HISTO TYPE SSP Kits - BAG Health Care GmbH

Návod k použití
HISTO TYPE SSP Kits
Low resolution
 0123
Testovací soupravy pro tkáňovou typizaci HLA alel
(třída I. HLA-A, B, C, třída II. HLA-DR, DQ)
na molekulárně genetickém základě
IVD
20 typizací
prealiquotováno a připraveno k použití
KATALOGOVÉ
ČÍSLO
NÁZEV
BAREVNÉ OZNAČENÍ
70721
70731
70741
70751
70891
7098
7102
7103
709010
70903
HISTO TYPE A low
HISTO TYPE B low
HISTO TYPE C low
HISTO TYPE DR low
HISTO TYPE DQB low
HISTO TYPE ABDR
HISTO TYPE ABC
HISTO TYPE DR/DQB
HISTO TYPE DQB high
HISTO TYPE DQB1*03
ČERVENÁ
BÍLÁ
ŽLUTÁ
PURPUROVÁ
BÍLÁ
BÍLÁ
MODRÁ
BÍLÁ
MODRÁ
PURPUROVÁ
OBSAH
1. Popis výrobku
2. Materiál
2.1 obsah souprav HISTO TYPE/DNA-SSP
2.2 další potřebné vybavení a reagencie
2.3 skladování a stabilita
3. Výkonnost testu
4. Provedení testu
4.1 bezpečnost práce a speciální poznámky
4.2 izolace DNA
4.3 amplifikace
4.4 gelová elektroforéza
4.5 dokumentace a interpretace výsledků
5. Varování a bezpečnostní opatření
6. Řešení problémů
7. Literatura
8. Použití in-vitro symbolů (IVD)
2
3
3
3
3
4
5
5
5
5
8
8
9
10
11
12
Verze: 09/2013
1
1. Popis výrobku
Díky metodám PCR (polymerázová řetězová reakce) bylo dosaženo v diagnostice
HLA v poslední době značného pokroku. Sekvenování HLA alel (1) umožnilo jasnou
typizaci s vysokým rozlišením na úrovni DNA a má mnoho výhod oproti klasickým
sérologickým metodám.
Základním materiálem pro práci s HISTO TYPE/ DNA-SSP soupravami je
purifikovaná DNA. Při práci s těmito soupravami je využito SSP (Sequence Specific
Primers) – PCR. (viz. obr. 1) (2,3) Metoda je založena na poznatku, že prodlužování
primerů, a tím i úspěšná PCR je závislé na přesné shodě 3' konců obou primerů
s templátovou DNA. A tedy pouze přesné usazení obou primerů na cílovou sekvenci
vede k získání produktu, který je pak identifikován při gelové elektroforéze.
obr. 1 Princip SSP-PCR
Perfect match Amplification
(specific Allel)
Mismatch
no Amplification
(unspecific Allel)
dokonalé dosednutí primeru
namnožení specifického produktu
nedokonalé nasednutí primeru
amplifikace (namnožení) neproběhne
Složení jednotlivých směsí primerů umožňuje jasnou HLA typizaci pomocí
vyhodnocovacích diagramů a tabulek. Každá typizace je prováděna pomocí určitého
množství (např. 24 nebo 96) prealiquotovaných a vysušených reakčních směsí.
Směsi obsahují i vnitřní amplifikační kontrolu a celkový objem reakce je 10μl.
2
2. Materiál
2.1 obsah souprav HISTO TYPE SSP kits
 20 destiček HISTO TYPE je dostatečných pro 20 HLA typizací. Předkapané,
prealiquotované reakční směsi obsahují specifické primery, vnitřní kontrolu
(specifická pro lidský gen G3PDH) a směs nukleotidů. První reakční směs je
označená šipkou (podívejte se na schéma na str. 6). U některých ze souprav
HISTO TYPE je na poslední pozici kontaminační kontrola (nahlédněte do
pracovního listu a vyhodnocovacího diagramu pro danou soupravu). Číslo
šarže je vytištěno na každém stripu/destičce.
 24 PCR reakčních směsí pro kontaminační kontrolu (pokud souprava
obsahuje kontaminační kontrolu na poslední pozici (viz výše), není přikládána
samostatně).
 10xPCR pufr v množství dostatečném pro 20 typizací.
 Víčka ke stripům nebo folie v množství dostatečném pro 20 typizací.
 Návod k použití, tabulka specifit, vyhodnocovací diagramy a pracovní listy.
2.2 další potřebné vybavení a reagencie
 Taq Polymeráza (5U/μl), (např. HISTO TAQ, kat.č. 70975)
(Nepoužívat Hot-start Taq Polymerázu!)
 BAG EXTRA GENE (doporučujeme) pro extrakci DNA z krve / lymfocytů /
leukocytů. Nebo jiná souprava na DNA izolaci.
 pipety (0,5 – 250 μl)
 sterilní špičky s integrovaným filtrem
 DNA cyklér (např. PTC 200 s vyhřívaným víkem, MJ Research/BioRad);
podívejte se na seznam schválených cyklérů na str. 6

Vybavení pro gelovou elektroforézu
o
o
o
o
o
o

agaróza pro separaci DNA
0,5xTBE pufr (45 mM Tris, 45 mM kyselina boritá, 0,5 mM EDTA)
ethidium bromid (EtBr)
jednotka na gelovou elektroforézu DNA
zdroj napětí (200-300V, 20mA)
DNA délkový standard (kat. č. 7097)
Vybavení pro interpretaci a dokumentaci výsledků
o zdroj UV záření (220-310 nm)
o fotografický přístroj (např. Polaroid) s filmem (např. Polaroid typ 667)
nebo video systém s termálním papírem (např. typ KP65HM-CE)
o případně počítač s vyhodnocovacím softwarem HISTO MATCH (BAG
Health Care) nebo SCORE
2.3 skladování a stabilita
Soupravy jsou dodávány nezmrazené.
Veškeré reagencie skladujte v temnu při -20° C až -80°C.
Datum expirace je uvedeno na každé reagencii a platí i po prvním otevření.
Datum expirace uvedené na obalu soupravy odpovídá reagencii s nejkratší dobou
trvanlivosti.
10xPCR pufr nechte krátce před použitím zcela rozmrazit.
3
3. Výkonnost testu
Uspořádání směsí primerů zaručuje spolehlivou identifikaci HLA-typů (na základě
nejnovějších sekvenčních dat) podle evaluačních diagramů. Aktualizace dat bude
probíhat pravidelně.
Přesnost a reprodukovatelnost specifity každé směsi primerů byla verifikována pro
každou šarži pomocí referenčních vzorků se známými HLA – antigeny. Alely, které
nejsou zahrnuty a/nebo z důvodů jejich vzácného výskytu netestovány, jsou
vyznačeny ve vyhodnocovacích diagramech a tabulkách specifit.
Studie výkonnosti testu byly prováděny s každou soupravou HISTO TYPE SSP s
alespoň 50ti vzorky. Srovnání s výsledky SSP testů jiného výrobce neukázalo žádné
rozdíly.
Hodnocení a kontrola kvality směsí byly provedeny pomocí DNA vzorků, které byly
extrahovány soupravami Extra Gene I nebo Qiagen. Pro testování byla použita
polymeráza HISTO TAQ (kat. č. 70975) nebo Taq Polymeráza od firmy Qiagen.
Hodnověrné výsledky jsou zaručeny při obsahu DNA 50-80 ng na reakční směs.
4
4. Provedení testu
4.1 bezpečnost práce a speciální poznámky
PCR je obzvláště citlivá metoda a měla by být prováděna dobře zacvičenými
pracovníky se zkušenostmi v molekulárně-biologické práci i testování
histokompatibility. Dodržováním transplantačních směrnic a standardů EFI
minimalizujete nebezpečí chybných typizací, obzvláště při neshodě sérologických
a molekulárně-biologických výsledků.
K zabránění kontaminaci a tím i chybným výsledkům je třeba dodržovat následující:
 Při práci používejte rukavice (pokud možno bez pudru).
 Pro každé pipetování berte novou špičku (s integrovaným filtrem).
 Vyhraďte oddělená pracovní místa pro pre-amplifikační (izolace DNA, příprava
reakcí) a post-amplifikační (elektroforéza, dokumentace) část testu. Kde je to
možné, používejte oddělené místnosti.
 Používejte přístroje a nástroje pouze pro jednotlivé části testu a nevyměňujte
je.
4.2 izolace DNA
Pro HLA-SSP typizaci jednoho pacienta je potřeba cca 5-10μg DNA (tj. cca 0,5 ml
krve). Souprava BAG EXTRA-GENE je nejvhodnějším nástrojem k izolaci, neboť
čistá DNA je získána z plné krve v krátkém čase bez použití toxických chemikálií
a rozpouštědel. K získání DNA potřebné kvality jsou dále využitelné také komerční
izolace jako kolonková nebo pomocí např. magnetických částic nebo jiné metody
popsané v literatuře (5) jako je metoda využívající chloroform-triethyl-ammoniumbromid (CTAB) nebo fenol-chloroformová purifikace. Přítomnost heparinu ve vzorku
může blokovat PCR (6). Proto je pro typizaci vhodným materiálem EDTA nebo
citrátová krev. DNA by měla mít index čistoty (poměr extinkcí OD 260/OD280) mezi 1,5–
2,0.
4.3 amplifikace
Veškeré prealiquotované a vysušené reakční směsi obsahují primery specifické pro
danou alelu, stejně jako kontrolní primery a nukleotidy. Dodávány jsou vysušené na
dně reakční zkumavky. Amplifikační parametry jsou nastaveny na celkový objem
reakce 10 μl.
1. Vyjměte odpovídající počet HISTO TYPE HLA-SSP destiček
z -20° C a nechte rozmrazit 10xPCR pufr.
2. Napipetujte MASTERMIX a dobře ho promíchejte
 10xPCR pufr
 roztok DNA
 Taq-polymeráza
 čistá destilovaná voda
Veškeré HISTO TYPE / DNA SSP soupravy pracují se stejným MASTERMIXEM
a ten tedy může být používán se všemi soupravami. Složení MASTERMIXU
závisí na počtu reakčních směsí tak, jak je uvedeno v tabulce 1 (str.6).
V případě, že má být prováděna kontaminační kontrola, připravte MASTERMIX
bez DNA a napipetujte 10μl této směsi do kontaminační kontroly (značeno
červeně). Po té přidejte DNA a rozdělte MASTERMIX do jednotlivých reakčních
zkumavek.
5
Tabulka 1: Složení MASTERMIXU v závislosti na počtu reakčních směsí.
počet
směsí
1
4
8
24
30
32
48
54
56
72
80
96
destil.
H20
7
55
69
194
235
249
360
401
415
540
595
706
10xPCR
pufr
Roztok DNA Taq(25-40 ng/μl)
polymeráza
celkový objem
(5U / μl)
1
8
10
28
34
36
52
58
60
78
86
102
2
16
20
56
68
72
104
116
120
156
172
204
0,08
0,6
0,8
2,2
2,7
2,9
4,2
4,6
4,8
6,2
6,9
8,2
10
80
100
280
340
360
520
580
600
780
860
1020
μl
μl
μl
μl
μl
μl
μl
μl
μl
μl
μl
μl
Množství DNA by mělo být 50-80ng na 1 reakční směs (mix)
pro jiné koncentrace DNA je třeba změnit objem DNA roztoku a H20.
(např. pro 24 reakčních směsí: 28,0 μl DNA roztoku (50 ng/μl) a 222 μl dest.H20)
3. Po smíchání na Vortexu
přidejte okamžitě 10μl této
směsi do předkapaných
reakčních
směsí.
Vyměňujte
špičku
po
každém pipetování. Pevně uzavřete mikrozkumavky víčky. Nedotýkejte se
vnitřní strany víček, ani horních okrajů mikrozkumavek prsty, abyste omezili
kontaminaci na minimum. U cyklérů s těsně uzavíratelnými víčky lze použít
i PCR desky. Lehce sklepněte destičkou dolů, tak aby se MASTERMIX dostal
ke zbytku reagencií na dně mikrozkumavky a rozpustil modrý pelet. Veškeré
PCR reagencie by měly být na dně.
4. Vložte reakční mikrozkumavky do cykléru a upevněte těsně víko, aby se
mikrozkumavky v průběhu PCR neotevřely. Nastavte a spusťte PCR program.
Překrytí minerálním olejem není u cyklérů s vyhřívaným víkem potřeba.
6
Schválené typy cyklérů:
krok programu
první denaturace
denaturace
annealing + extenze
denaturace
annealing
extenze
denaturace
annealing
extenze
teplota
96°C
96°C
68°C
96°C
64°C
72°C
96°C
61 °C
72°C
závěrečná extenze 72°C
čas
5 min.
20 sec.
1min.
20 sec.
50 sec.
45 sec.
20 sec.
50 sec.
45 sec.
počet cyklů PTC 100 / 200 / C1000
1
(MJ Reserch / BioRad)
5
10
15
GeneAmp PCR-System
9600 / 9700
(použijte faktor ohřevu 9600)
(ABI)
Mastercycler epGradient S
(použijte funkci „simulate
Mastercycler gradient“)
(Eppendorf)
5 min. 1
Tprofessional (Biometra)
Při použití cyklérů umožňujících velmi rychlé ohřívání a chlazení doporučujeme
nastavit pomalejší ohřívání a chlazení.
Vzhledem k faktu, že cykléry od různých výrobců se liší svými parametry reakce a
někdy i jednotlivé přístroje jednoho typu mohou být různě kalibrovány, může být
někdy nutné, v případě používání jiného typu cykléru optimalizovat amplifikační
parametry nebo validovat cyklér uživatelem.
K optimalizaci vašeho přístroje postupujte následujícím způsobem:
 Při falešně pozitivních výsledcích (nespecifické proužky, nadbytečné typy):
zvyšujte teplotu annealingu v 1° C krocích.
 Při falešně negativních výsledcích (absence proužků): snižujte teplotu
annealingu v 1° C krocích a/nebo zvyšujte dobu trvání annealingu v 5ti
vteřinových krocích a/nebo zvyšujte dobu trvání denaturace v 5ti vteřinových
krocích.
Doporučujeme používat pouze pravidelně kalibrované cykléry.
Pro kalibraci je velmi vhodný BAG-CyclerCheck (kat.č. 7104).
Testy kontroly kvality byly prováděny na cyklérech PTC-200 resp. C1000 (MJ
Research/BioRad), 9700 (ABI), Mastercycler epGradient S (Eppendorf) a
Tprofessional (Biometra).
7
4.4 gelová elektroforéza
Separace amplifikačních produktů se provádí pomocí gelové elektroforézy na
horizontální agarózovém gelu. Doporučeným pufrem pro elektroforézu je 0,5 x TBE
(45 mM tris, 45 mM kyselina boritá, 0,5 mM EDTA). Koncentrace gelu by měla být
2,0-2,5% agarózy. Před vnesením vzorků nechte gel polymerizovat alespoň 30
minut. Po ukončení amplifikace vyjměte vzorky z cykléru a vneste celý reakční objem
vzorku opatrně do odpovídající jamky v gelu. Dále přidejte 10 μl DNA délkového
standardu, tak aby bylo možno odečíst délku produktů amplifikace. Elektroforetická
separace se provádí při 10-12 V/cm (např. při 20cm vzdálenosti elektrod přibližně
200-240 V) po dobu 20-40 minut. Po ukončení běhu obarvěte celý gel v roztoku
ethidiumbromidu (EtBr) (např. 0,5 μg/ml EtBr ve vodě nebo TBE pufru) po dobu 3040 minut. Jinou možností je přidat EtBr (0,5 μg/ml) do elektroforetického pufru nebo
přímo do gelu. Pokud je to potřeba, lze odstranit přebytečný EtBr z gelu máčením ve
vodě nebo 0,5xTBE po dobu 20-30 minut.
4.5 dokumentace a interpretace výsledků
K zobrazení výsledků prosviťte gel UV transluminátorem (λ=220-310 nm)
a vyfotografujte výsledek vhodným fotografickým přístrojem. Ideálním je digitální
fotografie, ale lze použít i klasický fotoaparát nebo systém Polaroid (film 667) nebo
video systém s termálním papírem (např. typ KP65HM-CE). Nastavte čas a expozici
tak, aby jednotlivé proužky byly vykresleny ostře a stály jasně proti tmavému pozadí
(např. clona 11, expoziční čas 1s).
Pro interpretaci výsledků použijte odpovídající vyhodnocovací diagram, nebo tabulku
specificit (přiloženy samostatně). Pouze proužky s odpovídající délkou fragmentu
(měřeno dle DNA délkového standardu) jsou považovány za pozitivní. Správné délky
jsou uvedeny v tabulkách a vyhodnocovacích diagramech. V každé pozici musí být
při nepřítomnosti specifického proužku přítomna 1070 bp dlouhá vnitřní kontrola. Ve
většině případů je proužek vnitřní kontroly tato v přítomnosti specifického proužku
slabý, nebo zcela chybí! Pro interpretaci špatných výsledků nahlédněte do kapitoly 6
- Řešení problémů.
V kontaminační kontrole by neměl být patrný žádný proužek. Pokud došlo ke
kontaminaci genomickou DNA, bude přítomen proužek o délce 282 bp. Další proužky
se mohou vyskytovat v pozicích 78 bp, 104 bp, 176 bp a 580 bp. V případě
kontaminace amplifikáty budou patrny proužky o délce 78 bp a/nebo 104 bp a/nebo
176 bp a/nebo 282 bp a/nebo 580 bp.
Vyhodnocení může být provedeno s HISTO MATCH (Bag Health Care) nebo
softwarem SCORE.
8
5. Varování a bezpečnostní opatření
Ethidiumbromid je silný mutagen. Při práci s gely nebo roztoky obsahujícími EtBr
používejte rukavice. Postupujte podle návodu a bezpečnostních instrukcí výrobce.
Transluminátor vyzařuje velmi krátkovlnné UV záření, které může spálit kůži a sítnici,
Používejte ochranný UV obličejový štít nebo masku!
Veškerý materiál použitý pro extrakci DNA, tj. krev, tkáně atd. je třeba považovat za
potenciálně infekční. Při práci s biologickým materiálem dodržujte standardní
bezpečnostní
opatření
(nepipetujte
ústy,
používejte
jednorázové
rukavice,
dezinfikujte ruce po ukončení práce).
Veškerý biologický materiál musí být po práci inaktivován (např. autoklávováním).
Stejně tak i veškeré jednorázové pomůcky.
Rozlitý potenciálně infekční materiál musí být odstraněn okamžitě a kontaminovaná
místa očištěna standardním dezinfekčním prostředkem nebo 70% alkoholem.
Materiál použitý k čištění včetně rukavic je třeba inaktivovat před likvidací, (např.
sterilizací v autoklávu).
9
6. Řešení problémů
Problém
žádná amplifikace,
délkový standard viditelný
opakované chyby
v jednotlivých reakčních
liniích (chybí amplifikační
kontrola)
nespecifické amplifikační
produkty, nadbytečné
proužky (žádné proužky
špatné proužky nesmí být
přítomny)
při interpretaci výsledky
ukazují na víc než dvě
specifity
žádné, nebo pouze slabé
proužky, délkový standard
není vidět
pozadí gelu svítí příliš
silně
rozmazané proužky
Možný důvod
DNA kontaminovaná
ihibitory PCR
koncentrace DNA je příliš
vysoká/nízká
chybí enzym nebo je jeho
koncentrace příliš nízká
DNA z heparinizované
krve
špatné amplifikační
parametry
netěsnící reakční
mikrozkumavky, ztráta
vody a změny koncentrace
v průběhu PCR
kontaminace produkty
amplifikace
DNA kontaminována
solemi
příliš vysoká koncentrace
DNA
příliš vysoká koncentrace
enzymu
špatné parametry
amplifikace
kontaminace přenosem
amplifikačních produktů
nová alela
slabé barvení EtBr
Řešení
opakujte izolaci DNA,
použijte jinou metodu
změňte koncentraci DNA,
opakujte izolaci DNA
opakujte PCR, změňte
koncentraci enzymu
opakujte práci s EDTA,
nebo citrátovou krví
optimalizujte amplifikační
parametry (viz 4.3) *
uzavírejte mikrozkumavky
těsně, použijte jiné
mikrozkumavky
příliš dlouhá doba barvení,
příliš vysoká koncentrace
EtBr
elektroforetický pufr je
příliš horký nebo je
spotřebovaný
špatný elektroforetický
pufr
polymerizace Gelu není v
pořádku
máčejte gel ve vodě nebo
v TBE
snižte koncentraci EtBr
snižte napětí
použijte 0,5 x TBE pufr
opakujte test, zajistěte
přesnou práci
opakujte izolaci DNA,
použijte jinou metodu
použijte méně DNA
použijte méně enzymu
optimalizujte amplifikační
parametry (viz. 4.3)*
otestujte typizační směs
bez přidání DNA
zajistěte přesnou práci
opakujte barvení
* Pokud používáte materiál a přístroje tak, jak je zde popsáno, je změna parametrů
amplifikace až tím posledním řešením. Ve většině případů lze vyhodnotit test
odstraněním nadbytečných proužků podle rozdílu v délkách fragmentů.
10
7. Literatura
1. Bodmer, J., 1993. Immunogenetics 37:79-94
2. Olerup, O., Zetterquist H., 1992. Tissue Antigens 39:225-235
3. Olerup, O., Zetterquist H., 1993. Tissue Antigens 41:55-56
4. Lu, Y.H. and Négre, S., 1993. Trends in Genetics 9:297
5. Maniatis et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
New York: Cold Spring Harbour Laboratory
6. Beutler, E. et al., 1990. BioTechniques 9:166
7. Bunce, M., 1995. Tissue Antigens 46:355-367
11
8. Vysvětlení použitých symbolů
teplota skladování
použijte do
viz návod k použití
s
dostatečný pro n testy
CONT
obsah, obsahovat
HLA TYPING
určeno pro: HLA typizaci
IFU
návod k použití
IVD
pouze pro in-vitro použití
LOT
číslo šarže
PCRBUF | 10x
PCR pufr, 10x koncentrovaný
PCRCAP
PCR víčko, uzávěr
PCRFOIL
PCR fólie
PCRPLATE
PCR desky
PCRSTRIP
PCR proužky
REACTIONMIX
reakční směsi
REF
katalogové číslo
WORKSHEET
pracovní list
Návod k použití v jiných jazycích viz
http://www.bag-healthcare.com/en/Diagnostika/Downloads/
BAG Health Care GmbH
Na Hlínách 555/17
182 00 Praha 8
Tel.: +420 286 840 508
Fax: +420 286 840 510
E-mail: [email protected]
www.bag-healthcare.cz
BAG Health Care GmbH
Amtsgerichtsstraße 1-5
35423 Lich / Germany
Tel.: +49 (0) 6404 / 925 - 0
Fax: +49 (0) 6404 / 925 - 250
www.bag-healthcare.com
[email protected]
Auftragsannahme/Ordering:
Tel.: +49 (0) 6404 / 925 - 450
Fax: +49 (0) 6404 / 925 - 460
[email protected]
Customer Service:
Tel.: +49 (0) 6404 / 925 - 125
Fax: +49 (0) 6404 / 925 - 421
[email protected]
12