Protilátky proti Treponema pallidum (IgM) Návod na použití

Protilátky proti Treponema pallidum (IgM)
Návod na použití ELISA testu
Objednací číslo
EI 2111-9601M
Protilátky proti
Treponema
pallidum
Třída Ig
IgM
Substrát
Ag-potažené
mikrotitrační
jamky
Formát
96 x 01 (96)
Princip testu: ELISA test umožňuje kvantitativní in-vitro stanovení lidské protilátky třídy
IgM proti Treponema pallidum. Diagnostický kit (souprava) obsahuje oddělené proužky
mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy rekombinantními antigeny
Treponema pallidum. V prvním reakčním kroku se v jamce inkubují ředěné vzorky séra od
pacientů. V případě pozitivních vzorků, se specifické IgM (také IgA a IgG) protilátky
navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s
protilátkou proti lidským IgM značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna
vyvolat barevnou reakci. Intenzita vzniklé barevné reakce je úměrná koncentraci protilátek
proti antigenům Treponema pallidum.
Obsah kitu:
- Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky,
každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití)
- Kalibrační sérum: (lidské IgM): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno tmavě červeně.
- Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno modře.
- Negativní kontrolní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno zeleně.
- Enzymový konjugát: peroxidasou značené kozí protilátky proti lidským IgM: 1 x 12 ml,
připraveno k použití. Značeno červeně.
- Vzorkový pufr: obsahuje IgG/RF absorbent (kozí protilátky proti lidskému IgG):
1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně.
- Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný)
- Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen:
tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku.
- Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití. 0,5 M kyselina sírová.
- Návod k provedení testů
- Protokol s kalibračními hodnotami.
Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až
+ 8 oC, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do
vyznačeného data expirace.
Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a
nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HBsAG, anti-HCV, anti- HIV-1 a
anti-HIV-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně
infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou
jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu,
omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody.
Příprava a stabilita reagencií
Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu.
Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a
trhnutím otevřete lepící ochranný obal . Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska
vytemperovaná na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned
přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného
zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném
ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 oC až + 8 oC, lze je
použít po dobu nejméně dvou měsíců.
Kalibrace a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně
promíchat.
Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat.
Vzorkový pufr: Připraven k použití. Zeleně obarvený vzorkový pufr obsahuje IgG/RF –
Absorbent. Pro stanovení protilátek třídy IgM proti Treponema pallidum se musí vzorky séra
nebo plazmy naředit tímto pufrem.
Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství
pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou.
Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je
stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 oC až + 8 oC.
Poznámka. Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 oC a před
ředěním ho promíchejte.
Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití,
obsah je citlivý na světlo.
Zastavovací roztok: Připravený pro užití
Ředění séra a vzorků plasmy
Úvod: Předtím, než mají být ve vzorcích séra pacientů stanoveny protilátky třídy IgM , musí
se odstranit protilátky třídy IgG. Toto lze provést ultracentrifugací, chromatografií nebo
imunoabsorpcí. Tento proces musí být proveden tak, aby se zabránilo revmatickým faktorům
reagovat se specifickými vázanými IgG, což by vedlo k falešně pozitivním výsledkům
v testech pro IgM a dále se musí zabránit náhradě IgM za specifické IgG vázané k antigenu,
což by naopak vedlo k falešně negativním výsledkům pro IgM.
Princip: Vzorkový pufr (značeno zeleně ) obsahuje IgG/RF absorbent (kozí protilátky proti
lidskému IgG). IgG ze séra nebo plazmy se navážou s vysokou specificitou na tyto protilátky
a precipitují. Jestliže vzorek obsahuje revmatické faktory, tyto jsou absorbovány pomocí
komplexu IgG/anti-lidský IgG komplex.
Vlastnosti oddělení:
-Všechny IgG podtřídy se navážou a precipitují pomocí anti-lidských IgG protilátek.
-IgG se z lidského séra odstraní až do koncentrace 15 mg na mililitr (průměrné sérum
dospělého člověka obsahuje koncentraci IgG okolo 12 mg na mililitr)
-Odstraní se revmatické faktory
- Výtěžek IgM frakce je téměř 100%.
Provedení: Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například,
přidejte 10 µl séra k 1,0 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Inkubujte reakční směs po
dobu alespoň 10 minut při pokojové teplotě. Potom naneste vzorky podle pipetovacího
protokolu do jamek mikrotitrační desky.
Poznámky:
-Protilátky třídy IgG nelze pomocí této reakční směsi stanovit.
-Ověření účinnosti absorbentu IgG/RF se udělá tak, že se provede paralelní test na stanovení IgG ve směsi pro IgM – stanovení IgM je spolehlivé pouze tehdy, je-li test na IgG
negativní.
-Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je
znovu.
Inkubace
Inkubace vzorku: 1. Krok. Podle pipetovacího protokolu naneste 100µl kalibračního séra,
pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých
mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě.
Promývání:
Vyprázdněte jamky a následně každou jamku promyjte třikrát pomocí
300µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr
v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu,
teprve potom jamky vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů
(provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte,
vyklepejte promývací pufr poklepem desky otočené dnem vzhůru na
filtrační papír.
Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou
značené anti-lidské IgM) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte
po dobu 30 minut při pokojové teplotě.
Promývaní:
Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše
Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé
mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve
tmě.
Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační
desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový
roztok.
Měření:
Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové
délce 450 nm a referenční vlnové délce větší než 620 nm do 30 minut od
přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační
desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku.
Pipetovací protokol
1
2
A
C
P6
B
Poz. P7
C
Neg. P8
D
P1
P9
E
P2
P10
F
P3
P11
G
P4
P12
H
P5
P13
3
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
4
P22
P23
P24
5
6
7
8
9
10
11
12
Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem kvantitativní analýzy sér od 24 pacientů (P1
až P24). Kalibrační séra (C), pozitivní a negativní kontrolní séra (poz. a neg.) a všechny
vzorky sér od pacientů byly inkubovány jednotlivě v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu
se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat
z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií.
Výpočet výsledků:
Hodnota absorbance kalibračního séra definuje horní hranici referenčního rozsahu pro
neinfikované osoby (cut-off value). Hodnoty vyšší, než je tato hranice, se považují jako
pozitivní, pod touto hranicí jako negativní. Vedle této kvalitativní interpretace je možné také
jemnější vyhodnocení výsledků. Poměry > 1,0 se považují jako pozitivní, poměry < 1,0 jako
negativní. Jak pozitivní, tak negativní kontrolní sérum, slouží jako vnitřní kontrola pro
provedení testu, musí být proto zařazeny v každém prováděném testu.
Poměry se vypočítají z následujícího vztahu:
Extinkce kontrolního vzorku nebo vzorku séra
Extinkce kalibračního séra (cut-off)
= Poměr
Charakteristiky testu
Kalibrace: Jelikož neexistuje referenční sérum pro protilátky třídy IgM proti Treponema
pallidum, vyjadřují se výsledky ve formě poměrů, které jsou v relaci ke koncentraci
protilátek.
Pro všechny skupiny prováděných testů musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a poměry
určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité hodnoty
pro každý kit. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne
hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a musel by se opakovat.
Aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud
nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou
hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační
séra se vystaví stejnému vlivu, a proto nastalé změny jsou povětšinou zakalkulovány ve
výpočtu výsledků. Tato situace se bere následně do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace
substrátu vzhledem k pokojové teplotě:
Pokojová teplota 14 oC – 18 oC
Pokojová teplota 19 oC – 23 oC
Pokojová teplota 24 oC - 30 oC
doba inkubace substrátu 18 min
doba inkubace substrátu 15 min
doba inkubace substrátu 12 min
Antigen: Jako zdroj antigenu slouží směs rekombinantních antigenů Treponema pallidum.
Obsahuje T.pallidum p15-, T.pallidum p17-, T. pallidum p 47- a T.pallidum TmpA antigeny.
Klinický význam
Treponema pallidum je bakterie patřící do rodiny spirochaetaceae. Do této rodiny patří pět
rodů: borelie, spirocheta, kristispira, treponema a leptospira. Treponema pallidum je infekční
patogenní agens způsobující syfilis (lues), chronickou infekční chorobu. Přenos choroby se
děje hlavně sexuálním kontaktem, ačkoli přenos krevní transfuzí či přes poranění, či
diaplacentálně nelze vyloučit. Infekce se šíří mízními cévami a lymfatickými uzlinami do
krve a krví dále do orgánů. Syfilis patří mezi všeobecně známé choroby a její průběh lze
rozdělit do několika různých stadií. Primární a sekundární stádium je známo jako časná syfilis
a terciární a kvarterní stádium jako pozdní stádia syfilis.
Primární stádium: Typickým primárním projevem exogenní infekce Treponema pallidum je
ohraničený výskyt vláknité eroze, či ztvrdliny v místě infekce, která se objeví tři týdny po
infekci. Potom se může vyvinout vřed, či se zhorší vzniklé leze, vznikne tzv.tvrdý vřed.Do
týdne se zvětší mízní uzliny.
Sekundární stádium: Kromě zvětšení mízních uzlin se u 90 % pacientů ukazují tzv. lokální
či po celém těle rozmístěná poranění kůže, která mohou být symetrická, či se mohou projevit
ve formě skvrn, pupínků, odlupující se kůže a/nebo vřídků. Převládající jsou projevy ve
formě bradavičnatých útvarů. Dále se mohou vyvinout další poškození orgánů, například
keratitida, irititida, hepatitida, vaskulitida a potíže myokardu. Sekundární stádium syfilitidy
následuje klinicky se neprojevující (klidové) stádium (syphylis latens). Toto stádium může
trvat i několik let.
Terciární stádium: Typickými projevy syfililitidy ve třetím stádiu jsou velké pupeny a vředy
na kůži a sliznicích. Vnitřními projevy syfilitidy jsou změny na různých orgánech, které se
mohou projevit ve formě gumatózních
a intersticiálních zánětů, perivaskulitidy,
kardiovaskulární syfilis, neurosyfilis (v asymptomatické, či symptomatické formě), osteitis
(zánět kostní dřeně) a periosteitis.
Kvarterní stádium: Kvarterní projevy infekce Treponema pallidum ve formě neurosyfilitidy
se mohou projevit až 30 let po nakažení. Neurosyfilis se projevuje v tomto stadiu nejprve
vznikem primární formy progresivní paralýzy a tabes dorsalis (onemocnění míchy následující
po infekci neléčené syfilitidy).
Diagnóza syfilitidy je založená na klinických příznacích, odpovídajících stádiu nemoci,
mikroskopické detekci infekčního agens (tmavé pole) a sérologických detekcích pomocí
protilátek proti Treponema pallidum.
Literární odkazy:
1. Oschmann P., Nuckel M., Wellensiek H.J., Hornig C.R., Dorendorf W.: Immunoblot as a
Diagnostic Tool in Neurosyphilis. J.Lab.Med. 1997; 21(1):037-042.
2. Meyer P.M., Eddy T. Baughn R.E.: Analysis of Western Blotting (Immunoblotting)
Technique in Diagnosis of Congenital Syphilis. J.Clin.Microbiol. Mar. 1994:629-633.
3. Lewis L.L., Taber L.H., Baughn R.E.: Evaluation of Immunoglobulin M Western Blot
Analysis in the Diagnosis of Congenital Syphilis. J.Clin. Microbiol.Fed. 1990:296-302.