Jungova diplomka bak

Jihočeská universita v Českých Budějovicích
Biologická fakulta
Bakalářská diplomová práce
Nukleotidová variabilita genu Idgf4
u Drosophila melanogaster
Vypracovala: Radka Jungová
Vedoucí práce: PaedDr. Martina Žurovcová PhD.
České Budějovice 2006
Jungová R., 2006: Nukleotidová variabilita genu Idgf4 u Drosophila melanogaster
[Nucleotide variation in Idgf4 gene of Drosophila melanogaster. Bc. Thesis, in Czech] - 31p.
Faculty of Biological Sciences, The University of South Bohemia, České Budějovice, Czech
Republic
Anotace:
Demography and selection have been recognized for their important roles in shaping patterns
of nucleotide variability in all living organisms. To investigate the relative effects of these
forces in Idgf4 gene in Drosophila melanogaster we isolated this gene from putatively
ancestral African population (11 lines) and derived European (20 lines) and Japanese (10
lines) populations. The gene Idgf4 was sequenced and subsequently analysed statistically. In
spite of that the neutrality tests failed to reject a neutral model of evolution, several other
characteristics of those loci revealed that their evolution was more complex.
Tato práce je součástí grantového projektu GA ČR číslo 204/03/1383.
Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou diplomovou práci vypracovala samostatně pouze
s použitím citované literatury.
V Českých Budějovicích dne 7. 5. 2006.
………………………
Na tomto místě bych ráda poděkovala především své školitelce Martině Žurovcové za pomoc
a pochopení, které mi věnovala v průběhu mé práce. Také bych ráda poděkovala Františku
Marecovi nejen za poskytnutí drozofil, ale i za jeho neutuchající energii a optimismus, Míle
Novákové za to, že se mě hned na začátku této práce ujala a byla ochotná se mnou řešit
jakýkoli problém, a všem členům naší laboratoře za vynikající atmosféru.
OBSAH
1.
ÚVOD ..................................................................................................... 1
2.
CÍLE PRÁCE ......................................................................................... 3
3.
MATERIÁL A METODY ..................................................................... 4
3.1.
Pokusné organismy ................................................................................................... 4
3.2.
Izolace genomové DNA............................................................................................. 4
3.3.
Příprava templátů pro sekvenování ......................................................................... 5
3.3.1. Amplifikace genu Idgf4 pomocí PCR ................................................................ 5
3.3.2. Přečištění PCR produktů a kvantifikace DNA ................................................... 5
3.4.
Sekvenování produktů.............................................................................................. 6
3.4.1. Příprava sekvenační reakce ............................................................................... 6
3.4.2. Přečištění sekvenační reakce ............................................................................. 6
3.5.
Statistické analýzy .................................................................................................... 6
4.
VÝSLEDKY ........................................................................................... 9
4.1.
Nukleotidová variabilita ........................................................................................... 9
4.2.
Distribuce polymorfismu a divergence .................................................................. 10
4.3.
Struktura haplotypů ............................................................................................... 11
4.4.
Testy neutrality....................................................................................................... 12
4.5.
Vazebná nerovnováha a rekombinační rychlost.................................................... 13
4.6.
Genetický tok a migrace ......................................................................................... 13
5.
DISKUZE ............................................................................................. 15
6.
ZÁVĚR ................................................................................................. 18
7.
SEZNAM LITERATURY .................................................................. 19
1. Úvod
S nástupem nových molekulárních metod v posledních letech nastal v evoluční
biologii obrovský vývoj. Snadnější metody sekvenování umožnily rychlejší a přesnější
detekci mutací a variability na úrovni DNA, statistické a matematické modely dokáží určit
druh selekce nebo demografické procesy ovlivňující genovou variabilitu. Drosophila
melanogaster je výborným modelovým organismem právě pro tato studia, díky své
nenáročnosti, rychlé produkci potomstva a v neposlední řadě hlavně díky kompletní znalosti
jejího genomu. Kvůli podrobnému studiu drosofily mohly být lépe objasněny mnohé evoluční
jevy – například korelace mezi rychlostí a genetickým polymorfismem (Begun & Aquadro
1992) nebo mechanismy balancované selekce (Kreitman & Hudson 1991).
V této bakalářské práci jsem se snažila podrobněji prozkoumat úroveň nukleotidové
variability vývojového genu Idgf4 u D. melanogaster. Tento gen je součástí multigenové
rodiny, která neobsahuje žádné pseudogeny, dá se tedy předpokládat, že vznikla
subfunkcionalizací. Rodina má 6 členů, jejichž malá velikost (cca 2000bp), podobné řazení
intronů a exonů a různé cytologické umístění z nich dělá ideální objekty pro studium evoluce.
Multigenová rodina Idgf (Imaginal Disc Growth Factros) byla identifikována u
Drosophily melanogaster v roce 1995 Kirpatrickem et al. a dále studována Kawamurou v
roce 1999. Produkty těchto genů podporují proliferaci buněk imaginálních disků larev
drozofily – jedná se vlastně o první objevený polypeptidový růstový faktor u bezobratlých.
Rodina Idgf genů vznikla pravděpodobně duplikací genů pro chitinázy – enzymů s
hydrolytickou aktivitou β-1,4-N-acetyl-D-glukózaminových vazeb v molekule chitinu
(Hakala et al. 1993). Idgf geny mají 15-25% ní podobnost se sekvencí genů pro chitinázy
(Varela et al. 2002), i strukturní podobnost jejich produktů je neobvykle veliká. Změnou
aminokyseliny v aktivním místě enzymu došlo ke ztrátě katalytické aktivity, protein byl však
stále schopen se vázat na určité sacharidy a tedy mohl sloužit jako faktor pro ovlivnění
buněčného dělení (Varela et al. 2002). Homology těchto genů byly nalezeny i u jiných
bezobratlých, dokonce i u savců, kde mají funkci zejména v imunitním systému. Myší
homolog ECF-L působí jako chemotaktický faktor pro eosinofily (Owhashi et al. 1999),
lidský protein HC gp-39 produkují především buňky synoviální tekutiny a buňky kloubní
chrupavky postižené artritidou (Hakala et al. 1993).
První objevený gen Chit-like je lokalizován na pravém raménku druhého chromosomu
v cytologické oblasti 53D. V jeho blízkosti je gen Idgf5 (55C), který byl popsán jako poslední
pouze na základě podobnosti sekvencí. Na levém raménku druhého chromosomu v oblasti
1
36A byly lokalizovány v těsném klastru geny Idgf1, Idgf2 a Idgf3. Gen Idgf4, jehož studium
bylo náplní mé práce, je jako jediný lokalizován na pohlavním chromosomu X, v cytologické
oblasti 9A.
X chromosom je mimo jiné zajímavý tím, že na něm probíhá specifická evoluce, díky
tomu, že se, na rozdíl od autozomů, v populaci nachází v poměru 3/4. Gen Idgf4, který je
lokalizován na pohlavním chromosomu, může být studován mnohem snadněji, protože samci
jsou pro chromosom X homozygotní a tedy není potřeba jednotlivé linie křížit, abychom
získali izogenní linie. Na chromosomu X se prováděla řada studií zabývajících se například
divergencí genových duplikací drosofily (Thornton & Long 2002) nebo srovnáním
nukleotidové variability mezi chromosomem X a autozomy (Andolfatto 2001).
Výzkum jednotlivých členů této rodiny nebyl do dnešní doby příliš intenzivní, mohu
vzpomenout původní práci Kirkpatricka et al. (1995), ve které se zabývá srovnáním nově
objeveného glykoproteinu nazvaného DS47 (produkt genu Chit-like), extrahovaný z D.
melanogaster a lidského chrupavkového glykoproteinu HC gp-39, který je sekretovaný z
artritických kloubů. Uvádí, že gp-39 je nejlépe detekovatelný v lidských játrech, stejně jako
DS47 v tukovém tělese drosofily. Oba tyto orgány jsou vlastně homologické.
Kawamura (1999), podrobněji studoval téměř celou genovou rodinu Idgf. Zajímal se
především o stimulaci proliferace buněk produkty těchto genů a jejich kooperaci s inzulinem.
Popsal dopravu těchto glykoproteinů v těle hmyzu pomocí hemolymfy.
Práce o krystalové struktuře genu Idgf2 (Varela et al. 2002) ukázala podobu
trojrozměrné struktury tohoto genu i jeho domén s chitinázami A a B bakterie Serratia
marcescens. Také uvádí, že k narušení enzymatické aktivity došlo při záměně Glu za Gln v
katalytickém místě na 132 pozici proteinu.
Žurovcová a Ayala (2002) studovali variabilitu genů Idgf1 a Idgf3 ve španělské
populaci D. melanogaster. Mimo jiné objevili, že na gen Idgf1 u této populace působí
balancovaná selekce.
Variabilitu genů Chit-like a Idgf5 u africké i evropské populace – stejných, které jsem
použila ve své práci, studovala M. Nováková (2006), která sice nezjistila selekci ani na
jednom z genů, svými výsledky však podpořila hypotézu o demografických procesech těchto
populací.
Kučerová L. (2006) se ve své práci zabývá identifikací a fylogenetickou příbuzností
genů rodiny Idgf u dipter, vznikem a rekonstrukcí jejich duplikací. Jako nejpravděpodobnější
původní gen, ze kterého vznikla duplikací celá rodina, uvádí gen Idgf4, který se nejvíce
podobá rekonstruované ancestrální sekvenci.
2
2. Cíle práce
1. Vyizolovat gen Idgf4 z 20 linií moravské, 11 linií africké a 10 linií japonské
populace D. melanogaster.
2. Zjistit nukleotidovou variabilitu genu Idgf4.
3. Odhadnout možný model evoluce tohoto genu.
4. Srovnat míru variability mezi ancestrální (africkou) a odvozenými (evropskou a japonskou)
populacemi D. melanogaster a porovnat se stávajícími hypotézami o jejich demografickém
vývoji.
3
3. Materiál a metody
3. 1. Pokusné organismy
Drosophila melanogaster
K provedení analýz
nukleotidové variability jsem použila vzorky tří populací D.
melanogaster – africké, která je považována za původní (ancestrální) a odvozených: evropské
a japonské.
Vzorek africké populace obsahoval 11 izogenních samičích linií z populace odchycené
v Keni (od roku 2002 udržované v chovu), které jsme získali od Dr. Penelope Haddrill
(University of Edinburgh, UK).
Vzorek japonské populace tvořilo 10 linií, odchycených na jaře roku 2002 v národním
parku na ostrově Iriomotejima, které jsme získali od Masayoshi Watada (Ehime University,
Japan).
Vzorek moravské populace obsahoval 20 izogenních samičích linií, které byly
v roce 2003 odchyceny prof. F. Marecem na Moravě, Česká Republika.
Drosophila simulans
D. simulans byla pro nejbližší fylogenetickou příbuznost použita jako porovnávací
skupina (outgroup) pro statistické populační genetické testy. Sekvenci D. simulans jsem
získala z Genome Bioinformatics Site, označení sekvence je: chrX_random: 2804779 –
2825457.
3.2.
Izolace genomové DNA
K izolaci genomové DNA z africké a moravské populace D. melanogaster jsem
použila samce z předem vykřížených izogenních linií Mgr. Milenou Novákovou. Jednotlivé
zmražené samce jsem rozdrtila v 1,5ml ATL pufru a dále pokračovala podle návodu kitu
„Dneasy Tissue Kit Handbook (Quiagen)“.
K izolaci DNA z 10 linií japonské populace jsem použila chelexovou metodu (Hoelzel
1998). Zmražené samce jsem vložila do 0,5ml 10% chelexu BioRad (0,05g chelexu a 450ml
4
ddH2O), rozdrtila a k homogenátu jsem přidala 0,5ml deionizované vody tak, aby výsledná
koncentrace chelexu byla 5%. Poté se vzorky inkubovaly při teplotě 65°C po dobu 45min. Po
zvortexování se vzorek opět inkuboval při teplotě 95°C po dobu 10min.
Před každou PCR reakcí bylo nutno vzorek zcentrifugovat na 14500rpm po dobu
5min. Pro PCR reakci jsem použila supernatant.
3.3.
Příprava templátu pro sekvenování
3.3.1. Amplifikace genu Idgf4 pomocí PCR
Gen Idgf4 jsem amplifikovala PCR metodou pomocí primerů F4 a RE4 (sekvence
primerů viz. příloha č.3).
Amplifikační reakce (Eppendorf Master cycler): úvodní denaturace - 94°C po dobu 1
minuty, následovalo 35 cyklů při teplotách 94°C – 15s, 55°C – 25s, 72°C – 1,5min, záverečná
extenze – 72°C po dobu 10 minut.
PCR směs jsem převzala z návodu výrobce ExTaq (Takara), objem V=50μl:
32,35 μl - DdH2O, 5,65 μl - 10x PCR pufr (Takara), 4,52 μl - dNTP (2.5mM, Takara) ,
3,39 μl - forward primer (5μM), 3,39 μl - reverse primer (5μM), 0,225 μl - ExTaq
polymeráza, 1 μl - genomová DNA
Pro zjištění velikosti naamplifikovaných fragmentů jsem provedla elektroforézu pod
napětím 120V – na 1.5% agarosový gel jsem nanesla 1μl amplifikační reakce.
Fragmenty byly barveny ethidiumbromidem po dobu 15min a porovnány se standardem
molekulových hmotností λ / (EcoRI+HindIII).
3.3.2. Přečištění PCR produktů a kvantifikace DNA
49μl PCR reakce jsem přečistila pomocí kitu „QIAquick PCR purification Kit“
(Quiagen). DNA byla eluována do ddH2O a uskladněna při –20°C.
Obsah DNA v reakci jsem kvantifikovala nanesením 1μl přečištěné reakce na 1,5%
agarosový gel, provedla elektroforézu a porovnala se se standardem molekulových hmotností
λ / (EcoRI+HindIII)
5
3.4.
Sekvenování produktů
3.4.1. Příprava sekvenační reakce
K přípravě sekvenační reakce (čtvrtinové) jsem použila kit „Big Dye Terminator v 1.1,
cycle sequencing Kit“ ( Applied Biosystems).
¼ sekvenační reakce (V=20μl) měla složení: ddH2O – 10 μl, 2.5x sekvenační pufr – 6 μl,
sekvenační mix – 2 μl, primer (5μM) – 1 μl, DNA (200ng/μl) – 1 μl
Sekvenační reakce (Eppendorf Master cycler) pro verzi 1.1: úvodní denaturace – 96°C
po dobu 3min, následovalo 30 cyklů při teplotách 96°C – 30s, 50°C – 20°C, 60°C – 4min.
Na sekvenaci genu Idgf4 jsem použila 12 primerů (sekvence primerů viz. příloha č.3),
navržených na základě referenční sekvence AE003448 z databáze GenBank. Gen byl
sekvenován z obou řetězců, aby bylo možné ověřit detekované polymorfismy. Protože
sekvenační reakce v.1.1 obsáhne přibližně 500 – 700 bazí, pro africkou populaci bylo tedy
potřeba 120 reakcí, pro evropskou 240 a pro japonskou 132 reakcí.
3.4.2. Přečištění sekvenační reakce
Reakce jsem přečistila pomocí isopropanolu (ABI PRISM protocol). Do sekvenační
reakce jsem přidala 80μl isopropanolu, vzorky protřepala a uložila na 15min do tmy, při
pokojové teplotě (vysrážení). Následně se vzorky centrifugovaly při 14000rpm po dobu
20min v předchlazené centrifuze na 4°C. Supernatant jsem odsála a přidala ke vzorku 250μl
isopropanolu. Po zvortexování se vzorky opět stáčely při 14000rpm po dobu 5min, při teplotě
4°C a supernatant jsem odsála. Vzorky jsem nechala dosušit při 95°C po dobu 1min.
K analýze sekvencí byl použit automatický sekvenátor ABI Prism 310 od firmy Perkin
Elmer (Applied Biosystem).
3.5.
Statistické analýzy
Získané sekvence jsem editovala a sestavovala do kontinuálního řetězce (tzv. contig)
pomocí programu SeqMan (DNASTAR). Srovnání sekvencí (alignment) jsem provedla v
programu MEGA verze 3.1 (Kumar et al. 2004).
6
Program DnaSP v.4.1 (Rozas et al. 2003) byl použit k výpočtu následujících
parametrů a testů:
• nukleotidová diverzita, π (Nei 1987) – hodnota udává heterozygocitu na
nukleotidové úrovni,
• nukleotidový polymorfismus, θ (Nei 1987) –
udává očekávaný podíl
polymorfních nukleotidových míst,
• nukleotidová divergence, K (Nei 1987) – vyjadřuje množství fixních rozdílů
mezi sekvencemi D. melanogaster a D. simulans,
• počet haplotypů, h (Nei 1987) – udává počet haplotypů v jednotlivých
populacích,
• haplotypová diverzita, Hd (Nei 1987) – vyjadřuje rozdíl mezi haplotypy, vysoká
Hd může být způsobena balancovanou selekcí nebo demografií, nízká Hd
selektivním sweepem nebo populačním růstem,
• Strobeckovo S (Strobeck 1987) – umožňuje detekovat populační strukturu na
základě pozorované frekvence haplotypů ,
• rekombinační parametr, Rh (Hudson et al. 1987) – udává počet rekombinačních
událostí v daném lokusu za generaci,
• D* podle Fu a Li (Fu & Li 1993) – hodnota je založena na rozdílu ve výskytu
singletonů (mutací, které se vyskytují jenom jednou) a celkového počtu mutací,
• D (s outgroupem) podle Fu a Li (Fu & Li 1993) – hodnota je založena na rozdílu
výskytu mutací na externích větvích genealogického stromu a celkového počtu
mutací,
• D podle Tajimy (Tajima 1989) – Porovnává hodnoty nukleotidové diverzity π a
nukleotidového polymorfismu θ, v případě neutrálního chování genu se hodnoty
rovnají,
• test McDonalda a Kreitmana (McDonald & Kreitman 1991) – hodnota je dána
srovnáním synonymních a nesynonymních mutací v rámci druhu a mezi druhy, za
předpokladu neutrality se hodnoty sobě rovnají,
• Kellyho statistika, ZnS (Kelly 1997) – udává stupeň vazby mezi nukleotidy na
různých polymorfních místech,
• Kst * statistika (Hudson et al. 1992) – určuje, do jaké míry jsou si dvě populace
navzájem geneticky podobné,
7
• počet migrantů, Nm (Hudson et al. 1992) – udává počet migrantů mezi
jednotlivými populacemi za generaci.
V programu DnaSP byly dále provedeny koalescentní simulace (10 000 opakování) a
spočteny konfidenční intervaly pro: počet haplotypů h, haplotypovou diverzitu Hd, D a D*
podle Fu a Li, Tajimovo D a Kellyho statistiku ZnS. Pro výpočet Kst* statistiky byl použit
permutační test s opakováním 10 000x.
Přesnější stanovení konfidenčního intervalu lze provést zadáním parametru Clab do
koalescentních simulací.
Výpočet hodnoty Clab :
Clab= 2 x Ne x clab x L
kde:
(Przeworski et al. 2001)
Ne – efektivní velikost populace [Afrika: Ne = 106, Evropa a Japonsko: Ne =
3x105 (Glinka et al. 2003)]
clab (rekombinace/bp/generace) – rekombinační rychlost; hodnota stanovená na
základě laboratorních měření, hodnota zjištěna pomocí programu Recomb-Rate
(Comeron et al. 1999) (pro Idgf4: clab = 3,536 x 10-8 rekombinací/bp/generace)
Pro testování distibuce polymorfismu a divergence byl použit program DNA Slider
(McDonald 1998).
Pro znázornění podobnosti mezi jednotlivými haplotypy byla použita klastrová
analýza metodou Neighbor-Joining pomocí Kimurova 2parametrového modelu v programu
MEGA v. 3.1 (Kumar et al. 2004). Hodnoty bootstrapu byly generovány na 10 000
opakování.
8
4. Výsledky
4.1. Nukleotidová variabilita
Nukleotidová variabilita se vyjadřuje pomocí dvou parametrů: π (nukleotidová
diverzita), která vyjadřuje průměrný podíl nukleotidových rozdílů mezi haplotypy (Nei 1987),
a θ ( nukleotidový polymorfismus), který určuje pravděpodobnost polymorfismu konkrétního
nukleotidu. Zjištěné hodnoty jsou v tab. č.1.
Tabulka č. 1 Nukleotidová diverzita genu Idgf4
π-nukleotidová diverzita, θ-nukleotidový polymorfismus, K-hodnota celkové divergence mezi druhy
D. melanogaster a D. simulans
π
θ
K
Afrika
0,01542
0,01624
0,04483
Evropa
0,00747
0,00705
0,04522
Japonsko
0,00492
0,00460
0,04524
populace
Africká populace vykazuje podle očekávání nejvyšší míru variability ze všech tří
populací. V sekvencích vzorku bylo nalezeno celkem 121 nukleotidových polymorfismů. 83,
tedy nejvíce, se jich nachází v intronech, 6 v oblasti terminátoru a 32 v kódujících oblastech.
Pouze 2 z nich jsou nesynonymní, tzn. mají vliv na změnu aminokyseliny v proteinu. V
prvním případě došlo k záměně adeninu za thymin, což mělo za následek změnu
aminokyseliny tyrosinu na fenylalanin. Ve druhém případě došlo k záměně cytosinu za
adenin, tedy záměně alaninu za kyselinu aspartovou. V obou případech se jedná o preferované
kodony u drosofily. Nukleotidová diverzita π je v této populaci mnohonásobně vyšší než je
očekávaná průměrná hodnota u D. melanogaster pro chromosom X [πtot (na bázi) = 0,00271]
(Moriyama & Powell 1996). Totéž platí pro genetickou variabilitu θ [θtot (na bázi) =
0,00274].
U evropské populace je míra variability snížena až na polovinu variability populace
africké. V sekvencích bylo nalezeno celkem 65 nukleotidových polymorfismů, z toho 34 v
intronech, 22 v oblasti terminátoru a 9 v kódujících oblastech. Pouze jedna mutace má vliv na
změnu aminokyseliny a to při záměně thyminu za adenin a tedy změně kyseliny aspartové na
kyselinu glutamovou. Oba kodony jsou u drozofily nepreferované. Parametry π = 0,00747 a θ
= 0,00705 jsou sice nižší, ale stále dosahují téměř třínásobných hodnot než je průměr.
9
Japonská populace vykazuje výrazně nižší míru variability než předchozí dvě
populace. V sekvencích bylo nalezeno celkem 34 mutací, což je o polovinu méně než v
případě evropské populace a čtyřikrát méně než v africké populaci. Téměř všechny mutace
(30) se nacházejí v oblastech intronů, 2 jsou v oblasti terminátoru a 2 v kódujících oblastech.
Žádná z nich nemá vliv na změnu aminokyseliny. Parametry π = 0,00492 a θ = 0,00460 jsou
ovšem stále téměř dvakrát vyšší než průměrná hodnota určená pro D. melanogaster.
4.2. Distribuce polymorfismu a divergence
Rozložení polymorfismu a divergence podél celého genu bylo analyzováno pomocí
metody „sliding window“ (DNAsp) (příloha č.4).
Z grafů je patrné, že rozložení polymorfismu je u genu Idgf4 u mimoafrických
populací poměrně homogenní, pouze v oblastech prvních dvou intronů, na konci třetího
exonu a v oblasti terminátoru jsou hodnoty vyšší (viz. obr.č. 4 a 5). V těchto oblastech
hodnoty polymorfismu
kopírují
křivku
divergence
přesněji.
U
africké
populace
polymorfismus nabývá vyšších hodnot (i v oblasti třetího exonu), jeho křivka má více
heterogenní průběh a kopíruje divergenci mnohem přesněji, než u mimoafrických (viz. obr.
č.3).
Křivky divergence u všech tří populací dosahovaly vysoce heterogenního charakteru.
Nejvyšší hodnoty byly naměřeny v oblasti intronů, třetího exonu a částečně i druhého.
Nejnižší byly naopak naměřeny v oblasti prvního exonu a na konci druhého, kde zcela
kopírovaly křivku polymorfismu.
Pomocí McDonaldových testů byl zanalyzován gen Idgf4 pro rozložení variability
(příloha č.5). Tento test zachycuje poměr polymorfismu k divergenci, zároveň uvádí
vypočtené hodnoty jednotlivých statistik. Statistika K-S (Kolmogorov-Smirnov) je citlivá
vůči heterogenitě, při které jeden konec genu vykazuje nízké a druhý vysoké hodnoty. Max.G
uvažuje heterogenitu způsobenou výskytem vysokého lokálního maxima polymorfismu v
oblasti s nízkými hodnotami polymorfismu. Run statistika detekuje zejména oblasti, kde se
nachází několik lokálních maxim polymorfismu pohromadě.
Výsledky heterogenity v rozložení variability dosahovaly signifikantních hodnot
pouze u evropské populace (viz. obr. č.7), kde je ovšem tento výsledek nejspíš ovlivněn
abnormálně vysokou variabilitou v oblasti prvního intronu a terminátoru, které lze z působení
selekce vyloučit. Na druhou stranu je variabilita na začátku druhého i třetího exonu výrazně
10
snížena až na nulovou hodnotu. Podobné rozložení variability lze pozorovat i u japonské
populace, kde ovšem oblast terminátoru vykazuje průměrné hodnoty. Rozložení variability u
africké populace je zřetelně vyšší a rovnoměrnější (viz. obr.č.6).
Tabulka č. 2 Testy heterogenity
Uvedeny hodnoty nejvyšší dosažené pravděpodobnosti
P* < 0,05, P* < 0,01
populace
max.G
runs
K-S
avg.G
Afrika
0,2880
0,0830
0,7470
0,7720
Evropa
0,000**
0,000**
0,0020*
0,000**
Japonsko
0,0070*
0,0030*
0,0020*
0,0080*
4.3. Struktura haplotypů
Pro každou ze tří populací byl stanoven počet haplotypů (n) v daném vzorku (DNAsp,
4.0), zároveň byla spočtena hodnota haplotypové diverzity (Hd) a Strobeckovy statistiky (St)
(Strobeck 1987), která umožňuje částečný odhad struktury dané populace a vyjadřuje
pravděpodobnost, že množství haplotypů v náhodně vybraném vzorku bude menší nebo rovno
pozorované hodnotě (viz tab.3).
Signifikantní hodnoty byly zaznamenány pouze u japonské populace, kde jsou tyto
hodnoty všech tří parametrů výrazně nízké. U africké populace jsou všechny parametry v
horní polovině 95% konfidenčního intervalu.
Tabulka č. 3 Přehled počtu haplotypů, haplotypové diverzity a Strobeckovy statistiky
N-velikost vzorku, h-počet haplotypů, Hd-haplotypová diverzita, St-Strobeckova statistika
Hodnoty v závorkách vyjadřují 95% konfidenční interval stanovený na základě koalescentní simulace
P** < 0,01
populace
N
h
Hd
St
Afrika
11
11 <10;11>
1.000 <0.982;1.000>
1.000
Evropa
20
16 <14;20>
0.979 <0.953;1.000>
0.905
Japonsko
10
5** <7;11>
0.822** <0.866;1.000>
0.054
Analýza struktury haplotypů v dané populaci byla provedena pomocí programu
MEGA verze 3.1 (Kumar et al. 2004) (výstup viz příloha č.6). Gen Idgf4 se u všech tří
11
populací rozděluje do dvou hlavních nestejně velkých klastrů (viz. obr.č.9 a 11). Ve všech
případech má rozdělení vysokou průkaznost (95-100%).
4.4. Testy neutrality
Ke zjištění možné selekce, působící na daný gen, jsem použila více testů (test podle
McDonalda a Kreitmana, Tajimův test, testy podle Fu a Li) vzhledem k tomu, že univerzální
test neutrality neexistuje. Každý z jednotlivých testů je citlivý k jiné formě selekce (popř.
demografie).
Tajimův D test (Tajima 1989) porovnává hodnoty nukleotidové diversity π a
nukleotidového dimorfismu θ, které se v případě neutrálního chování genu přibližně rovnají.
Statistiky D a D* podle Fu a Li (Fu & Li 1993) porovnávají množsví výskytu
singletonů (mutací, vyskytujících se ve vzorku jen jednou) s parametrem θ. V případě
neutrálního modelu by se měly rovnat.
Test podle McDonalda a Kreitmana (McDonald & Kreitman 1991) porovnává vnitroa mezidruhovou variabilitu. V neutrálním modelu by se měl počet synonymních a
nesynonymních mutací pro fixní rozdíly rovnat s vnitrodruhovým polymorfismem.
Tabulka č. 4 Výsledky testů neutrality
Hodnoty v závorkách představují 95% konfidenční interval, stanovený na základě koalescentní simulace
─ Nebylo možné stanovit hodnotu testu
P** <0,01
populace
Afrika
Evropa
Japonsko
Tajimovo D
Fu a Li D*
Fu a Li D
McDonald a
(s outgroupem)
Kreitman
0,894
-0,04462
-0,437
-0,177
<-0,521;0,524>
<-0,589;0,556>
<-0,761;0,666>
0,377
-0,028
-0,250
<-0,817;0,808>
<-0,971;0,841>
<-1,110;1,069>
0,332
1,605**
1,923**
<-0,908;0,840>
<-1,279;1,124>
<-1,459;1,465>
12
0,735
–
Odklon od neutrality byl zaznamenán pouze u vzorku japonské populace a to u
statistik D a D* podle Fu a Li (viz. tab.č.4). Test McDonalda a Kreitmana nebylo možné
stanovit, kvůlu nulové hodnotě nesynonymního polymorfismu.
4.5. Vazebná nerovnováha a rekombinační rychlost
Pomocí programu DNAsp byla spočtena hodnota vazebné nerovnováhy ZnS (Kelly
1997). Tento parametr ukazuje, jak silná je vazba mezi nukleotidy polymorfních míst genu. U
všech tří populací nabývaly hodnoty ZnS průkazných hodnot. U evropské a japonské dokonce
hodnot mnohonásobně vyšších.
Rekombinační rychlost byla stanovena pomocí téhož programu, na základě parametrů
genu (Rh) a stejně tak vypočtena z hodnoty clab (viz. metodika). Tyto dvě hodnoty se od sebe
podstatně liší (viz. tab.č.5), největší rozdíl je patrný u japonské populace, kde je vypočtená
rekombinační rychlost Rh extrémně nízká.
Tabulka č.5 Přehled rekombinačních rychlostí a vazebné nerovnováhy
Clab – rekombinační parametr, Rh – Hudsonův rekombinační parametr, ZnS – Kellyho statistika vazebné
nerovnováhy
Hodnoty v závorkách znázorňují 99% konfidenční interval stanovený na základě koalecsentní simulace.
P** < 0,01
populace
Clab
Rh
ZnS
Afrika
179,91
87,9
0,183** <0,105;0,175>
Evropa
55,097
2
0,512** <0,071;0,177>
Japonsko
55,43
0,001
0,779** <0,118;0,371>
4.6. Genetický tok a migrace
Určení podobnosti populací bylo provedeno pomocí statistiky Kst* (obdoba Fst
statistiky; Hudson et al. 1992). Téměř úplné rozdělení můžeme nalézt mezi africkou a
japonskou populací [Kst*=0,0918, P(Kst*)=0,0008***; P***<0,001], a i mezi africkou a
evropskou [Kst*=0,04594, P(Kst*)=0,0006***; P***<0,001], kde hodnoty nabývaly vysoce
průkazných hodnot. Hodnoty pro srovnání evropské a japonské nejsou signifikantní, což
ukazuje na podobnost obou těchto populací.
13
Rychlost migrace (Nm) mezi africkou a evropskou populací je 1,66 migrantů na
generaci, mezi africkou a japonskou je to 1,25 migrantů za generaci. Mezi moravskou a
japonskou populací je migrační rychlost ve srovnání s předchozími dvěma případy velmi
vysoká, a to 126,45 migrantů za generaci
14
5.
Diskuze
Podle většiny studií je původním domovem Drosophily melanogaster tropická Afrika
(David & Cappy 1988), odkud se dokázala během poměrně krátké doby rozšířit po celém
světě (viz příloha č.1). Její průnik do oblasti Euroasie nastal při ústupu poslední doby ledové
před 10–15 000 lety. Ameriku nebo Austrálii osídlila teprve až s prvními kolonizátory před
několika sty lety. Při expanzi do nových oblastí na drosofilu působily jak procesy
demografické, tak selekční, které způsobily snížení variability (bottleneck) u mimoafrických
populací (Begun, Aquadro 1993; Haddrill et al. 2005).
Také z mé práce je tento trend poměrně patrný. Africká populace vykazuje velmi
vysokou variabilitu, dokonce 2x vyšší než evropská a 4x vyšší než japonská populace. Toto
zjištění je vcelku očekávané, když uvážíme, že se jedná o populaci původní, ze které došlo k
expanzi do celého světa.
Variabilita ani jedné z populací není ovlivněna přítomností inverzních smyček. Jediná
kosmopolitní inverze, nacházející se u D. melanogaster na chromozomu X, In(1)A nezasahuje
do oblasti genu Idgf4, a také nebyla ani u jedné populace detekována (Hadrill, pers.
communication; Watada, pers. communication).
Africká populace: Testy neutrality ani koalescentní simulace neodhalily přímý vliv
selekce na gen Idgf4, na druhou stranu se dá z výsledků odhadnout vliv demografických
procesů, které v této populaci působily. Negativní hodnota Tajimova D ukazuje na selektivní
sweep nebo populační růst. Selektivní sweep výrazně snižuje diverzitu, která je ale u africké
populace značně vysoká, a protože s výsledky většiny dalších testů se selektivní sweep
neshoduje, nemusíme ho dál uvažovat. Selektivní sweep může ovlivněním výsledků
napodobovat populační růst, který je u této populace pravděpodobnější. Negativní hodnota
Tajimova D navíc poukazuje na dávný bottleneck, který se měl stát na Africkém kontinentu
zhruba před 200 000 lety (Hadrill 2005, Glinka et al. 2003). Tento fakt se dá podpořit na
základě klastrové analýzy. Pokud srovnáme rozdělení haplotypů africké populace s jinou, u
které víme, že u ní bottleneck nastal (v tomto případě s evropskou populací), můžeme říci, že
dávný bottleneck u africké populace je pravděpodobný. Haplotypy
evropské i africké
populace jsou rozděleny do dvou nestejně velkých klastrů a jejich topologie je velmi podobná.
Tím se nám zároveň potvrzuje i populační růst, který následoval po zmíněném dávném
bottlenecku. Negativní hodnoty D a D* testů Fu a Li jsou důsledkem nadbytku singletonů
15
(mutací, které se ve vzorku vyskytují pouze jednou). Tento výsledek nám zas ukazuje na
populační růst, selektivní sweep neuvažujeme (viz. výše).
Demografické procesy jsou podpořeny i hodnotou haplotypové diverzity Hd. Velmi
vysoká hodnota Hd u africké populace může být zapříčiněna jednak demografickými procesy
nebo vlivem balancované selekce. Vliv selekce můžeme ovšem zamítnout. Není prokázána
žádným provedeným testem neutrality, navíc při působení balancované selekce je hodnota
vazebné nerovnováhy ZnS velmi vysoká, což u africké populace není.
Evropská populace: U evropské populace jsem zaznamenala 2x nižší variabilitu, než
u populace africké. K podobným výsledkům se dopracovala i M. Nováková (2006) ve své
studii o genech Idgf5 a Chit-like a byla také pozorována Begunem a Aquadrem (1993) i P.
Hadrill (2005). Při rozšíření drosofily do Evropy nastal u této populace bottleneck, který je z
výsledků jasně patrný. Recentní bottleneck je podpořen kladnou hodnotou Tajimova D a
velmi vysokou hodnotou vazebné nerovnováhy. Obě tyto hodnoty můžou být i důsledkem
selekce, ostatní testy to ovšem nepotvrzují. Pouze rozložení variability na genu Idgf4 u této
poulace by mohlo naznačovat určitý selekční proces, hodnoty jsou ovšem rozděleny velmi
nerovnoměrně, a to především v oblastech intronů a terminátoru, z čehož vyplývá, že ani tento
test selekci neodhalil. Negativní hodnoty D a D* testů Fu a Li ukazují buď na selektivní
sweep, který můžeme stejně jako u africké populace zamítnout, nebo na populační růst, který
u evroské populace po recentním bottlenecku rozhodně probíhá. Na nedávný bottleneck
ukazuje i velmi vysoká hodnota haplotypové diverzity, společně s haplotypovým
dimorfismem. Haplotypy jsou u této populace na základě klastrové analýzy rozděleny do
dvou tříd. Ke stejnému závěru došel také Baudry et al. (2004).
Japonská populace: Variabilita japonské populace je snížena na polovinu variability
populace evropské a je až 4x nižší, než variabilita populace africké. Toto výrazné snížení
může být způsobeno mimo jiné tím, že se jedná o ostrovní populaci. U japonské populace
kladná hodnota Tajimova D i testy neutrality podle Fu a Li společně s enormně nízkou
rekombinační rychlostí a vysokou vazebnou nerovnováhou ukazují na možný vliv
balancované selekce. Tato selekce byla již dříve prokázána u genu Idgf1 ve španělské
populaci (Žurovcová & Ayala 2002). Výsledky ostatních testů, například hodnota
haplotypové diversity s touto hypotézou ovšem příliš nesouhlasí. V případě působení
balancované selekce se hodnota Hd výrazně zvyšuje (jako u africké a evropské populace, kde
se ovšem o selekci nejedná). V japonské populaci naopak nabývá průkazně nízkých hodnot,
16
které mohou svědčit pro selektivní sweep nebo populační růst. Selektivní sweep ani populační
růst nejsou dostatečně podloženy ostatními výsledky, japonská populace se spíš chová, jako
by byla v rovnováze. Dvojí výsledky u této populace, které poukazují na balancovanou
selekci i selektivní sweep by mohly znamenat, že se jedná o lokální adaptaci. Tato adaptace se
také projevuje snížením diversity, jak u japonské populace pozorujeme. Že se o lokální
adaptaci může jednat, je dáno také tím, že existuje rozsáhlá migrace mezi touto populací a
kontinentální, což by mělo mít za následek vyšší variabilitu, než kterou pozorujeme. Všechny
tyto výsledky společně s kladnou hodnotou Tajimova D, hodnot D a D* testů Fu a Li a velmi
silnou vazebnou nerovnováhou můžou ovšem znamenat, že se pouze jedná o bottleneck,
zvýrazněný ostrovní lokalizací této populace.
K rozhodnutí, zda se jedná o balancovanou selekci, lokální adaptaci, nebo zda testy
zachytily pouze demografické procesy probíhající v japonské populaci, je potřeba
podrobnějšího výzkumu. Není možné rozhodnout o selekci na základě studia jediného genu v
dané populaci. Co se variability populace D. melanogaster na japonských ostrovech týče,
nebyly dosud žádné podobné práce publikovány.
17
6.
Závěr
V této práci se mi podařilo splnit dané cíle, tj. vyizolovat ze všech tří populací gen
Idgf4 a provést analýzu jeho nukleotidové variability.
V blízkosti genu Idgf4 se nevyskytují žádné inverzní smyčky, které by mohly ovlivnit
výsledky variability daného genu.
Jak ukázaly výsledky analýz a simulací, na evoluci tohoto genu značně působily
demografické procesy, především již zmíněný dávný bottleneck, který ovlivnil africkou
populaci a recentní bottleneck, ovlivňující populaci evropskou a japonskou. U japonské
populace je tento efekt ještě zdůrazněn její ostrovní lokalizací. Vliv selekce se neprokázal ani
u africké, ani u evropské populace. U japonské populace převážná většina testů a simulací
ukazuje, že daný gen se nechová zcela neutrálně, tyto výsledky ovšem mohou být také
vysvětleny na základě demografických procesů, a na zjištění vlivu selekce by bylo potřeba
podrobnějšího studia této populace.
18
7.
Seznam literatury
ANDOLFATTO, P. (2001): Contrasting patterns of X-linked and autosomal nucleotide
variation in Africa and non-Africa populations of Drosophila melanogaster and
Drosophila simulans. Mol. Biol. Evol. 18, 279-290
BAUDRY, E., VIGINIER, B. and VEUILLE, M. (2004): Non-African populations of
Drosophila melanogaster have a unique origin. Mol. Biol. Evol. 21, 1482-1491.
BEGUN, D.J. and C.F. AQUADRO. (1992): Levels of naturally occuring DNA
polymorphism correlate with recombination rates in D. melanogaster. Nature 356,
519-520.
BEGUN, D.J. and C.F. AQUADRO. (1993): African and North American populations of
Drosophila melanogaster are very different at the DNA level. Nature 365, 548-550.
COMERON, J.M., M. KREITMAN and M. AGUADE. (1999): Natural selectin on
synonymous sites in correlated with gene length and recombination in Drosophila.
Genetics 151, 239-249.
DAVID, J.R., P. CAPY. (1988): Genetic variation of Drosophila melanogaster natural
populations. Trends Genet. 4, 106-111.
DOBZHANSKY, T. (1950): Genetics of narural populations. XIX. origin of heterosis through
natural selection. Genetics 35, 288-302.
FU, Y.-X. and W.-H. LI. (1993): Statistical test of neutrality of mutations. Genetics 133,
693-709.
GLINKA, S., OMETTO, L., MOUSSET, S. STEPHAN, W. and DE LORENZO, D. (2003):
Demography and natural selection have shaped genetic variation in Drosophila
melanogaster: A multi-locus approach. Genetics 165, 1269-1278.
HADDRILL, P.R., THORNTON, K.R. CHARLESWORTH, B. and P. ANDOLFATTO.
(2005): Multilocus patterns of nucleotide variability and demographic and selection
history of Drosophila melanogaster populations. Genome. Res. 15, 790-799.
HARR, B., KAUER, M. and SCHLOTTERER, C. (2002): Hitchhiking mapping: A
population-based fine-mapping strategy for adaptivemutations in Drosophila
melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12949-12954.
HAKALA, B. E., WHITE, C. and RECKLIES, A.D. (1993): Human cartilage gp-39, a major
secretory product of articular chondrocytes and synovial cells, is a mammalian
member of chitinase protein family. J. Biol. Chem. 268, 25803-25810.
19
HOELZEL, A.R. (1998): Molecular genetic analysis of population, second edition.
Oxford University Press, New York.
HUDSON, R.R. (1987): Estimating the recombination parametr of finite population model
without selection. Genet. Res. 50, 245-250.
HUDSON, R.R., BOOS, D.D. and KAPLAN, N.L. (1992): A statistical test for detecting
geographic subdivision. Mol. Biol. Evol. 9, 138-151.
KAWAMURA, K., T. SHIBATA, O. SAGET, D. PEEL and P. J. BRYANT (1999): A new
family of growth factors produced by the fat body and active on Drosophila imaginal
disc cells. Development 126, 211-219.
KELLY, J.K. (1997): A test of neutrality based in interlocus associations. Genetics 146, 11971206.
KIRPATRICK, R.B., R.E. MATICO, D.E. McNULTY, J.E. STRICKLER and M.
ROSENBERG. (1995): An abundantly secreted glycoprotein from Drosophila
melanogaster is related to mammalian secretory protein produced in rheumatiod tissue
and by activated macrophages. Gene 153, 147-154.
KREITMAN, M. and R.R. HUDSON. (1991): Inferring the evolutionary histories of the Adh
and Adh-dup loci in Drosophila melanogaster from patterns of polymorphism and
divergence. Genetics 127, 565-582.
KUČEROVÁ L. (2006): Phylogeny of the Imaginal Disc Growth Factors (Idgf) gene family
of Drosophila melanogaster, Magisterská diplomová práce, Biologická fakulta, České
Budějovice
KUMAR, S., K. TAMURA and M. NEI. (2004): MEGA3: Integrated software for Molecular
Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Bioinformatics 5, 150-163.
McDONALD, J.H. (1998): Improved tests for heterogeneity across a region of DNA
sequence in the ratio of polymorphism to divergence. Mol. Biol. Evol. 15, 377-384.
McDONALD, J.H., and M. KREITMAN. (1991): Adaptive protein evolution at the Adh locus
in Drosophila. Nature 351, 652-654.
MORIYAMA, E.N., J.R. POWELL. (1996): Intraspecific nuclear DNA variation in
Drosophila. Mol. Biol. Evol. 13, 261-277.
NOVÁKOVÁ, M. (2006): Nukleotidová variabilita genů Idgf5 a Chit-like u Drosophila
melanogaster, Magisterská diplomová práce, Biologická fakulta, České Budějovice.
NEI, M. (1987): Molecular evolutionary genetics. Columbia university press, New York.
20
OWHASHI, M., H. ARITA, N. HAYAI. (2000): Identification of a novel eosinophil
chemotactic cytokine (ECF-L) as a chitinase family protein. J. Biol. Chem. 275, 12791286.
PRZEWORSKI, M., J.D. WALL and P. ANDOLFATTO. (2001): Recombination and the
frequency spektrum in Drosophila melanogaster and Drosophila simulans.Mol. Biol.
Evol. 18, 291-298.
ROZAS, J., J.C. SÁNCHEZ-DelBARRIO, X. MESSEGUER and R. ROZAS. (2003):
DnaSP, DNA polymorphism analysis by the coalescent and other methods.
Bioinformatics 19, 2496-2497.
STROBECK, C. (1987): Average number of nucleotide differences in a sample from a single
subpopulation: a test for subpopulation subdivision. Genetics 117, 149-153.
TAJIMA, F. (1989): Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA
polymorphism. Genetics 123, 585-595.
THORTON K., M. LONG. (2002): Rapid divergence of gene duplicates on the Drosophila
melanogaster X chromosome. Mol. Biol. Evol. 19, 918-925.
VARELA, P.F., A.S. LLERA, R.A. MARIUZZA and J. TORMO. (2002): Crystal structure of
imaginal disc growth factor-2 a member of a new family of growth-promoting
glycoproteins from Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem. 277, 13229-13236.
ŽUROVCOVÁ, M. and F.J. AYALA (2002): Polymorphism pattern in two tightly linked
developmental genes, Idgf1 and Idgf3, of Drosophila melanogaster. Genetics 162,
177-188.
21
Příloha č. 1
Rozšíření jednotlivých populací Drosophily melanogaster
Obrázek č.1:
ancestral – původní populace
ancient – odvozená stará populace
new – odvozená nová populace
unfavorable or unknown – nevhodný biotop nebo druh nenalezen
obrázek byl převzat z článku David J.R., P. Capy (1988): Genetic variation of D.
melanogaster natural populations
22
Příloha č. 2
Rozmístění inverzí a genů Idgf na chromosomech
Obrázek č.2:
Znázornění genů:
tmavě – promotor a terminátor
bíle - exony
23
Příloha č. 3
Seznam použitých primerů a jejich sekvencí
Amplifikace genu Idgf4:
F4: 5´-TCA CTT AAA GTT TGG ATC ACC-3´
RE4: 5´-ATC AGA TAC CCG TTA TTC GG-3´
Sekvenace genu Idgf4:
4F: 5´-TCA CTT AAA GTT TGG ATC ACC-3´
F1: 5´-GAA CTT TCC AAC AGT TAA CAG-3´
F2: 5´-GAG TAA ATT GCA TAT AGA GAGG-3´
F3: 5´-TCG AGC AAC AAG CTG GTC AGC-3´
F4: 5´-AAC TCT TCG CGT GAG TTA AC-3´
F5: 5´-TCT TAG CTG GCC AGA GGT G-3´
4RE: 5´-ATC AGA TAC CCG TTA TTC GG-3´
R1: 5´-ATC ACC AAC CTT TCG CAG C-3´
R2: 5´-ATA ATA AAT ATG CTG GGC AAT C-3´
R3: 5´-ACC TTG AGG GCT GGG TAC-3´
R4: 5´-GAA TCA TCA TCG TCG AAC AC-3´
R5: 5´-CAG AAG GGA GAA CAG GGC-3´
24
Příloha č. 4
Distribuce polymorfismu a divergence D. melanogaster (DNAsp)
0.25
Afrika
Diverzita
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
bp
Obr. č. 3: Distribuce polymorfismu π(─) a divergence K (▬) u genu Idgf4 africké
populace. Velikost intervalu 100 bp, krok po 25bp.
0.25
Evropa
Diverzita
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0
5 00
10 00
1 500
bp
200 0
2 500
300 0
Obr. č. 4: Distribuce polymorfismu π(─) a divergence K (▬) u genu Idgf4 evropské
populace. Velikost intervalu 100 bp, krok po 25bp.
25
Příloha č. 4-pokračování
Distribuce polymorfismu a divergence D. melanogaster (DNAsp)
0.25
Japonsko
Diverzita
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
bp
Obr. č. 5: Distribuce polymorfismu π(─) a divergence K (▬) u genu Idgf4 japonské
populace. Velikost intervalu 100 bp, krok po 25bp.
26
Příloha č. 5
Rozložení variability genu Idgf 4 u D. melanogaster (DNA slider)
1.00
Afrika
π/K
0.75
0.50
0.25
0.00
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
bp
Obr. č. 6: Rozložení variability genu Idgf4 africká populace, π/K- podíl polymorfismu
(π) a divergence (K) v daném intervalu. Velikost intervalu: 15 segregujících míst
1.00
Evropa
π/K
0.75
0.50
0.25
0.00
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
bp
Obr. č. 7: Rozložení variability genu Idgf4 evropské populace, π/K- podíl
polymorfismu (π) a divergence (K) v daném intervalu. Velikost intervalu: 15
segregujících míst
27
Příloha č. 5-pokračování
Rozložení variability genu Idgf 4 u D. melanogaster (DNA slider)
1.0
Japonsko
0.9
0.8
0.7
π/K
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
bp
Obr. č. 8: Rozložení variability genu Idgf4 japonské populace, π/K- podíl polymorfismu
(π) a divergence (K) v daném intervalu. Velikost intervalu: 15 segregujících míst
28
Příloha č. 6
Klastrová analýza haplotypů (MEGA v. 3.1)
A01
A20
A24
A23
A106
A38
A36
A13
A12
A70
A91
simulans
yakuba
51
36
53
63
39
57
47
95
58
92
Obr. č. 9: Haplotypový dimorfismus genu Idgf4 v africké populaci D. melanogaster. Jako
outgroup byly použity sekvence D. simulans a D. yakuby (sekvence získány z databáze
UCSC Blast). Bootstrap 10 000x.
8
2
1
2
8
9
95
100
98
J11
J12
J17
J16
J18
J19
J20
J14
J13
J15
simulans
yakuba
Obr. č. 10: Haplotypový dimorfismus genu Idgf4 v japonské populaci D. melanogaster.
Jako outgroup byly použity sekvence D. simulans a D. yakuby (sekvence získány z
databáze UCSC Blast). Bootstrap 10 000x.
29
Příloha č. 6-pokračování
Klastrová analýza haplotypů (MEGA v. 3.1)
66
94
98
75
35
57
79
62
26
37
68
44
93
100
80
96
43
86
29
M1
M2
M17
M19
M13
M16
M3
M7
M8
M11
M4
M12
M10
M15
M14
M9
M20
M18
M5
M6
simulans
yakuba
Obr. č.11: Haplotypový dimorfismus genu Idgf4 v evropské populaci D. melanogaster.
Jako outgroup byly použity sekvence D. simulans a D. yakuby (sekvence získány z
databáze UCSC Blast). Bootstrap 10 000x.
30
Příloha č. 7
Abstrakt z konference: Population Genetics Group 2005, University of Edinburgh
Nucleotide variation within the Idgf multigene family of Drosophila melanogaster
Presented by Dr. M. Zurovcova
Institute of Entomology, Czech Academy of Sciences
M. Novakova, R. Jungova
Faculty of Biological Sciences, University of South Bohemia
Imaginal disc grow factors (Idgf) in D. melanogaster form a small multigene family, with
characteristics (similar arrangement of introns and exons, small size and different
cytological localization) making this family an excellent candidate for evolutionary
studies. Previous analysis on genes Idgf1 and Idgf3 demonstrated that the pattern of
evolutionary change is different despite their tight physical linkage. We have continued
the research by sequencing and analysing the DNA haplotypes of all loci from this family.
Possible effects of selection and demography discussed.
31