Extracelulární enzymy ve vodě a mikrobiální rozklad polymerů

Extracelulární enzymy ve vodě
a
mikrobiální rozklad polymerů
p y
Jaroslav Vrba
• EKOTECH (CZ.1.07/2.3.00/09.0200 – BC AVČR Č. Budějovice)
molekuly polymerů nemohou být do buněk přenášeny
membránovým transportem (ale mohou být pohlceny do
vakuol! - fagocytoza)
živé mikroorganismy
g
y vylučují
y
j na buněčný
ýp
povrch aktivní
enzymy (hydrolázy), jež hydrolyzují polymery na jednotlivé
monomery, které mohou být transportovány přes buněčnou
membránu
fagocytující i holozoické mikroorganismy vylučují hydrolázy
do trávicích vakuol, kde probíhá hydrolýza polymerů
u mnohobuněčných organismů plní analogickou funkci
trávicí enzymy, vylučované do trávicího traktu
intracelulární enzymy 
ektoenzymy
extracelulární
(exoenzymy)
extracelulární enzymy (volné, rozpuštěné)
trávicí enzymy  volně rozpuštěné
svlékací enzymy  volně rozpuštěné
intracelulární enzymy 
extracelulární
ektoenzymy
extracelulární enzymy (volné, rozpuštěné)
trávicí enzymy  volně rozpuštěné
svlékací enzymy  volně rozpuštěné
EXTRACELULÁRNÍ ENZYMY VE VODNÍCH EKOSYSTÉMECH
aktivita extracelulárního enzymu bývá vázána na částice
sestonu = ektoenzymy bakterií nebo řas
kromě primárně extracelulárních enzymů jsou do vody
uvolňovány vnitrobuněčné enzymy při lyzi buněk, resp.
somatické enzymy mnohobuněčných organismů (svlékání
čl
členovců,
ů poranění
ě í apod.)
d)
aktivita rozpuštěného (volného) enzymu bývá nízká (může
být druhotně adsorbován na částice!)
extracelulární enzymy mají někdy překvapivě dlouhou
životnost, jsou různě chráněny před působením volných
proteáz
t á
endoenzymy
HYDROLÁZY
polymery
oligomery
exoenzymy
y y
monomery
umělé fluorogenní
substráty
O
O
O
CH2OH
O
OH
OH
β-D-glukosidáza
CH3
O
O
OH
umělý (nefluorescenční) substrát
4-methylumbelliferyl
4
methylumbelliferyl β-D-glukosid
β D glukosid
4-methylumbelliferyl fosfát
O
O
O — PO4
CH3
4-methylubelliferon
y
fosfatáza
CH3
(fosfomonoesteráza)
Princip funkce a regulace ektoenzymů
(Ch ó t 1991)
(Chróst
HMW ~
>1000 Da
LMW ~
<700 Da
Princip funkce EEA v planktonu
(H
(Hoppe
1991)
DEA (EEA)
2 různé enzymy
štěpící
MUF-GlcNAc
Princip metody stanovení EEA
MUF fluorescence
(filtrace)
inkubace

(in situ pH & teplota)
vzorek
(+ pufr)
+ HgCl2
(blank)
MUF
substrát
alkalizace
+ HgCl2 + 2M NaOH
& EDTA
(blank)
Časový průběh hydrolýzy substrátu – časová kinetika
14000
Relative F
R
F.U. (cps
s)
12000
5 µM
10000
Ohyb závislosti signalizuje
vyčerpávání substrátu
8000
6000
4000
2000
0
0
10
20
30
40
50
60
70
time (min)
80
90
100 110 120
Časový průběh hydrolýzy substrátu – časová kinetika
14000
Relative F
R
F.U. (cps
s)
12000
5 µM
10000
8000
6000
Sklon regresní přímky
v oblasti lineární závislosti udává
rychlost hydrolýzy substrátu
4000
2000
0
0
10
20
30
40
50
60
70
time (min)
80
90
100 110 120
Časový průběh hydrolýzy substrátu – časová kinetika
0.1 µM
0.5 µM
1 µM
2 µM
5 µM
14000
Relative F
R
F.U. (cps
s)
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
10
20
30
40
50
60
70
time (min)
80
90
100 110 120
Časový průběh hydrolýzy substrátu – časová kinetika
0.1 µM
0.5 µM
1 µM
2 µM
5 µM
14000
Relative F
R
F.U. (cps
s)
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
10
20
30
40
50
60
70
time (min)
80
90
100 110 120
Rychlost hydrolýzy při různé koncentraci substrátu
– saturační kinetika
Rovnice Michaelise-Mentenové:
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
v (µ
µmol l-11 h-1)
7
6
5
4
3
2
1
0
0
100
200
300
[S] (µmol l-1)
400
500
Rychlost hydrolýzy při různé koncentraci substrátu
– saturační kinetika
Rovnice Michaelise-Mentenové:
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
v (µ
µmol l-11 h-1)
7
6
5
4
3
2
1
0
0
100
200
300
[S] (µmol l-1)
400
500
Rychlost hydrolýzy při různé koncentraci substrátu
– saturační kinetika
Rovnice Michaelise-Mentenové:
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
v (µ
µmol l-11 h-1)
7
6
Vmax = 6.942 µmol l-1 h-1
5
4
3
2
1
0
0
100
200
300
[S] (µmol l-1)
400
500
Rychlost hydrolýzy při různé koncentraci substrátu
– saturační kinetika
Rovnice Michaelise-Mentenové:
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
v (µ
µmol l-11 h-1)
7
6
Vmax = 6.942 µmol l-1 h-1
5
4
v = 1/2 Vmax
3
2
KM = 3.898
3 898 µmol l-1
1
0
0
100
200
300
[S] (µmol l-1)
400
500
Wolf (Hobie-Wright)
Lineweaver-Burk
1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])
70
60
y = 0.6272 x – 0.2932
60
50
S//v
1/v
v
y = 0.1398 x + 0.7464
50
40
30
40
30
20
20
10
0
-10
[S]/v = KM/Vmax + (1/V max) × [S]
70
10
1/Vmax
0
–KM
50
0
100
0
1/[S]
KM/Vmax
100 200 300 400 500
[S]
v
7
6
Transformace –
5
– lineární regrese:
Michaelis-Mentenová
4
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
3
2
1
0
0
100
200
300
[S]
400
500
Vmax
KM
(µmol l-1 h-1) (µmol l-1)
Wolf (Hobie-Wright)
Lineweaver-Burk
Eadie
1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])
v = Vmax – KM (v/[S])
7
y = 0.2674
0 2674 x + 0
0.1710
1710
5
0.6
4
02
0.2
1/Vmax
0
1
20
Vmax/KM
10
1
2
3
0
4
40
30
2
–1/KM
-1
y = –1.937 x + 6.245
3
0.4
y = 0.1398 x + 0.7464
50
S//v
0.8
60
1/Vmax
6
v
1/v
v
1.0
[S]/v = KM/Vmax + (1/Vmax) × [S]
70
–KM
0
1
1/[S]
2
3
4
0
0
v/[S]
/[S]
KM/Vmax
100 200 300 400 500
[S]
v
7
6
Transformace –
5
– lineární regrese:
Michaelis-Mentenová
4
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
3
Lineweaver-Burk
2
1
0
0
100
200
300
[S]
400
500
Vmax
KM
(µmol l-1 h-1) (µmol l-1)
5.8
1.7
Wolf (Hobie-Wright)
Lineweaver-Burk
Eadie
1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])
v = Vmax – KM (v/[S])
7
y = 0.2674
0 2674 x + 0
0.1710
1710
5
0.6
4
02
0.2
1/Vmax
0
1
20
Vmax/KM
10
1
2
3
0
4
40
30
2
–1/KM
-1
y = –1.937 x + 6.245
3
0.4
y = 0.1398 x + 0.7464
50
S//v
0.8
60
Vmax
6
v
1/v
v
1.0
[S]/v = KM/Vmax + (1/Vmax) × [S]
70
–KM
0
1
1/[S]
2
3
4
0
v/[S]
/[S]
0
KM/Vmax
100 200 300 400 500
[S]
v
7
6
Transformace –
5
– lineární regrese:
Michaelis-Mentenová
4
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
3
Lineweaver-Burk
Eadie
2
1
0
0
100
200
300
[S]
400
500
Vmax
KM
(µmol l-1 h-1) (µmol l-1)
5.8
6.2
1.7
1.9
Wolf (Hobie-Wright)
Lineweaver-Burk
Eadie
1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])
v = Vmax – KM (v/[S])
7
y = 0.2674
0 2674 x + 0
0.1710
1710
5
0.6
4
02
0.2
1/Vmax
0
1
20
Vmax/KM
10
1
2
3
0
4
40
30
2
–1/KM
-1
y = –1.937 x + 6.245
3
0.4
y = 0.1398 x + 0.7464
50
S//v
0.8
60
Vmax
6
v
1/v
v
1.0
[S]/v = KM/Vmax + (1/Vmax) × [S]
70
–KM
0
1
1/[S]
2
3
4
0
KM/Vmax
0
v/[S]
/[S]
100 200 300 400 500
[S]
v
7
6
Transformace –
5
– lineární regrese:
Michaelis-Mentenová
4
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
3
2
Lineweaver-Burk
Eadie
Wolf (Hobie-Wright)
1
0
0
100
200
300
[S]
400
500
Vmax
KM
(µmol l-1 h-1) (µmol l-1)
5.8
6.2
7.2
1.7
1.9
5.3
Wolf (Hobie-Wright)
Lineweaver-Burk
Eadie
1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])
v = Vmax – KM (v/[S])
7
y = 0.2674
0 2674 x + 0
0.1710
1710
5
0.6
4
02
0.2
1/Vmax
0
1
20
Vmax/KM
10
1
2
3
0
4
40
30
2
–1/KM
-1
y = –1.937 x + 6.245
3
0.4
y = 0.1398 x + 0.7464
50
S//v
0.8
60
Vmax
6
v
1/v
v
1.0
[S]/v = KM/Vmax + (1/Vmax) × [S]
70
–KM
0
1
1/[S]
2
3
4
0
KM/Vmax
0
100 200 300 400 500
v/[S]
/[S]
[S]
v
7
6
Transformace –
5
– lineární regrese:
Michaelis-Mentenová
4
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
3
2
(µmol l-1 h-1)
KM
(µmol l-1)
5.8
6.2
7.2
1.7
1.9
5.3
6.9
3.9
Nelineární regrese:
1
0
Lineweaver-Burk
Eadie
Wolf (Hobie-Wright)
Vmax
Michaelis-Mentenová
0
100
200
300
[S]
400
500
Vmax – potenciální rychlost hydrolýzy substrátu
~ množství enzymových jednotek ve vzorku,
ale
l závisí
á i í též na reakčních
kč í h podmínkách
d í ká h (teplotě,
(t l tě pH
H aj.)!
j )!
Vmax = 16
Vmax = 8
KM – polosaturační (Michaelisova) konstanta
nepřímo úměrná afinitě enzymu k substrátu
Vmax = 6.942 µmol l-1 h-1
7
v (µmol l-1 h-1)
6
5
4
v = 1/2 Vmax
3
KM = 100 µmol l-1
2
KM = 38.98
38 98 µmol l-1
1
0
KM = 3.898 µmol l-1
0
100
200
300
[S] (µmol l-1)
400
500
Vliv kompetetivní
p
inhibice na afinitu enzymu
y
k substrátu
pH = 4.5
45
AccPA (µm
mol l-1 h-1)
5
4
KM = 10.1 µ
µmol l-1
3
2
cAl = 0 (control)
1
0
0
10
20
30
40
50
60
MUFP (µmol l-1)
70
80
90
100
Vliv kompetetivní
p
inhibice na afinitu enzymu
y
k substrátu
pH = 4.5
45
AccPA (µm
mol l-1 h-1)
5
4
KM = 10.1 µ
µmol l-1
KM = 11.5 µmol l-1
3
2
cAl = 0 (control)
cAl = 100 µg l-11
1
0
0
10
20
30
40
50
60
MUFP (µmol l-1)
70
80
90
100
Vliv kompetetivní
p
inhibice na afinitu enzymu
y
k substrátu
pH = 4.5
45
AccPA (µm
mol l-1 h-1)
5
4
KM = 10.1 µ
µmol l-1
KM = 11.5 µmol l-1
3
KM = 21.2 µmol l-1
2
cAl = 0 (control)
cAl = 100 µg l-11
cAl = 300 µg l-1
1
0
0
10
20
30
40
50
60
MUFP (µmol l-1)
70
80
90
100
Vliv kompetetivní
p
inhibice na afinitu enzymu
y
k substrátu
pH = 4.5
45
AccPA (µm
mol l-1 h-1)
5
4
KM = 10.1 µ
µmol l-1
KM = 11.5 µmol l-1
3
KM = 21.2 µmol l-1
2
cAl = 0 (control)
cAl = 100 µg l-11
cAl = 300 µg l-1
cAl = 1000 µg l-1
KM = 30.4 µmol l-1
1
0
0
10
20
30
40
50
60
MUFP (µmol l-1)
70
80
90
100
Analýza dat saturační kinetiky
Aeromonas hydrophila
xosaminid
dase activ ity
 -hex
(µmol l-11 h-1)
5
T r = Vmax /KM = 0.1824 h-1
4
3
2
1
0
0
100
EGME
Model 1:
200
300
MUF-GlcNAc (µmol l-1)
v = Tr × [S]
při KM >> [S]
Analýza dat saturační kinetiky
Aeromonas hydrophila
xosaminid
dase activ ity
 -hex
(µmol l-11 h-1)
5
T r = Vmax /KM = 0.1824 h-1
4
3
2
Vmax = 5.248 µ
µmol l-1 h-1
KM = 171 µmol l-1
1
0
0
100
EGME
200
MUF-GlcNAc (µmol l-1)
300
DMSO
Model 1:
v = Tr × [S]
při KM > [S]
M d l 2:
Model
2
v = Vmax × [S] / (KM + [S])
Analýza dat komplexní saturační kinetiky
osaminida
ase activity
y
 -hexo
(µmol l-1 h-1)
Aeromonas hydrophila
& Cyclidium glaucoma
12
10
8
6
4
2
0
0
100
200
300
MUF-GlcNAc (µmol l-1)
Model 3:
v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+[S]) + Tr(L)×[S]
Analýza dat komplexní saturační kinetiky
osaminida
ase activity
y
 -hexo
(µmol l-1 h-1)
Aeromonas hydrophila
& Cyclidium glaucoma
12
10
8
6
4
2
0
0
100
200
300
MUF-GlcNAc (µmol l-1)
Model 3:
v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+[S]) + Tr(L)×[S]
Model 4:
v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+ S]) + Vmax(L)×[S]/(KM(L)+[S])
Analýza dat komplexní saturační kinetiky
osaminida
ase activity
y
 -hexo
(µmol l-1 h-1)
Aeromonas hydrophila
& Cyclidium glaucoma
12
10
8
6
4
2
0
0
100
200
300
MUF-GlcNAc (µmol l-1)
Model 3:
v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+[S]) + Tr(L)×[S]
Model 4:
v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+ S]) + Vmax(L)×[S]/(KM(L)+[S])
Analýza dat komplexní saturační kinetiky
osaminida
ase activity
y
 -hexo
(µmol l-1 h-1)
Aeromonas hydrophila
& Cyclidium glaucoma
12
10
8
6
Vmax(L) = 16.61 µmol l-1 h-1
-1
KM((L)
(( ) = 241.0 µmol l
4
2
0
0
100
200
300
MUF-GlcNAc (µmol l-1)
Model 4:
v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+ S]) + Vmax(L)×[S]/(KM(L)+[S])
Analýza dat komplexní saturační kinetiky
osaminida
ase activity
y
 -hexo
(µmol l-1 h-1)
Aeromonas hydrophila
& Cyclidium glaucoma
12
10
8
6
Vmax(L) = 16.61 µmol l-1 h-1
-1
KM((L)
(( ) = 241.0 µmol l
4
Vmax(H) = 3.399 µmol l-1 h-1
KM(H) = 0.1436 µmol l-1
2
0
0
100
200
300
MUF-GlcNAc (µmol l-1)
Model 4:
v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+ S]) + Vmax(L)×[S]/(KM(L)+[S])
1. den
0.14
Bodo saltans
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0
20
40
60
80
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
100
Bodo saltans
0
MUF-GlcNAc (µM)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
0.04
0 02
0.02
0
20
40
60
MUF-GlcNAc (µM)
6
8
10 12
0.08 Cyclidium glaucoma
0.06
0.00
4
TGR (10 9 bact./l h)
Cyclidium glaucoma
0.08
2
80
100
0.06
0.04
0 02
0.02
0.00
0
1
2
3
4
5
TGR (10 9 bact./l h)
6
2. den
0.14
Bodo saltans
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0
20
40
60
80
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
100
Bodo saltans
0
MUF-GlcNAc (µM)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
0.04
0 02
0.02
0
20
40
60
MUF-GlcNAc (µM)
6
8
10 12
0.08 Cyclidium glaucoma
0.06
0.00
4
TGR (10 9 bact./l h)
Cyclidium glaucoma
0.08
2
80
100
0.06
0.04
0 02
0.02
0.00
0
1
2
3
4
5
TGR (10 9 bact./l h)
6
4. den
0.14
Bodo saltans
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0
20
40
60
80
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
100
Bodo saltans
0
MUF-GlcNAc (µM)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
0.04
0 02
0.02
0
20
40
60
MUF-GlcNAc (µM)
6
8
10 12
0.08 Cyclidium glaucoma
0.06
0.00
4
TGR (10 9 bact./l h)
Cyclidium glaucoma
0.08
2
80
100
0.06
0.04
0 02
0.02
0.00
0
1
2
3
4
5
TGR (10 9 bact./l h)
6
7. den
0.14
Bodo saltans
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0
20
40
60
80
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
100
Bodo saltans
0
MUF-GlcNAc (µM)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
0.04
0 02
0.02
0
20
40
60
MUF-GlcNAc (µM)
6
8
10 12
0.08 Cyclidium glaucoma
0.06
0.00
4
TGR (10 9 bact./l h)
Cyclidium glaucoma
0.08
2
80
100
0.06
0.04
0 02
0.02
0.00
0
1
2
3
4
5
TGR (10 9 bact./l h)
6
9. den
0.14
Bodo saltans
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0
20
40
60
80
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
100
Bodo saltans
0
MUF-GlcNAc (µM)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
0.04
0 02
0.02
0
20
40
60
MUF-GlcNAc (µM)
6
8
10 12
0.08 Cyclidium glaucoma
0.06
0.00
4
TGR (10 9 bact./l h)
Cyclidium glaucoma
0.08
2
80
100
0.06
0.04
0 02
0.02
0.00
0
1
2
3
4
5
TGR (10 9 bact./l h)
6
11. den
0.14
Bodo saltans
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
-hexosaminidase
(µm
mol/l h)
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0
20
40
60
80
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
100
Bodo saltans
0
MUF-GlcNAc (µM)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
hexosaminiidase
-h
(µmol/l h)
0.04
0 02
0.02
0
20
40
60
MUF-GlcNAc (µM)
6
8
10 12
0.08 Cyclidium glaucoma
0.06
0.00
4
TGR (10 9 bact./l h)
Cyclidium glaucoma
0.08
2
80
100
0.06
0.04
0 02
0.02
0.00
0
1
2
3
4
5
TGR (10 9 bact./l h)
6
Vysokoafinní β-N-acetylhexosaminidázy (KM < 1 µM)
~ trávicí enzymy bakterivorních prvoků
100
1000
González et al.1993
MUF-(GlcNAc)3
MUF-GlcNAc
Vmax
100
10
10
1
1
01
0.1
01
0.1
0.01
0.01
0.001
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
Total bacterivory
10
0.001
100
MUF-GlcN
M
NAc hydro
olysis
MUF-(G
GlcNAc)3 hydrolys
sis
1000
Vysokoafinní trávicí enzym bakterivorních prvoků?
~ lysozym nebo β-N-acetylhexosaminidáza?
MUF-(G
GlcNAc)3 hydrolysis
MUF-GlcNAc
32
MUF-(GlcNAc)
(
)3
28
1:3
8
24
20
16
4
12
8
4
0
4
5
6
7
pH
8
9
0
MUF-GlcNAc hydrolysis
M
1:3
36
12
Hydrolýza MUF-N-acetyl-β-D-glukosaminidu
epilimnion – Římov, 10.9.1993 – metalimnion
-1
-1
Enzyme
e activity [µ
µmol l h ]
0.007
0.0008
Vmax(H) A
0.006
0.0004
2
Vmax(R)
0.005
0.004
1
B
0.0004
0
0
0.0008
0.006
Vmax(R)
0.005
0.004
0.007
3
0
0
0.003
0.003
0.002
0.002
0.001
0.001
0
1
2
3
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-1
Substrate [µmol l ]
90 100
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-1
Substrate [µmol] l
Vysokoafinní trávicí enzym bakterivorních prvoků
Piburger See - 1994
0.6
0.4
0.2
3
1.5
2
1.0
1
0.5
0
4
0.0
2.0
3
1.5
5
2
1.0
1
0.5
0
0.0
2
Epilimnion
1
-1
0.0
1.0
Metalimnion
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
14
21 28
August
4
11 18 25
September
0
2
Metalimnion
1
0
1
8
15 22
May
29
5
June
-1
08
0.8
2.0
-1
1
Epilimnion
4
Pico
oplanktivo
ory [µg C l h ]
1.0
-1
Enzym
me activity
y [nmol l h ]:
Vmaax(H);
Vmaax(R)
Rímov Reservoir - 1993
20 µm
Hydrolýza MUF-N-acetyl-β-D-glukosaminidu
Římov, 23.8.1993 – metalimnion
0.0006
0.020
Vmax(R)
0.0003
-1
-1
Enzyme
e activity [µ
µmol l h ]
0.025
0 015
0.015
0 0000
0.0000
0
1
2
3
LEA
0.010
0.005
Vmax(R)
0.000
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-1
Substrate [µmol l ]
LEA = low-affinityy
enzyme activity
(KM(L)
( )>100 µM)
(celková – Vmax(R))
Piburger See - 1994
Epilimnion
200 15
15
150
10
100
5
50
0
20
Metalimnion
150
10
100
5
50
0
0
14
21 28
August
4
11 18 25
September
10
100
5
50
0
0
200 15
15
150
Epilimnion
-1
20
Crusta
acean zoo
oplankton
n [ind. l ]
Rímov Reservoir - 1993
-1
-1
En
nzyme ac
ctivity [nm
mol l h ];
-1
Diatom biomass [mg l ]
Nízkoafinní enzymy rozsivek a perlooček
0
150
Metalimnion
10
100
5
50
0
0
1
8
15 22
May
29
5
June
Nízkoafinní enzymy rozsivek a perlooček
5
PIB
12
3
LEA
LEA
4
RIM
rs= 0.578 *
2
8
4
1
0
0
0
1
2
3
20 30 40 50 60 70
Crustacean abundance
Diatom biomass
20
12
LEA
15
5
LEA
rs= 0.850
0 850 *
10
5
rs= 0.483
0
0
3
6
9 12 15
Diatom biomass
rs= 0.862 *
8
4
0
0
1
2
3
Diatom biomass
minidase
-N-acetyylhexosam
activityy [nmol l -11 h-1]
100
A
rs = 0.3529 ***
10
1
0.1
0.01
0.1
1
10
Diatom biomass [mm 3 l-11]
100
minidase,
-N-acetyllhexosam
Vmax(L) [nmol l-11 h-1]
Nízkoafinní ektoenzymy rozsivek (KM>150 µM)
20
B
r2 = 0.9870
15
pennate diatoms
centric diatoms
10
r 2 = 0.9923
5
0
0
3
6
9
12
15
Di
Diatom
bi
biomass [[mm 3 l-11]
18
ylhexosam
minidase a
activity
 -N-acety
(nmol l-11 h-1 )
Svlékací enzym perlooček
3.5
0.8316
3.0
A
2.5
20
2.0
3
1.5
2
1.0
1
0.5
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Body
y length
g ((mm))
• KM ~ 60 µmol l-1
• rozpuštěný (po svléknutí)
• stabilní (> 2,5 dne
2.5
3.0
Příklad vyhodnocení saturační kinetiky
extracelulárních β
β-N-acetylhexosaminidáz
N acetylhexosaminidáz
v různých velikostních frakcích planktonu
hexosaminidase
 --N-acetylh
activity
y [µmol l-1 h -1]
0 025
0.025
<100 µm
<10 µm
<4 µm, <0.2 µm
0.020
0.015
0.010
0 005
0.005
0.000
0
50
100
150
200
250
Substrate [µmol l-1]
St ý Vrbenský
Starý
V b
ký ryb.,
b 11
11.4.1995:
4 1995
nálevníci, HNF, rozsivky, korýši, chitinolitické bakterie
300
Někdy lze v povrchových vodách odlišit
různé enzymy
y y štěpící
p MUF–GlcNAc
kineticky (0,01–300 µmol l-1) a frakcionačně
• "Extracelulární" aktivita trávicího enzymu
y
bakterivorních p
prvoků jje vždy
y
vázána na částice a vyznačuje se vysokou afinitou (KM<0.5 µmol l-1).
• Ektoenzymy chitinolytických bakterií mají nízkou afinitu k substrátu
(KM>100 µmol l-1), tyto bakterie velmi často přisedají na částice
chitinu.
• Chitinolytická aktivita s nízkou afinitou k substrátu je často vázána na
výskyt rozsivek, kromě ektoenzymů přisedlých chitinolytických bakterií jde
zřejmě
j
o ektoenzymy
y y rozsivek ((KM>150 µ
µmol l-1)).
• Zvýšená aktivita rozpuštěných svlékacích enzymů korýšů (členovců) ve
vodě je charakteristická pro období rychle rostoucích populací korýšů
(KM~60 µmol l-1), a zřejmě také např. pro období výletu vodního hmyzu?
• Ke zvýšené aktivitě rozpuštěných enzymů mohou přispívat trávicí
enzymy mnohobuněčných živočichů (chitinázy – korýši, hmyz, ryby)?
• Podílí se na hydrolýze MUF–GlcNAc virové lysozymy?
CHITIN = polymer N-acetyl-β-D-glukosaminu (GlcNAc–GlcNAc)n:
členovci houby,
členovci,
houby měkkýši,
měkkýši červi,
červi nálevníci
nálevníci, rozsivky
rozsivky...
O
CH2OH
O
OH
O
CH2OH
O
OH
NH–CO–CH
NH
CO CH3
O
CH2OH
O
OH
NH–CO–CH
NH
CO CH3
O
NH–CO–CH
NH
CO CH3
chitinázy,
y chitobiázy,
y β
β-N-acetylhexosaminidázy...
y
y
PEPTIDOGLYKAN = polymer kyseliny N-acetyl-β-D-muramové
a N-acetyl-β-D-glukosaminu
N
t lβD l k
i (MurNAc–GlcNAc)
(M NA Gl NA )n:
Prokaryota (bakterie, sinice)
CH2OH
O
CH2OH
O
OH
O
O
O
NH–CO–CH
CO C 3
CH3CH–CONH–CH–COOH
CH2OH
O
O
O
NH–CO–CH
CO C 3 O
NH–CO–CH
CO C 3
CH3CH–COOH
CH3
lysozymy
y
y y ((muramidázy)
y)
umělý (nefluorescenční) substrát
4-methylumbelliferyl
4
methylumbelliferyl N
N-acetyl-β-D-glukosaminidid
acetyl β D glukosaminidid
O
O
O
CH2OH
O
OH
O
NH–CO–CH
NH
CO CH3
CH3
((extracelulární)) β
β-N-acetylhexosaminidázy
y
y
Příjem fosfátu řasovými buňkami
Pi
Porg
Snížená dostupnost P pro fytoplankton
P limitace fytoplanktonu
Indukce extracelulárních alkalických fosfatáz fytoplanktonu
Římov reservoir
60
SRP
Chl a
50
2.5
40
2.0
30
15
1.5
20
1.0
10
0.5
0
0.0
J
F
M
A
M
J
J
2000
A
S
O
N
D
M UF [µmo
ol l-1 h-1]
SRP & Chl a [µg l-1]
S
3.0
Indukce extracelulárních alkalických fosfatáz fytoplanktonu
Římov reservoir
60
SRP
Chl a
50
40
2.5
2.0
MUF
MUF > 2µm
30
15
1.5
20
1.0
10
0.5
0
0.0
J
F
M
A
M
J
J
2000
A
S
O
N
D
M UF [µmo
ol l-1 h-1]
SRP & Chl a [µg l-1]
S
3.0
P limitace fytoplanktonu:
lokalizace aktivní extracelulární fosfatázy (ELF®97 fosfát)
autofluorescence fytoplanktonu (LUCIA)
Eudorina
10µm
20µm
2000 © A. Štrojsová
Římov 31.5.00
O
Cl
Jak ELFP funguje?
NH
Cl
N
HO
O
Cl
NH
pH < 8 (?)
Cl
N
O
-O
O
Cl
O-
NH
Cl
N
H
P
O
rozpustný? (při nízkých koncentracích?)
O
O
O
Cl
pH > 8 (?)
NH
Cl
NH
Cl
N
Cl
N
-O
HO
O
Cl
NH
pH < 8 (?)
Cl
N
O
-O
O
Cl
O
Cl
O
P
Cl
O
O-
NH
NH
O
Cl
NH
O
Cl
N
H
Cl
N
O
rozpustný? (při nízkých koncentracích?)
Cl
NNH
N
NH Cl
H
O
H
H
Cl
O
N
Cl O
O
NH
Cl
Cl
N
H
O
H
O
silně fluoreskující, nerozpustná sraženina
Plešné jezero (9.10.00)
50µm
2000 © A. Štrojsová
Autofluorescence fytoplanktonu, aktivní extracel. fosfatázy
Různé extracelulární fosfatázy planktonních mikrobů
Lake Čertovo
Lake Plešné
20
1000
16
18
14
ELFP-fluorimeter
13
MUFP-fluorimeter
12
8
7
6
small bacteria
vibrio-shaped
filaments
5
4
Activity ((µmol l-1 h-11)
Activity ((µmol l-1 h-11)
15
ELFP on filter
MUFP-fluorimeter
16
12
Monoraphidium
100
10
8
6
10
4
3
2
2
1
1
0
0
May Jun Jul Aug Sep Oct Nov
2003
May
Jun
Jul
Aug
Sep
2003
celoroční P limitace planktonu v šumavských jezerech
(SRP < 1 µg/l)
Oct
Specific a
activity (fmo
ol Monorap
phidium-1 h-1)
17
Diurnální změny fosfatáz v jednorázové kultuře
Chlamydomonas
y
reinhardtii
7000
Relativ
ve fluorrescenc
ce
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
12
18
24
6
12
18
day time (hours)
24
6
12
Detekce jiných ektoenzymů v planktonu
Fosfatázy
ß-Hexosaminiddázy
(ELF phosphate)
(ELF N-acetyl-ß-D-glucosaminide)
C ti
Ceratium
hi
hirundinella
di ll
Ankyra
Rhodomonas
Lipázy
(ELF palmiate)
A t i
Asterionella
ll fformosa
Hetero- & Mixotrofní bičíkovci
Planktonní vířníci: detekce & lokalizace
enzymatických
ý aktivit u různých
ů ý druhů
ů
Trichocerca similis
K. cochlearis
K. cochlearis Synchaeta pectinata
 korona 
fosfatázy
mastax 
lipáza
ß-hexosaminidáza
(v žaludku)
trávení prokaryt?
12 druhů: Keratella spp., Polyarthra spp., Synchaeta spp., Kellicottia,
Trichocerca, etc.)