P027 Příprava Cox4-1/Cox4-2 knockout modelů pro studium

P027
Příprava Cox4-1/Cox4-2 knockout modelů pro studium regulace mitochondriální
cytochrom c oxidázy
Čunátová Kristýna, Kaplanová Vilma, Houštěk Josef, Mráček Tomáš, Pecina Petr
Fyziologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4
E-mail: [email protected]
Sekce: Biochemie membrán a bioenergetika
Cytochrom c oxidáza (COX) je multipodjednotkovým terminálním enzymem elektrontransportního řetězce uloženého ve vnitřní mitochondriální membráně. Její úlohou je přenos
elektronů na terminální akceptor - kyslík, který je redukován na vodu. Enzym rovněž přispívá
k tvorbě protonového gradientu přenosem protonů do mezimembránového prostoru. Tento
gradient je dále využíván ATP syntázou k tvorbě ATP. Savčí COX je tvořena
13 podjednotkami, z nichž tři jsou kódovány mitochondriální DNA a zbylých deset jadernou
DNA.
Významnou regulační úlohu hraje největší jaderně kódovaná podjednotka Cox4, která má
dvě tkáňově a vývojově specifické izoformy. Tyto izoformy pravděpodobně vznikly genovou
duplikací a subfunkcionalizací. Existují mezi nimi strukturní odlišnosti, které mohou
ovlivňovat funkci izoforem této podjednotky v rámci regulace COX. Izoforma Cox4-1 je
exprimována ve všech tkáních, zatímco Cox4-2 je u savců ve větším množství detekovatelná
pouze v plicích, srdci a mozku. Ke zvýšení exprese Cox4-2 izoformy dochází ve všech
tkáních za hypoxie, kdy tato „výměna“ izoforem může modulovat tok elektronů COX za
snížené koncentrace kyslíku a předcházet tím vzniku reaktivních forem kyslíku.
Za účelem výzkumu regulační funkce jednotlivých izoforem v rámci enzymu
připravujeme knockout modely (KO) na pozadí HEK293 buněčné linie. Za normoxie
HEK293 buňky obsahují především Cox4-1 izoformu, zatímco za hypoxie dochází k navýšení
exprese Cox4-2 izoformy. Naším cílem je příprava COX4-1KO a COX4-2KO klonů a
následně i COX4-1/2 dvojitých KO klonů, které budou využity ke vložení Cox4-1 či Cox4-2
izoformy s cílenou mutagenezí klíčových aminokyselin pro studium jejich významu in vivo.
KO klony připravujeme pomocí CRISPR CAS9-10A systému (CRISPR CAS9-10A paired
nickase targeted knock-out), který je vhodný pro genomovou editaci lidských buněčných linií,
včetně HEK293. Tato metoda spočívá ve využití párů guide RNA (gRNA), které cílí na exony
genu (early exons), a CAS9-10A nikázy, která vytvoří jednovláknové zlomy obou vláken
DNA mezi specificky nasedajícími gRNA.
Diskutovány budou naše poznatky týkající se fungování COX s chybějící izoformou
Cox4-1 nebo Cox4-2.
Projekt je podporován grantem GAČR 16-13671S.