Jemné genetické mapování

Genomika hospodářských zvířat
QTL pro rezistenci
a/nebo citlivost vůči
leishmanióze a jiným
infekcím u myší
QTL pro hybridní sterilitu samců u myší
White et al. 2011, Genetics
Jemné genetické mapování
• Abychom v genetickém mapování pomocí BC1 či F2 generace získali rozlišovací
schopnost cca 1 cM, je třeba analyzovat velké množství jedinců (~ 100) za použití
jemné genetické mapy (~ 1 marker/1cM) - to je příliš!
• Obvykle se genetické mapování provádí ve dvou krocích. V prvním kroku
analyzujeme menší množství jedinců (cca 30) za použití hrubé genetické mapy (~ 1
marker/10cM).
- nízká rozlišovací schopnost – desítky cM.
V druhém kroku analyzujeme větší množství jedinců, genotypujeme však pouze
markery v kandidátní oblasti.
- zúžení kandidátní oblasti na zhruba 1cM.
- umožňuje přechod z genetického mapování (cM) na fyzikální mapování (bp).
• Součástí jemného genetického mapování je často vytvoření kongenního kmene.
- umožňuje funkční analýzu hledaného genu.
Fyzické mapování
• Sekvenování kritické oblasti vymezené genetickým mapováním.
• Klonování DNA do vektorů (BAC, YAC). Sestavování získaných
sekvencí do kontigů. Anotace získané sekvence.
• Určení pozice markerů na fyzikální mapě.
• V dnešní době už většinou netřeba. Fyzická mapa u organismů s
přečteným genomem je známá.
Ověřování kandidátních genů
• Vytvoření seznamu kandidátních genů v kritické
oblasti
• Hledání polymorfismů korelujících se sledovaným
genotypem
- nesynonymní mutace v kódujících oblastech
- změny genové exprese
• Testování vlivu jednotlivých genů či SNP na fenotyp
pomocí transgeneze či knock-out
Další metody vazebné analýzy pomocí
laboratorního křížení
Konsomické kmeny
(Chromosomálně substituční
kmeny)
10 generací zpětného křížení za současné selekce přenášeného chromosomu
Vazebná analýza pomocí konsomických
kmenů
• Příprava konsomických kmenů zdlouhavá a pracná (10 generací
křížení, nutnost genotypovat každou generaci)
• Jakmile ale kmeny hotové, mapování je rychlé a bez nutnosti
genotypování.
• Nízká rozlišovací schopnost mapování (celý chromosom). Pro
jemnější mapování potřeba další křížení.
• Z konsomického kmene lze snadno vytvořit kongenní kmen.
Idiogram genomu potkana
Inbrední kmen
Konsomický kmen
Kongenní kmen
Dvojitě kongenní kmen
Polydaktylní kmen potkana PD/Cub
• Vysoce inbrední model (F > 90)
• model vývoje končetiny a
teratogeneze
• model hypertriglyceridémie,
metabolického syndromu
• Specifický farmakogenetický a
nutrigenetický profil
• Model vývojové plasticity
metabolického syndromu
Mapování znaků pomocí panelu
konsomických kmenů myší odvozených od
kmenů B6 a MSM
Takada et al. 2008, Genome Research
Rekombinantně inbrední linie
opakované křížení F1 bratr-sestra (alespoň 20 generací)
Rekombinantně inbrední linie
samoopylení (alespoň 20 generací)
Vazebná analýza pomocí rekombinantně
inbredních linií
• Příprava sice zdlouhavá (20 generací křížení), ale nemusí se
během ní genotypovat. Genotypuje se až konečná generace.
• Jakmile hotové, rychlé mapování bez genotypování.
• Vysoká rozlišovací schopnost – až 1cM (záleží na počtu
vytvořených RIL).
• Z RIL nelze snadno vytvořit kongenní kmen.
Mapování genů podmiňujících bílou korunku
u WSB/EiJ
Vazebná analýza pomocí rodokmenů
• Je třeba dostatek rodokmenů, ve kterých segreguje studovaný
znak (choroba).
• Rozlišovací schopnost daná počtem meióz zachycených
v rodokmenech. Obvykle nízká (~1-10cM).
• Vhodné pro mapování znaků s jednoduchou Mendelovskou
dědičností, ne však kvantitativních znaků.
Identifikace genu odpovědného za
cystickou fibrózu pomocí analýzy
rodokmenů.
Science (1985)
Asociační mapování
(LD mapování, haplotypové mapování)
• Mapování v přírodních populacích na základě vazebné
nerovnováhy (linkage disequilibrium, LD) ke genetickým
markerům.
• Je potřeba velmi vysoký počet markerů (~ 1 mil).
• Přesný počet markerů závisí na míře LD v genomu
(čím větší LD tím míně je potřeba markerů).
- LD nepřímo úměrně závisí na míře rekombinace a efektivní
velikosti populace
- LD je větší kolem nedávno vzniklých výhodných mutací
• Míra LD se mění podél genomu a tomu by mělo odpovídat
rozložení markerů.
Haplotypová mapa
lidského genomu
(HapMap projekt)
• určen genotyp více než 1 mil SNP
rozmístěných každých 5 kb v genomu u
více než 250 jedinců z několika populací
• zjištěno, že genom je rozdělen do bloků
(haplotypů) s vysokým LD (tzn. uvnitř
těchto bloků téměř nejsou rekombinace).
Hranice mezi jednotlivými bloky korelují
mezi
populacemi
a
odpovídají
rekombinačním hotspotům.
• Výsledky ukazují, že pro asociační
mapování je třeba genotypovat ~ 0.5 mil
SNP u Evropské populace a 1 mil SNP u
Africké populace (tj. kapacita jednoho
SNP genotypovacího čipu )
Asociační mapování
• Má vysokou rozlišovací schopnost (~10kb).
• Vhodné i pro mapování kvantitativních znaků.
• Třeba analyzovat velký počet jedinců (~ 1000).
• Důležité mít správnou kontrolní skupinu
(pozor na populační strukturu).
• Málo účinné pouze při mapování alel s velmi nízkou frekvencí
v populaci a velmi komplexních fenotypů podmíněných velmi
velkým množstvím genů s malými účinky.
Asociační
studie sedmi
chorob
v britské
populaci
The Wellcome Trust Case Control Consortium, Nature 2000
Asociační studie sedmi
chorob v britské
populaci
Vazbová analýza
- nízký počet genetických
markerů
(~ 100)
- nízká rozlišovací schopnost
(~ 10 cM)
Asociační mapování
- vysoký počet genetických
markerů
(~ 1 000 000)
- vysoká rozlišovací schopnost
(~ 10 kb)
Ideální je kombinace obou přístupů
1. vazebná analýza
Hrubé genetické mapování
- na úrovni celého genomu
2. Asociační mapování
Jemné genetické mapování
- lze omezit jen na určitou
předem vybranou oblast
Jak rychle nalézt gen odpovědný za určitý
fenotyp bez pozičního klonování
Metoda kandidátních genů
• Vytvoření seznamu genů, které by mohly mít nějakou
souvislost s pozorovaným fenotypem.
• Hledání polymorfismů a jejich korelace s fenotypem.
• Takto objeveny geny podmiňující některé lidské
nemoci (např. geny pro srpkovitou anémii) i některé
geny pro adaptivní znaky (např. geny podmiňující
různou barvu srsti u hlodavců).
• Tento přístup lze použít jen u některých fenotypů.
Nelze nalézt geny, jejichž funkce je neznámá.
Pytlouš skalní, obvykle světlý, na lávových polích černé populace. Černé zbarvení
vzniká mutací v genu melanocortin-1-receptor gene (Mc1r), ale jen v některých
populacích. V jiných populacích způsobuje černé zbarvení mutace v jiném genu
zatím neznámém (Nachman et al. PNAS 2003).
ZNAK, VLASTNOST
kongenitální dystonie svalstva I, II,
ichthyosis fetalis
ZDROJ
PLEMENO
POČET VZORKŮ
CMD 1 (12 pozit., 14
Charlier et al. Belgické modré, kontrolní), CMD 2 (7 pozit.,
(2008)
Chianina
24 kontrolní), ICF (3 pozit.,
9 kontrolních)
POČET
VÝZNAM. SNPs
-
KONTROLA V NEZÁVISLÉ
POPULACI
byly identifikovány 3
identifikována kauzální mutace geny nesoucí kauzální
mutaci
Ne, přesné předpovědi
netestováno odhadovaných PH mladých býků
(viz. komentář) dojných plemen (Wiggans et al.
2011)
produkce mléka, plodnost, reprodukce,
exteriérové vlastnosti a ostatní klíčové
ukazatele mléčné užitkovosti
Cole at al.
(2009)
Holštýn
5285
produkce mléka, PSB, životnost stáda,
servis perioda, ins. Interval
Daetwyler et al.
(2008)
Holštýn
484p
144
Ne
produkce mléka
Jiang et al.
(2010)
Holštýn
2093
105
Ne
1533
4514 (napříč 19
znaky)
Ano
produkce mléka, PSB, životaschopnost, Bolormaa et al.
Holštýn, Jersey
rychlost dojení, temperament při dojení
(2010)
KOMENTÁŘ
všechny SNPs
současně
použito 9919 SNPs
Multitrait metoda
ZNAK, VLASTNOST
ZDROJ
PLEMENO
POČET VZORKŮ
POČET
VÝZNAM.
SNPs
KONTROLA V NEZÁVISLÉ
POPULACI
KOMENTÁŘ
Testovány
jednotlivé SNPs,
stejně jako
varHAP
produkce mléka, ukazatele
plodnosti
Pryce et al.
(2010a)
Holštýn,
Jersey
1533
perzistence laktace
Pryce et al.
(2010b)
Holštýn,
Jersey
1533
619, při
P<0,005
Ano
odolnost vůči tepelnému stresu,
schopnost dojit při nízké úrovni
krmení
Hayes et al.
(2010)
Holštýn,
Jersey
1533
362
Ano
produkce mléka, PSM
Kolbehdari et
al. (2009)
Holštýn
28
Ne
1536 SNPs
produkce mléka - interakce s
úrovní krmení
Lillehammer
et al. (2009)
Holštýn
Ne
9918 SNPs
384
1573 (napříč Ano, 544 SNPs u Holštýna,
159 u Jersey
6 znaky)
ZNAK, VLASTNOST
ZDROJ
PLEMENO
POČET VZORKŮ
POČET
VÝZNAM.
SNPs
KONTROLA V NEZÁVISLÉ
POPULACI
produkce mléka
Mai et al.
(2010)
Jersey
1039
157
Ne
konformace zmasilost, funkční znaky
Kolbehdari et
al. (2008)
Holštýn
462
196
Ne
1036 SNPs v
intronech
866
2799
ne
Použit nový
multivarietní
postup
8207 SNPs
plodnost, věk při nástupu puberty
Fortes et al.
tropická
(2010)
plemena skotu
plodnost býků
Feugang et al.
(2009)
Holštýn
20 býků vynikající
plodnosti
97
Ano, 4 nejvíce signifikantní SNPs
se testovaly u 210 býků s
mimořádnou plodností, dva
signifikantní, související s integrin
beta 5 proteinem.
plodnost samic
Sahana et al.
(2010)
Holštýn
2531
74
Ne
KOMENTÁŘ
POČET VZORKŮ
POČET
VÝZNAM. SNPs
KONTROLA V NEZÁVISLÉ
POPULACI
KOMENTÁŘ
27
Ne, ale souhrnné výsledky
potvrzeny individuální
genotypizací.
První využití souhrnné
DNA anylýzy pomocí
GWAS u skotu
13
Ano
17,343 SNPs
ZNAK, VLASTNOST
ZDROJ
PLEMENO
plodnost, míra oplození, oplození,
blastocysty
Huang et al.
(2010)
Holštýn
mrtvě narozená mláďata, dystokie
Olsen et al.
(2010)
Norská červinka
2525
snadnost telení
Pausch. et al.
(2010)
Fleckvieh
1800
Ne
dvojče
Kim et al. (2009)
Holštýn
200
174
Ano, Birman et al. (2010). 55 SNPs
ověřeno v nezávávislém souboru
dat 921 holštýnských býků.
Poslední set 18 SNPs vysvětluje
34% variabilitu ve výskytu dvojčat.
složení mastných kyselin v hovězím mase
Uemoto et al.
(2010)
Japonský černý
skot
160 mimořádných zvířat
32
Ne
ZNAK, VLASTNOST
ZDROJ
PLEMENO
POČET VZORKŮ
odolnost vůči Johnově chorobě (posuzováno dle odolnosti
vůči M. aviumpoddr. paratuberculosis - MAP infekce)
Zanella et al. (2010)
Holštýn
90 plus, 16 pozit., 25 kontrolních
MAP - status
Settles et al. (2009)
Holštýn
245
MAP - status (ELISA)
Pant et al. (2010)
Holštýn
232 zvířat se známým MAP statusem
serologicky pozitivní (či neg.) na MAP (ELISA)
Minnozi et al. (2010)
Holštýn
483 MAP pozit., 483 negat. (ELISA)
vnímavost k BSE
Murdoch et al. (2010)
Holštýn
481 polosourozenců, 149 BSE pozit.,
184 kontrolních vzorků
POČET VÝZNAM. SNPs
5 SNPs při P<1 * 〖10〗
^(-5)
7 regionů při P<1 * 〖
10〗^(-5), 2 při P<1 * 〖
10〗^(-7)
12 genomických
úseků signifikantních
KONTROLA V NEZÁVISLÉ POPULACI
KOMENTÁŘ
Ne
Ne
Ne
jeden úsek
signifikantní při P<1 *
Ano, menší kohorta ze stejné populace.Ověřeno
〖10〗^(-6) a tři
5 SNPs.
signifikantní při P<1 *
〖10〗^(-5)
27 SNPs
Ne
Použito 3072 SNPs
ZNAK, VLASTNOST
ZDROJ
PLEMENO
POČET VZORKŮ
POČET VÝZNAM. SNPs
KONTROLA V NEZÁVISLÉ POPULACI
KOMENTÁŘ
růst
Snelling et. al (2010)
Angus, Charolais,
Gelbvieh, Hereford,
Limousin, Red Angus,
Simentál
2603
231 SNPs
Ne
využití krmiva
Barendse et al. (2007)
Angus, Brahman,
Belmont Red, Hereford,
Murray Grey, Santa
Gert., Shorthorn
189 mimořádných zvířat
161 SNPs při P<0,01
Ano, testována zvířata ze středu distribuce
odkud pocházel panel 198 mimořádných zvířat
využití krmiva
Sherman et al. (2010)
Angus, Charolais,
Alberta (hybrid)
464
23 při P<0,01
Ne
Použito 2633 SNPs
odolnost k tick burden
Turner et al. (2010)
Jersey , Holštýn, Aussie
Red, Sahiwal, Illawara,
Shorthorn
189 mimořádných zvířat
27 při P<0,05
Ne
Použito 7397 SNPs. Porto Neto
et al. (2010) signifikantní SNPs
velmi blízko u Integrin alpha 11
genu v navazující studii.