Biosyntéza NK - Biotrend

OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
1
Kapitoly z bioorganické chemie
OCH/KBCH
RNDr. Lucie Brulíková, Ph.D.
LS 2014/2014
[email protected]
2
4. Biosyntéza a metabolismus NK
Lucie Brulíková
2015
• Holý, A. Principy bioorganické chemie ve vývoji antivirotik a cytostatik, UP Olomouc, 2004
• Blackburn et al. Nucleic Acids in Chemistry and Biology, RSC Publishing, UK, 3rd edition, 2006
• Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Science, New York, 5th edition, 2008
3
Biosyntéza a metabolismus NK
Biosyntéza nukleosidů de novo
Většina živých organizmů není schopna získat dostatečné množství nukleosidů z
potravy, proto v jejich buňkách probíhá de novo syntéza.
Biosyntéza pyrimidinových a purinových nukleosidů se významně liší:
Purinový heterocyklus je postupně vystavěn z 5-fosforibosyl-1-aminu, kdežto u
pyrimidinů nejdříve vznikne báze a ta je potom navázána na ribózu.
Významným zdrojem nukleosidů je i šetřící dráha (salvage pathway - syntéza z bází a
nukleosidů)
mnohem méně energeticky náročné než de novo syntéza
snižují syntézu de novo
substráty: a) báze (adenin, guanin, hypoxanthin); PRDP
b) ribonukleosidy; ATP
4
Biosyntéza NK – pyrimidinová analoga
Carbamoyl
phosphate
aspartate
PRPP
(ribose
phosphate)
UTP
CTP
RNA
TMP
dCTP
DNA
5
Biosyntéza NK – pyrimidinová analoga
V prvním kroku syntézy pyrimidinových nukleosidů de novo dochází ke vzniku
karbamoyl fosfátu. Reakce je katalyzovaná enzymem karbamoylfosfátsyntetasou.
Aminoskupinu poskytuje glutamin, ze kterého při reakci vzniká kyselina glutamová,
zdrojem fosfátu a energie jsou dvě molekuly ATP, při reakci se dále spotřebovává
molekula vody.
Karbamoyl fosfát je velmi reaktivní meziprodukt, který za katalýzy aspartát
transkarbamoylasou kondenzuje s kyselinou asparagovou za vzniku karbamoyl
aspartátu (bez spotřeby ATP).
Následně dojde k dehydrataci na cyklický dihydroorotát, jehož oxidací vzniká
orotát. Oxidace je ireverzibilní a katalyzovaná enzymem
dihydroorotátdehydrogenasou.

6
Biosyntéza NK – pyrimidinová analoga
7
Biosyntéza NK – pyrimidinová analoga
V dalším kroku je orotát navázán na ribózu, která do reakce vstupuje
aktivovaná, jako fosforibosylpyrofosfát (PRPP). Vzniká orotidin-5´-monofosfát
(OMP). Potřebná energie je získávána hydrolýzou PPi, katalyzátorem je enzym
pyrimidinfosforibosyltransferasa.
Následuje dekarboxylace OMP za tvorby UMP, kterou katalyzuje enzym
OMPdekarboxylasa.
Nukleosid monofosfát kinasy následně fosforylují UMP na UDP a UTP.
CTP syntetasa je schopná naaminovat UTP za vzniku CTP, zdrojem dusíku je
glutamin, ze kterého vznikne kyselina glutamová.
8
Biosyntéza NK – pyrimidinová analoga
9
Biosyntéza NK – pyrimidinová analoga
Pro syntézu DNA potřebují živé organizmy vyprodukovat thymidin.
Výchozím nukleotidem pro biosyntézu thymidinu je deoxyuridin monofosfát dUMP.
Methylová skupina pochází z N5,N10-methylentetrahydrofolátu.
Dalším produktem této reakce je dihydrofolát, který musí být následně regenerován.
Nejdříve dochází k redukci dihydrofolátu enzymem dihydrofolátreduktasou s
koenzymem NADPH+H+ a následně je na tetrahydrofolát přenesena methylenová
skupina ze serinu pomocí enzymu serinhydroxymethyltransferasy.
Toto je jediný způsob, kterým živé organizmy syntetizují dTMP a správná funkce
všech složek je tedy nutná pro syntézu DNA během replikace. Nesprávná funkce
thymidylát synthasy může v extrémním případě vést ke smrti z nedostatku thymidinu.
10
Biosyntéza NK – pyrimidinová analoga
11
Enzymy biosyntézy pyrimidinových
nukleotidů a možnost terapeutických cílů
Enzym dihydroorotátdehydrogenasa obsahuje FMN a nehemové Fe. Je
lokalizována na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je reoxidována
chinony. Inhibice dihydroorotátdehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů v Tlymfocytech a tak potlačuje autoimunitní onemocnění revmatoidní arthritidu. Na tomto
principu funguje například v klinice používané léčivo leflunomid. Ostatní enzymy jsou
cytosolární.
Pyrimidinfosforibosyltransferasa je velmi důležitým enzymem, protože se také
podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází, jako jsou uracil a cytosin v tzv.
salvage pathway (viz dál).
Enzym OMPdekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP 2 x 1023 krát a je tak
jedním z nejúčinnějších enzymů vůbec.
Vzhledem k tomu, že řada negativních procesů v organizmu, např. růst tumorů, je
spojen s výrazně rychlejší replikací v nádorové tkáni a tedy i vyšší spotřebou dTTP, je
thymidylátsyntasa důležitým cílem chemoterapeutik. Z protinádorových inhibitorů
thymidylátsynthasy můžeme jmenovat např. 5-fluoruracil. Blokáda syntézy thymidinu
přivodí buňce smrt z jeho nedostatku, přesný mechanizmus účinku bude probrán
12
dále.
Biosyntéza NK – purinová analoga
dATP
ATP
DNA
RNA
IMP
GTP
dGTP
RNA
DNA
13
Biosyntéza NK de novo – purinová analoga
Enzymy:
ribosafosfátpyrofosfátkinasa
1. amidofosforibosyltransferasa
2. GAR synthetasa
3. GAR transformylasa
4. FGAM synthetasa
5. AIR synthetasa
6. AIR karboxylasa
7. SAICAR synthethasa
8. adenylosukcinátlyasa
9. AICAR transformylasa
10. IMP cyklohydrolasa
14
Biosyntéza NK de novo – purinová analoga
Výchozím materiálem je -D-ribosyl-5-fosfát, na který následně enzym
ribosafosfátpyrofosfátkinasou přenese pyrofosfát z molekuly ATP, vzniká 5fosforibosyl--pyrofosfát (PRPP).
V následném reakčním kroku dochází ke vzniku 5-fosforibosyl-1-aminu (PRA).
Do reakce vstupuje PRPP, který je aminován v poloze 1’ pomocí enzymu
glutaminfosforibosylamidotransferasy.
Aminová skupina pochází z glutaminu, do reakce vstupuje molekula vody a
produktem jsou kromě aminované ribózy ještě pyrofosfát a kyselina glutamová.
Zdrojem energie je makroergická vazba pyrofosfát~ribóza. Reakce je formálně
nukleofilní substitucí s SN2 mechanizmem, který se projevuje charakteristickým
Waldenovým zvratem konfigurace na stereogenním centru. Jedná se o kontrolní
krok celé biosyntézy purinových nukleosidů.
15
Biosyntéza NK de novo – purinová analoga
Dále do vznikající molekuly vstupují atomy C-4, C-5 a N-7. Atomy pochází
z molekuly glycinu, ten vytváří peptidovou vazbu s PRA (reaguje amin z PRA a
karboxyl z Gly) a vzniká glycinamidribotid (GAR). Reakce je katalyzována enzymem
GAR syntetasou.
Následuje vstup purinového atomu C-8. Volná aminoskupina GAR je formylována
N10-formyl THF za tvorby formylglycinamidribonukleotidu (FGAR). Reakce je
katalyzována enzymem GAR transformylasou.
Dále je do molekuly inkorporován purinový atom N3. Vstupuje ve formě Gln a
energii dodá štěpení ATP  ADP + Pi. Reakce je katalyzována enzymem FGAM
syntetasou.
Následuje uzavření imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzací se
tvoří 5-aminoimidazolribonukleotid (AIR), energii k tomuto kroku opět dodá
hydrolýza ATP  ADP + Pi; reakci katalyzuje enzym AIRsyntetasa.
C6 atom purinu se do molekuly dostane v následujícím kroku, kterým je reakce
aminoskupiny AIR s HCO3- za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku
karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).
16
Biosyntéza NK de novo – purinová analoga
17
Biosyntéza NK de novo – purinová analoga
Dále do molekuly vstoupí N1 atomu purinu. Nejdříve se vytvoří amidická vazba mezi
aminoskupinou kyseliny asparagové a C6 (který je ve formě karboxylu), energii dodá
hydrolýza ATP  ADP + Pi, meziproduktem je 5-aminoimidazol-4-(Nsukcinylokarboxamid) ribotid (SACAIR), reakce je katalyzována enzymem SAICAR
syntetasou.
Poté se z SACAIR odštěpí fumarát, tato reakce je podobná reakcím, ke kterým
dochází v rámci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4-karboxamidribotid
(AICAR). Enzymem katalyzujícím tento proces je adenylosukcinátlyasa.
Následně je do molekuly zabudován C2 atom purinu. Dochází ke druhé formylaci za
účasti N10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR).
Obě formylace jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové
kyseliny. Eznymem katalyzujícím tuto reakci je AICAR transformylasa.
Hlavním produktem celého tohoto sledu je univerzální meziprodukt syntézy
purinových nukleotidů inosin monofosfát (IMP). Vzniká v posledním kroku cyklizací a
eliminací vody. Zde není nutno štěpit ATP, reakce je katalyzována enzymem IMP
cyklohydrolasou.
18
Biosyntéza NK de novo – purinová analoga
19
Biosyntéza NK de novo – purinová analoga
Inosin monofosfát (IMP) se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí na AMP a
GMP.
AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. Na IMP se nejdřív naváže aspartát, což je
spojeno s hydrolýzou GTP  GDP a Pi. V další reakci se eliminuje fumarát z
adenylsukcinátu za tvorby AMP.
GMP se syntetizuje z IMP také ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje za účasti
NAD+ za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým krokem je vstup dusíku, který
původně pochází z Gln; energii dodá současné štěpení ATP  AMP + PPi .
V B a T lymfocytech, odpovídajících za imunitní odpověď organizmu, je vysoká
aktivita IMP dehydrogenasy vedoucí ke zvýšené tvorbě GMP nutných pro proliferaci.
Produkt plísně, mykofenolová kyselina, tento enzym inhibuje, a proto se využívá jako
imunosupresivum po transplantacích.
20
Biosyntéza NK de novo – purinová analoga
21
Syntéza deoxyribonukleotidů
 Syntéza deoxyribonukleotidů spočívá v redukci 2’-CHOH skupiny ribózy na 2’-CH2
skupinu a probíhá na úrovni difosfátu.
 Enzymem, který reakci katalyzuje je ribonukleotidreduktasa (RNR).
22
Syntéza deoxyribonukleotidů
Redukce má poměrně složitý mechanizmus, který není ještě plně potvrzen.
Předpokládá se, že nejdřív RNR odejme radikál vodíku z atomu C-3’
prostřednictvím svého radikálu cysteinu Cys439, potom dojde k protonaci 2’-OH
skupiny protonem z cysteinového zbytku a následné eliminaci molekuly vody za
vzniku C-2’ karbokationtu. Následuje transfer atomu vodíku z Cys225 na C-2’ a v
molekule RNR se vytvoří disulfidický můstek. Posledním krokem je navrácení
vodíkového radikálu z RNR na C-3’
23
Regulace syntézy nukleotidů
Regulace syntézy nukleotidů probíhá na několika základních úrovních.
Fosforibosylpyrofosfátsyntetasa je inhibována purinovými i pyrimidinovými
nukleosid trifosfáty a difosfáty.
Dále je syntéza jednotlivých nukleotidů regulována zpětnou vazbou.
Hlavním kontrolním krokem v syntéze deoxyribonukleotidů je regulace
nukleosiddifosfátreduktasy (ribonukleotidreduktasy), kterou aktivují nukleosid
trifosfáty a inhibuje jí deoxyadenosin trifosfát (dATP).
24
Katabolismus nukleových kyselin a
nukleosidů
 Většina potravy obsahuje nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny jsou odolné ke
kyselému prostředí žaludku a jsou odbourávány až v tenkém střevě pankreatickými
nukleasami a střevními fosfodiesterasami.
 Iontová povaha nukleotidů jim nedovoluje procházet přes buněčné membrány, a
proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy.
 Nukleosidy jsou ve střevní stěně hydrolyzovány nukleosidasami a
nukleosidfosforylasami:
Nukleosidasa: Nukleosid + H2O  báze + ribosa
Nukleosidfosforylasa: Nukleosid + Pi  báze + ribosa-5-fosfát
 Recyklováno je jen velmi malé množství bází nukleových kyselin z potravy, proto
musí probíhat biosyntéza de novo.
 Ribóza-1-fosfát, jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PNP), je prekurzorem
PRPP.
 Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PNP. Jsou deaminovány
adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na odpovídající deriváty ionosinu,
které jsou dále degradovány až na kyselinu močovou.
 Léčivo pentostatin (deoxycoformycin) je inhibitorem ADA (analog tranzitního stavu)
25
a byl schválen k léčení některých typů leukemií.
Katabolismus nukleových kyselin a
nukleosidů
Odbourávání purinů
Odbourávání purinů hraje důležitou roli v kosterním svalstvu.
Xanthinoxidasa (XO) převádí hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou
kyselinu.
U savců je XO v játrech a v lemu tenkého střeva.
XO je homodimer obsahující FAD a Mo komplex cyklující mezi Mo6+ a Mo4+.
Koncovým akceptorem elektronů je O2 přecházející na H2O2, což je nebezpečná
oxidační sloučenina ihned štěpená katalasou na H2O a O2.
26
27
Katabolismus nukleových kyselin a
nukleosidů
Odbourávání pyrimidinových nukleosidů
 Živočišné buňky degradují pyrimidinové nukleotidy na jejich báze.
 Reakce probíhají přes defosforylace, deaminace a štěpení glykosidových vazeb.
 Vznikající uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně, na rozdíl od
purinových bází.
 Konečnými produkty jsou b-alanin a b-aminoisobutyrát.
 Obě sloučeniny jsou dále převáděny transaminací a aktivací na malonyl-CoA a
methylmalonyl CoA.
 Malonyl CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl CoA je
převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl CoA.
 Produkty degradace pyrimidinových nukleotidů přispívají k energetickému
metabolizmu buňky.
28
29
Odbourávání purinů a pyrimidinů
SOUHRN:
 puriny → NH3, kyselina močová - má antioxidační vlastnosti
(částečně vylučována močí; poruchy: hyperurikémie, dna)
normální hodnoty:
sérum
220 – 420 µmol/l (muži)
140 – 340 µmol/l (ženy)
moč
0,48 – 5,95 mmol/l
 pyrimidiny:
C, U → -alanin, CO2, NH3
T → -aminoisobutyrát, CO2, NH3
30
Hlavní rozdíly metabolismu purinů a pyrimidinů
 tvorba N-glykosidové vazby:
Puriny: v 1. kroku syntézy (syntéza začíná na PRDP)
Pyrimidiny: nejprve se syntetizuje pyrimidinový kruh
 lokalizace biosyntézy:
Puriny: cytoplazma
Pyrimidiny: cytoplazma + 1 enzym v mitochondrii
 produkty odbourávání:
Puriny: kyselina močová (špatně rozpustná v H2O), NH3
Pyrimidiny: CO2, NH3, -AMK (dobře rozpustné v H2O)
31
Šetřící dráha (salvage pathway)
 Při degradaci nukleových kyselin se uvolňují báze adenin, guanin a hypoxanthin.
 V případě, že nejsou dále degradovány, mohou být tyto báze znovu recyklovány
na nukleosidy cestou odlišnou od biosyntézy.
 U savců jsou puriny recyklovány dvěma enzymy:
 adeninfosforibosyl transferasou (APRT) katalyzující reakci: Adenin +
PRPP  AMP + PPi
 hypoxanthinguaninfosforibosyl transferasou (HGPRT) katalyzující reakci:
Hypoxanthin + PRPP  IMP + Ppi a Guanin + PRPP  GMP + Ppi
 S poruchou šetřící dráhy souvisí tzv. Lesch-Nyhamův syndrom – deficit HGPRT
způsobuje akumulaci PRPP u chlapců, což vede k vysoké hladině močové kyseliny
v moči, krvi a tkáních, což souvisí s neurologickými potížemi a agresívním či
destruktivním chováním. V těle se hromadí fosforibosyldifosfát (PRDP), který
nemůže v důsledku mutace vstupovat do syntézy nukleotidů z nukleových bází, což
v těle zvyšuje biosyntézu samotných purinů a konečným důsledkem je hromadění
kyseliny močové v těle – hyperurikémie.
32
Šetřící dráha (salvage pathway)
Šetřící dráha (salvage pathway)
34
Poruchy metabolizmu purinů
 V souvislosti s metabolizmem nukleosidů je asi nejznámějším onemocněním dna,
která je způsobená zvýšenou hladinou kyseliny močové v tělesných tekutinách, ta
krystalizuje ve formě sodné soli a způsobuje záněty kloubů.
 Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené vylučování tohoto produktu
odbourávání purinových bází, dalším může být např. nedostatečnost HGPRT (LeschNyhamův syndrom) vedoucí k nadměrné produkci kyseliny močové z důvodů
akumulace PRPP.
 Dna se léčí podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu, což je strukturní analog
hypoxanthinu.
 XO allopurinol hydroxyluje na alloxanthin, který se pevně naváže na redukovanou
formu enzymu, a tím ho ireverzibilně inhibuje. Jedná se o příklad „suicide inhibitoru“
nebo „mechanism-based“ substrátu.
Časté jsou geneticky podmíněné změny v aktivitách enzymů metabolizmu purinů,
jejichž klinické projevy jsou pestré a nespecifické, např. poškození ledvin, kloubů
(dna), postižení imunitního systému, anémie, nadprodukce kyseliny močové.
Vyskytuje se např. polymorfizmus enzymů, který může způsobit zvýšenou či
sníženou aktivitu, jejímž následkem je hromadění fyziologických či atypických
metabolitů v tkáních nebo tělesných tekutinách, a tím může dojít k poškození
organizmu.
35
Poruchy metabolizmu purinů
Příklady nejběžnějších poruch mohou být:
 deficit hypoxanthin nebo guanin fosforibosyltransferasy (nadprodukce kyseliny
močové, zvýšená syntéza purinů de novo – poškození ledvin, poškození nervového
systému, sebepoškozování)
 deficit adeninfosforibosyltransferasy (tvorba 2,8-dihydroxyadeninu, špatně
rozpustný metabolit, vytváří močové konkrementy (kameny), může dojít až k akutnímu
selhání ledvin)
 deficit xanthinoxidasy (zvýšené vylučováni xanthinu a hypoxanthinu močí)
 deficit/zvýšená aktivita adenosindeaminasy (deficit způsobuje těžký
kombinovaný imunodeficit)
 deficit purinnukleosidfosforylasy (poškození imunitního systému – T lymfocytů)
 deficit myoadenylátdeaminasy (enzymový defekt ve svalech)
 deficit adenylosukcinátlyasy (poškození CNS, retardace)
 zýšená aktivita fosforibosyldifosfátsynthetasy (opožděný vývoj, ataxie,
dysmorfické rysy)
36
Přehled základních enzymů biosyntézy a
katabolizmu nukleových kyselin a jejich
složek, které mohou být cíleny terapeutiky
Enzymy biosyntézy složek NK:
 nukleosiddifosfátreduktasa (NDPreduktasa), někdy se označuje
ribonukleotidreduktasa (RNR) – vznik 2´-deoxyribonukleotidů
 dihydrofolátreduktasa – ovládá AICAR-formyltransferasu
 polyglutamylovatelné inhibitory
 nepolyglutamylovatelné inhibitory typu A – „neklasické“ antifoláty
 thymidylátsynthasa – konverze dUMP na dTMP
 IMPdehydrogenasa – konverze IMP na XMP
jako
Biosyntéza pyrimidinů je cílem antiparazitárních léčiv, u nichž lze využít rozdílů
v biochemických drahách u parazita a u člověka Např. parazit Toxoplasma gondii
(toxoplasmóza) může způsobit oslepnutí, neurologické dysfunkce a u lidí se sníženou
imunitou i smrt. Místem zásahu je karbamoylfosfátsyntetasa II, enzym, který se
strukturou i kineticky liší od savčího. Parazit není schopen využít pyrimidinové báze
hostitele a proto je musí syntetizovat de novo.
37
Přehled základních enzymů biosyntézy a
katabolizmu nukleových kyselin a jejich
složek, které mohou být cíleny terapeutiky
Enzymy katabolismu NK:
 cytidindeaminasa – degradace cytosinových nukleosidů a nukleotidů
 adenosinaminohydrolasa – zahajuje sled degradace nukleosidů adeninu
 adenylátdeaminasa – konverze AMP na IMP
 purinnukleosidfosforylasa – štěpí nukleosidovou vazbu na inosinu a
2´deoxyinosinu za vzniku hypoxanthinu a riboso-alfa-fosfátu, resp. 2-deoxyribosoalfa-fosfátu
 xanthinoxidasa/xanthindehydrogenasa – katalyzuje oxidaci xanthinu na
kyselinu močovou
 uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa – štěpí nukleosidovou vazbu
pyrimidinů za vzniku U nebo T a D-riboso--fosfátu, resp. 2-deoxy-D-riboso-fosfátu
38
Enzymy biosyntézy složek NK
 nukleosiddifosfátreduktasa (NDP-reduktasa)
• hlavní zdroj deoxynukleotidů
• cílový enzym pro nádorovou terapii
• buněčná hotovost dNDP a dNTP je velmi nízká, proto inhibitory této reakce
zasahují především rychle proliferující buňky
• také některé viry (př. některé herpesviry) kódují specifickou virovou NDP
reduktasu
• NDP-reduktasa je čtyřjednotkový enzym, složený ze dvou dimerů, jsou v ní pevně
vázané ionty Fe3+, které stabilizují tyrosinový radikál
39
Enzymy biosyntézy složek NK
 nukleosiddifosfátreduktasa (NDP-reduktasa)
 INHIBITORY
• hydroxymočovina a příbuzné látky
• thiosemikarbazony - Triapine
• hydroxamové kyseliny – Didox, Trimidox
• analoga substrátu – Gemcitabin, Cladribin, DMDC, 2-Fluoro-araA; současně působí
po převedení na trifosfát jako inhibitory DNA nebo RNA pol
NH2
NH2
N
N
HO
S
N
H
NH2
N
H
OH
N
O
HO
N
O F
Didox
N
HO
O
OH
OH F
NH2
H2N
OH
Cladribine, CldA
DMDC
NH2
O
Trimidox
Cl
O
N OH
OH
N
N
HO
Gemcitabine
HO
N
HO
Triapirine
HO
NH2
N
N
O
NH2
N
H
N
OH
N
HO
hydroxymocovina
O OH
NH2
N
N
N
F
N
HO
N
N
Cl
O F
OH
OH
Fludarabine
Clofarabine
40
O
Enzymy biosyntézy složek NK
 IMP-dehydrogenasa
41
Enzymy biosyntézy složek NK
 IMP-dehydrogenasa - mechanismus
O
O
N
HN
H
N
N
Rib-5-P
Enz-Cys
331
N
HN
H
Enz-Cys331
O
N
H
NAD
NADH
N
Rib-5-P
N
HN
N
N
Enz-Cys331
Rib-5-P
IMP
O
N
HN
O
N
H
N
Rib-5-P
XMP
42
Enzymy biosyntézy složek NK
 IMP-dehydrogenasa
anticancer
enzyme specific for transformed cells)
depletion of DNA & RNA precursors
immunosuppressant, prevention
of graft rejection
(suppression of T- and B-cell proliferation)
INHIBITORY
• analoga substrátu a produktů (inosin, IMP, xanthosin, XMP)
• analoga nikotinamidu
• analoga nikotinamidadenindinukleotidu (NAD) a jejich prekurzory
• mykofenolová kyselina a její deriváty
43
Enzymy biosyntézy složek NK
 IMP-dehydrogenasa
O
O
N
O
-O P O
O-
N
NH2
N N
O
O
O
-O P O
O-
Cl
N
N
O
EICAR MP
O
N
N
N
O
O
-O P O
O-
NH2
OH OH
Bredinin MP
Mizoribine MP
Ribavirin MP
N
OH
OH OH
OH OH
O
-O P O
O-
N
NH2
N
O
-O P O
O-
O
N
O
OH OH
OH OH
6-Chloropurine riboside MP
2-Vinylinosine MP
O
N
NH
O
-O P O
O-
NH
N
NH2
O
OH OH
3-Deazaguanosine MP
44
Enzymy biosyntézy složek NK
 IMP-dehydrogenasa
O
O
X
O
-O P O
O-
OH OH
NH2
N
N
X = S, TAD
X = Se, SAD
N
N
O
CH3
SH
SH
OH
OCH3
O
N
CH3
O
N
NH2
X = S, Thiazofurin
X = Se, Selenazofurin
OH
N
NH2
OH OH
N
OH OH
O
OO
O P O P O
O
O-
O
O
X
N
N
H
6-merkaptopurin
N
N
H2N
N
N
H
6-thioguanin
Mycophenolic acid
45
Enzymy biosyntézy složek NK
 dihydrofolátreduktasa
• syntéza dTMP de novo
• jediný zdroj thyminových nukleosidů
46
Enzymy biosyntézy složek NK
O
 dihydrofolátreduktasa
 Inhibitory – antifoláty
N
H
OH
N
N
H2N
N
COOH
N
H
kyselina listová
N
O
OH
H2N
N
COOH
N
H
N
N
N
H
N
H2N
N
N
H
COOH
THF
N
H
O
COOH
N
H
COOH
N
N
N
H2N
COOH
N
H
H
N
OH
COOH
DHF
N
H
O
OH
COOH
N5,N10-methyleneTHF
N
N
H
47
Enzymy biosyntézy složek NK
O
 thymidylatesynthase - inhibitory
HN
O
• jejich účinkem nastává tzv.
„thymineless death“
• použití – cytostatika, antivirotika
(inhibice syntézy DNA, vzácně mají
specifické dThd-synthasy i některé viry)
• INHIBITORY
• analoga substrátu
• klasické antifoláty (omezený
transport, musí být přítomen
specifický transportní systém,
koncová aminokyselina musí být
polyglutamylována, aby vznikla
profarmaka pomalu uvolňující
aktivní látku, jinak probíhá rychlý
eflux)
• neklasické antifoláty (místo
zbytku glutamové kyseliny jiná
elektronegativní skupina)
O
P P O
HN
N
O
O
P O
OH
N
O
OH
dUDP
dUMP
5,10-methyleneTHF
THYMIDYLATE
SYNTHASE
DHF
O
CH3
HN
O
P O
N
O
OH
dTMP
48
Enzymy biosyntézy složek NK
 thymidylatesynthase – inhibitory
• analoga thymidinu
O
O
O
O
CH
CH3
HN
O
F
HN
NH
O
NH
-
thymin
CF 3
HN
5 fluoruracil
O
-
NH
5 trifluormetyhluracil
HN
O
NH
-
5 ethynyluracil
• aktivní metabolit 5-fluoruracilu – 5-fluoruridin monofosfát
O
F
NH
O
HO
P
O
N
O
O
OH
OH
49
Enzymy biosyntézy složek NK
 thymidylatesynthase –
inhibitory
O
HN
O
O
O
HO P O
• inaktivace
thymidylatesynthase
C
CH
N
OH
HO
• příklad mechanismu irreverzibilní vazba s
enzymem
O
C
HN
O
O
O
HO P O
O
CH
CH2THF
C CH
HN
N
Cys198Enz
O
O
O
HO P O
OH
N
Cys198Enz
O
CH2
OH
HO
HO
O
C
HN
CH2
O
O
O
O
HO P O
OH
HO
N
Cys198Enz
C
HN
O
O
HO P O
HCys198Enz
N
OH
HO
50
Enzymy biosyntézy složek NK
 thymidylatesynthase – inhibitory
• 5-fluoruracil
P O
O
O
O
O
OH OH
F
HN
HN
O P P
O
O
F
N
ATP
P O
N
H
O
5FU
N
P P O
O
phosphoribosyl
transferase
F
HN
5-FUTP
O
OH OH
OH OH
5-FUMP
5-FUDP
Incorporation into RNA
NDP
O
HN
THYMIDYLATE
SYNTHASE
INHIBITION
O
O
F
HN
N
O
P O
O
F
N
P P P O
O
F
HN
O
ATP
N
P P O
O
O
OH
OH
OH
5-FdUTP
5-FdUTP
5-FdUDP
Incorporation into DNA
O
F
HN
O
N
HO
O
OH
Floxuridine
5-FUdR
51
Enzymy biosyntézy složek NK
 thymidylatesynthase – inhibitory
• 5-fluoruracil
52
Enzymy katabolismu složek NK
 adenosindeaminasa (adenosinaminohydrolasa)
 katalyzuje hydrolytickou reakci
 adenosin je v organismu produkován ve velikém množství jako hormon, ale uvnitř
buňky je, stejně jako 2´-deoxyadenosin, velmi toxický a jeho přebytek – pokud není
využit zachraňujícím mechanismem – musí být stále odstraňován
NH2
N
N
N
O
HO
HO
O
N
OH
N
HN
N
O
HO
HO
N
OH
53
Enzymy katabolismu složek NK
 adenosindeaminasa (adenosinaminohydrolasa)
• inhibitory – přirozené látky
HO
HO
N
N
N
NH
HO
O
HO
N
HO
N
OH
COFORMYCIN
(Nocardia interforma)
NH
N
HO
HO
OH
ADECYPENOL
(Str.OM3223)
N
NH
HO
O
N
N
HO
Cl
ADECHLORIN
(Actinomadura OMR-37)
54
Enzymy katabolismu složek NK
 adenosindeaminasa (adenosinaminohydrolasa)
• Syntetický inhibitor - Pentostatin
• kombinován s adenosinovými cytostatiky
• působí také jako cytostatikum (misinkorporace do DNA, akumulace adenosinu –
ovlivnění jeho metaboslismu, inhibice methylací – inhibice SAHasy)
HO
N
NH
HO
O
N
N
HO
DEOXYCOFORMYCIN
PENTOSTATIN, dCF
transition state inhibitor
K i ~ 2.5 x10-12M
anticancer activity, approved
for hairy cell leukemia
55
Enzymy katabolismu složek NK
 cytidindeaminasa
 degraduje cytosinové nukleosidy a nukleotidy
 degraduje cytosinová cytostatika, která jsou poměrně široce využívána v chemoterapii
nádorů a leukémií (např. cytosinarabinosid)
 nejčastějším inhibitorem je tetrahydrouridin
 další – zebularin – silný antibakteriální účinek
56
Enzymy katabolismu složek NK
 cytidindeaminasa
 inhibitory
OH
H
HN
HN
N
O
O
HO
HO
O
O
HO
OH
HO
DIAZEPINONE
RIBOSIDE
O
O
HO
N
H
H
H
H
OH
TETRAHYDROURIDINE
HN
HO
OH
N
N
(CH2)n
O
O
HO
OH
CYCLIC UREA
RIBOSIDES
HO
N
OH
ZEBULARINE
57
Enzymy katabolismu složek NK
 uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa – mechanismus
 oba enzymy katalyzují štěpení nukleosidové vazby fosforolýzou za vzniku pyrimidinové
báze a D-riboso-alfa-fosfátu, resp. 2-deoxy-D-riboso-alfa-fosfátu
O
O
HN
O
O
HO
HN
N
HO
O
O
N
H
O
O P OH
HO
OH
HO
OH
OH
Pi
O
O
CH3
HN
O
O
HO
N
CH3
HN
HO
O
O
O
N
H
O P OH
HO
HO
Pi
OH
58
Enzymy katabolismu složek NK
 uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa
 Nežádoucí účinky DEGRADACÍ ÚČINNÉ LÁTKY při terapii pyrimidinovými
nukleosidovými cytostatiky a virostatiky, např. FUdR, BROVUDIN, SORIVUDIN,
IDOXIN, araC, ddC, ...
hlavní typy inhibitorů
TdG (thymindeoxyglukopyranosid)
5-BENZYLPYRIMIDINY
ACYKLONUKLEOSIDY
ANHYDRONUKLEOSIDY
BAU (benzylacyklouridin) – nejvíce prostudovaný, při jeho orálním podání
současně s 5-FU dochází k několikanásobnému zvýšení hladiny uridinu v plasmě
při zachování terapeutického účinku
59
Enzymy katabolismu složek NK
 uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa
URIDINE PHOSPHORYLASE INHIBITORS
ACYCLIC NUCLEOSIDES
O
O
HN
N
O
N
O
HO
HO
O
O
BAU
BBAU
O
O
O
HN
N
O
O
HO
O
HN
N
O
O
HN
O
OH
HO
NH 2
AMBBAU
HMBBAU
O
O
HN
H
N
O
O
HO
O
BBBA
60
Enzymy katabolismu složek NK
 purinnukleosidfosforylasa (PNPasa)
O
O
N
HN
R
N
N
Rf (dRf)
N
HN
R
R = H, NH2
N
N
H
+
Rf(dRf)-1-phosphate
purine salvage
pathway
• enzym katabolismu adenosinu
• štěpí nukleosidovou vazbu – fosforolysa
• přednostním substrátem je inosin a 2´-deoxyinosin vzniklé deaminací adenosinu a
2´-deoxyadenosinu
• může katalyzovat reakce v obou směrech, záleží na systému s jakým je spřažena
• ve spojení s xanthinoxidasou – enzym katabolismu purinů
• ve spojení s hypoxanthin/guaninfosforibosyltransferasou – enzym salvage pathway
61
Enzymy katabolismu složek NK
 purinnukleosidfosforylasa
N
HN
H 2N
N
HN
NH2
N
O
O
O
N
H
N
H2N
N
HN
NH2
N
N
N
H 2N
O
O
HO P O
OH
O
HN
H 2N
O
H
N
HN
N
O
H
N
HN
N
H 2N
H2N
H
N
N
Cl
S
BCX-5
CO2H
N
BCX-34
(severe psoriasis,
cutaneous T cell lymphoma)
O
NH
C
N
HO
O
N
N
NH2
.HCl
N
HN
H2N
N
N
n
HO
HO
OH
P O
OH
62
Enzymy katabolismu složek NK
 purinnukleosidfosforylasa
DERIVÁTY 8-AMINOGUANINU:
O
N
HN
N
N
N
HN
NH2
N
H2N
O
N
HN
NH2
N
H 2N
HO
O
H2 N
NH2
N
N
O
S
HO
OH
DERIVÁTY 9-DEAZAPURINU
H
N
HN
N
O
HO
HO
N
O
I
OH
H
N
HN
HO
O
O
O
O
H
N
HN
H2 N
N
H
N
HN
N
H 2N
N
OH
nejsilnější známý
inhibitor
PELDESINE
BCX-34
63
Enzymy katabolismu složek NK
 purinnukleosidfosforylasa
 analoga ACV-difosfátu
64
Enzymy katabolismu složek NK
 purinnukleosidfosforylasa
• U dětí s dědičnou deficiencí PNPasy se projevuje těžká imunodeficience T-buněk,
zatímco B-buňky si svou aktivitu zachovávají.
• Nedostatečná aktivace T-lymfocytů se projevuje také psoriázou, revmatickou artritidou,
T-buněčnými lymfomy nebo autoimunními stavy.
• Deficience je vyvolaná 2´-deoxyguanosinem, který se v buňkách hromadí, protože může
být rozkládán jedině PNPasou.
• Fosforyluje se na dGTP a zřejmě působí jako allosterický inhibitor
ribonukleosidifosfátreduktasy: poruší se rovnováha mezi deoxynukleosidtrifosfáty v
buněčné hotovosti a tím je narušena syntéza DNA.
65
Enzymy katabolismu složek NK
 purinnukleosidfosforylasa
Mechanismus dGuo toxicity při deficienci PNPasy
Ribosa-5-fosfát + guanin
PNPasa
dGuo
dCyd
dGMP
dCMP
5´-nukleotidasa
deoxycytidin
kinasa
inhibice
dGTP
inhibice
NDP
dNDP
ribonukleosid
difosfát reduktasa
dNTP
66
Enzymy katabolismu složek NK
 Formycin B
 Immucilin H – nejsilnější inhibitory
67