STANOVENI KYSELINY PYROHROZNOVÉ V KYSELINĚ MLÉČNÉ c i

STANOVENI KYSELINY PYROHROZNOVÉ
V KYSELINĚ MLÉČNÉ
PETR ZUMAN
Ústřední
ústav
polarografichý
v
Praze
PRIŠLO DO НКПЛКСП-: 1.4. II. lí»r>?
V l i t e r a t u ř e byly p o p s á n y č e t n é m e t h o d y ke kvalitativnímu d ů k a ­
zu i ke kvailit^iyníxnu s t a n o v e n í kyseliny p y r o h r o z n o v é . Z fermentativnich m e t h o d má význam m a n o m e t r i c k ý způsob, p o p s a n ý W a r b u r g e n i
11, 2]. Z chemických m e t h o d je to zvláště tvorba h y d r a z o n ů , k t e r é byly
stanoveny buď vážkově [3-7], nebo po r o z p u š t ě n í v louhu kolorime1 ricky, jak popsal C a s e [8], jeliož m e t h o d a v modifikaci podle L u [9]
je nejčastěji užívána v novějších p r a c í c h . Tvorby addičních sloučenin
s kyselým siři či t a n é m a re ti trace n a d b y t k u činidla j o d e m užili С 1 i f t
a C o o k [10], důkaz po r e d u k c i na kyselinu m l é č n o u popisuje E e g r iw e [11]. V jiných m e t h o d á c h užívá se oxydace kyseliny p y r o h r o z n o v é
b u ď p e r o x y d e m [12-14], nebo c h l o r a m i n e m [15], m a n g a n i s t a n e m [16] r
cerisulfátem [17] nebo j o d i s t a n e m [18]. Z četných b a r e v n ý c h reakcí,
sloužících především к důkazu kyseliny pyrohroiznové, je n u t n o uvést
reakci 6 nitropruissidem p o d l e S i m o n a a P i;a u x [19] a k o n den sací
ее salicylaldehydem p o d l e C s o n к a [20] a S t r a u b а [21].
V poslední době S l a v í k
a M i c h a 1 e с [22] modifikovali тпеt h o d u F r i e d e m a n o v u a H a u g e n o v u [23], při níž rušící kyše
liny oxaloctovou a k e t o g l u t a r o v o u převedli v h e t e r o c y k l i o k é látky pů­
sobením h y d r a z i n u v p r o s t ř e d í kyseliny chlorovodíkové. Stanovili in­
tensitu zbarvení »sodné soli diinifcrofeinylíhydrazonu, k t e r ý byl e x t r a h o ­
ván sodou z organického rozpouštědla.
Ž á d n é z uvedených m e t h o d n e b y l o však užito к stanovení kyseliny
p y r o h r o z n o v é vedle n a d b y t k u kyseliny m l é č n é . P r o t o byla o b r á c e n a
pozornost к polarografickénin stanovení.
Kyselina p y r o h r o z n o v á poskytuje r e d u k č n í polarografické vlny [2428]. Závislost t ě c h t o vln n a p H sledovali M ü l l e r a B a u m b e r g e r
[29]. Tito a u t o ř i vykládali vznik dvou vln, jejichž vzájemný p o m ě r se
mění s p H z á k l a d n í h o r o z t o k u a jejichž suma zůstává k o n s t a n t n í a od­
povídá d v o u e l e k t r o n o v é m u ději, k e t o e n o l t a u t o m e r i í . Jejich závěry vy­
vrátil B r d i č к a [30], když ukázal, že kyselina fenylgloxylavá, u níž
je enolisace vyloučena, se chová s t e j n ý m způsobeni. P ř e s t o všaik Z a m b o t t i a F e r r a n t e [31] připisují dvě vlny na polarografické k ř i v c e
kyseliny p y r o h r o z n o v é keto- a enol-formě, p o d o b n ě jako K u z i n a
E 1 p i n e r [32], k t e ř í p ř e d p o k l á d a j í , že p ř í t o m n o s t aminokyselin pod­
poruje enolisaci. Ve své další p r á c i p o d a l B r d i č k a
[33] výklad
elektrodových dějů p ř i r e d u k c i p o d o b n ý c h kyselin, kdy ve vlně při p o ­
sitivně jších p o t e n c i á l e c h dochází к r e d u k c i nediisociované kyseliny, v
druhé vlně к r e d u k c i aniomtu. Výška p r v é vlny je zvyšována t v o r b o u
nedisociovaných molekul r e k o m b i n a c í [33] v okolí elektrody. К reduk­
ci
ci amioaitu dojde při negativnějším potenciálu tehdy, až reakční rychlost
nestačí vytvářet n edi soci o van é molekuly.
К analytickým účelům užil vln kyseliny pyrohroznové jedině Š a n
t a v ý [34], který sledoval polarografický vznik kyseliny pyrohroznové
během alkoholického kvašení. — V této práci byly redukční vlny kyseliny
ipyrohroiznové použity к stanovení ve vzorcích kyseliny mléčné a mléčnanu vápenatého různé čistoty.
i
Experimentálna éást
Bylo použito obvyklého polarografického zařízení spolu s derivačním zapojením
podle V o g e l a a Ř í h y [35]. Polarografická stanovení byla prováděna v nádobkách
bez odděleného dna a jen tam, kde přítomnost silně povrchově aktivních látek brá­
nila průchodu proudu adsorpcí na anodě, bylo užito Kalouskovy nádobky s odděle­
nou kalomelovoii elektrodou, která byla před každým stanovením vypláchnuta analysovaným roztokem. Kyslík byl odstraňován dusíkem. К vyhodnocení křivek bylo
užito methody standardního přidáníf umožňující jednotné odčítání při vlnách» někdy
značně protažených. Jako standardu bylo používáno sodné soli kyseliny pyrohrozno­
vé, Merckova preparátu» přečištěného krystaHaací z ethanolu, který laskavě poskytl
Dr K. Slavík.
К identifikaci kyseliny pyrohroznové byla zjišťována závislost vln na pH a
f srovnávána se závislostí, nalezenou В т d i č к о u [33].
Stanovení (kyseliny pyrohroznové v kyselině mléčné a meziproduktech
její vý­
roby mohlo být prováděno různými způsoby:
1. 1 g kyseliny mléčné byl rozpuštěn v 10 ml vody a zaznamenána křivka
v tomto roztoku. Při napětí 0,8 až 1,0 V byla pozorována vlna kyseliny pyrohrozno­
vé. (Obr. 1 vlevo.)
Obr. 1. Stanovení kyseliny pyrohroznové
v kyselině mléčné v kyselém
prostředí.
Křivka (1) 9,5 ml vody + 0,5 ml kyseliny mléčné „Všetečka"; křivka (2) dtto 4U,5 ml 0,005tm roztoku sodné soli kyseliny pyrohroznové; křivka (3) 9,5 ml acetátového pufru (1,0m) p H 4,7; křivka (4) dtto + 0,5 ml 0,005m roztoku sodné soli
kyseliny pyrohroznové. — Křivky byly zaznamenány při citlivosti 1:10 od 0 V,h =
= 55 cm, Hg X dno.
2. 1 g kyseliny mléčné byl rozpuštěn v 10 ml acetátového pufru pH 4,7.
V tomto prostředí byla vlna kyseliny pyrohroznové u napětí 0*9 až 1,1 V. (Obr. 1
vpravo.)
192
3. 2 g kyseliny mléčné bylo rozpuštěno ve 20 ml vody. Z tohoto roztoku bylo
odpipetováno 5 ml a ztitrovájio ln NaOH сьа použití thymolové modře jako indiká­
toru. Tak bylo stanoveno množství volné kyseliny.
К dalším pěti mililitrům původního ro-ztoku bylo přidáno stejné množství louhu
bez indikátoru, kapkou roztoku byla na indikátorovém papírku ověřena alkalická
reakce roztoku a raztok doplněn na 10 nebo 25 ml. Takto připravený vzorek byl
převeden do elektrolytické nádobky a byla zaznamenána křivka. Vlna aniontu kyse­
liny pyrohroznové je u napětí 1,3 V. (Obr. 2.)
Obr. 2. Stanovení
kyseliny
pyrohroznové
lickém
v různých vzorcích
prostředí.
kyseliny
mléčné
v alka­
Křivka (1) a (3) kyselina mléčná od firmy Dříza, citl. 1:15; (5) a (7) Merck DAB 6;
(9) a (11) kyselina mléčná od firmy Všetečka» citl. 1:30. Sudé křivky zaznamenány
vždy po přidání 1 ml 0,001m roztoku sodné -soli kyseliny pyrohroznové к 10 ml od­
povídajícího roztoku. Každá analysa je vždy dvakrát opakována. — Křivky od
— 1,0 V, h = 28 cm, Hg X dno.
-1. 1 až 2 g kyseliny mléčné byly rozpuštěny v 25 ml 0,5n NajCC^ a roztok
po uniknutí kysličníku uhličitého a ochlazení byl polarografován. Vlna aniontu ky­
seliny pyrohroznové byla pozorována opět u napětí 1,3 V.
Výsledky, získané těmito čtyřmi způsoby, byly .shodné. Různá pH byla zvolena
proto, aby mohl být případ od případu eliminován vliv rušících látek. Nejlépe mě­
řitelné vlny byly získávány způsoby 3 a 4, z nichž 4 byl podstatně rychlejší a je
proto nejvhodnější. Zatím co v kyselejších roztocích neruší látky, běžně přicházející
v biologickém materiálu, nelze použít stanovení v alkalických prostředích v přítom­
nosti aldehydických látek a cukrů.
U vzorků mléčnanu vápenatého bylo postupováno tak, že 0,5 g až 1 g vzorku
bylo rozpuštěno v 10 ml vody tříminutovým záhřevem při 80 u C. Bylo zjištěno, že
takový záhřev nemá na obsah kyseliny pyrohroznové žádný vliv. Po vychladnutí byl
roztok polarografován a vlna kyseliny pyrohroznové byla mezi 1,3 až 1,5 VPři stanovení kyseliny pyrohrozové v láku z o k u r e k a k y s e l é h o
zelí
byly polarografovány přímo tylo tekutiny za použití derivačního zapojení podle V og с 1a a Říhy
[35].
Přehled výsledku
Kyselina pyrohroznová byla nalezena v množstvích od 0,2% do 0,007% v ky­
selině mléčné různého původu a čistoty. (Tab. i, obr. 2 a 3.)
3
193
Obr. 3. Stanovení
kyseliny
pyrohroznové
v kyselině
uhličitanů.
mléčné
různé
čistoty
v
prostředí
Vzorky byly dodány cukrovarem v Seredi, n. p. Křivka (1) 2 ml roztoku kyseliny,
označené „Potravinářská 5 0 % " ; (2) dtto + 0,2 ml 0,002m roztoku sodné soli kyse­
liny pyrohroznové (NaP); (3) 2 ml roztoku kyseliny, označené ,,Potravinářská 8 0 % " ;
(4) dtto, + 0,1 ml 0,002m NaP; (5) 2 nil roztoku kyseliny mléčné označené „Tech­
nická I " ; (6) dtto + 0,2 ml 0,002m N a P ; (7) 2 ml roztoku kyseliny označené „Tech­
nická 11";'(8) dtto + 0,2 ml 0,002m N a P ; (9) 2 ml roztoku matečného louhu; (10)
dtto + 0,2 ml 0,002m N a P ; (11) roztok kyseliny mléčné DAB 6, 1. č.; (12) dtto +
0,2 ml 0,002m NaP. — Křivky byly zaznamenány od 1,0 V při citl. 1:30, h = 28 cm,
Hg X dno.
Tab.
1. Stanovení
kyseliny
pyrohroznové
v kyselině
Označení
Mallinckrodt I
Mallinckrodt II
Mallinckrodt i l l
Merck DAB 5
Původ ineudán
Dříza — napaden plísní
Merck DAB 6
Původ neudán
Vše t eck a
Vignatti I
Vignatti II
Kahlbaum — Schering
,,Milchsäure"
mléčné
různého
původu
O/o kys. py­
rohroznové
% kysmléčné
40 kys py­
rohroznové
na ikyselino
mléčnou
0,0156
0,0155
0,0156
0.016
0,025
0,02
0,04
0,04
0,06
0,05
0,08
0,15
0,22
79,2
78,0
79,0
78,0
74,0
52,5
75,5
79,1
74,5
51,8
52,5
77,2
79,0
0,02
0,02
0,02
0,02
0,03
0,04
0,05
0,055
0,09
0,10
0,16
0,195
0,28
1
Dále byla stanovena koncentrace kyseliny pyrohroznové ve vzorcích kyseliny
mléčné různé ' čistoty a v meziproduktech výroby, které byly laskavě poskytnuty
cukrovarem v Seredi, n. p. Výsledky jsou shrnuty v tab. 2.
194
Tab
2. Stanovení
Označení
Potravinářská
Potravinářská
Technická I
Technická II
Ca-laktát
Matečný louh
Zápara
Kys. mléčná
podle DAB 6,
1. ô.
kyseliny
pyrohroznové
v kyseline
O/o kys. py­
rohroznové
O/o ;kys.
mléčné
O/o kys. pyrohiroznové
na kyselinu
mléčnou
0,0083
0,0198
0,010
0,019
0,0042
0,0052
0,0041
53,0
78,5
51,0
52,0
0,016
0,025
0,021
0,037
mléčné
%
0,0215
různé
sušiny
čistoty
O/o kys. py­
rohroznové
na sušinu
19,5
50,8
34,7
45,1
20,0
14,7
20,6
0,042
0,039
0,030
0,043
0,021
0,035
0,020
58,5
0,037
V tabulce je udáno procentické množství kyseliny pyrohroiznové na váhové
množství vzorku kyseliny jako průměr z několika souběžných analys. Vzorky mateč­
ného louhu, zápary a Ca-laktátu byly konservovány přídavkem 0,5% fenolu, když
bylo zjištěno, že přítomnost fenolu nemá na polarografieké chování kyseliny pyro­
hroznové vliv. Touto konservací bylo dosaženo toho, že obsah kyseliny pyrohroznové
se ve vzorku neměnil ani během několika měsíců.
V láku z okurek bylo nalezeno asi 1,5 111«?%, v láku z kyselého zelí asi 5 m g %
kyseliny pyrohroznové.
Obr.
4. Stanovení
kyseliny
pyrohroznové
v láku z kyselého
methody podle V o g e l a a
Říhy.
zelí
pomocí
derivační
Křivky 1 — 4 při zapojení derivačním, křivky 5 — 8 při zapojení normálním. Křiv­
ka 1 a 5 vzorek láku, křivky 2 — 4 a 6 — 8 po postupném přidávání 0,3 ml 0,01m
roztoku sodné soli kyseliny pyrohroznové к 10 ml vzorku. — Křivky zaznamenávány
od 0,6 V při citl. 1:2 při zapojení derivačním a s citl. 1:30 při zapojení normálním,
h = 42 cm, otáčka kola 45 sec.
Dále bylo sledováno, zda kyselina pyrohroznová nevzniká z kyseliny mléčné
oxydací během skladování. Bylo zjištěno, že koncentrace kyseliny pyrohroznové se
nemění, poneeháme-li sledovanou kyselinu mléčnou volně na vzduchu. Ke změnám
nedošlo ani po několikahodinovém probublávání kyslíku v kyselém ani v alkalickém
195
prostředí a to ani v koncentrovaných ani ve zředěných roztocích. Na rozdíl od tvrzení
G a n a s s i n i h o [36] nedošlo v roztoku ke zmenám, ať bylo zavádění plynu pro­
váděno potmě, 6i ma slunečním světle. Zato v přítomnosti katalysátorů, jakými jsou
soli železa, lze pozorovat — ye shodě s pracemi N c i i b e r g a [37] — značný vzrůst
vlny kyseliny pyrohroznové. (Obr. 5.)
Obr. 5. Vliv katalysátorů
na oxydaci
kyseliny
mléčné.
0,45% roztok .mléčnanu vápenatého byl bublán 2 bod. na slunci kyslíkem. Liché
křivky: před osvětlením, sudé křivky: po osvětlení. Křivka (1), (2) bez katalysátoru*
křivka (3), (4) e 10"5 m F e S 0 4 ; ikřivka (5), (6) s 10" 5 m FeCl 3 . Druhá vlna u nega­
tivnějších potenciálů nebyla zde registrována. — Křivky byly zaznamenávány od 0.6
V při citl. 1:15, b = 70 cm.
Diskuse
Protože kyselina pyrohroznová byla nalezena ve všech vzorcích
kyseliny mléčné, které byly к disposici, bylo sledováno, zda kyselina
pyrohroznová vzniká již při výrobě kyseliny mléčné, nebo teprve ipři
j e»j ím sklia do vání.
Z údajů, uvedených v tab. 1 je patrné, že kyselina pyrohroznová
provází (kyselinu mléčnou během celého výrobního procesu a při pří
pravě nejčistší vápenaté soli hromadí se v odpadních produktech. Ky­
selina pyrohroziiová vzniká nejspíše enzymatickou oxydaci kyseliny
mléčné. Taiková reakce byla popsána za působení čisté kultury B. D e l b r ü c k i i [38] nebo kvasnic etbanoliekého kvašení [39] na mléčnan
vápenatý. Vznik kyseliny pyrohroznové byl zjištěn při rozkladu kyše
liny mléčné dehydrázou této kyseliny [40] a M a z e [41] isoloval do­
konce 12 druhů mikroorganismů, které na půdě z mléčnauu vápenaté
ho a minerálních látek tvořily kyselinu pyroihroznovou vedle některých
jiných ketolátek.
Zdá ise tedy, že kyselina pyrohroznová provází pravidelně produk­
ty mléčného kvašení, pro což svědčilo též zjištění kyseliny pyrohrozno
v é v láku z okurek ia z kyselého zelí.
Výsledky pokusů o oxydaci vzdušným kyslíkem svědčí pro to, že
oxydace kyseliny pyrohroznové by byla možná jen v přítomnosti stop
těžkých kovů, které při této autoxydaci působí jako katalysátory. Pro195
tože nelze předpokládat přítomnost stopy katalyticky účinných těžkých
kovů ve všech zkoumaných Vzorcích za současného působení svetla, zdá
se, že oxydatce během skladování není hlavním zdrojem ikyselimy pyro­
hroznové v kyselině mléčné. Pro těmto závěr, svědčí také zjištění, že
v přítomnosti katalysátorů při oxydaci na slunečním světle byla pozo­
rována vedle vlny kyseliny pyroihroznové ještě dališí vlna u více nega­
tivních potenciálů, odpovídající redukci aldehydu. Dochází zde nejspí­
še к dalšímu rozkladu kyseliny pyrohroznové za vzniku acetaldehydu.
Tato druhá vlna nebyla v anal vso váných vzorcích pozorována a je tedy
pravděpodobné, že vznik kyseliny pyrohiroznové neprobíhal takto katalysovanou oxydaci vzdušným kyslíkeni.
Konečně je třeba diskutovat přesnost stanovení, které plyne z tab,
3, v níž jsou shrnuty analysy mléčnanu vápenatého různého původu a z
prvých tří údajů v tab. 1, kde v různých vzorcích od firmy Mallinck rodit
byla zřejmě kyselina téhož původu.
Tab.
3. Stanovení
Sered 2 X kryst.
Guldeweťke DA p V 4
Původ neudán
Medice
Ingelheim
kyseliny
pyrohroznové
ve vzorcích
1
2
3
4
0,C05
0,013
0,0-4
0,027
0,035
0,005
0,014
0,024
0,026
0,0 7
0,006
0,014
0,024
0,028
0,035
0,006
0,013
0,023
0,025
0,036
mléčnanu
5
6
0,015
0,022
0,013
0,024
Poznámka:
V tabulce jsou udávány hodnoty ve váhových
pyrohroznové na vzorek.
vápenatého
Průměr
0,0055
0,0137
0,0233
0,0265
0,0357
procentech
Prüm,
chyba
9,1%
4,6°/o
3,5%
3,8%
1,7%
kyseliny
Bylo zjištěno, že polarograficky lze stanovit 0,0005 g kyseliny py­
rohroznové při m. zř. 1:1,000.000. Při koncentracích 0,2% až 0,003^
kyseliny pyrohrozmové v původním vzorku (což byly pozorované meze)
:
lze kyselinu pyrohroznovou stanovit s průměrnou chybou - 2 až 10^r
na výsledek podle koncentrace a čistoty vzorku. Menší přesnost byla
zjištěna hla\ně u nejnižších koncentrací a v přítomnosti koloidiních lá­
tek, které činily viny obtížně měřitelné. Uvedená chyba znamená přes­
nost na 0,004% při nejvyšších a 0.0003 6/ při nejnižších koncentracích.
Souhrn
Polarograficky byla stanovena kyselina pyrohroiznová v kyselině
mléčné a mléčnanu vápenatém. Ve vzorcích kyseliny mléčné různé čis­
toty a původu bylo nalezeno od 0,2% do 0,0003% kyseliny pyrohroz­
nové. Protože při oxydaci kyseliny mléčné vzdušným kyslíkem je nutná
přítomnost stop těžkých kovů a slunečního -světla, bylo usouzeno, že
kyselina pyroihroznová nevzniká z kyseliny mléčné oxydaci při sklado­
vání, ale především fermemtativně při výrobě kyseliny mléčné. Tento
předpoklad byl potvrzen nálezem kyseliny pyrohroznové ve všech vzor
197
cí-oh m e z i p r o d u k t ů výroby kyseliny m l é č n é a v n ě k t e r ý c h p r o d u k t e c h
m l é č n é h o k v a š e n í . Popísanou m e t h o d o u lze s t a n o v i t i 0,0005 g kyseliny
p y r o h r o z n o v é p ř i imezném z ř e d ě n í 1:1,000.000 s chybou 2 — 1 0 % po­
dle koncemitraice a čistoty v z o r k u .
Определение пировинограднои кислоты в молочной кислоте
Пётр Зуман
Центральный полярографический институт в Праге
Выводы
Полярографическим путем определена пировиноградная кислота в молочной
кислоте и в молочнокислом кальцие. В образцах молочной кислоты разной
чистоты и разного происхождения найдено от 0,2% до 0,003% пировиноград­
нои кислоты. Ввиду того, что при окислении молочной кислоты воздушным
кислородом необходимо присутствие тяжелых металлов и солнечного света, заклю­
чено, что пировиноградная кислота не получается из молочной кислоты окислением
при помещении в силадах, но прежде всего ферментационным путем при производ­
стве молочной кислоты. Этот вывод подтвержден нахождением пировинограднои
кислоты во всех образцах промежуточных продуктов производства молочной кис­
лоты и в некоторых продуктах молочного брожения. Описанным методом мож­
но определять 0,0005 г пировинограднои кислоты при предельном разбавлении
1:1,000.000 с ошибкой 2—10% в зависимости от концентрации и чистоты образца.
Получено в Редакцию б февраля 1952 г.
BESTIMMUNG VON BRENZTRAUBENSÄURE IN DER MILCHSÄURE
PETR ZUMAN
Zentralinstitut
für Polarographie
in Prag
Zusammenfassung
Es wurde polarographisch die Brenztraubensäuire in Milchsäure und Calciumlactat
bestimmt. In den Proben von Milchsäure verschiedener Reinheit und Herkunft wurden 0,2—0,003% Brenztraubensäure gefunden. Da bei der Oxydation von Milchsäure
durch atmosphärischen Sauerstoff die Gegenwart von Spuren von schweren Metallen
und Sonnenlicht notwendig ist, kam man zu der Schlussfolgerung, dass Brenztrauben
säure aus MiL^hsäure nicht durch Oxydation während der Lagerung, sondern in erster
Reihe fermentativ bei der Milchsäureerzeugung entsteht. Diese Voraussetzung wm-de
durch den Befund von Brenztraubensäure in allen Proben der Zwischenprodukte
der Milohsäureerzeugung und in einigen Produktein der Milchgärung bestätigt. Mittels
der angeführten Methode ist es möglich, 0,0005 g Brenztraubensäure bei einer Grenzverdünming von 1:1,000.000 mit 2 — Ю/4ГFehler je nach Koiiuzentration und Rein­
heit der Probe zu bestimmen.
In die Redaktion eingelangt den 6. IÍ. 1952
LITERATURA
1. W a r b u r g O,, K u b o w i t z F., C h r i s t i a n W., Biochem. Z. 227, 250 (1930;
2. W a r b u r g O., C h r i s t i a n W., Biochem. Z. 242, 210 (1931).
3. A l i e n C. F. H., J. Amcr. chem. Soc. 52, 2955 (1930).
198
4. C a s e E: M.,. C o o k R. P . , B i o c h e m . J. 25, 1319 ( 1 9 3 1 ) .
.">. N e u b e r g Č., K o b e l M . , ' B i o c h e m . Z. 210, 467 ( 1 9 2 9 ) ; 276, 4 9 3 ( 1 9 2 9 ) ; 219,
4 9 0 ( 1 9 3 0 ) . B e r . 63, 1986 ( 1 9 3 0 ) .
6. D e j o n g M. A., W. K., R e c . P a y s - B a s 19, 2 8 0 ( 1 9 0 0 ) .
7. K o s t y č e v
S., S o l d a t c n k o v
S., Z. p h y s i o l . Ch. 168, 124 (1927)
176,
287 ( 1 9 2 8 ) .
K o s t y č e v S., G v a 1 a d z e V., E l i a s b e r g P . , J . p h y s i o l . Ch. 188,127
^93<»8. C a s e E. M., B i o c h e m . J . 26, 753, 759 ( 1 9 3 2 ) .
9. L u G. D., B i o c h e m . J . 33, 249 ( 1 9 3 9 ) .
1.0. C l i f t F . P . , C o o k R. P . , B i o c h e m . J . 26, 1788 ( 1 9 3 2 ) .
U . E e g r i w e E., Z. a n a l . C h e m . 95, 323 ( 1 9 3 3 ) .
12. Q u a s t e l J . H., B i o c h e m . J . 18, 365 ( 1 9 2 4 ) .
13. F e r n b a c h S., S c h o e n N., C o m p t . r e n d . /57, 1478 ( 1 9 1 3 ) ; 170, 7 6 4 ( 1 9 2 0 ) .
14. L e v e n - e R., M e y e r A., J . b i o l . Chean. 17, 4 4 3 ( 1 9 1 4 ) .
15. B I e y e r В., B r a u n W., B i o c h e m . Z. 183, 310 ( 1 9 2 7 ) .
16. E v a n s W . L., W i t z e m a n E. J., J . A m . C h e m . Soc. 34, 1086 ( 1 9 1 2 ) .
17. F r o m a g e o t C , D e s-n u e 11 c P-, B i o c h e m . Z. 279, 174 ( 1 9 3 5 ) .
18. F l e u r y P . , B o i s « o n R., J . p h a r m . C h i m . 30, 307 ( 1 9 3 9 ) .
19. S i m o n L. J., P i a u x L., B u l l , s o c c h i m . b i o l . 6, 4 7 7 ( 1 9 2 4 ) .
20. C s ю n k ia E., J . b i o l . C h e m . 27, 209 ( 1 9 1 6 ) .
2 1 . S t r a u b F . M., Z. p h y s i o l . C h e m . 244, 117 ( 1 9 3 6 ) .
2 2 . S l a v í k K., M i c h a l e c Č., C h e m . l i s t y 43, 102 ( 1 9 4 9 ) .
2 3 . F r i e d m a n T . E., H a n g e n G. E., J . b i o l . C h e m . 144, 61 ( 1 9 4 2 ) ;
147, 4 1 5 ( 1 9 4 3 ) .
24. H e y r o v s k ý J.» Polarographie,
Springer, V í d e ň 1941.
25. S c h w a e r L., C o U e c t i o n 7, 3 2 6 ( 1 9 3 5 ) .
26. S h i k a t a M., S h o j i К . , B u l l . Agr. C h e m . Soc. J a p a n 4, 96 ( 1 9 2 8 ) .
27. A d k i n e H . , C o x F . W., J . A m e r . c h e m . Soe. 60, 1 1 5 1 ( 1 9 3 8 )
2 8 . W i n k e l A., P r o s k e G., B e r . 69, 1917 ( 1 9 3 6 ) .
2 9 . M ü l l e r O. H., B a i i m b e r g e r J . P . , J . A m . C h e m . Soc. 61, 5 9 0 ( 1 9 3 9 ) .
30. B r d i č k a R., C h e m . l i s t y 39, 3 5 ( 1 9 4 5 ) .
3 1 . Z a m b o t t i V., F e r r a n t e A., A r c h . Sei. b i o l . it. 26, 51 ( 1 9 4 0 ) ,
3 2 . K u z i,n A. M., E l p i n e r I . E., B i o c h i m i j a 12, 509 ( 1 9 4 7 ) .
3 3 . B r d i č k a R., C o l l e c t i o n 12, 212 (1947) i t e m C h e m . l i s t y 40, 232 ( 1 9 4 6 ) .
B r d i č k a R., W i e s n e r K., C o l l e c t i o n 12, 138 ( 1 9 4 7 ) , i t e m C h e m . listy 39,
36 ( 1 9 4 5 ) .
3 4 . Š a n t a v ý F . , B u l l . Soc. c h i m . b i o l . 31, 1 2 1 1 ( 1 9 4 9 ) .
35. Ř í h a J., C h e m . l i s t y 4 5 , 189 ( 1 9 5 1 ) .
36. G a n a s e i n i D-, C. Z . 1910-1-729; 1913-1-387.
3 7 . N-e u-b e r g C , B i o c h e m . Z. 39, 158 ( 1 9 1 2 ) .
38. N e u b e r g C , K ' o b e l M., B i o c h e m . Z. 216, 4 9 3 ( 1 9 2 9 ) ; 219, 4 9 0 ( 1 9 3 0 ) .
39. K a y s e r E., B u l l . Soc. c h i m . b i o l . 6, 345 ( 1 9 2 4 ) .
4 0 . H a h n A., F i s c h b a c h E., N i e m e r H., Z. b i o l . 94, 58 ( 1 9 3 3 ) ; 95, 155 ( 1 9 3 4 ) .
4 1 . M a z é ' P , C o m p t . r e n d . Soc. biol. 81, 1150 ( 1 9 1 8 ) ; C. Z. 1919-I-96Ö.
199