Chybné sbalení a agregace – častá reakce na

Chybné sbalení a agregace –
častá reakce na mutace v genu
pro Cystathionin beta-synthasu
Miroslav Janošík
Ústav dědičných metabolických poruch
1.LF UK
• Deficit cystathionin beta synthasy (CBS)
• CBS mutační databáze
• Misfolding u CBS mutantů
Metabolismus methioninu
Proteiny
Methionine
THF
DMG
MethyleneTHF
S-AdoMet
Betaine S-AdoHcy
Methyl-THF
H2S
Homocysteine
Cystathionine
2Cysteine SO3
Deficit
CBS CBS
SO24
3-Sulfinoalanine L-gamma-glutamylcysteine
Hypotaurine
Taurine
Glutathione
Homocystinurie z deficitu CBS
• výskyt 1:100.000 až 1:330.000
• AR způsob přenosu
• začíná v dětství
• postižení pojiva, cévního systému a CNS
• léčitelné dietou s omezením Met, pyridoxinem,
betainem
• prenatální diagnostika možná
• zvýšená hladina homocysteinu a methioninu
Cystathionin β-synthasa
- charakterizován v r. 1998
- 28 kb, lokalizován na chromosomu 21q22.3
- 23 exonů
- primární transkript ~ 2,6 kbp
Cystathionin β-synthasa
•
•
•
•
280
428
+
Absorbance
0.25
tvoří tetramery / multimer
podjednotka 63 kDa
ligandy: serin, homocystein, PLP, Hem, SAM
aktivovatelná SAMem
0.2
L-serine
0.15
0.1
L-homocysteine
363
0.05
550
H(2)O
0
+
300
350
400
450
Wavelength [nm]
500
cystathionine
Cystathionin β-synthasa
Amino acid
residue
1
40
413
CBS active core
NH2-terminus
Hem
PLP
551
COOH-terminus
AdoMet
CBS mutace v ČR a SK
- privátní charakter
- nejčastější v ČR: I278T a del Ex 12
- 12 mutací / 34 alel
- molekulový efekt mutací studován jen zřídka
E144K
A114V
A155T
E176K
I278T
19insC
C165Y
H65R
del ex.12
W409X
IVS7+1G>A
IVS11+39del99
Počet alel
3
1
3
2
8
3
2
2
7
1
1
1
Σ: 34
CBS mutace celosvětově
Databáze mutací
Proces začlenění nové mutace do databáze
• vložení do formuláře, odeslání a následná kontrola kurátorem
• popis mutace
• CBS aktivita
• biochemická data
• klinický fenotyp
Proces začlenění nové mutace do databáze
• kontrola správnosti dat, vložení do DB v MS Access
Proces začlenění nové mutace do databáze
• export do MySQL a flat file (PERL) již bez osobních údajů
Projekt WayStation
• celosvětová databáze mutací
• příprava od roku 1994
• financování
• jednotný systém DB
• kvalita dat
• etika
Molekulový efekt mutací
- Efekt mutací na úrovni RNA
nonsense mediated decay
- Efekt mutací na úrovni proteinu
aktivní místo
regulace proteinu
sbalování
Poruchy sbalování
• Mutace mohou ovlivnit správné sbalování a stabilitu proteinu
• Misfolding je příčinou více jak 50% genetických onemocnění
• Misfoldované proteiny jsou nestabilní, agregují a jsou rychle
degradovány
• Chaperóny – ovlivňují sbalování proteinů
Perlmutter DH,
Pediatric Research 2002
Poruchy sbalování
• KONFORMAČNÍ NEMOCI
- vzniklé konformačními změnami při sbalování a ustavením
nepřirozeného (ne-nativního) stavu proteinu
- velká tendence agregovat a vytvářet agregáty
• Agregáty
- amorfní či strukturované
- nerozpustné a odolné proti proteolýze
- příčina mnoha nemocí
• Agresom
- výsledek intracelulární/extracelulární akumulace
agregovaných proteinů
E. coli
heme
CBS Ab
10 NC 11 12 13 14 C1
WT
WT 50%
delEx12
I278T
E176K
9
A155T
8
A114V
7
NC
6
WT
5
WT 50%
4
delEx12
3
I278T
2
E176K
1
A155T
A114V
Fibroblasts
Předběžná data
C2
Aggregate
Tetramer
Aggregate
Tetramer
Obecný mechanismus
u homocystinurie
• PORUCHA SKLÁDÁNÍ MUTANTNÍHO
POLYPEPTIDU
• PORUCHA TVORBY TETRAMERU
LZE CHEMICKÝMI ČI MOLEKULOVÝMI CHAPERONY
OVLIVNIT MISFOLDING A AGREGACI CBS MUTANTŮ?
Chemické chaperony
trimethylamine N-oxid, glycerol, betain, 4-phenylbutyrát, sorbitol,
dimethylsulfoxid
Molekulové chaperony
GroES - GroEL, Dna K - Dna J
P. Lund, Molecular Chaperones in the Cell
EFEKT CHAPERONŮ
100%
90%
CBS a ctivity a s % of WT
80%
70%
60%
50%
Normal
Glycerol
TMAO
Heme
P LP
Betain
GroES L
40%
30%
20%
10%
0%
de lEX12
I278T
E176K
A155T
A114V
G85R
G ro E S L
N o rm a l
tetramer
WT
C B S a c tiv ity (% o f W T
aggregate
E176K+GroESL
E176K
E176K MUTANT
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
tetramer
CBS activity (% of WT)
10%
WT
dEx12 + TMAO
dEx12
∆Ex12 MUTANT
8%
6%
4%
2%
0%
0
35
75
TMAO (mM)
150
A114V MUTANT
100%
C B S ac tiv ity (% of W T
80%
60%
40%
20%
0%
-20%
This
study
Heme
PLP
TMAO
Glycerol
Betaine GroES/EL
GFP EXPRESE
GFP
Normální CBS
Mutantní CBS
SOUHRN
• Mutace v genu pro CBS vedou k poruše sbalování
• Nízká teplota exprese zlepšuje správné sbalení
CBS mutantů (11 z 14)
• Chemické a molekulové chaperony stabilizují CBS
v katalyticky aktivní konformaci
• Potenciální terapeutické využití ?
Poděkování
Charles University, 1st Faculty of Medicine,
Institute of Inherited Metabolic Disorders, Prague,
Czech Republic
University of Colorado, Department of Pediatrics,
Health Sciences Center, Denver, CO, USA
Doc. MUDr. Viktor Kožich, CSc.
MVDr. Zorka Novotná
Ing. Bohumila Janošíková. Ph.D.
Ing. Jitka Sokolová
Eva Richterová
Prof. Jan P. Kraus, Ph.D.
Dr. Ken MacLean, Ph.D.
Grantová agentura České Republiky GAČR 305/02/D167
Interní Grantová Agentura University Karlovy GAUK 12/2001
The Wellcome Trust