inhibice
•
T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci,
naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou
izolaci exprimovaného proteinu.
Jaké geny lze v E.coli exprimovat?
• většinu z prokaryotických organismů
• eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním
modifikacím
• většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná)
• geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA
(podobný genetický kód, evoluční příbuznost)
• všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě
stabilizace exprimovaného proteinu
2004
SUMO peptide – Small Ubiquitin like MOdifier
ochrana před proteolýzou
zvyšování rozpustnosti proteinu
zvyšuje množství exprimovaného proteinu
Sumo proteasa
kvasinkové expresní systémy
•
•
•
•
•
jednoduchá a levná exprese v eukaryotním organismu
rychlá propagace a jednoduchá média
jednoduchá manipulace s genem (klonovací systémy kompatibilní s bakteriálními,
„shuttle“
shuttle vektor)
vektor
většinou lze produkovat nativní proteiny z vyšších eukaryot (správná posttranslační
modifikace – glykosylace, folding)
jednoduchý a prozkoumaný systém pro sekreční expresi do média
hostitelské organismy:
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Pichia pastoris
Hansela polymorpha
Kluyveromyces lactis
Yarrowia lipolytica
k9
k10
Saccharomyces cerevisiae (od 1979)
SHUTTLE VEKTOR
• GAL1 promotor zajišťuje induktivní expresi
vloženého genu
• T7 promotor/priming
promotor/priming site umožňuje in vitro
transkripci a sekvenaci inzertu
• Multiple cloning site má 9 jedinečných
klonovacích míst
• CYC1 terminátor transkripce, stabilizuje mRNA
transkript
• pMB1 origin (pUCpUC-derived)
derived) udržuje „high copy“
replikaci v E. coli
• Ampicillin resistance gene selekce v bakterii
• URA3 selekce kvasinek v uracil-deficientním
médiu
• 2 μ origin udržování replikace v kvasince
• f1 origin produkce single-stranded DNA
Snímek 45
k9
epimerasa galaktosy UDP-glucosa na UDP galaktosa
kokos; 22.4.2010
k10
CYC1 cytochrom c oxidase
kokos; 22.4.2010
Saccharomyces cerevisiae
REGULACE EXPRESE
• u kmene INVSc1 je transkripce z GAL1 promotoru inhibována přítomnosti
glukosy v médiu
• transkripce je indukována odstraněním glukosy a přidáním galaktosy jako
zdroje uhlíku do média
• alternativně se může kvasinková kultura propagovat v médiu obsahující
rafinosu, která neinhibuje ani neindukuje galaktosový promotor a transkripce se
spustí pouze přídavkem galaktosy, bez nutnosti odstraňování rafinosy
HOSTITELSKÉ BUŇKY
A) standardní kmen E. coli např. TOP10F který slouží pro namnožení plasmidu, jeho
udržování a manipulaci s ním.
B) kmen S.cerevisiae INVSc1
Genotyp: MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52
Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, UraINVSc1 je diploidní kmen autotrofní na histidin, leucin, tryptofan, a uracyl.
Saccharomyces cerevisiae
SEKRECE HETEROLOGNÍHO PROTEINU V KVASINKÁCH
• sekrece proteinu v kvasinkách je komplexní proces a není zde obecně akceptovaný
sekreční signální peptid
• některé heterologní jsou sekretovány úspěšně pod svým vlastním signálem
• často se k heterolognímu proteinu přidává kvasinkový sekreční signál odvozený od
S.cerevisae genů pro invertasu (SUC2), kyselou fosfatasu (PHO5) nebo alfa-faktor
(MFa1)
POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY HETEROLOGNÍHO PROTEINU
• N-a O-glykosylace se u kvasinek liší od vyšších eukaryot a způsobuje tvorbu
neaktivního heterologního proteinu
• např. kvasinky preferuji glykosylaci manosou na zbytky treoninu a serinu zatímco
vyšší eukaryota preferuji O-glykosylaci sialovou kyselinou
• tyto rozdíly mohou způsobovat špatný folding, nestabilitu či jinou imunogenicitu od
původních proteinů
• N-glykosylace většinou probíhá bez problému
• problémy mohou nastat u složitějších proteinů s jejich fosforylací, acetylací,
methylací, miristylací a isoprenylací
• problém jsou nejčastěji kvasinkové endoproteasy, které rády napadají exprimované
cizí proteiny
g10
Pichia pastoris
• v ideálních případech poskytuje 10 až 100 krát vyšší výtěžky než klasická
Saccharomyces
• klonování a manipulace s Pichii je velmi obdobná jako pro Saccharomyces
• selekce – zeocin nebo nutriční autotrofie
• Pichia přirozeně sekretuje daleko méně vlastních proteinů než Saccharomyces zjednodušuje izolací rekombinantního proteinu
Pichia pastoris je methylotrofní organismus tzn. jako zdroj uhlíků využívá metanol
• nejdříve ho oxiduje na formaldehyd (dva geny pro alkoholdehydrogenasu) za
přítomností kyslíku, proces probíhá v peroxizomech jelikož vzniká toxický
peroxid vodíku. Kvasinková AOX má velice slabou afinitu ke kyslíku a proto je
AOX exprimováná ve velice velkém množství (5% veškeré mRNA).
• toho využívá heterologní expresní systém, kdy je transgen vložen pod AOX
promotor.
Snímek 48
g10
roste do vysoké density až sirupovitá
galuszka; 1.3.2011
Pichia pastoris
HIS4 selekce v Pichii
ampicilinová selekce v bakterií
AOX1 promotor
AOX1 terminátor
pBR322 bakteriální počátek replikace
f1 produkce ssDNA
S – signální sekvence alfa faktoru
3´AOX1 – ORF pro AOX gen –
místo pro homologní
rekombinaci
Pichia pastoris
rekombinace a integrace v Pichia pastoris
• transformace lineární plasmidovou DNA vede k integraci do genomu kvasinky
pomocí homologní rekombinace.
• transformanti vykazují vysokou stabilitu i bez selekčního tlaku
• integrace na AOX1 lokus – gen narušen
• může nastat i mnohonásobná inzerce s pravděpodobností 1-10% jednoduché
inzerce
rekombinace a integrace v Pichia pastoris
MNOHONÁSOBNÁ REKOMBINACE A INTEGRACE v
PICHII
• selekce na základě stupňující se koncentrace antibiotika v médiu
• je třeba otestovat stovky kolonií (1-10% účinnost)
různé typy selekce transformované Pichia pastoris
ANTIBIOTIKA
• zeocin 50 μg - 2000 μg /mL
• blasticidin
• Kanamycin/G418
G418
kanamycin
• nutriční autotrofie – gen pro histidinol fosfatasu (his4) – lepší pro udržování
integrity transformanta při kultivacích ve velkých objemech (fermentace)
• narušení genu pro AOX1 způsobuje ztrátu aktivity alkohol dehydrogenasy a
kvasinka získává MutS fenotyp (methanol utilization slow). Je schopná zpracovávat
metanol pouze AOX2 (která má daleko nižší aktivitu 5%)
• využívá se toho pro selekci integrantů po transformaci: ti co vyrostou daleko
později než ti co mají v sobě cirkulární plasmid a nemají narušený gen pro AOX1
Pichia pastoris - glykosylace
N-glykany mají vysoký obsah manosy
Yarrowia lipolytica
•
je to lipofilní kvasinka, která spotřebovává jako zdroj uhlíku n-alkány
a mastné kyseliny
•
do prostředí sekretuje velké množství extraceluární proteasy (gen
XPR2)
•
promotor tohoto genu byl upraven, tak aby nebyl reprimovám
okolními vlivy
•
hybridní promotor má 4x opakující se tandemové části z pXPR2 a
vykazuje konstitutivní expresi
•
za hybridní promotor je vložená signální sekvence proteasy XPR2
nebo sekretované lipázy
•
klonovací místo SfiI a KpnI (XbaI)
Yarrowia lipolytica
•
•
•
•
•
vektory jsou integrativní (rekombinatní DNA se zabudovává do genomu
kvasinky) odvozené od základního plasmidu pBR322
pINA1267 – mono-integrativní (homologní rekombinace na Po1g lokus, který byl
klonován do hostitelského kmene kvasinky do Leu2 genu, linearizace přes
jedinečné NotI místo
pINA1294 – mnohonásobná integrace, do vektoru vložená Ylt1 retraspozonová
sekvence, která aktivuje nehomologní rekobinaci do genomu kvasinky
hostitelský kmen na knockoutovány geny pro extracelulární proteasy
do hostitelské Yarrowia je vložen gen Suc2 ze Saccharomyces který umožňuje
růst nového kmenu na sacharóze (snadnější propagace)
Heterologní exprese v Yarrowia lipolytica
srovnání s ostatními heterologními systémy
exprese kukuřičného enzymu cytokinin oxidasy/dehydrogenasy
Escherichia coli (pTYBII cytosolická exprese s protein fusován s inteinem)
± 5 mg/litr média
3 dny
Saccharomyces cerevicae (pYES2 sekrece do média)
± 2 μg/litr média
2 měsíce
Pichia pastoris pPICZ-A (přirozený signální peptid)
±10 μg/litr média
3 týdny
Pichia pastoris pPICZ-α (signální peptid z kvasinky)
1 mg/litr média
Yarrowia lipolytica pINA1294 (signální peptid z kvasinky)
5mg/litr média
přirozený zdroj – kukuřice (purifikace)
2 μg/kg média kukuřičných zrn
3 týdny
1 týden
3 měsíce
mutace místně cílená
(site-directed mutagenesis)
• gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba mít v libovolném vektoru
• navržení dvou reverzně komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat,
nesoucí tuto mutaci
• vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží
u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick)
• ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA,
templátový plasmid)
• transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu
• 100% účinnost není třeba selekce mutovaný/nemutovaný
mutace místně cílená
originá
originální
lní plasmid
(site-directed mutagenesis)
původní sekvence
forward primer
reverse primer
M
G
A
L
L
W
L
5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’
3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’
5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’
M
G
A
L
L
S
L
nastavení
nastavení PCR
s PfuTURBO Taq
PCR s ní
nízkým
poč
počtem cyklů
cyklů
PfuTURBO termostabilní DNA polymerasa
- nejmenší chybovost
- 3´- 5´exonukleasová aktivita
DpnI
restrikce s DpnI
XL10-Gold kmen E.coli
- nemá knockoutované metyltransferasy
transformace
a namnož
namnožení
ení
CÍLENÁ MUTACE
KOZAKOVÁ SEKVENCE je důležitá pro efektivitu translace (umožňuje
pevnou vazbu malé ribozomální podjednotky na mRNA) u eukaryot.
gccRccATGG
obratlovci
cAAaATG
Drosophila spp.
Saccharomyces cerevisiae aAaAaAATGTCt
rostliny
aAcaATGGc
-6 -5 -4
Kozak seq. U A A
AtCKX1
AtCKX2
HvCKX2
G
A
A
U
A
G
A
A
A
-3 -2 -1 start codon +4 +5 +6
A C A
A U G
G C U
60%
100%
70%
G
C
G
A
A
C
A
A
C
A
A
A
U
U
U
G
G
G
G
G
A
G
C
G
A
U
G
syntéza genů na zakázku
Minimum charge 0 – 999 bp 1000 – 1999 bp 2000 – 3000 bp
price/bp
$159
turnaround time 12#
$0.39/bp
$0.39/bp
$0.39/bp
12#
12#
17#
syntéza DNA
ochrana N-bází
FOSFORAMIDIT
Syntéza umělého genu
odchylky v genetickém kódu
snižují výtěžek heterologní exprese
výjimky:
jiná preference:
kodón pro arginin (6 různých):
CGU
CGA
CGG
CGC
E. coli
AGA 2.2%
AGG 1.6%
AGA
AGG
Arabidopsis th.
H. sapiens
AGA 18.9%
AGG 11.0%
AGA 11.9%
AGG 12.1%
Optimalizace syntetického genu firmou Mr.GENE
1. Úprava kodonů
2. Vyvarování se terciárním strukturám mRNA
3. Vyhledávání specifických motivů např.
Shine-Dalgarnova sekvence 5'-AGGAGGU-3'
polyadenylační signály
NOVÉ METODY SEKVENCOVÁNÍ:
Pyrosekvencování
DNA polymerasa
dNTP mix
ATP sulfurylasa
Adenosine 5 fosfosulfát
Luciferasa
Luciferin
Apyrasa
1. Izolace genomové
genomové DNA a restrikce na vhodné
vhodné fragmenty (300(300-800 bp)
bp)
2. Zatupení
Zatupení konců
konců a navá
navázání adaptorové
adaptorové sekvence s biotinovou
znač
značkou (modrá
(modrá) a druhé
druhé bez (č
(červená
ervená)
3. Navá
Navázání na kulič
kuličky se streptavidinem
4. Nanesení
Nanesení na mikroreaktorovou destič
destičku
5. Provedení
Provedení emulsní
emulsního PCR (č
(červený a modrý primer)
primer)
6. Paralelní
Paralelní pyrosekvencová
pyrosekvencování ve vš
všech jamká
jamkách
Roche 454/GS FLX Sequencing Technology
Illumina/Solexa
1.
2.
4.
5.
metoda cyklické reverzibilní terminace
3.
6.
„Bridge“ PCR
cyklická reverzibilní terminace
Chemické štěpení ve vodném
prostředí za katalýzy paladiem
DEALLYLACE
Illumina/Solexa - vyhodnocení
SROVNÁNÍ
platforma
Příprava
templátu
chemismus
Délka
jednoho
čtení
(bp)
Doba
běhu
Přečtené
Gb
na jeden
běh
Cena
přístroje
(USD)
ROCHE
454
Fragmentace
+ emulsní
PCR
ILLUMINA
SOLEXA
Fragmentace
+ „bridge“
PCR
Cena
přečtení
lidského
genomu
pyrosekvencování
330
8
hod.
0.45
500.000 1.000.000
Cyklická
reverzibilní
terminace
35
9 dní
35
540.000 200.000
ROCHE 454 + dlouhé běhy, lze dělat i de novo nekomplikované genomy (mikroorganismy)
+ rychlé
-- chyby v homopolymerních repeticích (AAAAAAAAA, GGGGGGGGGGG)
ILLUMINA/ + nejpoužívanější
SOLEXA
+ obrovský rozsah, resekvenace celého genomu v jednom běhu
-- nízká multiplexita
ODSEKVENOVANÉ GENOMY
největší význam DIAGNOSTIKA
•
zlevnit přesekvencování lidského genomu na 1.000 USD (do roku
2015)
(nové levnější přístupy: SOLID Applied Biosystems, HELIOS)
•
CANCER GENOME ATLAS
•
TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA-seq) – výhoda oproti DNA
čipům je že 100% postihuje alternativní sestřih a alelickou variabilitu
•
SINGLE MOLECULE SEQUENCING (Helios) – preinplantační
diagnostika
•
SOLID PHASE CAPTURE – NimbleGene™ čip vyrobený pro vychytání
kodujících sekvencí a regulačních oblastí z fragmentované genomické
DNA před vlastním vysokoúčinným sekvencováním