Metody - proteiny, NK

METODY
METODY STUDIA
PROTEINŮ
Metody studia bílkovin
Studium
• struktury – molekulární vlastnosti
• funkce – katalytické aj. vlastnosti
Podle potřeby a účelu
• izolace do potřebné čistoty
• studium in situ
Isolace – metody více či méně komplikované podle účelu
• čisté nativní bílkoviny pro studium vlastností event.
farmakologii,
• hrubé isolace pro průmysl apod
Isolační postupy – separační metody
Proč izolovat enzymy
• Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu
• Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou
• Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy
degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory snížení aktivity
cílových enzymů)
• V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové
preparáty (např. medicina urokinasa, streptokinasa ...)
Možné problémy
• Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných
bílkovin a jiných látek)
• Malá množství cílového enzymu
• Labilita enzymu
Metody studia bílkovin
Izolace – přehled metod
• desintegrace materiálu
• preparativní centrifugace
• srážecí metody, jsou založeny na změně rozpustnosti
• membránové separace
• chromatografie
• preparativní elektromigrační metody – elektroforéza
• krystalisace
Analytické postupy – včetně metod separačních
• elektroforéza a chromatografie v analytickém měřítku,
• spektrální metody
 absorpční
 disperzní
 chiroptické metody
 NMR
 rentgenostrukturní analýza,
• MS – moderní metoda umožňující i štěpení řetězce
• další speciální metody
Metody stanovení koncentrace proteinů
Metoda
Rozsah (ng)
Biuretová
0.5 - 5
Lowryho
0.05 - 0.5
UV - 280 nm
0.05 - 2
UV – 205 nm
0.01 - 0.05
Bradfordové
0.01 - 0.05
Desintegrace materiálu (homogenizace)
Izolace membránových proteinů
Membránové bílkoviny
interagující
elektrostaticky
hydrofobně
integrální
zanořené
transmembránové
Extrakce
1. vodné roztoky
• 2-5 násobek objemu vzorku
• doba extrakce 1-2 h až 24h
• stálé míchání
• vliv teploty
• pH
• koncentrace solí, chelatačních látek
• vliv substrátů a kofaktorů
2. detergenty u enzymů vázajících se na buněčné částice žlučové
kyseliny, SDS, Triton
3. organická rozpouštědla - delipidizace
aceton, n-butanol, etanol, pyridín
4. jiné enzymy - autolýza, lysozym - rozrušení b. stěny, lipasa,
fosfolipasa, proteolytické enzymy
Extrakce
5. stabilizátory - látky chránící enzymy
• 2-merkaptoethanol, cystein, dithiotreitol - chrání SH- skupiny
před oxidací
• fenylmehansulfonylfluorid - inhibitor proteinas
• chelatační činidlo EDTA - pokud enzym neobsahuje kov
H2C SH
H2C SH
HC OH
HC OH
HO CH
C SH
H2
dithiothreitol
HC OH
C SH
H2
dithioerythritol
C SO2F
H2
fenylmethansulfonylfluorid
(benzylsuldonylfluorid)
Rozpustnost proteinů je daná
• pH: rozpustnost je minimální v izoelektrickém bodě – molekula má
nulový náboj
• Iontovou silou: při zvyšující se koncentraci – vzrůstá rospustnost
(vsolovací efekt), po dosažení maxima prudce klesá (vysolování)
• Relativní permitivita (dielektrická konstanta): fyzikální konstanta
kapalin - velikost elektrostatických sil, kterými na sebe působí
nabité částice. Rozpouštědla s nižší RP než voda zvyšují tendenci
molekul se shlukovat (snižují stupeň hydratace)
• Přítomnost látek tvořících s proteiny sloučeniny typu solí nebo
koordinačních látek (ionty těžkých kovů)
• Teplota: rozpustnost s teplotou vzrůstá
Centrifugace
Podle frekvence otáček
• běžná centrifugace (frekvence 15 000-21 000 min-1)
• ultracentrifugace (30 000-50 000 min-1)
Podle dělení
• diferenciální cent. - centrifugace suspenze víckrát při
narůstající odstředivé síle
• cent. v gradientu hustoty - zónová centrifugace
- izopyknická centrifugace
Podle účelu
• cent. analytická (stanovení molekulové hmotnosti)
• cent. preparativní
Centrifugace
• Diferenční centrifugace po homogenizaci.
• Zvyšující se centrifugační síla (násobky g) umožňuje oddělení
těžšího materiálu od lehčího, případně se oddělí pevné částice od
rozpuštěných v roztoku.
Centrifugace
Zónová ultracentrifugace
Izopyknická ultracentrifugace
Srážecí metody/vysolování
Vysolování:
• mnohé proteiny jsou méně rozpustné v roztocích s vyšší
koncentraci solí
• vysolování lze provádět frakčně např. síranem amonným
• rozpustnost většiny bílkovin klesá s koncentrací roztoku
(iontovou silou)
• lineární vztah mezi log rozpustnosti a iontovou silou
log sol. = b - Ksol . m
• b = rozpustnost bílkoviny při m = 0, Ksol - směrnice přímky závislá
na druhu soli, teplotě a pH
Srážecí metody/vysolování
Globulíny
v čisté vodě nerozpustné
„salting in“ efekt - vsolování - přídavkem soli se
rozpouští
„salting out“ - vysolování - při určité koncentraci se
opět vylučují
FRAKCIONACE ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY
Je založena na snižování dielektrické konstanty vodného prostředí
• odnímání hydratačního obalu
• není nutná dialýza
• nejvhodnější je aceton
• pH isoelektrického bodu
• nízká teplota
• frakcionace - změnou konc. rozpouštědla a pH
Dialýza
Dialýza je proces při kterém se oddělují velké molekuly proteinů od
malých molekul (např. solí) přes semipermeabilní membránu.
Dializační sáček
Koncentrovaný
roztok
Pufr (ústroj)
Zahájení dialýzy
V rovnováze
%
Tepelná denaturace
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Bílkovina 1
Bílkovina 2
teplota
Chromatografické metody
CHROMATOGRAFICKÉ METODY
ionexová
afinitní
hydrofóbní
gelová molekulová síta
Chromatografické metody
Gelová chromatografie.
• Metoda slouží k oddělování velkých molekul od malých.
• Používají se kolony obsahující nerozpustné, ale vysoce
hydratované polysacharidy dextran, agarosa nebo polyakrylamid.
• Malé molekuly vnikají do hydratovaných gelů a tím se zpožďují,
kdežto velké molekuly prochází rychleji (nezpožďují se).
•
Pořadí eluce molekul z gelu je : první velké, poté střední a
nakonec malé molekuly.
• Používá se také k odsolování.
Gelová chromatografie na Sephadexu
Využívá rozdílné velikosti molekul
nosiče - polymery s póry o kontrolované specifické velikosti - Sephadexy (do 2.105),
Sepharosa, Biogel (do 108)
Gelová chromatografie na Sephadexu
Využívá rozdílné velikosti molekul
Oddělují se velké molekuly, které nepronikají dovnitř polymeru, od
malých molekul, které pronikají dovnitř gelu a tím se zpožďují.
Využití
• na odsolování (oddělení bílkoviny od solí)
• dělení bílkoviny podle velikosti molekuly
• stanovení molekulové hmotnosti
Chromatografické metody
Chromatografie na iontoměničích.
• Proteiny se oddělují na základě náboje na jejich povrchu.
• Když má protein na povrchu kladný náboj při pH 7, váže se na
kolonu polymeru obsahujícího karboxylátové skupiny, zatímco
protein s negativním nábojem se neváže.
•
Navázaný protein s kladným nábojem se uvolní přidáním chloridu
sodného do ústoje, protože sodný iont kompetuje s kladným
nábojem proteinu.
• Proteiny s kladným nábojem se váží na negativní náboj kolony
(např. karboxymethylcelulosa).
• Naopak proteiny se záporným nábojem se váží na pozitivní náboj
např. diethylaminoethylcelulosu DEAE.
Chromatografie na iontoměničích – katex –
karboxymethylcelulosa
+-+
--------+
-- - -+
---- - -+
---+
-+
C
O
Karboxymethylová (CM) skupina
(ionizovaná forma)
CH3
Celulosa
nebo
agarosa
H2
C
H2C
C
H2
H
+
+-+
---
+-+ - --
O
-
- - +-+
--
Celulosa
nebo
agarosa
H2
C
N
+
C
H2
CH3
Diethylaminoethylová (DEAE) skupina
(protonovaná forma)
Afinitní chromatografie
• Afinitní chromatografie spočívá ve vazbě proteinů na specifické
chemické skupiny (afinanty).
• Např. enzym se může vázat na afinitní kolonu s navázaným
kompetitivním inhibitorem.
nosič - raménko (1-1,6 mm) - afinant -enzym
Afinitní chromatografie
Afinitní chromatografie
1. Analog substrátu
Enzym
Afinitní
ligand
+
Nosič
Raménko
Enzym vázaný v aktivním místě
2. Imunoafinitní chromatografie
Protilátka
Proteinový epitop
+
Nosič
Raménko
Enzym vázaný na protilátku
Kvantifikace purifikačního protokolu – fiktivní protein
Stupeň
purifikace
Celkové Celková
proteiny aktivita
(mg) (jednotky)
Homogenizace
20 000
200 000
10
100
1
Vysolování
5 000
150 000
30
75
3
Chromatografie
na iontoměniči 1 000
120 000
120
60
12
Gelová filtrace
80 000
800
40
80
60 000
30 000
30
3 000
100
Afinitní chrom. 2
Specifická
Výtěžek
aktivita
(jednotky/mg)
(%)
Stupeň
Gelová elektroforéza
• Ověření úspěšnosti purifikace.
• Molekuly nesoucí náboj putují stejnosměrným elektrickým
polem. Proces se nazývá elektroforéza. V biochemii můžeme
takto dělit proteiny i nukleové kyseliny.
• Rychlost pohybu molekul v elektrickém poli závisí na síle el. pole
(E), celkovém náboji molekuly (z) a frikčním koeficientu (f):
v = E.z / f
• Proti elektrické síle E.z nesoucí molekulu s nábojem proti
elektrodě s opačným nábojem působí viskozita jako projev
interakce mezi putující molekulou a prostředím.
• Frikční koeficient f závisí na hmotnosti a tvaru molekuly a
viskozitě prostředí (h ).
• Pro molekulu ve tvaru koule o poloměru r, platí: f = 6 p. h . r
• Elektroforéza se provádí na nosiči o konzistenci gelu nebo na
papíře. Gel slouží současně jako molekulové síto.
•
Elektroforéza
ELEKTROFORETICKÉ METODY
elektrofokusace
nativní elfo
konvenční
isotachoforéza
dělení podle velikosti
SDS - elfo
elfo v gradientovém gelu
Uspořádání elektroforetické metody
Uspořádání elektroforetické metody
typy
• analytická
• preparativní
• kontinuální
• diskontinuální
nosiče
• agar
• škrob
• akrylamid
Uspořádání elektroforetické metody
DISKONTINUÁLNÍ ELFO
Zaostřující a dělící gel
Gradientový gel
Ve směru migrace se zvyšuje hustota gelu
Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE).
O
O
+
NH2
Akrylamid
N
H
H2
C
O
N
H
N,N´-Methylenbisakrylamid
S2O82-
2 SO4-
CONH2 CONH2
Persíran
Síranový radikál
(iniciátor polymerace)
CONH2 CONH2
O
NH
H2C
O
CONH2 CONH2
NH
CONH2 CONH2
Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE).
Provedení PAGE.
• Vertikální (shora dolů), molekuly se pohybují směrem
k anodě (+).
• Velké molekuly se zpožďují, malé putují v čele.
Směs
makromolekul
(proteinů)
Směr
elektroforézy
+
Elektroforeza
Porézní gel
SDS PAGE
• Modifikací je elektroforéza za podmínek denaturace – SDS-PAGE.
• Denaturačním činidlem je dodecylsíran sodný (SDS) – aniontový
detergent.
• SDS štěpí téměř všechny nekovalentní vazby v proteinech.
• Aniont SDS se váže na hlavní řetězec polypeptidu (jedna molekula SDS na
dvě aminokyseliny).
• Komplex denaturovaného proteinu s SDS získá záporný náboj, který je
úměrný molekulové hmotnosti proteinu.
O
H3C
O
Dodecylsíran sodný
S
O
-
+
O Na
Sledování čistoty proteinů
Eluované proteiny
Nenavázané proteiny
Původní vzorek
• Kromě SDS se přidává merkaptoethanol
nebo dithiothreitol k redukci disulfidových
vazeb.
• Po proběhnutí elektroforézy se proteinové
pásy vizualizují.
• Nejčastěji se používá trifenylmethanové
barvivo Coomasie blue nebo barvení
stříbrem.
• Pohyblivost většiny polypeptidů je za těchto
podmínek je přímo úměrná logaritmu jejich
molekulové hmotnosti.
Standardy
SDS PAGE
SDS PAGE
Dělení podle velikosti molekul - uniformní náboj
SDS se váže na peptidové vazby a zásadité skupiny proteinů
1.4 g SDS se váže na 1 g proteinů
Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu
Homogenát
Frakční
vysolování
1
2
Iontoměničová Molekulové síto
Afinitní
chromatografie (gelová filtrace) chromatografie
3
4
5
Stanovení relativní molekulové hmotnosti proteinů
1. Pomocí SDS-PAGE elektroforézy
2. Ultracentrifugace
3. Gelové chromatografie
4. Hmotnostní spektrometrie

Ultracentrifugace
• Centrifugace se používá k oddělení hrubých směsí buněčných
komponent.
• Při kvantifikaci rychlosti pohybu molekul v roztoku v centrifugačním poli
používáme sedimentační koeficient (s) dle rovnice:
s = m(1 – nr)/f
kde m je hmotnost částice, n je parciální specifický objem (reciproká
hodnota hustoty částice), r je hustota média, f frikční koeficient
(závisí na tvaru molekuly)
• (1 – nr) vyjadřuje schopnost prostředí nadnášet částice
• Sedimentační koeficient se obvykle vyjadřuje v jednotkách: Svedberg
(S); S = 10-13 s.
• Čím je hodnota S nižší, tím pomaleji částice sedimentuje.
• Na tomto principu je založena gradientová nebo jinak zonální
centrifugace vedoucí k oddělení částic na základě hodnoty jejich
sedimentačních koeficientů.
Ultracentrifugace
• Relativní molekulová hmotnost proteinů může být stanovena přímo z tzv.
sedimentační rovnováhy při které se částice centrifugují nízkou rychlostí,
tak, že sedimentace je v rovnováze s difůzí.
• Metoda je poměrně přesná a na rozdíl od SDS-PAGE nedenaturační při
zachování kvartérní struktury.
Hodnoty S (Svedberg = 10-13 s) a molekulové hmotnosti některých proteinů
Protein
Hodnota S
Molekulová hmotnost
Cytochrom c
1, 83
12 310
Myoglobin
1, 97
17 800
Trypsin
2, 50
23 200
Malátdehydrogenasa
5, 76
74 900
Laktátdehydrogenasa
7, 54
146 200
MALDI-TOF MS
(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of Flight-Mass
Spectrometry)
Princip metody:
• Proteinový vzorek je smíchán s matricí - tvorba krystalů
• Krystaly vystaveny laserovému paprsku – vznik jednou nabitých
iontů proteinu
• Ionty analyzovány v analyzátoru doby letu (t  (m/z)1/2)
MATRICE PRO MALDI – organické látky zajišťující ionizaci látek
O
O
OH
HO
CN
a-kyano-4-hydroxyskoøicová kyselina
HO
OH
OH
2,5-dihydroxybenzoová kyselina
Intens. [a.u.]
MALDI-TOF MS
4000
Hovězí sérový albumin
Mr=66350
3000
2000
1000
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
m/z
METODY STUDIA
NUKLEOVÝCH KYSELIN
Určení sekvence DNA
Sekvenování DNA (tsekvenace či sekvencování, mnohdy také
„čtení“ DNA)
• souhrnný termín pro biochemické metody, jimiž se zjišťuje pořadí
nukleových bází (A, C, G, T) v sekvencích DNA
Základní strategie určení sekvence DNA
• chemická (selektivní štěpení – Maxam-Gilbert)
• biochemická (syntéza, dideoxy metoda - Sanger)
Metody sekvencování nukleových kyselin
Strategie sekvencování:
• Štěpení polymerů na specifické fragmenty, které mohou být celé
sekvencovány.
• Určení pořadí nukleotidů každého fragmentu.
• Sestavení překrývajících se fragmentů tak, aby došlo k rekonstrukci
původního polymeru.
• Enzymy: restrikční enzymy - nukleasy (endonukleasy a
exonukleasy).
• Restrikční endonukleasy typu II rozpoznávají a štěpí
palindromovou sekvenci DNA.
Maxam–Gilbertova metoda
M&G nebo též „chemické sekvenování“
• Chemická metoda
• Specifické (téměř) štěpení řetězce činidly
• Pracná, málo efektivní, ale univerzální a nezávislá
• Modifikace bazí – DMS – puriny
• hydrazinolýza pyrimidinů
•
krátká sekvence DNA 5' konci radioaktivně označena fosforem
32P.
•
vzorek - na pět částí a každá je vystavena chemikáliím, které
specificky štípají sekvenci DNA
•
v každé z pěti nádob docíleno různě dlouhých sekvencí DNA
Maxam–Gilbertova metoda
Štěpení řetězce v místě této báze
•G – DMS, piperidin
•A+G – kyselina mravenčí,
piperidin
•T+C – hydrazin, piperidin
•T – hydrazin + NaCl, piperidin
Maxam–Gilbertova metoda
• PAGE elektroforéza – seřazení sekvence podle své délky: nejdále v
gelu doputují ty nejkratší sekvence.
• Autoradiografie - sekvence z gelu s 5' koncem označeným
radioaktivním fosforem patrné jako svítící proužky
• Vyhodnocení pozice proužků ve srovnání s ostatními proužky
vyhodnocuje - původní řazení nukleových bází ve vzorku DNA.
Gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu
• Dělení fragmentů nukleových kyselin elektroforézou
• Gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, PAGE.
• Výsledkem je restrikční mapa.
Jamky pro
nanesení vzorku
Vzorek
Pufr
-
Katoda
Gel
Směr
elektroforézy
Stojan
Pufr
+
Anoda
Maxam–Gilbertova metoda
Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera
Metoda ukončení řetězce neboli dideoxymetoda
• Enzym DNA polymerasa I z E. coli (enzym podílející se na replikaci
bakteriální DNA).
• Jednovláknová DNA jako templát a čtyři deoxynukleosidtrifosfáty
(dNTP): dATP, dCTP, dGTP a dTTP.
• Krátký polynukleotid primer, který je komplementární 3´koncem
templátu DNA a stává se 5´koncem nového řetězce.
• Syntéza DNA je zakončována specifickými nukleotidy.
• Reakční směs také obsahuje označenou sloučeninu, buď jeden z dNTS
nebo primer. Označení může být radioaktivním isotopem (např. 32P)
nebo fluorescenčně.
Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera
Metoda ukončení řetězce neboli dideoxymetoda
• Klíčovou komponentou je malé množství
2´, 3´-dideoxynukleosidtrifosfátu (ddNTP), který nemá 3´-OH.
• Když je tato komponenta vřazena do syntetizovaného polynukleotidu,
řetězec je ukončen.
-
-
O
-
O
P
O
-
O
O
P
O
O
O
P
O
BÁZE
O
CH2
O
H
H
H
OH
H
2´,3´-Dideoxynukleosidtrifosfát
H
Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera
Reakce katalyzovaná DNA polymerasou
TEMPLÁT
TEMPLÁT
5´
P
P
P
P
P
P
5´
P
P
3´
P
P
P
P
P
P
3´
G
A a G
T
C
T
A a
C
G
OH
P
P
DNA polymerasa I
A a A a T
C
+
PPP
T
OH
+
PPP
G
A a G
T
C
T
A a C
A a A a T
T
PPi
OH
+
OH
...
P
P
5´
C
G
P
P
+
PPP
OH
P
5´
PRIMER
dCTP
dGTP
PRIMER
dGTP
+
...
Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera
TEMPLÁT:
PRIMER:
3´
5´
dATP + ddATP
dCTP
dGTP
dTTP
GGCCA
GGCCATCGTTGA
CCGGTAGCAACT
GG 3´
dATP
dCTP + ddCTP
dGTP
dTTP
GGC
GGCC
GGCCATC
A
C
5´
dATP
dCTP
dGTP + ddGTP
dTTP
GGCCATCG
GGCCATCGTTG
G
dATP
dCTP
dGTP
dTTP + ddTTP
GGCCAT
GGCCATCGT
GGCCATCGTT
T
A 3´
G
T
T
G
C
T
A
C
C 5´
Sekvence komplementární
k templátu DNA
Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera
Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera
Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera
Sangerova metoda
Sangerova metoda má mnoho alternativ – fluorescenční detekce
• čtyři terminační nukleotidy jsou značeny každý jiným
fluorescenčním barvivem
• reakce může probíhat v jedné zkumavce, pruhy v gelu se po
ozáření excitačním zářením zobrazují v různých barvách podle typu
nukleotidu v místě terminace
• místo čtyř zkumavek lze použít jenom jedinou, tzv. kapilární
elektroforéza může být do velké míry automatizována a tedy velice
zrychlena
Sangerova metoda
Sangerova metoda má mnoho alternativ – fluorescenční detekce
Využití kapilární elektroforézy pro sekvenování
emise jedné ze 4 vlnových délek
podle typu fluorescenčního
barviva, kterým je označen právě
procházející nukleotid
excitace
kapilára naplněná
polyakrylamidovým
gelem
zkumavka s fluorescenčně
značenými produkty
sekvenování
Automatické sekvencování DNA.
• Na primer v každé ze čtyř reakčních směsí jsou připojena
fluorescenční barviva.
• Každá ze čtyř barevných křivek reprezentuje elektroforézou
oddělený fragment s jedním dideoxynukleotidem.
• Barevné fragmenty:
Zelená = ddATP, červená = ddTTP, černá = ddGTP a modrá = ddCTP.
Sekvenování genomu
Frederick Sanger
1975 - Dideoxy sekvenační metoda
1977 – osekvenoval Φ-X174 (5,368 bp)
1980 – dostal druhou Nobelovu cenu
za chemii
Později (polovina 80-tých let)
osekvenoval bakteriofága λ pomocí
shotgun metody (48,502 bp)
Sekvenování genomu
Leroy Hood
• 1986 Leroy Hood: první automatický
sekvenátor
• 1990 započat projekt sekvenování lidského genomu
(předpokládaná doba 15 let)
• 1995
John Craig Venter sekvenoval první
bakteriální genom
• 1996
první eukaryotický genom (kvasinka)
sekvenován
John Craig Venter
Sekvenování genomu
• 1997
• 1998
sekvence E. coli
Caenorhabditis elegans genom
(první multicelulární genom)
• 1999 lidský chromozom 22 sekvenován
• 2000 Drosophila melanogaster genom
• 2001 Human Genome Sequencing:
předběžná sekvence lidského genomu
• duben 2003 Lidský genom.
myšího genomu.
• duben 2004
Sekvence
Sekvence krysího genomu
Sekvenování genomu
• genomy jsou rozsáhlé
• sekvenování lidského genomu (Human Genome Project) stálo
téměř tři miliardy amerických dolarů
• nově patentované technologie snižují cenu stanovení sekvence
genomu na 100 000 dolarů, v některých případech dokonce na
pouhých 1000 dolarů.
Syntéza oligonukleotidů
Syntéza na pevné fázi
• Monomery s aktivovanými a
chráněnými skupinami
• První zakotven na nosiči
• Deblokace reagujících skupin
• Vazba
• Promývání
• Cyklický proces - automatizace
Příprava primerů
• Komerční záležitost
Umělé geny
Syntéza oligonukleotidů
Monomery s aktivovanými a chráněnými skupinami
Syntéza oligonukleotidů
Polymerase chain reaction - PCR
• technika umožňující v krátkém čase namnožit daný kus DNA
bez pomoci buněk
• užívá se, pokud je DNA velmi malé množství nebo je DNA
znečištěna
• za několik hodin je schopna metoda PCR vyprodukovat kolem
miliardy kopií DNA
• vedle vysoké rychlosti je na metodě PCR impozantní její
selektivita.
• známe-li příslušné sekvence, PCR je schopna „vybrat“ z dlouhé
molekuly DNA oblast, která má být namnožena, například
konkrétní gen
• objevil Kally Muris 1983, o 10 let později obdržel Nobelovu
cenu. Metoda se dnes běžně užívá v mnoha laboratořích
Polymerase chain reaction - PCR
• metoda PCR se sestává ze tří kroků, při
kterých se množství DNA zvětšuje
exponenciálně
• klíčovým enzymem je DNA-polymeráza
z Thermus aquaticus, žijícím v horkých
pramenech Yellowstonského národního
parku
• tato polymeráza nese název Taq
polymeráza, je odolná vůči vysokým
teplotám a zůstává aktivní přes mnoho
cyklů
Význam
• analytický – diagnostika, forenzní analýza,
• preparativní - pomnožení materiálu, cílené mutace, umělé geny
atd.
Polymerase chain reaction - PCR
Potřeby pro PCR
• DNA, která má být namnožena
• Taq polymeráza
• zásoba primerů, ohraničujících
cílovou sekvenci.
• zásoba dATP, dCTP, dGTP, dTTP
• MgCl2
Polymerase chain reaction - PCR
První krok
• krátké zahřátí celé směsi na 94oC -96oC
• teplem se poruší vodíkové vazby a oba řetězce DNA se oddělí
Polymerase chain reaction - PCR
Druhý krok
• ochlazení směsi na 50°C – 65°C.
• ochlazení umožní primerům se navázat na cílovou DNA
vodíkovými můstky podle pravidel komplementarity
• primery jsou krátké, synteticky vyrobené molekuly
jednořetězcové DNA (20-30 nukleotidů), které jsou
komplementární ke koncům DNA, která má být amplifikována
• primery tak determinují místo na DNA, které má být zmnoženo
Polymerase chain reaction - PCR
Třetí krok
• DNA-polymeráza může přidávat nukleotidy k 3´koncům primerů,
jako při obvyklé replikaci
• směs je zahřáta na 72°C
Polymerase chain reaction - PCR
• směs je znovu ohřáta a
začíná nové kolo cyklu
• každé kolo trvá pouze asi 5
minut
• výsledkem je dvojnásobné
množství cílové DNA,
dlouhé i stovky párů bází
• tento tříkrokový cyklus je
následně opakován znovu
a znovu.
• za třicet cyklů je možno
teoreticky obdržet
miliardu kopií
Polymerase chain reaction - PCR
Kvantitativní PCR
• Schéma RT PCR
• Sledování fluorescencí, kvantifikace
• Využití fluorescence, 3‘-exonukleasové aktivity Taq polymerasy
Modifikace PCR
• Využití reverzní transkriptázy
• Syntéza cDNA
Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky
• Klonování – je produkce násobku
odvozených od jednoho předka.
identických
organismů
• Klon je soubor buněk obsahujících vektor nesoucí žádanou DNA.
• Metoda dovoluje připravit větší množství DNA, které nelze získat
např. izolací z bakteriální kultury. Genové inženýrství.
naklonování ovce Dolly v roce 1997 - jádra
přenesená do oocytu pocházela z epitelu mléčné
žlázy dospělé ovce
Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky
Způsoby amplifikace segmentu DNA:
• Specifický fragment DNA vytvořený restrikčním enzymem,
technikou PCR (polymerázová řetězové reakce) nebo chemickou
syntézou.
• Fragment je vnesen do jiné DNA molekuly označené jako vektor,
obsahující nezbytnou sekvenci k přímé replikaci DNA.
• Vektor nesoucí vloženou DNA je inkorporován do buněk, kde je
replikován.
• Buňky obsahující požadovanou DNA jsou odděleny.
• Klonovací vektory. Nejčastěji plasmidy, kruhové DNA molekuly od
1 po 200 kb z bakterií nebo kvasinek.
• (kb = 1 000 párů bází dvojšroubovice nebo 1 000 bází
jednovláknové DNA).
Součásti klonovacího vektoru
• Počátek replikace
• Dominantní selekční marker (obvykle gen, který uděluje
hostitelské buňce rezistenci k léčivům)
• Nejméně jedno unikátní restrikční místo – místo štěpení, které je
přítomno pouze jednou a leží v oblasti vektoru, které nenaruší ani
počátek replikace ani selekční marker.
• V současnosti používané klonovací vektory obsahují seskupení
unikátních restrikčních míst nazývané polylinker nebo
mnohočetné klonovací místo.
Restrikční enzymy
Tvorba rekombinantní DNA (rDNA)
Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky
• Laboratorní plasmidy jsou relativně malé kruhové DNA, snadno
se replikující, nesoucí geny specifické rezistence k jednomu nebo
více antibiotikům a obsahující jedno nebo více míst pro restrikční
endonukleasu, kam může být zavedena cizí DNA.
• Např. E. coli plasmid označený pUC18 (2,69 kb) reprezentuje
klonovací vektor (pUC znamená plasmid Universal Cloning).
Používá se ke klonování DNA do velikosti 10 kb.
• Obsahuje 13 restrikčních míst, tři geny rezistence k ampicilinu,
lacZ kódující enzym b-galaktosidasu.
• Bakteriofág l je vektor klonující DNA do 16 kb.
Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky
• Rekombinantní DNA neboli chiméra (podle řecké mytologie
obluda se lví hlavou, kozím tělem a hadím ocasem) složená DNA.
• Ligace (vazba). DNA segment, který má být klonován má obvykle
lepivé konce. DNA ligasa je enzym katalyzující spojení segmentu
DNA s klonovacím vektorem.
• Transformace – exprese chimerního plasmidu do hostitelské
bakterie.
Konstrukce rekombinantní DNA molekuly
Inzerce DNA do plasmidu
Namnožení DNA
Molekulární klonování in vivo
- pomocí prokaryot (bakterie, např. E. coli),
- pomocí eukaryot (kvasinky),
- pomocí buněk savců rostoucích v tkáňových kulturách.
Molekulární klonování in vitro
- procesem polymerázové řetězové reakce (PCR)
TRANSFORMACE baktérii a kvasinek
přímý přenos genetické informace z okolí do organismu
• buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá KOMPETENTNÍ
• přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis,
Hemorheae influenze atd.
• všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do
kompetentního stavu dvěma způsoby:
A) ELEKTROPORACE
buňky se pořádně promyjí diH2O
smíchají s plasmidovou DNA rozpuštěnou
také v diH2O a vloží do elektroporátoru
B) CHEMICKÁ METODA
buňky se ošetří roztokem rubidné
a vápenaté soli, které způsobují
větší permeabilitu membrány
DNA se smísí s těmito buňkami a
provede se tzv. HEAT SHOCK (45
sec. 42°C)
 EFEKTIVITA 
 NÁROČNOST 
Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky
Schéma bakteriální transformace
Transformace cizí DNA do bakterie
• Úspěšnost transformace cizí DNA je sledována na základě marker
genů, které novou buněčnou kolonii odlišují na kultivačním
mediu od kolonií bez přenesené DNA.
Marker geny:
• pro rezistenci vůči antibiotiku;
• b-galaktosidasy (enzymy štěpící galaktosu na laktosu a glukosu)
zajišťující barevnou odlišnost kolonií atd.
Transformace a selekce transformovaných buněk
• Selekce – oddělení pouze těch hostitelských organismů, které byly
transformovány a obsahují správně konstruovaný vektor.
• V případě plasmidového vektoru lze provést výběr za použití
antibiotik a nebo chromogenních látek.
• Např. lacZ gen v pUC18 plasmidu kóduje enzym b-galaktosidasu,
který štěpí bezbarvou látku X-gal na modrý produkt.
• E.coli transformované nemodifikovaným pUC18 plasmidem tvoří
modré kolonie.
• V případě, že plasmid obsahuje cizí DNA inkorporovanou do jeho
polylinker regionu, jsou kolonie bezbarvé, protože kódující
sekvence lacZ byla přerušena netvoří se funkční b-galaktosidasa.
Transformace a selekce transformovaných buněk
• Bakterie, do kterých nebyl vnesen plasmid jsou také bezbarvé.
• Tyto bakterie mohou být odděleny přidáním antibiotika
ampicilinu do růstového média (plasmid obsahuje gen rezistence
k ampicilinu).
Příprava rekombinantního proteinu
Usnadnění izolace rekombinantního proteinu
nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy):
•
•
•
•
•
•
His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni)
FLAG epitope - tag DYKDDDDK
(Sigma; specifická protilátka)
CBP - calmodulin binding peptide
(26 AK)
CBD - cellulose binding domain
Genová knihovna
DNA knihovny - kolekce klonovaných DNA fragmentů genomu určitého organismu (cDNA), které
jsou skladovány uvnitř hostitelských organismů (zejména bakterií). cDNA (copy DNA,
complementary DNA) je získávána přepisem z mRNA pomocí enzymu reverzní transkriptázy.