zde - Společnost pro lékařskou mikrobiologii

MALDI – TOF v klinické
mikrobiologii
MUDr. Josef Scharfen, CSc.
Pracovní skupina pro správnou laboratorní praxi
Společnost pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů
MALDI-TOF
1
Motto:
„ Programy vždy dávají výsledky,
ale je na uživateli, aby rozhodl,
zda výsledek dává také smysl“.
Andrea Hansen
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
2
Moto
• Akreditace má dávat záruky kvality
výsledku vyšetření pro klienta /
pacienta.
• V mikrobiologii pacientovi nejvíce
uškodíme, pokud nezachováme
vlastní smysl / podstatu oboru.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
3
Definice lékařské mikrobiologie podle
koncepce oboru LM umístěné na
stránkách SLM a MZČR.
• Lékařská mikrobiologie se zabývá etiologií, patogenezí a
imunogenezí onemocnění vyvolaných mikroorganismy s
poskytováním diagnostických, interpretačních,
terapeutických a epidemiologických podkladů. Vychází z
vědeckých základů mikrobiologie a jejích dílčích oborů
(bakteriologie, virologie, mykologie, parazitologie a
antiinfekční imunologie).
• http://www.splm.cz/koncepce-oboru
• http://www.mzcr.cz/data/c441/lib/20a.rtf
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
4
Klinická mikrobiologie
• Klinická mikrobiologie je aplikovaný obor lékařství postavený
na klinickomikrobiologické diferenciální diagnostice.
• Poskytuje informace k diagnostice a léčbě infekčního
onemocnění u konkrétního pacienta v kontextu klinické
diagnózy, podklady pro kontrolu infekcí spojených se
zdravotní péčí a pro kontrolu přenosných infekčních nemocí v
komunitě.
• Je základem praktické diagnostiky na pracovištích lékařské
mikrobiologie.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
5
Specifické vlastnosti oboru
lékařské mikrobiologie
• VZTAH MAKRO A MIKROORGANISMU
• INTERPRETACE VZTAHU M+M
• Kontrola kvality v přímé a nepřímé
diagnostice
– První úroveň: Správnost metody
– Druhá úroveň: Správnost vyšetření
• Dokumenty mikrobiologických společností
(minima, NSVP): KLINICKÁ PREAMBULE.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
6
Podstata oboru lékařské mikrobiologie:
VZTAH MAKRO A MIKROORGANISMU
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
7
Podstata oboru lékařské
mikrobiologie
• Předmětem vyšetření je vztah parazita a
hostitele, který se za určitých okolností
může projevit jako onemocnění
– etiologické agens
• identifikace
• citlivost na antibiotika.
• Mikrob není analyt, neexistují normální
hodnoty nebo kritická rozmezí.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
8
4 sféry oboru lékařské mikrobiologie
cíle a prostředky
2. PACIENTI V NEMOCNICI
Infekční kontrolní programy u
infekcí spojených se zdravotní
péčí (HCAI)
OPATŘENÍ =
OPATŘENÍ =
Klinická konsilia a konzultace ,
CÍL
CÍL
CÍL
PROSTŘEDEK
3. PACIENTI V KOMUNITĚ
prevence a epidemiologie
komunitních infekcí
13. 6. 2016
1.PACIENT
= DIAGNÓZA A LÉČBA
4.ŘÍZENÍ LABORATOŘE
KLINICKÉ
MIKROBIOLOGIE
9
2012SZÚDDVKMAMALDITOF
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
9
4 sféry oboru lékařské mikrobiologie – epidemiologické souvislosti (přenos infekce, rezistence na atb, hlášení)
Pro diferenciální
diagnostiku potřebujeme
znát:
1. Anamnéza
Klinická konsilia a
1. Osobní
konzultace
1. Léčba atb
2. Imunita
3. Abusus
4. očkování
4.ŘÍZENÍ
2. Rodinná
LABORATOŘE
3. Pracovní
KLINICKÉ
1. Zemědělství
MIKROBIOLOGIE
4. Nemocniční
5. Cestování v cizině
6. Sexuální
2. PACIENTI
7. Kontakty s
V NEMOCNICI
infekčním
(HAI)
onemocněním
8. Epidemiologická
situace v
nemocnici, v
komunitě a ve
státě.
1.PACIENT
13. 6. 2016
3.
PACIENTI V
KOMUNITĚ
prevence a
epidemiologie
komunitních
infekcí
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
Provádíme
hlášení
výsledků
1. podle
vyhlášky
ZÚ
2. Podle typu
HCAI
komisi NI
Souvislosti
1. OBP v
laboratoři
2. Bioterorismus
3. Typy
zabezpečení
(BSL 1,2,3,4)
10
11. 12. 1843 – 27. 5. 1910
Robert
Koch
Etiologie infekčního onemocnění
klinickomikrobiologická diferenciální diagnostika
20140506_SLM ČLS JEP_NSVP IDENTIFIKACE
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
11
11
Kochovy postuláty
1
2
Nemocné
zvíře
1) Mikroorganismus se musí
masivně vyskytovat u všech
organismů, které mají příslušné
onemocnění, ale nesmí se
vyskytovat u zdravých jedinců.
Suspektní
patogen
Nález
v mikroskopickém
preparátu
4
2) Mikroorganismus musí
být izolován z nemocného
organismu v čisté kultuře.
Kultivační vyšetření
zdravého a
nemocného zvířete
13. 6. 2016
3) Izolát musí způsobit u
zdravého jedince typické
onemocnění.
4) Mikroorganismus musí být
znovu izolován z naočkovaného
experimentálního hostitele a po
identifikaci je identický s
původním etiologickým agens.
Erytrocyty
Erytrocyty
Vykultivovaný
patogen
3
Zdraví
zvíře
Kultivačně
negativní
Zdraví zvíře je naočkována
izolátem patogenu
Nemocné
zvíře
Suspektní
patogen
Kultivace
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
12
Mikrob ve vztahu k hostiteli (člověk)
obecná ve vztahu ke klinické mikrobiologii
technologie ve vztahu ke klinické patologii
(aplikovaná)
• Baktérie - biologie, taxonomie,
základní výzkum
–
–
–
–
Leeuwenhoek
Linné
Bergey
Woese
prostředek
13. 6. 2016
•
Člověk, onemocnění, etiologie,
diferenciální diagnostika, klinická
mikrobiologie / bakteriologie
– Pasteur
– Koch
– Gram
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
13
Mikrob ve vztahu k hostiteli (člověk)
obecná ve vztahu ke klinické mikrobiologii
technologie ve vztahu ke klinické patologii
• Baktérie - biologie,
taxonomie, základní
výzkum
– Leeuwenhoek
– Linné
– Bergey
– Woese
13. 6. 2016
•
Člověk, onemocnění, etiologie,
diferenciální diagnostika, klinická
mikrobiologie / bakteriologie
– Pasteur
– Koch
– Gram
Cíl,aplikace
interpretace, vztah
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
14
Co odlišuje klinickou mikrobiologii od ostatních laboratorních
oborů?
Klinickomikrobiologická diferenciální diagnostika !
1. Pro určení diagnózy infekčního onemocnění na základě vztahu makro
a mikroorganismu, je nutná klinickmikrobiologická diferenciální
diagnostika vycházející ze znalostí hostitele / pacienta:
1. normální (rezidentní) flóry
HOSTITEL
2. typických nozologických jednotek a jejich původců,
3. znalostí okolností (stav imunity, typ pacienta, místo pobytu pacienta
(nemocnice, komunita, zahraniční cesty, anamnéza, komorbidity, předchozí
atb léčba apod.)
2. Podle virulence v dané populaci dělíme mikroorganismy /patogeny na
1.
2.
3.
4.
Primární patogen, antagonismus
Potenciální patogen, antagonismus za určitých podmínek
Komensál, synergie
P
Saprofyt (neutrální vztah)
H
PATOGEN
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
15
Zvláštní komplexní vyšetřovací postupy
v bakteriologii
1.
Identifikace mikroorganismu je zvláštní vyšetření uvnitř vyšetření (SOP), se svou
vlastní interpretací a diferenciální diagnostikou
1. Interpretace výsledku identifikace se děje s pomocí znalostí taxonomie,
nomenklatury a identifikačních metod (diferenciální diagnostika uvnitř
metody – fenotyp, genotyp, proteomika X diagnóza)
2.
Vyšetření citlivosti izolátu na antibiotika je zvláštní vyšetření uvnitř vyšetření (SOP),
se svou vlastní interpretací a diferenciální diagnostikou
1. Interpretace a diferenciální diagnostika uvnitř taxonu (fenotyp
rezistence), na základě farmakokinetiky, mechanismů rezistence,
diagnózy, anatomického systému, výsledek je semikvantitativní a
kvantitativní informace o tom, že léčba antibiotiky bude pravděpodobně
účinná (C= citlivost) nebo nebo pravděpodobně neúčinná (R =
rezistentní). –o výsledku léčby rozhoduje více proměnných než pouze
in-vitro stanovení citlivosti nebo rezistence.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
16
Infekční onemocnění
PATOGEN
PROSTŘEDÍ
HOSTITEL
NEMOC
ZÁVAŽNÉ
ONEMOC
NĚNÍ
SMRT
13. 6. 2016
MANIFESTACE ONEMOCNĚNÍ
V POPULACI
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
SUBKLINICKÉ,
INAPARENTNÍ
ONEMOCNĚNÍ
17
Co znamenají předchozí snímky?
• Kvalita mikrobiologického vyšetření je plně závislá na
interpretaci výsledku uvnitř metody spolu s interpretací
výsledku uvnitř konkrétního případu onemocnění, oboje lze
shrnout do termínu klinicko-mikrobiologická
diferenciální diagnostika
• Může tuto diferenciální diagnostiku provádět klinik ? Pouze z
části, protože nemá odpovídající znalosti o problematice
patogenů a metod, kterými s prokazují.
• JE NUTNÁ VZÁJEMNÁ KOMUNIKACE, kterou zahajuje
obvykle ten, kdo se chce něco dozvědět nebo něco
důležitého sdělit, nikoli plošně, ale k vybraným vyšetřením
podle závažnosti !
• Kde lze najít základní informace o dif. Dg? Jsou součástí SOP
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDI18
pro
příslušné vyšetření.
TOF
150
300
2.generace
3.generace
Phoenix BD
16s rDNA sekvenace
Vitek 2,
BioMerieux
20-80%
Microscan Walkaway
Siemens
4,24 h
97%-100%
7500 RT PCR
•Nomenklatura
LightCycler Roche
4h
•Klasifikace
1.generace
API bioMérieux
•IDENTIFIKACE
BAKTÉRIÍ
4.generace
MALDI Biotyper MS
Bruker Daltonics
97%-100%
20-80%
Biochem.ID
BBL Crystal
100
4,24,48 h
Vitek MS
bioMérieux
10 min
190
19
Upraveno, podle: Santos AF et al. Evaluation of MALDI-TOF in microbiology laboratory, J Bras Patol Med Lab 2013,49,3,191-197
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDI-TOF
19
Jak se změnil
myšlenkový
postup při
identifikaci
pomocí
MALDI-TOF ?
Výsledek
MALDI–TOF je
nutno interpretovat
s kultivační
plotnou v ruce a
s komplexní
znalostí
13. 6. 2016
mikrobiologie
STÁLE
PLATÍ
KOCHOVY
POSTULÁTY
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
20
Vandamme,P. et.al.:
Polyphasic taxonomy,
a consensus approach to
Bacterial Systematics,
Micr.Rev.1996, 407-438
13. 6. 2016
•MALDI - TOF
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
21
PACIENT
Racionalita oborová
Kontext medicíny
Znalost a zkušenost
Intuice.
SEQ
VALIDACE
(FENOTYP)
KULTIVACE
MALDI-TOF
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
22
UK Standards for Microbiology Investigations
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation
- Time of Flight Mass Spectrometry (MALDITOF MS) Test Procedure
MUDr. Josef Scharfen, CSc.
Pracovní skupina pro správnou laboratorní práci
Společnost pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP
https://www.gov.uk/ukstandards-for-microbiology-investigations-smi-qualityand-consistency-in-clinicallaboratories
Scope of the document
Předmět dokumentu
• This SMI describes the test procedure, MALDI-TOF MS
and its use in the examination of clinical specimens as
mentioned in the UK SMI Identification (ID) documents.
This document includes the mechanism as well as the
limitations of the technique in its use in diagnostic
microbiology laboratories.
• Tento standard vyšetřovacího postupu popisuje postup
testování MALDI-TOF MS a jeho použití při vyšetření
klinických vzorků podle dokumentů v britských
identifikačních standardech. Tento dokument obsahuje
mechanismy a omezení techniky při použití v
mikrobiologické laboratorní diagnostice.
Úvod-definice
• MALDI-TOF MS je měkká ionizační technika
používaná v hmotové spektrometrii, která umožňuje
analýzu biomolekul (jako DNA, proteiny, peptidy a
cukry) a velkých organických molekul jako jsou
polymery, dendrimery a jiné makromolekuly), které
jsou fragilní a při ionizaci fragmentují vhodnými
ionizačními metodami. Ionizace se spustí laserovým
paprskem. Je to rychlý a vysoce spolehlivý analytický
nástroj pro charakterizaci mnoha různorodých baktérií,
s nimiž se setkáváme v klinické laboratoři.
• Tato technika se používá k analýze skladby
mikrobiální stěny a stala se novou technologií pro
identifikaci druhů.
Úvod-výhody při srovnání
s ostatními ID technikami
• Rychlost: min x hod
• Jednoduchost přípravy vzorku
• Malá spotřeba materiálu (SZM)
– RUTINNÍ POUŽITÍ, KAPACITA PRO VELKÉ POČTY
VZORKŮ.
• Nákladová efektivita při počátečních vysokých
nákladech.
• Dostupnost databází (cena), není přímá
srovnatelnost výsledků mezi systémy.
• Je možno vytvářet vlastní databáze.
Technické informace/omezení_1
uváděné informace se vztahují na všechny provozované systémy
• Přítomnost bakteriálních endospor (interference
spekter) u Clostridium species.
• Rozlišení organismů: Escherichia coli x Shigella
species
• Některé viridující streptokoky a pneumokoky, členové
Candida albicans complex, atd.
• Výzvou je přímé rozlišení MRSA a MSSA
• Obtížná identifikace do species Mycobacterium,
Burkholderia, Acinetobacter, Corynebacterium a
betahemolytické streptokoky (u všech je vysoký
stupeň genetické podobnosti)
Technické informace/omezení_2
Existující taxonomické databáze
• Existující databáze mohou být vylepšeny buď na
stávajícím základu nebo lze vytvořit vlastní laboratorní
databáze s místně důležitými bakteriálními kmeny nebo
s kmeny, které nejsou dobře zastoupeny ve firemní
databázi.
• Avšak, to vyžaduje spolehlivou molekulární
identifikaci kmenů (příkladem může být
Propionibacterium acnes, Eubacterium brachy, viridující
streptokoky a pneumokoky, Pantoeaa agglomerans jako
Enterobacter spp, Pandoraea pulminicola jako
Sphingobacterium spiritivorum)
• Někdy je problém s nesprávným referenčním spektrem v
databázi, ale ne u všech systémů.
Technické informace/omezení_3
Obtíže při lýze buněčné stěny
• Některé organismy mají pouzdro, které zabraňuje
úspěšné lýze buněk a způsobuje slabý výtěžek extrakce a
tudíž nevyhovující kvalitu spektra. To může vést k
problémům při identifikaci.
• Příklady: Streptococcus pneumoniae x Streptococcus
mitis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae.
Klíčem k překonání těchto problémů je množství inokula a
použitá metoda extrakce.
• Uživatelům se doporučuje testovat všechny izoláty v
duplikátu, protože se obvykle koncentrace inokul v
nánosech liší. Lepší inokulum dává lepší skóre a tím
vzrůstá i pravděpodobnost správnost identifikace.
• Při použití vyšetření v duplikátu musí mít laboratoř „smírčí“
strategii pro postupy. Tato strategie musí být součástí
místní SOP.
Technické informace/omezení_4
Komerční platformy
• Každý výrobce používá při identifikaci
mikroorganismů své vlastní algoritmy, databáze,
software a interpretační kritéria, takže numerická
data (spektrální skore) nelze mezi jednotlivými
komerčními systémy přímo porovnávat.
• Poznámka: Je třeba zdůraznit, že některé MALDITOF MS komerční softwary nejsou schopny
identifikovat Rizikovou skupinu patogenů 3
(bioteroristická agens), pro které je nutno zakoupit
zvláštní databázi.
• To může potenciálně vést k dalšímu testování
těchto izolátů k přesné identifikaci, čímž vzrůstá
riziko expozice laboratorního personálu.
Technické informace/omezení_5
Kultivační média
• K neúspěšné identifikaci kmene může dojít kvůli
použité kultivační půdě. Některé součásti médií
např. u agaru s kolistinem a nalidixovou kyselinou
nebo u tekutých půd mohou vyvolat interferenci.
• Jiné příklady neúspěšných identifikací vznikají u
drobných nebo mukózních kolonií, vyšetřováním
smíšené kultury, přenosem mezi terčíku, špatným
vyčištěním destičky nebo přehozením pořadí
inokulovaných terčíků .
• Chyba v umístění terčíků může být minimalizovaná
vyšetřováním v duplikátech (se „smířením“ rozdílných
výsledků) a opakovaným vyšetřením v případech, kdy
s výsledkem identifikace nesouhlasí morfologie kolonií
nebo klinická data (viz diferenciální diagnostika).
Technické informace/omezení_6
Identifikace antimikrobiální rezistence
• Přímou detekci antimikrobiální rezistence nelze
provádět pomocí MALDI-TOF MS, protože stav
rezistence se neprojevuje změnou spekter. V
současnosti není dostupná univerzální platforma pro
rychlé určení antimikrobiální rezistence včetně ESBL +
kmenů, která by mohla být implementována do provozu
mikrobiologických laboratoří.
• Ačkoliv se MALDI-TOF stále více prosazuje v
diagnostických laboratořích, má potenciál v průkazu
produkce karbapenemázy, ale jsou třeba další
zdokonalení a validace než se vyšetřování citlivosti
stane rutinní praxí (UK).
Hrabak J, Chudackova E, Walkova R. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (maldi-tof) mass
spectrometry for detection of antibiotic resistance mechanisms: from research to routine diagnosis. Clin Microbiol Rev
2013;26:103-14.
Hrabak J, Studentova V, Walkova R, Zemlickova H, Jakubu V, Chudackova E, et al. Detection of NDM-1, VIM-1, KPC, OXA48, and OXA-162 carbapenemases by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin
Microbiol 2012;50:2441-3.
Technické informace/omezení_7
Přímé testování klinických vzorků
• Tato technologie se ukázala jako velmi užitečná pro
přímé testování klinických vzorků jako je moč, likvor a
krev, což by vedlo k významnému zlepšení péče o
pacienta a zkrácení TAT při vydání výsledku.
• I když existují komerční validované kity pro přímou
extrakci z těchto vzorků (např. z pozitivních
hemokultur), je třeba provést další studie ke
zpracování vzorků z hemokultivačních lahviček a
moči, a je třeba vylepšit databáze před tím, než si
laboratoře vyberou mezi MALDI-TOF MS metodami a
nově zaváděnými molekulárními metodami
průkazu baktérií z kultivační půdy nebo ze vzorků.
• Jiným omezením může být i finanční stránka věci,
svázaná s pořizováním doplňků k MALD-TOF MS.
Technické informace/omezení_8
Metody extrakce
• K úpravě vzorků pro vyšetření MALDI-TOF MS existuje několik
extrakčních metod.
• Neexistuje žádná nejlepší doporučená extrakční metoda.
Uživatelé by se měli ujistit o tom, že používají vhodnou extrakční
metodu k získání přesných výsledků identifikace podle výrobce
zařízení a měli by se také přesvědčit o konzistentnosti výsledků s
databází typických spekter v knihovně.
• Např. kvasinky ke správné identifikaci vyžadují extrakci
proteinu.
• Vláknité houby nemají standardní extrakční protokol a komerční
databáze zatím neobsahují plné spektrum druhů pro identifikaci hub.
• Anaeroby se mohou identifikovat s pomocí chemické extrakce
nebo z přímého nátěru na terčík. Někde se uvádí, že plná extrakce
má horší výsledky.
• Viz příloha 2
Technické informace/omezení_9
Chyby v identifikaci
• K chybě může dojít při zadávání názvu do
LIS.
• Důvodem může být i závada v databázi.
Technické informace/omezení_9
Výhody MALDI-TOF MS
• Identifikace pouze z 1 kolonie (ale ne u kvasinek, nebo
mukózních kolonií)
• Riziko expozice infekcím je obvykle velmi nízké,
protože baktérie ve vzorku jsou inaktivovány extrakcí.
• Velmi adaptabilní otevřený systém, který se dá lehce
rozšířit uživatelem.
• Ekologická technika s malým uhlíkovým zatížením
• Vyžaduje minimální spotřební materiál
• Identifikuje baktérie, které se obtížně kultivují
(mykobaktérie, bartonely, legionely, atd.)
• Spolehlivý při identifikaci klinicky relevantních
anaerobů (bakteroidy, prevotely, aktinomycety a jiné
grampozitivní baktérie)
• Užitečný při identifikaci klinicky relevantních kvasinek
(kandidy)
1 Bezpečnostní rozvaha
nebezpečné patogeny
• Veškerá práce, kde vzniká aerosol, se musí
provádět v laminárním boxu.
• U patogenů na úrovni bezpečnosti BSL3
se práce musí provádět v laboratoři s
plným zabezpečením typu BSL3 podle
platných směrnic (patogeny typu Brucella,
Bacillus anthracis, Mycobacterium sp. /u nás
BSL2-3/, atd.) v k tomu určených laboratořích
(u nás SZÚ, podle platných Národních
vyhlášek)
1 Bezpečnostní rozvaha
chemikálie
• Matrice jsou nízkomolekulární sloučeniny, kyseliny a látky
prchavé povahy se silnou schopností absorpce v UV/IR oblasti.
Na trhu jsou různé typy matricí pro práci s MALDI-TOF/MS s
odlišnými vlastnostmi a použitím.
• Kyselina mravenčí se používá pro práci s klinickými vzorky.
Koncentrovaná je vysoce leptavá (použití ochranných
prostředků), je třeba velké opatrnosti, protože kyselina
mravenčí má specifické toxické účinky u člověka (poškození
optického nervu, poškození ledvin, kožní alergie po
opakované expozici.).
• Pracovní riziko při kontaktu očí, kůže a respiračního traktu.
• Je třeba respektovat všechny národní vyhlášky OBP a
lokální směrnice a další pravidla uvedená v souvisejích SOP,
včetně poštovních a transportních směrnic.
2 Reagencie a vybavení
rozdělení
• Podle vybavení a použité extrakce pracujte podle
návodu výrobce.
• Existují 2 hlavní přístupy
– Čistá kultura (kolonie) na plotně. Doporučují se čerstvě
narostlé kolonie (nárůst přes noc), v případě pomalu rostoucích
baktérií až několik dnů. Plotny se před použitím nemají
uchovávat při +4C, protože to negativně ovlivní kvalitu spektra,
která se znehodnocuje v průběhu několika dnů. Pokud to je
možné, skladujte při pokojové teplotě několik dnů.
NEBO:
– klinický vzorek (přímo materiál z hemokultivační lahvičky, moč,
likvor nebo proteinový extrakt). K dispozici jsou komerční
extrakční kity pro hemokultivační bujón.
2 Reagencie a vybavení
kontrola kvality
• Extrakční postup provádí kompetentní vycvičený personál.
• Všechny reagencie mají platnou dobu použitelnosti a jsou řádně
uskladněny.
• Kontrola provedení extrakce pro MALDI-TOF se rutinně kontroluje pomocí
vybraných bakteriálních kmenů, jejichž spektra jsou v aktuální databázi.
• Při jakýchkoliv změnách (reagencie, extrakční protokol) se v příslušné
laboratoři provádí validace před rutinním zavedením do provozu.
• Tam, kde se zavádí modifikovaný extrakční protokol, uživatel se musí
přesvědčit, že je kompatibilní se stávající databází. Pokud není kompatibilní,
lze vytvořit novou databázi při použití modifikovaného protokolu s
příslušnou validací.
• Pro dosažení přesných výsledků je třeba pravidelný servis a údržba
přístroje. Pokud je přístroj velmi vytížen nebo se používá prašných nebo
stísněných prostorách, musí být servis častější.
2 Reagencie a vybavení
IT, interpretace výsledku
• Výsledky
– Výsledky musí být řádně intepretovány a validovány v
procesu diferenciální diagnostiky. V ČR je konsensuálně
non lege artis validace a interpretace výsledku na dálku.
– Výsledky musejí být interpretovány s originální plotnou v
ruce tím, kdo odečítal a indikoval identifikaci s použitím
MALDI-TOF / MS.
– Žádný identifikační systém nedosahuje 100% přesnosti a
MALDI-TOF/MS má množství známých slabin: klinický
mikrobiolog musí přehodnocovat výsledky identifikace v
laboratoři podle klinických projevů onemocnění a
známých informací o pravděpodobné přesnosti
identifikace. V případě potřeby indikuje použití
alternativních metod.
3 organismy pro kontrolu kvality
• Pozitivní kontrola – bakteriální testovací standard
poskytovaný výrobcem se používá pro denní
kalibraci a jako kontrola při každém běhu/matrix.
• Negativní kontrola – měří se blank – prázdné
místo zakapané matricí poskytovanou výrobcem
pouze k verifikaci, že destička byla správně
vyčištěna.
• Poznámka: organismy používané pro kontrolu
kvality jsou závislé na výrobci. Pracujte podle
návodu výrobce.
4 Postup a výsledky_1
• Čistá kultura (typicky jedna
kolonie) je nabrána z Petriho misky a
je nanesena s pomocí párátka, hrotu
pipety nebo kličkou na destičku
MALDI-TOF MS ve formě tzv.
přímého nátěru. Kolonie
mykotických organismů vyžadují
před testováním extrakci (viz
odstavec technická omezení).
4 Postup a výsledky_2
• Poznámka: - Přímé nanášení na destičku se nesmí provádět s
rizikovými organismy typu Mycobacterium sp., Brucella sp a
Bacillus anthracis.). Rizikové organismy musejí být
inaktivovány a potom musí být přidána kyselina mravenčí,
která zabíjí většinu baktérií.
• Jakýkoliv rizikový organismus musí být před testováním
extrahován za odpovídajících podmínek BSL3 z důvodů
zabránění infekce personálu při zpracování.
• Je třeba zdůraznit, že ani kultivační médium, ani inkubační
teploty a podmínky, nebo délka inkubace neovlivňují přesnost
identifikace.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
46
4 Postup a výsledky_3
• Nános na destičce je pak převrstven 1 – 2 ul matrice. V
případě, že přímá identifikace baktérií selže, lze suspenzi
překrýt kyselinou mravenčí v acetonitrilu před přidáním
matrice), v případě mykotických organismů se provede před
překrytím matricí na destičce zpracování s etanolem a
kyselinou mravenčí v acetonitrilu. Tomu se obvykle říká lýza
na destičce (On Target Lysis).
• Matrice se musí přidávat v co nejkratší době, aby nedošlo k
oxidaci vzorku na destičce.
• Po krátkém zasychání při pokojové teplotě je destička
umístěna do ionizační komůrky hmotového spektrometru k
vlastní analýze.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
47
4 Postup a výsledky_4
• Získá se hmotové spektrum, které se automaticky porovnává s
databází hmotových spekter pomocí softwaru a tím je
organismus identifikován. Uživatelé musejí při vyhodnocování
identifikace postupovat podle doporučení výrobce při
rozhodování o tom, zda je identifikace úspěšná buď na úrovni
druhu nebo rodu.
• Poznámka: Většina baktérií se identifikuje už při provedení
přímého nátěru bez potřeby další aplikace kyseliny mravenčí.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
48
Příloha 1:
vývojový
diagram
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
50
Příloha 2:
Návrh přípravy vzorků
různých tříd
mikroorganismů
pro identifikaci
MALDI-TOF MS
Literatura
Literatura
Závěr
1.
2.
3.
4.
Pro identifikaci mikroorganismů s použitím MALDI-TOF je nutná
znalost a pochopení principů polyfázové taxonomie a identifikace.
Technologicky správně provedená identifikace není zárukou validity
klinického výsledku.
Identifikace není samostatné vyšetření. Metoda je součástí dokonale
provedených kultivačních vyšetření v rámci SOP pro příslušný
biologický materiál s důrazem na preanalytickou fázi vyšetření.
Definitivní uzavření vyšetření je založené na interpretaci nálezu
klinickým mikrobiologem v klinickém kontextu daného onemocnění,
která vyplývá z klinickomikrobiologické diferenciální diagnostiky
obsažené v NSVP (SOP) pro příslušný klinický materiál.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
54
Děkuji vám za pozornost.
13. 6. 2016
2016 Setkání uživatelů MALDITOF
55