Určení avidity IgG protilátek proti Toxoplasma gondii

Určení avidity IgG protilátek proti Toxoplasma gondii
Návod na použití ELISA testu
Objednací číslo Určení
EI 2410-9601-1G Toxoplasma
gondii avidita
Třída IgG
IgG
Substrát
Ag-potažené
mikrotitrační
jamky
Formát
96 x 01 (96)
Teoretický základ testu: Určení rozdílu mezi právě začínajícími infekcemi a infekcemi,
které už po delší dobu probíhají, je jedním z hlavních úkolů sérologie. V dnešní době je
hlavním kritériem pro toto rozlišení určení specifických protilátek třídy IgM, které se obecně
vyskytují jen v počátečních fázích infekce a jejichž určení je často velmi nejisté a
problematické. Interferenčními faktory jsou - přetrvávající IgM odpověď, nedetekovatelná
nebo zpožděná tvorba IgM a nespecifická tvorba IgM způsobená polyklonální stimulací Bbuněk.
Pro bezpečné určení současných, právě probíhajících primárních infekcí, byl před několika
lety vypracován postup měření avidity protilátek IgG třídy: První reakcí imunitního systému
na právě probíhající infekci je tvorba protilátek s nízkou aviditou . V dalším průběhu infekce
se začnou tvořit ve stále vyšší koncentraci pro dané antigeny specifické IgG a avidita vzrůstá.
Dokud nejsou v séru detekovatelné IgG s vysokou aviditou, předpokládá se, že je infekce
v ranném stadiu
K identifikaci protilátek s nízkou aviditou v sérech pacientů se provádí ELISA paralelně na
dvou mikrotitračních deskách: jeden test je prováděn konvenčním způsobem, ve druhém se
zavádí mezi kroky inkubace pacientského séra a inkubace konjugátu (peroxidázou značené
anti-idské IgG) další inkubační krok s použitím roztoku močoviny, což vede k objektivnímu
odlišení nízkoafinitních protilátek od antigenů.
Obsah testovací soupravy:
EI 2410-9601-1G Testovací systém pro určení avidity IgG protilátek proti toxoplasma gondii
se skládá z:
- Testovací souprava Anti –toxoplasma gondii ELISA ((IgG), objednací číslo EI 24109601G)
- Anti- Toxoplasma gondii pozitivní kontrolní sérum obsahující protilátky s vysokou
aviditou proti Toxoplasma gondii (kontrolní sérum 1; lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené
k použití, značeno tmavě červeně.
- Anti- Toxoplasma gondii pozitivní kontrolní sérum obsahující protilátky s nízkou aviditou
proti Toxoplasma gondii (kontrolní sérum 2; lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití,
značeno modře.
- Roztok močoviny pro Anti-toxoplasma gondii ELISDA; 1 x 12 ml, připraveno k použití,
značeno žlutě.
- Fosfátový pufr: 1 x 12 ml; připraveno k použití, značeno světle modře.
- Instrukce pro provedení testu.
Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až +8 oC,
nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do
vyznačeného data expirace. Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na
pokojovou teplotu a před použitím řádně promíchat.
Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a
nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HbsAG, anti-HCV, anti- HIV-1 a
anti-HIV-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně
infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie obsahují
jedovatý azid sodný: v případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody.
Inkubace
Inkubace vzorku: 1. Krok. Naneste 100 µl kontrolního séra nebo ředěného vzorku séra
v duplikátech do jednotlivých mikrotitračních jamek na dvou různých
mikrotitračních proužcích podle pipetovacího protokolu a inkubujte 30
minut při pokojové teplotě.
Promývání:
Vyprázdněte jamky a promyjte každou jamku postupně jednou pomocí
300 µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr
v jamce působit alespoň třicet vteřin, teprve potom jamku vyprázdněte. Po
proběhnutí promývání (provedeného ručně nebo automaticky) kapalinu
z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky dnem
vzhůru na filtrační papír.
Inkubace s močovinou: 2. Krok. Napipetujte 200 µl roztoku močoviny do každé jamky
prvního proužku mikrotitrační desky a 200 µl fosfátového pufru do každé
jamky druhého o proužku mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 10
minut při pokojové teplotě.
Promývaní:
Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše, ale třikrát pomocí 300 µl
naředěného promývacího pufru pro každý promývací cyklus. Aby došlo
k promytí, nechejte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin, a to
v každém promývacím cyklu.
Inkubace konjugátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou
značené anti-lidské IgG) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po
dobu 30 minut při pokojové teplotě
Promývaní:
Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše, ale třikrát pomocí 300 µl
naředěného promývacího pufru pro každý promývací cyklus. Aby došlo
k promytí, nechejte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin, a to
v každém promývacím cyklu.
Inkubace substrátu: 4. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé
mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve
tmě.
Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační
desky a to v tom samém pořadí , jako byl kapán chromogen/substrátový
roztok.
Měření:
Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové
délce 450 nm a referenční vlnové délce vyšší než 620 nm za 30 minut od
přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační
desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku.
Pipetovací protokol
1
2
3
4
5
6
A
B
C
P7
P8
P9
P15
P16
P17
P15
P16
P17
C1
C2
P1
C1
C2
P1
P7
P8
P9
7
8
9
10
11
12
D
E
F
G
H
P2
P3
P4
P5
P6
P2
P3
P4
P5
P6
P10
P11
P12
P13
P14
P10
P11
P12
P13
P14
P18
P18
Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem analýzy AVIDITY IgG protilátek od 18
pacientů (P1 až P18). Kontrolní séra (C1 a C2) a všechny vzorky sér od pacientů byly
inkubovány v duplikátech každý v jedné jamce na dvou různých mikrotitračních proužcích.
Reagenční jamky v mikrotitračních proužcích 1, 3 a 5 byly ošetřeny močovinou po inkubaci
se sérem pacientů, jamky na mikrotitračních proužcích 2, 4 a 6 byly ošetřeny fofátovým
pufrem. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužků. To umožňuje sestavit test
s minimálními spotřebami všech reagencií.
Výpočet výsledků:
Přítomnost protilátek s nízkou aviditou v sérech pacientů je průkazná, jestliže hodnoty
extinkce v ELISA testech s močovinou jsou značně redukovány při použití močoviny.
K objektivizaci výsledků se počítá relativní index avidity (RAI) a vyjadřuje se v procentech
za užití hodnot extinkce s užitím a bez užití močoviny:
Extinkce vzorku s užitím močoviny x 100
Extinkce vzorku bez užití močoviny
= relativní index avidity (RAI) v %
Horní hranice rozsahu pro protilátky s nízkou aviditou (cut-off value ) je podle doporučení
EUROIMMUN 40 % RAI. Hodnoty nižší, než je tato hranice, indikují protilátky s nízkou
aviditou, hodnoty mezi 40 % a 60 % RAI jako nerozhodné, hodnoty nad 60 % jako indikace
protilátek s vysokou aviditou. Jsou-li výsledky kvalifikované jako nerozhodné, doporučujeme
odebrat druhý vzorek ne dříve než sedm dní po prvním vzorku a testovat ho společně se
vzorkem prvním.
RAI < 40 %
RAI 40 % až 60 %
RAI > 60 %
Indikace protilátek s nízkou aviditou
Nerozhodná oblast
Indikace protilátek s vysokou aviditou
Obě pozitivní kontrolní séra, jak s vysokou aviditou, tak nízkou aviditou, slouží jako vnitřní
kontrola pro provedení testu, musí být proto zařazeny v každém prováděném testu.
Klinický význam: Ve studii provedené EUROIMMUN byla vyšetřena séra 10 pacientů
vykazující právě probíhající infekci a relativní index avidity byl pod 40 5 (12 % až 37 %;
průměr 28,2 %). Ve vzorcích sér odebraných pacientům s dříve probíhající infekcí RAI byl
významně vyšší (55 % až 96 %; průměr 76,4 %).
Literární odkazy:
1. Bauer, G.: IgM: Ein variabler mehrdeutiger Marker. Mikrobiologie 6.Jg.:44-51 (1996).
2. Joynson, D.H.m., Payne, R.A., Rawal, B.K.: Potential role of IgG avidity for diagnosing
toxoplasmosis. Journal of clinical Pathology 43: 1032 – 1033 (1990).
3. Kruppa, C., Blatz, R.: Ehrfahrungen mit Aviditatsbestimmungen bei der
Toxoplasmosediagnostik wahrend der Schwangerschaft. Mikrobiologie 9. Jg.: 41 –44
(1999).