Protilátky třídy IgG proti Treponema pallidum v

Protilátky třídy IgG proti Treponema pallidum v mozkomíšním moku
Návod na použití ELISA testu
Objednací číslo
Protilátky proti
EI 2111-9601-LG Treponema
pallidum
Třída Ig
IgG
Substrát
Ag-potažené
mikrotitrační
jamky
Formát
96 x 01 (96)
Indikace: Nemoci spojované s Treponema infekcí: syfilis neboli lues.
Princip testu: ELISA test umožňuje kvantitativní in-vitro stanovení lidské protilátky třídy
IgG proti Treponema pallidum v mozkomíšním moku (cerebrospinal fluid-CSF). Test pracuje
na stejném principu jako pro určeni protilátek proti Treponema pallidum v lidském séru, ale
kromě toho obsahuje kalibrační séra pro CSF diagnostiku. Diagnostický kit (souprava)
obsahuje oddělené proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy
rekombinantními antigeny Treponema pallidum. V prvním reakčním kroku se paralelně
v jamkách inkubují ředěné vzorky séra a mozkomíšního moku pacientů. V případě
pozitivních vzorků, se specifické IgG (také IgA a IgM) protilátky navážou na antigeny.
K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským
IgG značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci.
Určení koncentrace protilátek proti Treponema pallidum v mozkomíšním moku a sérech se
měří pomocí kalibrační křivky vytvořené pomocí CSF kalibračních sér A až D. Jestliže jsou
protilátky proti Treponema pallidum detekovány pouze v lidském séru, použijí se
k vyhodnocení kalibrační séra 1 až 3 (viz kit EUROIMMUN Anti-Treponema pallidum –
ELISA(IgG); objednací číslo EI 2211-9601 G).
Obsah kitu:
EI 2211-9601-LG Testovací systém pro určení protilátek proti Treponema pallidum v
mozkomíšním moku sestává z:
- Kit Anti-Treponema pallidum ELISA (IgG); objednací číslo EI 2211-9601 G)
- CSF kalibrační sérum A; 100 U (lidské IgG): 1 x 1,0 ml, připravené k použití, značeno
tmavě fialově.
- CSF kalibrační sérum B; 40 U (lidské IgG): 1 x 1,0 ml, připravené k použití, značeno
fialově.
- CSF kalibrační sérum C; 8 U (lidské IgG): 1 x 1,0 ml, připravené k použití, značeno světle
fialově.
- CSF kalibrační sérum D; 1 U (lidské IgG): 1 x 1,0 ml, připravené k použití, značeno slabě
fialově.
- Návod k provedení testů
- Instrukce pro výpočet relativních CSF/sérum kvocientů.
Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až
+ 8 oC, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do
vyznačeného data expirace.
Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a
nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HBsAG, anti-HCV, anti- HIV-1 a
anti-HIV-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně
infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou
jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu,
omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody.
Příprava a stabilita reagencií
Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu.
Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a
trhnutím otevřete lepící ochranný obal . Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska
vytemperovaná na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned
přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného
zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném
ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 oC až + 8 oC, lze je
použít po dobu nejméně dvou měsíců.
Kalibrační séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat.
Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat.
Vzorkový pufr: Připraven k použití
Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství
pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou.
Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je
stabilní pro použití maximálně po dobu čtyř týdnů, je-li skladován při teplotě +2 oC až
+ 8 oC.
Poznámka. Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 oC a před
ředěním ho promíchejte.
Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití,
obsah je citlivý na světlo.
Zastavovací roztok: Připravený pro užití
Ředění séra a vzorků plasmy
Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 401 vzorkovým pufrem. Například, nejdříve
vzorky sér pořádně promíchejte, potom přidejte 10 µl séra k 1,0 ml vzorkového pufru a dobře
promíchejte (ředění 1 : 101). Poté přeneste 250 µl takto ředěného vzorku do 750 µl
vzorkového pufru a opět řádně promíchejte (ředění 1 :401).
Vzorky CSF: pro analýzu se ředí 1 : 2 ve vzorkovém pufru. Například, nejprve vzorky CSF
řádně promíchejte. Poté přidejte 100 µl CSF do 100 µl vzorkového pufru a opět řádně
promíchgejte. (ředění 1 :2).
Poznámka: Kalibrační séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je
znovu.
Inkubace
Inkubace vzorku: 1. Krok. Podle pipetovacího protokolu naneste 100µl CSF kalibračního
séra nebo mozkomíšního moku do jednotlivých mikrotitračních jamek a
inkubujte 60 minut při pokojové teplotě.
Promývání:
Vyprázdněte jamky a následně každou jamku promyjte třikrát pomocí
300µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr
v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu,
teprve potom jamky vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů
(provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte,
vyklepejte promývací pufr poklepem desky otočené dnem vzhůru na
filtrační papír.
Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou
značené anti-lidské IgG) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po
dobu 60 minut při pokojové teplotě.
Promývaní:
Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše
Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé
mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve
tmě.
Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační
desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový
roztok.
Měření:
Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové
délce 450 nm a referenční vlnové délce větší než 620 nm do 30 minut od
přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační
desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku.
Pipetovací protokol
A
B
C
D
E
F
1
CSF
A
CSF
B
CSF
C
2
S3
1:401
CSF3
1:2
S4
1:401
3
S7
1:401
CSF7
1:2
S8
1:401
4
5
S11
1:401
CSF11
1:2
S12
1:401
CSF
D
S1
1:401
CSF1
1:2
CSF4
1:2
S5
1:401
CSF5
1:2
CSF8
1:2
S9
1:101
CSF9
1:2
CSF12
1:2
6
7
8
9
10
11
12
G
H
S2
1:401
CSF2
1:2
S6
1:401
CSF6
1:2
S10
1:401
CSF10
1:2
Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem analýzy sér od 12 pacientů (S1 až S12) a 12
odpovídajících vzorků mozkomíšních moků CSF (vzorky C1 až C12). Pro CSF kalibrační
séra (CA až CD) a vzorky sér od pacientů bylo provedeno jedno stanovení pro jedno ředění.
Spolehlivost kalibrační křivky lze zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se
mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami
všech reagencií.
CSF kalibrační séra se musí inkubovat v každém novém testu a musí se určit nová kalibrační
křivka. Séra a odpovídající CSF musí být testovány spolu v jednom testu.
Výpočet výsledků:
Pomocí tohoto testu lze stanovit kvocient CSF/sérum pro patogen-specifické protilátky
LSQpath.-spec.(IgG). Další podrobnosti a požadavky na určení patogen- specifických protilátek
v CSF se zjistí v kapitole „ Základy CSF diagnostiky“.
Křivka standardů, ze které se odečítá koncentrace protilátek ve vzorcích CSF a párových sér,
se sestrojí vynesením hodnot extinkce získaných z měření 4 kalibračních sér, bod po bodu,
proti odpovídajícím jednotkám. Následující vynesení je příkladem typické kalibrační křivky.
Prosím, neužívejte tuto kalibrační křivku k určení koncentrací protilátek v sérech pacientů.
Jestliže hodnoty určené pro vzorky leží vně měřeného rozsahu, postup je následující:
1) Jestliže hodnota získaná pro vzorek séra a/nebo CSF vzorek leží pod měřeným rozsahem
(extinkce vzorku < extinkce vzorku kalibračního séra C D): ve vzorku nejsou detekovány
žádné specifické protilátky a proto nelze vypočítat kvocient CSF/sérum
2) Jestliže hodnota získaná pro vzorek séra a/nebo pro vzorek CSF leží nad měřeným
rozsahem (extinkce vzorku >extinkce kalibrátoru LA): vzorek musí být testován podle
stejného schématu ve vyšším ředění. Například, použijte ředění séra 1 : 801 a ředění CSF
1 : 4. Nový ředící faktor musí být zakomponován i do výpočtu kvocientu CSF/sérum.
3) Výpočet kvocientu CSF/sérum lze získat pouze tehdy, jestliže hodnoty extinkce obou
vzorků leží v měřeném rozsahu.
Kvocient CSF/sérum pro patogen-specifické protilátky LSQpath.-spec.(IgG) se vypočítá
z následujícího vztahu:
LSQpath.-spec.(IgG) = jednotky (CSF) x ředící faktor (CSF
)
jednotky (sérum) x ředící faktor (sérum)
Příklad výpočtu:
- CSF kalibrační sérum A; 100 E: extinkce 1,053
- CSF kalibrační sérum B; 40 E: extinkce 0,468
- CSF kalibrační sérum C;
8 E: extinkce 0,116
- CSF kalibrační sérum D;
1 E: extinkce 0,023
- CSF 1:2; Extinkce 0,675,: 55 U
- Sérum 1:401; Extinkce 0,530 42 U
LSQpath.-spec.(IgG) = 55 jednotek (CSF) x 2) = 6,531.10-1
42 jednotek(sérum) x 401
Základy CSF diagnostiky
Během infekce centrální nervové soustavy Treponema pallidum narůstá množství patogenspecifických protilátek v mozkomíšním moku. Jestliže není infekce omezena na mozek a
není-li disfunkce bariéry mezi krví a CSF, patogen-specifické protilátky jsou distribuovány
jak v mozkomíšním moku, tak séru jako celkové IgG. V tomto případě, všechny
imunoglobulíny v mozkomíšním moku pocházejí z krve. Pro detekci neurologické infekce je
nezbytné rozlišit mezi intratekálně produkovanými protilátkami a protilátkami, které se do
mozkomíšního moku dostaly z krve.
Hodnota intratekálně produkovaných patogen-specifických protilátek je dána relativním
kvocientem CSF/sérum LSQrel. (synonymum pro index specificity protilátky). Tato hodnota
je dána kvocientem části patogen-specifických protilátek v celkovém množství IgG
protilátek v mozkomíšním moku a části patogen-specifických protilátek v celkovém IgG
v séru.
patogen-specifické IgG v CSF
LSQrel =
celkové IgG v CSF
celkové IgG v séru
=
patogen-specifické IgG v séru
=
patogen-specifické IgG v séru
LSQrel
patogen-specifické IgG v CSF
LSQpath-spec(IgG)
LSQ celkové (IgG)
celkové IgG v CSF
celkové IgG v séru
Kvocient CSF/sérum patogenních specifických protilátek LSQpath.-spec (IgG) je v relaci
k CSF/sérum kvocientu celkové IgG koncentrace LSQ total(IgG). Relativní LSQ hodnota nad
1,3 indikuje, že se v centrálním nervovém systému neprodukují žádné specifické protilátky.
Relativní LSQ hodnota nad 1,5 indikuje, že se v centrálním nervovém systému produkují
patogen specifické protilátky, jako odpověď na lokální infekci.
Tvorba protilátek v centrálním nervovém systému se může vyskytovat za různých
patologických podmínek, například při mnohočetném zánětu kostní dřeně nebo při
encephalomyelitis disseminata (roztroušená skleróza). Jestliže tedy jexistuje důkaz o
intratekální tvorbě IgG nebo o poruše bariéry krev-mozek, lze aplikovat na tyto případy
Reiberův diagram (Reiber,1991) pro CSF/sérový kvocient .
Tento ELISA test obsahuje instrukce k provedení testu: Protilátky IgA, IgG a IgM tříd
v mozkomíšním moku: Instrukce pro výpočet relativních kvocientů CSF/sérum CSQ
rel.
Klinický význam
Treponema pallidum je bakterie patřící do rodiny spirochaetaceae. Do této rodiny patří pět
rodů: borelie, spirocheta, cristispira, treponema a leptospira. Treponema pallidum je infekční
patogenní agens způsobující syfilis (lues), chronickou infekční chorobu. Přenos choroby se
děje hlavně sexuálním kontaktem, ačkoli přenos krevní transfuzí či přes poranění, či
diaplacentálně nelze vyloučit. Infekce se šíří mízními cévami a lymfatickými uzlinami do
krve a krví dále do orgánů. Syfilis patří mezi všeobecně známé choroby a její průběh lze
rozdělit do několika různých stadií. Primární a sekundární stádium je známo jako časná syfilis
a terciární a kvarterní stádium jako pozdní stádia syfilis.
Primární stádium: Typickým primárním projevem exogenní infekce Treponema pallidum je
ohraničený výskyt vláknité eroze, či ztvrdliny v místě infekce, která se objeví tři týdny po
infekci. Potom se může vyvinout vřed, či se zhorší vzniklé leze , vznikne tzv.tvrdý vřed.Do
týdne se zvětší mízní uzliny.
Sekundární stádium: Kromě zvětšení mízních uzlin se u 90 % pacientů ukazují tzv. lokální
či po celém těle rozmístěná poranění kůže, která mohou být symetrická, či se mohou projevit
ve formě skvrn, pupínků, odlupující se kůže a/nebo vřídků. Převládající jsou projevy ve
formě bradavičnatých útvarů. Dále se mohou vyvinout další poškození orgánů, například
keratitida, irititida, hepatitida, vaskulitida a potíže myokardu. Sekundární stádium syfilitidy
následuje klinicky se neprojevující (klidové) stádium (syphylis latens). Toto stádium může
trvat i několik let.
Terciární stádium: Typickými projevy syfililitidy ve třetím stádiu jsou velké pupeny a vředy
na kůži a sliznicích. Vnitřními projevy syfilitidy jsou změny na různých orgánech, které se
mohou projevit ve formě gumatózních
a intersticiálních zánětů, perivaskulitidy,
kardiovaskulární syfilis, neurosyfilis (v asymptomatické, či symptomatické formě), osteitis
(zánět kostní dřeně) a periosteitis.
Kvarterní stádium: Kvarterní projevy infekce Treponema pallidum ve formě neurosyfilitidy
se mohou projevit až 30 let po nakažení. Neurosyfilis se projevuje v tomto stadiu nejprve
vznikem primární formy progresivní paralýzy a tabes dorsalis (onemocnění míchy následující
po infekci neléčené syfilitidy).
Diagnóza syfilitidy je založená na klinických příznacích, odpovídajících stádiu nemoci,
mikroskopické detekci infekčního agens (tmavé pole) a sérologických detekcích pomocí
protilátek proti Treponema pallidum.
Literární odkazy:
1. Oschmann P., Nuckel M., Wellensiek H.J., Hornig C.R., Dorendorf W.: Immunoblot as a
Diagnostic Tool in Neurosyphilis. J.Lab.Med. 1997; 21(1):037-042.
2. Meyer P.M., Eddy T. Baughn R.E.: Analysis of Western Blotting (Immunoblotting)
Technique in Diagnosis of Congenital Syphilis. J.Clin.Microbiol. Mar. 1994:629-633.
3. Lewis L.L., Taber L.H., Baughn R.E.: Evaluation of Immunoglobulin M Western Blot
Analysis in the Diagnosis of Congenital Syphilis. J.Clin. Microbiol.Fed. 1990:296-302.