Jak akreditovat metodu bez IVD?

Imunofenotypizace leukemií z kostní dřeně, periferní krve, výpotku a mozkomíšního moku průtokovou cytometrií
1) Použití validovaných kitů od výrobce – značka CE/IVD
2) Home‐made metoda s vlastní (laboratoří provedenou) validací
3) Metoda publikována v mezinárodním impaktovaném časopise, kde prošla recenzním řízením
Panely kombinující protilátky pro detekci povrchových a intra znaků definujících příslušnost k buněčné linii (B, T, myelo, erythro), stadiu diferenciace apod.
Interní kontrola kvality
1) Kontrola přístrojů
2) Verifikace metody – Reprodukovatelnost?
Opakovatelnost?
Nejistota měření?
Externí kontrola kvality
Česká … mezilaboratorní porovnání
Mezinárodní … UK NEQAS
iBFM
EuroFlow
„Nezávislou verifikací musí laboratoř potvrdit, prostřednictvím získání objektivního důkazu (ve formě výkonnostních charakteristik), že požadavky na výkonnost u daného postupu laboratorního vyšetření byly splněny. Požadavky na výkonnost, které se potvrzují procesem verifikace, musí být takové, které odpovídají zamýšlenému použití výsledků laboratorního vyšetření.“
Celková analytická chyba, velikost odchylky (bias), … v cytometrii???
1) Dlouhodobá přesnost měření v laboratoři, získávanou v procesu vnitřní kontroly kvality – hodnoceno v rámci verifikací (CV a SD u metod s dostupným referenčním materiálem, kdy hodnotíme jednotlivé antigeny zvlášť)
2) Dlouhodobá přesnost měření získávaná v procesu externí kontroly kvality
3) Stabilita přístroje – sledování CV pro jednotlivé kanály (Rainbow Beads)?
4) Specifičnost?
5) Požadavek na minimalizaci ztrát buněk v průběhu přípravy vzorku?
Metodické pokyny Sekce laboratorní imunologie ČSAKI: http://www.sli‐csaki.cz/metodicke‐pokyny/
‐ Praktické provádění validace a verifikace metod
‐ Doporučení pro určení odhadů nejistot výsledků měření v laboratoři
‐ Doporučení k aplikaci “in‐house” metod v imunologických laboratořích
Pravidelná údržba cytometrů ‐ servis, promývání
Denní kontrola správné činnosti cytometrů
CST Beads … laser delay, linear range, optical background, …
Rainbow Beads … standardizace MFI, definovat přijatelnou mez detekce, standardizace mezi různými cytometry
datum
start měření
konec měření
22.9.2014
08:00:00 dop.
04:30:00 odp.
Kontrola kompenzací
B‐530/30‐A B‐575/26‐A B‐610/20‐A B‐695/40‐A V‐450/50‐A CV
CV
CV
CV
CV
2,8
2,4
2,7
3,9
4,9
CD1a
CD2
CD3
CD4
CD5
CD7
CD8
CD10
CD24
CD33
CD34
CD38
CD45
CD56
CD58
CD64
CD11b
CD13
CD14
CD15
CD16
CD19
CD20
CD22
CD66c
CD81
CD117
HLA‐DR
Kappa
Lambda
NG2
TCRab/gd
IVD kit?
IVD protilátky?
intra TdT
intra MPO
intra CD3
intra CD79a,
……………
IMMUNO‐TROL cells
IVD … CD2, 3, 4, 5, 8, 19, 45, 3‐56+
not IVD … CD7, 10, 13, 14, 22, 33, , , HLA‐DR
CD‐Chex Plus % pozitivity
SD
Cílové hodnoty uvedené výrobcem:
CD3+
CD4+
CD8+
CD19+ CD3-56+
76
47
26
11,9
12,2
10
6
6
5
5
IVD … CD2, 3, 4, 5, 8, 19, 20, 45, 3‐16+56+, HLA‐DR
not IVD … CD7, 10, 11b, 11c, 13, 15, 22, 23, 33, 38, , 
... CD117, 25, 71 … CD34
Stabilizovaný vzorek leukemie
UK NEQAS … B, T …
Rozsáhlé panely znaků (protilátek a fluorochromů)
FITC
4/8/3/7/45
CD4 FITC
DR GATE KOMBI HLA‐DR FITC
99/7/5/3/45
CD99 FITC
KORSA/56/19/45
KORSA 3544 FITC
20/10/19/34/45/SYTO 41/38
CD20 FITC
15/117/34/33/45/7
CD15 FITC
34/iLYSOZYM/45/33/14/11c
CD34 FITC
iTDT/7/3/i3/45
iTDT FITC
iMPO/i79a/i3/45/7/19
iMPO FITC 11b/45/7/19/i22
BD
IM
BD
IM
BD
BD
IM
DAKO
IM
PE
CD8 PE
CD14 PE
CD7 PE
CD56 PE
CD10 PE
CD117 PE
iLYSOZYM PE
CD7 PE
iCD79a PE
CD11b PE
IM
EX
IM
BD
DAKO
IM
ADG
IM
DAKO
BD
PerCP
CD3 PC5
CD45 PerCP
CD45 PerCP
CD45 PerCP
CD45 PerCP
CD45 PerCP
CD11c PerCp CY5.5
CD45 PerCP
CD45 PerCP
CD45 PerCP
IM
EX
EX
EX
EX
EX
BD
EX
EX
EX
ECD
CD7 ECD
CD4 ECD
IM
IM
PC7
CD7 ECD
IM
mCD7 ECD IM
CD7 ECD IM
CD3 PC7
CD5 PC7
CD19 PC7
CD19 PC7
CD34 PC7
CD33 PC7
CD3 PC7
CD19 PC7
CD19 PC7
IM
IM
IM
IM
IM
IM
IM
IM
IM
APC
CD45 APC
CD8 APC
CD3 APC
BD
EX
IM
CD34 APC
CD33 APC
CD14 APC
iCD3 APC iCD3 APC
iCD22 APC
IM
IM
BD
IM
IM
BD
A700
PB
CD38 A700 EX SYTO 41 INV
Vybrat protilátky, které reportujeme na výsledkovém listě.
CD45 PerCP
KORSA 3544 FITC
CD20 FITC
CD34 APC
CD15 FITC
CD117 PE
n=45
Měsíční testování na referenčním materiálu, zdravé PK, zdravé KD
PO
CD45 PO EX
Reprodukovatelnost
Testovaný znak
CD4 FITC
CD8 PE
HLA‐DR FITC
CD14 PE
CD7 PE
CD5 PC7
šarže refer.materiálu
říjen
44,9
29,5
20,1
77,7
75,8
70,5
cílové hodnoty uvedené výrobcem
46±5
27±7
19±6
77±20
73±18
73±12
listopad
47,5
28,2
22,6
77,5
78,7
73,1
7587045
cílové hodnoty uvedené výrobcem
49±5
27±7
20±6
82±20
77±18
75±12
7587047
prosinec
47,5
28,2
21,9
77,5
78,7
73,6
cílové hodnoty uvedené výrobcem
49±5
27±7
20±6
82±20
77±18
75±12
7587047
+ šarže protilátek
kontrola návaznosti různých šarží
Testovaný znak Na čem? Lymfo Mono Granulo % pozitivní/negativní
KORSA 3544 FITC krev
G
88,8
pozitivní
CD20 FITC
krev
L
5,4
pozitivní
CD34 APC
dřeň
L
34,4
pozitivní
CD15 FITC
krev
G
99,9
pozitivní
CD117 PE
dřeň
L
3,8
pozitivní
Nejistotu měření nestanovujeme
MFI
2408
18697
3243
1.3e5
2102
% pozitivní/negativní
MFI
90,9
pozitivní
2309
8,2
pozitivní
18370
32,1
pozitivní
3075
99,4
pozitivní
1.31e5
2,4
pozitivní
2234
% pozitivní/negativní MFI
91
pozitivní
2336
4,83
pozitivní
18370
36,8
pozitivní
3381
99,2
pozitivní
1.33e5
6,8
pozitivní
1969
UK NEQAS …. stabilizovaný vzorek leukemie (diagnoza + minimal residual disease)
dg, vybrat antigeny pro detekci zbytkové nemoci, % leukemických blastů
Léčebná skupina iBFM … mezilaboratorní porovnání diagnostického vzorku UK NEQAS
% pozitivity jednotlivých znaků vybraných podle iBFM SOP
EuroFlow QA
Quality assessment program for EuroFlow protocols: Summary results of four‐year
(2010‐2013) quality assurance rounds.
Kalina T, et al. (Cytometry A, 2015 Feb;87(2):145‐56) Monitoruje celý cytometrický proces : nastavení cytometru, příprava vzorku, nahrávání, analýza.
PRIMÁRNÍ VERIFIKACE REAGENCIÍ … nově v normě ISO 15189
Kontrola reagencií probíhá při prvním měření vzorku danou reagencií. Reagencie jsou monitorovány, včetně šarže, doby expirace, data otevření a data vypotřebování.
SPRÁVNĚ TITROVAT
zejména na vhodném materiálu
DOBŘE A PRAVIDELNĚ KOMPENZOVAT
CD19 PerCP x general (PE)
SLEDOVAT DOBU EXPIRACE
Jak zacházet s protilátkami, které mají po době expirace?
NIS
LIS
Databáze … nutná validace výrobcem … nově v normě ISO 15189
Analyzační software (Diva, FlowJo, …)
Vzorek (referenční materiál) několikrát analyzován stejnou gejtovací strategií … porovnání dat.
Softwary nebo tabulky pro automatické přepočty
př. Stanovení absolutního počtu buněk ‐ z WBC
‐ podle referenčních kuliček
versus kalkulačka 13:30 workshop
Synchronizační software
kontrola přenosu a celistvosti dat
http://en.wikipedia.org/wiki/Phrases_from_The_Hitchhiker%27s_Guide_to_the_Galaxy
#Don.27t_Panic
Poděkování
Hana Feixová
zástupce manažera kvality CLIPu
kolegové z CLIPu:
Daniel Thürner
Martina Šmídková
Pavla Luknárová
Pavel Semerák
http://clip.lf2.cuni.cz
13:30 workshop
workshop „Klinická cytometrie“
kontrola kvality, problémy v cytometrických vyšetřeních
http://www.csac.cz/cs‐konference‐seminare‐konferenceCSAC.html