AMYLASE

Příprava pracovního činidla
AMYLASE
Start substrátem – činidla R1 a R2 jsou připravena
k použití.
IFCC (EPS)
Kat. číslo
107 016
107 000
107 001
107 002 Hit I
Velikost balení
7 x 10 ml R1
5 x 20 ml R1
2 x 100 ml R1
4 x 50 ml
2 x 7 ml R2
1 x 20 ml R2
2 x 20 ml R2
2 x 20 ml
Kolorimetrická, kinetika, EPS.
Princip
Enzymatický kolorimetrický test s 4,6-etyliden(G7)p-nitrofenylmaltoheptaosidem
(EPS)
jako
substrátem:
α-amyláza
5 etyliden G7-PNP + 5 H2O —→ 2 etyliden-G5 + 2 G2PNP + 2
etyliden-G4 + 2 G3PNP + etyliden-G3 + G4PNP
α-glukosidáza
2 G2PNP + 2 G3PNP + 10 H2O —→ 4 PNP + 10 glukóza
Složení reagencií
R2
100 mmol/l
50 mmol/l
10 mmol/l
≥ 2 kU/l
100 mmol/l
1,6 mmol/l
Upozornění




změnám
Referenční hodnoty (37°C)
Sérum / plasma 0,5-1,67 μkat/l
Moč
< 7,5 μkat/l
Moč – sbíraná
< 6,9 μkat/l / 24 hod
Poznámka: Uvedená data jsou pouze doporučením, každá
laboratoř by si měla stanovit vlastní referenční rozmezí.
Postup stanovení
(PNP = p-nitrofenol)
Good´s pufr (pH 7,1)
NaCl
MgCl2
α-glukosidáza
Good´s pufr (pH 7,1)
EPS-G7
Vzorek
Sérum, plasma (EDTA / heparin), moč.
V séru nedochází k
významným
katalytické koncentrace po dobu 5 dnů.
Stabilita v moči: 10 dnů při 4°C,
2 dny při 25°C.
Metoda
R1
Pro start vzorkem se připraví pracovní činidlo
smícháním činidel R1 a R2 v poměru 5 + 1.
Stabilita pracovního činidla:
20 dnů při 2-8°C,
5 dnů při 18-22°C.
Reagencie lze použít pro manuální stanovení (viz
níže) nebo na většině analyzátorů. Aplikace na
vyžádání.
Vlnová délka:
Teplota:
Kyveta :
Odečet proti vzduchu.
405 nm
37°C
1 cm
■ Start vzorkem – jednočinidlová metoda
Pouze pro použití in vitro.
Nepipetujte ústy, zabraňte kontaktu
reagencií s pokožkou, protože sliny a pot
obsahují α-amylázu.
Reagencie obsahuje azid sodný v
koncentraci < 0,95 g/l. Zabraňte kontaktu
s pokožkou a / nebo sliznicí.
Během reakce vzniká p-nitrofenol, který je
zdraví škodlivý při vdechnutí nebo
v kontaktu
s pokožkou.
V případě
potřísnění opláchněte zasažené místo
dostatečným množstvím vody.
Stabilita reagencií
Reagencie jsou stabilní do uvedeného data
exspirace, pokud jsou skladovány při teplotě 2-8°C
a chráněny před světlem.
Pracovní činidlo
Vzorek
sérum
1 000 μl
20 μl
moč
1 000μl
10 μl
Promíchejte a po dvouminutové inkubaci začněte
sledovat změnu (nárůst) absorbance po dobu 3
minut.
Vypočítejte změnu absorbance za minutu ΔA.
■ Start činidlem R2 – činidlo R1 / R2
sérum
Činidlo R1
1 000 μl
Vzorek
20 μl
Promíchejte a po 1 minutě pipetujte:
Činidlo R2
200 μl
04/2011
moč
1 000μl
10 μl
200 μl
1
Greiner Diagnostic GmbH – Unter Gereuth 10 – D 79353 Bahlingen – Germany
www.greiner-diagnostic.com
Promíchejte a po dvouminutové inkubaci začněte
sledovat změnu (nárůst) absorbance po dobu 3
minut.
Vypočítejte změnu absorbance za minutu ΔA.
Výpočet katalytické koncentrace – faktor
Start činidlem R2
sérum /plasma U/l = 6 157 x ΔA/min
μkat/l = 102,7 x ΔA/min
moč
U/l = 12 218 x ΔA/min
μkat/l = 203,7 x ΔA/min
Start vzorkem
sérum /plasma
moč
U/l = 5 148 x ΔA/min
μkat/l = 86 x ΔA/min
U/l = 10 198 x ΔA/min
μkat/l = 170 x ΔA/min
Výpočet katalytické koncentrace – standard
ΔA vzorku
Katalyt. koncentrace AMS (μkat/l) = ———— x c
ΔA standardu
c = koncentrace standardu v μkat/l
■ Přesnost
Přesnost v sérii
n=20
průměr
(U/l)
vzorek 1
77,7
vzorek 2
196
vzorek 3
72,1
Celková přesnost
n=20
průměr
(U/l)
vzorek 1
79,5
vzorek 2
195
vzorek 3
72,5
1,009
1,834
1,700
1,298
0,935
0,934
SD (U/l)
CV( %)
0,934
0,674
0,934
1,176
0,345
1,288
Srovnání reagencií Greiner bylo provedeno
s komerčně dostupnými reagenciemi na 36
pacientských vzorcích s těmito výsledky:
korelační koeficient
r = 0,977
lineární regrese
y = 1,00 x + 2,480 U/l
Interference


Přepočítávací faktor
Kyselina askorbová – neinterferuje do
koncentrace 1 700 μmol/l.
Triacylglyceroly – neinterferují do
koncentrace 22,8 mmol/l.
Bilirubin – neinterferuje do koncentrace
680 μmol/l.
Literatura
1.
Kalibrace a kontrola
Pro kalibraci je doporučen multikalibrátor Greiner
(kat.číslo 280 000).
Ke kontrole použijte kontrolní séra Unitrol I a
Unitrol II.
2.
Charakteristika stanovení (37°C)
■ Linearita
Stanovení je lineární do hodnoty koncentrace α –
amylázy odpovídající změně ΔA/min 0,35. Pokud
je tato hodnota překročena, opakujte stanovení
s vzorkem ředěným 10μl vzorku + 1 ml
fyziologického roztoku (NaCl 9g/ l). Výsledek
vynásobte 11.
3.
■ Mez detekce
0,05 μkat/l
CV( %)
■ Korelace

U/l x 0,0167 = μkat/l
SD (U/l)
4.
Likvidace odpadu
Podle místních legislativních nařízení.
Lorentz K. α-Amylase in: Thomas L.
editor, Clinical laboratory diagnostics, 1 st
ed.
Frankfurt:TH-Books
Verlagsgesellschaft ;1998,p.192-202
Moss DW, Henderson AR. Digestive
enzymes of pancreatic origin. In
.
In:Burtis CA, Ashwood ER, editors. Tietz
Textbook of Clinical Chemistry. 3 rd ed.
Philadelphia
:
W.B
Saunders
Company;1999, p.689-98
Kruse-Jarres JD, Kaiser C, Hafkenscheid
JC, Hohenwallner W, Stein W., Bohner J
et al. Evaluation of a new alpha-amylase
assay
using
4,6-ethylidene-(G7)-1,4nitrophenyl-(G1)-alpha-D-maltoheptaosid
as substrate. J Clin Chem Biochem
1989;27;103-13
Hohenwallner W, Stein W, Hafkenscheid
JC, Kruse-Jarres JD, Kaiser C, Hubbuch A
et al. Reference ranges for alpha – amylase
in serum and urine with EPS as substrate. J
Clin Chem Clin Biochem 1989,27, 97-101
04/2011
2
Greiner Diagnostic GmbH – Unter Gereuth 10 – D 79353 Bahlingen – Germany
www.greiner-diagnostic.com