2. - Základy biochemie

Základy biochemie KBC / BCH
Metabolismus nukleotidů
Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu
CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem
a státním rozpočtem České republiky.
Metabolismus nukleotidů
2
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Osnova
Syntéza purinových ribonukleotidů
Syntéza adeninových a guaninových ribonukleotidů
Kontrola biosyntézay purinových nukleotidů
Recyklace purinů
Syntéza pyrimidinových nukleotidů
Syntéza uridinmonofosfátu
Syntéza uridintrifosfátu a cytidintrifosfáttu
Kontrola biosyntézy pyrimidinových nukleotidů
Tvorba deoxyribonukleotidů
Tvorba deoxyribos
Tvorba thyminu.
Odbourávání nukleotidů
Katabolismus purinů
Dráha močové kyseliny
Katabolismus pyrimidinů
Struktura purinu a pyrimidinu
N
1
2
6
3
N
5
7
4
9
N
Purin
3
N
8
5
6
N
4
1
3
2
N
H
Pyrimidin
Ribosa a 2-deoxyribosa
HO
5´
CH2
4´
H
O
H
3´
OH
Ribosa
4
OH
H
2´
OH
1´
OH
HO
5´
CH2
4´
H
OH
O
H
3´
OH
H
2´
H
2´-Deoxyribosa
1´
OH
β-N-glykosidová vazba. Ve vazbě je uhlík C1´.
NH2
N
β-N-Glykosidová
vazba
HO
CH2
N
O
H
H
H
OH
OH
5
OH
N
N
Ribonukleotid a deoxyribonukleotid
Nukleosid je pouze báze a pentosa vázaná N-glykosidovou vazbou.
2-
O 3P O
Báze
5´
CH2
4´
H
HO
O
H
3´
OH
H
2´
OH
5´-Ribonukleotid
6
1´
OH
Báze
5´
CH2
4´
O
H
H
2-
O 3P O
3´
H
2´
1´
OH
H
3´-Deoxyribonukleotid
Názvy a zkratky bází nukleových kyselin, nukleosidů a nukleotidů
Strukturní
vzorec
NH2
N
N
N
N
X
O
H
N
N
H2N
N
N
X
NH2
N
N
O
X
O
H
N
N
O
X
O
H
7
O
CH3
N
N
dX
Báze
(X = H)
Nukleosid
(X = ribosa, 2´-deoxyribosa)
Nukleotid
(X = ribosafosfát, 2´-deoxyribosafosfát)
Adenin
Adenosin
Adenylová kyselina
Ade
Ado
Adenosinmonofosfát
A
A
AMP
Guanin
Guanosin
Guanosylová kyselina
Gua
Guo
Guanosinmonofosfát
G
G
GMP
Cytosin
Cytidin
Cytidylová kyselina
Cyt
Cyd
Cytidinmonofosfát
C
C
CMP
Uracil
Uridin
Uridylová kyselina
Ura
Urd
Uridinmonofosfát
U
U
UMP
Thymin
Deoxythymidin
Deoxythymidylová kyselina
Thy
dThd
Deoxythymidinmonofosfát
T
dT
dTMP
Biosyntéza purinových ribonukleotidů
• Nukleotidy jsou fosforečné estery pentos (ribosy nebo
deoxyribosy) ve kterých je purinová nebo pyrimidinová báze
vázána na uhlík C1´sacharidu.
• V roce 1948 John Buchanan dělal pokusy s holuby, které krmil
různými izotopy značenými sloučeninami
a zjišťoval pozici
značených atomů ve vylučované močové kyselině.
• Buchananovy závěry:
HCO 3
Aminoskupina
aspartátu
Formiát
8
N
C
C
1
2
6
3
N
5
4
Glycin
N
C
7
C
9
8 C
N
H
Amidoskupina
glutaminu
Formiát
Schéma biosyntézy IMP, ATP, GTP, dATP a dGTP
CO2
Aspartát
N
N 10-Formyltetrahydrofolát
C
Glutamin
C
1
2
6
3
N
5
4
Glycin
N
C
7
C
9
N 10-Formyltetrahydrofolát
8 C
N
Glutamin
ribosa-P
Struktura
purinového kruhu
IMP
9
ATP
GTP
RNA
dATP
dGTP
DNA
Inosinmonofosfát (IMP) – prekurzor AMP a GMP.
O
N
HN
O
O
-
P
O
-
N
N
O
Hypoxanthin
O
H
H
H
OH
OH
OH
Inosinmonofosfát (IMP)
10
Jednotlivé kroky biosyntézy inosinmonofosfátu
•
•
•
•
•
•
•
11
1. Výchozím materiálem je produkt pentosafosfátové dráhy α-D-ribosa5-fosfát, která se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP).
2. Vstup atomu N9 purinu reakcí PRPP s Gln. Dochází k inverzi
konfigurace na β. Kontrolní krok biosyntézy – současná hydrolýzy PPi !!
Vznik β-5-fosforibosylaminu (PRA).
3. Vstup purinových atomů C4, C5 a N7. Atomy vstupují ve formě Gly na
PRA a tvorby glycinamidribotidu (GAR).
4. Vstup purinového atomu C8. Volná aminoskupina GAR je formylována
N 10-formyl THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR).
5. Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě Gln za účasti ATP →
ADP + Pi.
6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzace za
účasti ATP tvoří 5-aminoimidazolribotidu (AIR).
7. Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3- za katalýzy AIR
karboxylasy a vzniku karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).
Jednotlivé kroky biosyntézy inosinmonofosfátu (IMP)
•
•
•
•
•
•
12
8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti
ATP → ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid)
ribotidu (SACAIR).
9. Odštěpení fumarátu z SACAIR. Podobná reakce reakci močovinového
cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAR).
10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá formylace za účasti N 10-formyl THF a
tvorby 5-formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato
reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy paminobenzoové kyseliny !!
11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není
nutné ATP.
Poznámka: U živočichů jsou reakce 10 a11 katalyzovány bifunkčními
enzymy, stejně jako reakce 7 a 8. Reakce 3, 4 a 6 probíhají na
jednoduchém proteinu. Meziprodukty multifunkčních enzymů nejsou
uvolňovány do prostředí, ale posouvány tunely k dalšímu enzymu.
Podobná situace je u pyruvátdehydrogenasového komplexu, synthasy
mastných kyselin, synthasy glutamátu a tryptofansynthasy.
1. Výchozím sloučeninou je produkt pentosafosfátové dráhy
α-D-ribosa-5-fosfát, která se aktivuje ATP
na 5-fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP).
2-
CH2
O 3P O
H
O
H
α
H
OH
H
OH
OH
α-D-Ribosa-5-fosfát
(R5P)
ATP
1
Ribosafosfátpyrofosfátkinasa
AMP
2-
O 3P O
CH2
H
O
H
H
O
H
OH
13
α O
OH
P
O
-
O
O
P
O
5-Fosforibosyl-α-pyrofosfát
(PRPP)
-
O
-
2. Vstup atomu N 9 purinu reakcí PRPP s Gln.
Dochází k inverzi konfigurace v poloze 1´na β.
Kontrolní krok biosyntézy – současná hydrolýzy PPi !!
Vznik β-5-fosforibosylaminu (PRA).
2-
O 3P O
CH2
H
O
H
-
α O
H
H
P
O
OH
O
OH
O
O
P
-
O
O
5-Fosforibosyl-α-pyrofosfát
(PRPP)
Glutamin + H2O
2
Amidofosforibosyltransferasa
Glutamát + PPi
2-
O3P O
CH2
NH2
O
H
H
H
H
OH
14
β
OH
β-5-Fosforibosylamin
(PRA)
3. Vstup purinových atomů C4, C5 a N7.
Atomy vstupují ve formě Gly na PRA a tvorby glycinamidribotidu (GAR).
2-
CH2
O 3P O
NH2
O
H
β
H
H
H
OH
OH
β-5-Fosforibosylamin
(PRA)
Glycin + ATP
3
GAR synthetasa
ADP + Pi
CH2
O
2-
O3P O
CH2
C
NH
O
H
H
H
H
OH
15
β
OH
Glycinamidribotid
(GAR)
NH2
4. Vstup purinového atomu C8.
Volná aminoskupina GAR je formylována N10-formyl THF za tvorby
formylglycinamidribotidu (FGAR).
CH2
O
2-
O 3P O
CH2
NH2
C
NH
O
H
H
H
β
H
OH
OH
Glycinamidribotid
(GAR)
N 10-Formyl-THF
4
GAR transformylasa
THF
H2C
O
C
H
N
NH
CH
O
ribosa-5-fosfát
16
Formylglycinamidribotid
(FGAR)
5. Vstup purinového atomu N3.
Vstupuje ve formě Gln za účasti ATP → ADP + Pi.
H2C
O
C
H
N
NH
CH
O
ribosa-5-fosfát
Formylglycinamidribotid
(FGAR)
ATP + Glutamin + H2O
5
FGAM synthetasa
ADP + Glutamát + Pi
H2C
HN
C
H
N
NH
CH
O
ribosa-5-fosfát
17
Formylglycinamidinribotid
(FGAM)
6. Tvorba imidazolového kruhu purinu.
Intramolekulární kondenzace za účasti ATP tvoří 5-aminoimidazolribotidu
(AIR).
H2C
HN
C
H
N
CH
NH
O
ribosa-5-fosfát
Formylglycinamidinribotid
(FGAM)
ATP
6
AIR synthetasa
ADP + Pi
HC
H2N
C5
N
CH
N
ribosa-5-fosfát
18
5-Aminoimidazolribotid
(AIR)
7. Vstup C6 atomu purinu.
Vstupuje jako HCO3- za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku
karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).
N
HC
H2N
C
5
CH
N
ribosa-5-fosfát
5-Aminoimidazolribotid
(AIR)
ATP + HCO3-
-
7
AIR karboxylasa
ADP + Pi
OOC
H2N
C4
C5
N
CH
N
ribosa-5-fosfát
19
Karboxyaminoimidazolribotid
(CAIR)
8. Vstup N1 atomu purinu.
Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP → ADP + Pi a tvorby
5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid) ribotidu (SACAIR).
-
OOC
H2N
C4
C
5
N
CH
N
ribosa-5-fosfát
Karboxyaminoimidazolribotid
(CAIR)
Aspartát + ATP
8
SAICAIR synthetasa
ADP + Pi
COO
HC
-
NH
O
C
CH2
COO
-
H2N
C4
C
5
N
CH
N
ribosa-5-fosfát
20
5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid
(SAICAIR)
9. Odštěpení fumarátu z SACAIR.
Reakce podobná reakci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4karboxamidribotid (AICAR).
COO
HC
-
NH
O
C
CH2
COO
-
H2N
C4
C5
N
CH
N
ribosa-5-fosfát
5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid
(SAICAIR)
9
Fumarát
Adenylosukcinátlyasa
O
H2N
C
H2N
C4
C5
N
CH
N
ribosa-5-fosfát
21
5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid
(AICAIR)
10. Vstup C2 atomu purinu.
Druhá formylace za účasti N 10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány
sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové kyseliny !!
O
C
H2N
H2N
C4
C5
N
CH
N
ribosa-5-fosfát
5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid
(AICAIR)
N 10-Formyl-THF
10
AICAR Transformylasa
THF
O
H2N
O
22
CH
C
N
H
C4
C
5
N
CH
N
ribosa-5-fosfát
5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid
(FAICAIR)
11. Cyklizace za tvorby IMP.
Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není nutné ATP.
O
C
H2N
O
CH
N
C4
C
N
H
CH
5
N
ribosa-5-fosfát
5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid
(FAICAIR)
11
H2O
O
C
HN
HC
2-
O 3P O
IMP cyklohydrolasa
N
H
C4
C
5
CH
N
O
H
H
OH
OH
23
N
OH
Inosin-5´-monofosfát
(IMP)
Biosyntéza adeninového a guaninového ribonukleotidu
•
•
•
24
IMP se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí na AMP a GMP.
AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. Na IMP se naváže Asp, což je
spojeno s hydrolýzou GTP → GDP a Pi. V další reakci se eliminuje fumarát
z adenylsukcinátu za tvorby AMP.
GMP se syntetizuje z IMP také ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje
za účasti NAD+ → NADH za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým
krokem je vstup amidodusíku Gln za účast ATP → AMP + PPi a tvorby
GMP.
Poznámka: V B a T lymfocytech,
odpovídajících
za
imunitní
odpověď organismu, je vysoká
aktivita
IMP
dehydrogenasy
vedoucí ke zvýšené tvorbě GMP
nutných pro proliferaci. Produkt
plísně, mykofenolová kyselina,
tento enzym inhibuje a využívá se
jako
imunosupresivum
po
transplantacích !!
O
CH3
OH
OH
O
OCH3
CH3
Mykofenolová kyselina
O
První krok biosyntézy AMP a GMP
O
H
N
N
N
Aspartát + GTP
GDP + Pi
-
OOC
CH2
CH
N
ribosa-5-fosfát
Inosin-5´-monofosfát
(IMP)
Adenylosukcinátsynthetasa
COO
-
IMP dehydrogenasa
NAD+ + H2O
NADH + H+
NH
O
N
N
N
N
ribosa-5-fosfát
Adenylosukcinát
25
H
O
N
N
N
H
N
ribosa-5-fosfát
Xantosin-5´-monofosfát
(XMP)
Druhý rok biosyntézy AMP a GMP
-
OOC
CH2
CH
COO
-
NH
N
N
O
N
H
N
O
ribosa-5-fosfát
Adenylosukcinát
Fumarát
Adenylosukcinátlyasa
N
ribosa-5-fosfát
26
N
H
ribosa-5-fosfát
Xantosin-5´-monofosfát
(XMP)
Glutamin + ATP + H2O
GMP synthetasa
O
N
N
N
Glutamát + AMP + PPi
NH2
N
N
N
Adenosin-5´-monofosfát
(AMP)
H
H2N
N
N
N
H
N
ribosa-5-fosfát
Guanosin-5´-monofosfát
(GMP)
Biosyntéza nuklosiddifosfátů a nukleosidtrifosfátů
•
Pro
vstup
nukleotidů
do
nukleových
kyselin,
musí
nukleosidmonofosfáty převedeny na odpovídající trifosfáty.
•
Převedení na nukleosiddifosfáty: Nukleosidmonofosfátkinasy.
•
•
Např. adenylátkinasa –
Podobně guanylátkinasa –
•
Nukleosiddifosfáty
jsou
nukleosiddifosfátkinasou.
AMP + ATP ↔ 2 ADP
GMP + ATP ↔ GTP + ADP
převáděny
na
GDP + ATP ↔ GTP + ADP
27
být
nukleosidtrifosfáty
–
Regulace biosyntézy purinových nukleotidů
•
Dvě hladiny regulace.
•
A) Rychlost tvorby IMP je nezávisle, ale synergicky kontrolována
hladinou adeninových a guaninových nukleotidů. Vysoká hladina
nukleotidů inhibuje syntézu IMP.
•
B) Místo regulace je za místem syntézy IMP. Rychlost syntézy GTP se
zvyšuje s koncentrací [ATP], zatímco rychlost syntézy AMP s rostoucí
koncentrací [GTP].
28
Schéma regulace biosyntézy purinových nukleotidů
Ribosa-5-fosfát
PRPP
INHIBICE
AKTIVACE
5-Fosforibosylamin
IMP
Adenylosukcinát
29
XMP
AMP
GMP
ADP
GDP
ATP
GTP
Recyklace purinových nukleotidů
•
Při obměně nukleových kyselin se uvolňují báze adenin, guanin a
hypoxanthin a ty jsou recyklovány cestou odlišnou od biosyntézy.
•
•
U savců jsou puriny recyklovány dvěma enzymy:
Adeninfosforibosyltransferasa (APRT) katalyzující reakci:
Adenin + PRPP ↔ AMP + PPi
•
Hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa (HGPRT) katalyzující reakci:
Hypoxanthin + PRPP ↔ IMP + PPi
Guanin + PRPP ↔ GMP + PPi
•
30
Lesch-Nyhamův syndrom – deficit HGPRT, akumuluje se PRPP, u chlapců,
vysoká hladina močové kyseliny v moči, spojeno s neurologickými potížemi,
agresívní a destruktivní chování.
Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů
•
31
Biosyntéza pyrimidinů je podstatně jednodušší než purinů. Čtyři atomy
pyrimidinu jsou z Asp, jeden C2 má původ v CO2 a dusíkový atom N3 je z
amidu Gln. Produktem biosyntézy je uridinmonofosfát (UMP), který je
prekurzorem cytidinmonofosfátu (CMP).
Aminoskupina
glutaminu
N
HCO3-
C
C
5
6
4
1
N
3
2
C
C
Aspartát
Biosyntéza uridinmonofosfátu (UMP)
•
•
•
•
•
32
Syntéza UMP je šestistupňová. Na rozdíl od biosyntézy purinů je
pyrimidinový kruh syntetizován samostatně a poté připojen k ribosa-5fosfátu.
1. Syntéza
karbamoylfosfátu.
Cytosolární
enzym
karabmoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z
HCO3a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP. Srovnej s
močovinovým cyklem.
2. Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp
za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP !
3. Uzavření kruhu za tvorby dihydroorotátu.
4. Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym
dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové Fe a je
lokalizován na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je
reoxidován chinony. Ostatní enzymy jsou cytosolární. Inhibice
dihydroorotátdehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů v T
lymfocytech a tak potlačuje autoimunitní onemocnění rheumatoidní
arthritidu.
Biosyntéza uridinmonofosfátu
•
5. Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin5´-monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym:
orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatních
pyrimidinových bází jako jsou uracil a cytosin.
•
6. Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa
(ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023 – jeden z
nejúčinnějších enzymů vůbec !!
•
Poznámka: Biosyntéza pyrimidinů je cílem antiparasitických léčiv. Např.
parazit Toxoplasma gondii (toxoplasmosa) způsobuje oslepnutí,
neurologické dysfunkce a u lidí se sníženou imunitou i smrt. Místem
zásahu je karbamoylfosfátsynthetasa II, enzym, který se strukturou i
kineticky liší od savčího. Parazit není schopen využít pyrimidinové báze
hostitele a proto je musí syntetizovat de novo.
33
1. Syntéza karbamoylfosfátu.
Cytosolární enzym karabmoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je
syntetizován z HCO3- a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP.
2 ATP + HCO3- + Glutamin + H2O
1
Karbamoylfosfátsynthetasa II
2 ADP + Glutamát + Pi
NH2
O
C
O
2-
PO3
Karbamoylfosfát
34
2. Syntéza karbamoylaspartátu.
Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy
aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP !
NH2
O
C
O
2-
PO 3
Karbamoylfosfát
Aspartát
2 Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa)
Pi
O
C
HO
NH2
O
35
C
N
H
CH2
CH
COO
Karbamoylaspartát
-
3. Uzavření kruhu za tvorby dihydroorotátu.
O
C
HO
NH2
O
C
N
H
CH2
CH
COO
-
Karbamoylaspartát
3
Dihydroorotasa
H 2O
O
HN
O
C
C
N
H
CH2
CH
COO
Dihydroorotát
36
-
4. Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym
dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové Fe a je
lokalizován na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je
reoxidován chinony. O
HN
O
C
C
N
H
CH2
CH
COO
-
Dihydroorotát
Chinon
4 Dihydroorotátdehydrogenasa
Chinol
O
HN
O
37
C
C
N
H
CH
C
Orotát
COO
-
5. Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym:
orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatních
pyrimidinových bází jako jsou uracil a cytosin.
O
C
HN
C
O
CH
C
N
H
COO
-
Orotát
PPRP
5 Orotátfosforibosyltransferasa
O
PPi
HN
2-
O 3P O
C
O
CH2
O
H
H
N
CH
C
β
H
H
OH
38
C
OH
Orotidin-5´-monofosfát
(OMP)
COO
-
6. Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa
(ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023 – jeden z nejúčinnějších
O
enzymů vůbec !!
HN
2-
O 3P O
C
O
CH2
C
N
O
H
CH
C
COO
-
β
H
H
H
OH
OH
Orotidin-5´-monofosfát
(OMP)
6
OMP dekarboxylasa
CO2
O
HN
2-
O 3P O
C
O
CH2
O
H
H
CH
N
CH
β
H
H
OH
39
C
OH
Uridin-5´-monofosfát
(UMP)
Syntéza uridintrifosfátu (UTP) a cytidintrifosfátu (CTP)
•
Enzymy:
nuklosidmonofosfátkinasa
a
nukleosiddifosfátkinasa
analogie syntézy purinových nukleotidtrifosfátů.
UMP + ATP ↔ UDP + ADP
UDP + ATP ↔ UTP + ADP
•
CTP se tvoří aminací UTP CTP synthasou. U živočichů je donorem
aminoskupiny Gln u baktérií přímo NH3.
O
H
O
-
O
-
P
O
40
O
O
P
O
-
O
O
P
O
O
UTP
CH2
H
N
O
-
N
O
H
H
H
H
OH
NH2
OH
Glutamin
+ ATP + H2O
Glutamát
+ ADP + Pi
-
-
O
O
-
P
O
O
P
O
O
-
O
O
O
P
N
O
O
CTP
CH2
N
O
H
H
H
H
OH
OH
Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů - inhibice zpětnou
BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U BAKTERIÍvazbou.
BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U ŽIVOČICHŮ
(E. coli)
HCO3- + Glutamin + ATP
HCO3- + Glutamin + ATP
AKTIVACE
Karbamoylfosfát
Karbamoylfosfát
AKTIVACE
Karbamoylaspartát
Karbamoylaspartát
Dihydroorotát
Dihydroorotát
Orotát
Orotát
PRPP
PRPP
INHIBICE
INHIBICE
OMP
OMP
UMP
UMP
UDP
UDP
UTP
UTP
CTP
CTP
41
Biosyntéza deoxyribonukleotidů
•
Deoxyribonukleotidy jsou syntetizovány z odpovídajících ribonukleotidů
redukcí pozice 2´. Katalyzují allosterické enzymy ribonukleotidreduktasy
(RNR). Substrátem je nukleotiddifosfát, reakce je radikálová a RNR je
udržována v redukovaném stavu thioredoxinem. Po redukci je dNDP
fosforylovcán ATP na dNTP.
-
-
O
-
P
O
O
P
O
O
H
H
H
H
OH
OH
-
-
P
O
Báze
O
O
O
O
NDP
42
-
Báze
O
O
O
P
O
O
O
H
H
H
dNDP
H
OH
H
Biosyntéza deoxythymidinmonofosfátu.
•
Deoxythymidinmonofosfát (dTMP), součást DNA, je syntetizován
methylací dUMP. dUMP je generován hydrolýzou dUTP:
dUTP + H2O → dUMP + PPi
•
Vytvořený dTMP je ihned fosforylován na dTTP ! Tyto dvě reakce
spotřebovávající energii jsou nutné jako prevence vstupu dUTP do DNA.
Enzymový systém katalyzující syntézu DNA z dNTP efektivně
nerozlišuje mezi dUTP a dTTP.
•
Vlastní methylace dUMP: Enzym thymidylátsynthasa a nositel methylu
N 5, N 10 –methylentetrahydrofolát (N 5, N 10 –methylen-THF).
•
Poznámka: Přenášená methylenová skupina, mající oxidační stav
formaldehydu, je redukována na methyl (oxidační stav methanol) na úkor
oxidace THF na dihydrofolát (DHF).
43
Schéma methylace dUMP na dTMP
O
H
O
N
C
C
6C
5
N
C
+
H
H
H
N
N
H2N
H
8
N
5
O
N
C
N
C
C
+
H
H
H
N
N
H2N
CH3
N
CH2
N
CH2
NH
O
dTMP
R
Dihydrofolát
O
44
N
R
dRibosa-5-fosfát
R =
10
H2C
O
C
9 CH2
N 5,N 10-Methylentetrahydrofolát
dUMP
H
H
6
N
O
dRibosa-5-fosfát
7 CH2
C
H
N
COO
CH
-
O
CH2
CH2
C
-
O ; n = 1-6
n
Regenerace N 5, N
10
–methylentetrahydrofolátu
Dihydrofolátreduktasa (DHFR) (FdUMP = fluordeoxyuridinmonofosfát)
dUMP
FdUMP
dTMP
Thymidylátsynthasa
N 5,N 10-Methylen-THF
H3N
+
CH2
COO
NADPH + H+
-
Dihydrofolátreduktasa
Glycin
Serinhydroxymethyltransferasa
H3N
45
DHF
+
CH COO
CH2OH
Serin
THF
-
NADP+
Methotrexát
Aminopterin
Trimethoprim
Inhibice thymidylátsynthasy nebo dihydrofolátreduktasy –
terapie rakoviny.
•
Tvorba dTTP je kritický proces pro rychle
proliferující buńky jako jsou rakovinné. Přerušení
syntézy dTTP vede k jejich zániku. Normální
buňky, kromě buněk kostní dřeně, imunitního
systému, kartáčového lemu střev a vlasových
uzlíků, jsou na tyto zásahy méně citlivé.
O
H
-
O
-
O
•
46
5-Fluordeoxyuridylát (FdUMP) je ireversibilní
inhibitor thymidylátsynthasy. FdUMP se váže na
thymidylátsynthasu jako dUMP. Při vlastní
methylaci nelze odštěpit F (F+) stejně jako H+ a
enzym je tak svázán v inaktivním kovalentním
ternárním komplexu enzym-FdUMP-THF. Takové
inhibitory nazýváme mechanism-based inhibitors
nebo také suicide substrates (sebevražedné
substráty).
P
O
N
C
O
O
C
N
O
H
H
OH
H
OH
H
5-Fluorodeoxyuridylát
(FdUMP)
C
C
F
H
Inhibice dihydrofolátreduktasy. Blokuje se regenerace THF.
Antifoláty, DHF analoga, se váží na DHFR 1 000 x pevněji než DHF.
H2N
H
N
N
H
N
CH2
N
O
CH2
NH2
C
N
H
N
COO
CH
R
R = H
Aminopterin
R = CH3
Methotrexát (amethopterin)
OCH3
H2N
N
OCH3
N
CH2
NH2
47
Trimethoprim
OCH3
-
CH2
CH2
COO
-
Odbourávání (katabolismus) nukleotidů
•
Většina potravy obsahuje nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny jsou
intaktní ke kyselému prostředí žaludku a jsou odbourávány až v tenkém
střevě pankreatickými nukleasami a střevními fosfodiesterasami.
Iontová povaha nukleotidů jim nedovoluje procházet přes buněčné
membrány a proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy. Nukleosidy jsou ve
střevní stěně hydrolyzovány nukleosidasami a nukleosidfosforylasami:
Nukleosidasa: Nukleosid + H2O → báze + ribosa
Nukleosidfosforylasa: Nukleosid + Pi → báze + ribosa-5-fosfát
•
•
•
48
Recyklováno je jen velmi malé množství bází nukleových kyselin z
potravy – musí probíhat biosyntéza de novo.
Ribosa-1-fosfát jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PNP) je
prekurzorem PRPP.
Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PNP. Jsou
deaminovány adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na
odpovídající deriváty ionosinu, které jsou dále degradovány.
Schéma katabolismu purinových nukleotidů 1. část
NH2
O
N
N
AMP deaminasa
N
N
H2O
H
O
N
NH4+
N
Ribosa-5-fosfát
N
O
H2O
Nukleotidasa
H
N
N
H2N
H
Ribosa-5-fosfát
Adenosindeaminasa
NH4+
Nukleotidasa
Inosin
Pi
Ribosa-1-P
H2O
N
N
H
Ribosa-5-fosfát
Xanthinoxidasa
GMP
Nukleotidasa
H2O
Nukleotidasa
Pi
Pi
Xanthosin
Guanosin
Pi
Purinnukleosidfosforylasa
(PNP)
Ribosa-1-P
Hypoxanthin
N
N
XMP
Pi
H2O
49
N
N
IMP
Pi
Adenosin
H
Ribosa-5-fosfát
AMP
H2O
N
O
Pi
Purinnukleosidfosforylasa
(PNP)
Ribosa-1-P
Xanthin
Guanindeaminasa
Purinnukleosidfosforylasa
(PNP)
Guanin
Schéma katabolismu purinových nukleotidů 2. část
Hypoxanthin
Xanthinoxidasa
Guanindeaminasa
Xanthin
NH4+
O2 + H2O H2O2
O2 + H2O
Xanthinoxidasa
H2O2
O
H
O
H
N
N
O
N
H
N
H
Močová kyselina
50
H2O
Guanin
Cyklus purinových nukleotidů
•
Cyklus hraje důležitou roli v kosterním svalstvu. Zvyšuje se svalová
aktivita zvyšováním aktivity citrátového cyklu. Svaly nemají dostatečné
množství enzymů, které by doplňovaly meziprodukty citrátového cyklu –
anaplerotické reakce. Cyklus purinových nukleotidů je dodavatelem
fumarátu pro svalový citrátový cyklus !!!
H2O
NH4+
AMP deaminasa
AMP
IMP
Fumarát
Aspartát + GTP
Adenylosukcinátlyasa
Adenylosukcinátsynthetasa
Adenylosukcinát
GDP + Pi
51
H2O + Aspartát + GTP
NH4+ + GDP + Pi + Fumarát
Xanthinoxidasa (XO)
Převádí hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou kyselinu.
•
U savců je XO v játrech a v lemu tenkého střeva. XO je homodimer
obsahující FAD a Mo komplex cyklující mezi Mo6+ a Mo4+. Koncovým
akceptorem elektronů je O2 přecházející na H2O2 což je nebezpečná
oxidační sloučenina ihned štěpena katalasou na H2O a O2.
O
O
N
HN
N
N
H
Hypoxanthin
N
HN
O
O
N
H
N
H
O
N
HN
7
9
O
Xanthin
N
H
8
O
N
H
O
Močová kyselina
(enol forma)
O
O
N
52
-
O
N
H
N
H
Ureát
O
N
H
N
H
Močová kyselina
(keto forma)
pK = 5.4
HN
N
HN
H
H
+
H+
Osud močové kyseliny
•
Konečným produktem degradace purinů u člověka a primátů je močová
kyselina vylučovaná močí.
•
Totéž platí pro ptáky, suchozemské plazy a většinu hmyzu. Smyslem je
zadržovat vodu, protože močová kyselina je jen omezeně rozpustná ve
vodě a proto její vylučování ve formě krystalů nebo pasty šetří pro
organismus vodu.
•
•
U všech dalších organismů je močová kyselina dále degradována.
Savci, vyjma primátů, oxidují močovou kyselinu na ve vodě dobře
rozpustný allantoin.
Kostnaté ryby štěpí allantoin dále na allantoovou kyselinu.
Chrupavčité ryby a obojživelníci degradují allantoovou kyselinu na
močovinu a tu vyměšují.
Mořští bezobratlovci rozkládají močovinu na amoniak a amonné ionty.
•
•
•
53
Schéma další degradace močové kyseliny
O
N
HN
O
VYLUČOVANO:
H
O
N
N
H
H
Primáti
Ptáci
Plazi
Hmyz
Močová kyselina
2 H2O + O2
Urátoxidasa
CO2 + H2O2
H
O
N
N
H
N
NH2
O
O
Další savci
H
Allantoin
H2O
COOH NH2
NH2
O
Allantoinasa
N
H
N
H
Kostnaté ryby
O
Allantoová kyselina
H2O
Allantoikasa
CHO-COOH
Glyoxylová kyselina
O
2 H2N
C
NH2
Močovina
2 H2O
54
Chrupavčité ryby
Obojživelníci
Ureasa
2 CO2
4 NH4+
Mořští bezobratlí
Dna je onemocnění provázené zvýšenou hladinou močové kyseliny
v tělesných tekutinách.
•
Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené vylučování močové
kyseliny. Jedním z důvodů je nedostatečnost HGPRT (Lesch-Nyhamův
syndrom) vedoucí k nadměrné produkci z důvodů akumulace PRPP.
•
Dna se léčí podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu, což je
strukturní analog hypoxanthinu. XO allopurinol hydroxyluje na
alloxanthin, který se pevně naváže na redukovanou formu enzymu a tím
ho ireversibilně inhibuje. Příklad „suicide inhibitor“ nebo mechanismbased substrate.
O
HN
7
N
55
O
8
N
H
Allopurinol
N
O
N
HN
N
N
H
Hypoxanthin
HN
O
N
N
H
N
H
Alloxanthin
Odbourávání (katabolismus) pyrimidinových nukleotidů
•
Živočišné buňky degradují pyrimidinové nukleotidy na jejich báze.
Reakce probíhají přes defosforylace, deaminace a štěpení glykosidových
vazeb. Vznikající uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně,
na rozdíl od purinových bází.
•
Konečnými produkty jsou β-alanin a β-aminoisobutyrát.
•
Obě sloučeniny jsou dále převáděny transaminací a aktivací na malonylCoA a methylmalonyl CoA.
•
Malonyl CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl
CoA je převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl CoA.
•
Závěr: Produkty degradace pyrimidinových
k energetickému metabolismu buňky.
56
nukleotidů
přispívají
Degradace pyrimidinových nukleotidů I. část
NH2
N
N
O
O
H
H
H
O
N
CMP
UMP (dTMP)
H2O
Nukleotidasa
Pi
Cytidin
H
Ribosa-5-fosfát
Ribosa-5-fosfát
H2O
CH3
N
Nukleotidasa
Pi
Cytidindeaminasa
H2O
NH4+
Uridin
(Deoxythymidin)
Pi
O
H
Uridinfofsforylasa
(d)Ribosa-1-P
57
O
Dihydrouracildehydrogenasa
Uracil
(Thymin)
NADPH + H+
NADP+
CH3
N
H
H
N
H
H
Dihydrouracil
(Dihydrothymin)
Degradace pyrimidinových nukleotidů II. část
O
H
CH3
N
O
H
H
N
H
H
Dihydrouracil
(Dihydrothymin)
H2O
Hydropyrimidinhydratasa
-
O
O
C
H2N
O
58
N
H
CH
-
OOC
CH3
CH2
β-Ureidopropionát
(β-Ureidoisobutyrát)
β-Ureidopropionasa
H2O
NH4+ + CO2
H2N
CH
CH3
CH2
β-Alanin
(β-Aminoisobutyrát)
Transaminace a aktivace β-alaninu a β-aminoisobutyrátu
-
OOC
H2N
CH
CH2
COO
CH3
Aminotransferasa
2-Oxoglutarát
β-Alanin
(β-Aminoisobutyrát)
Glutamát
-
HC
CH3
HC
O
Malonát semialdehyd
(Methylmalonát semialdehyd)
CoA + NAD+
NADH + H+
COO
HC
59
-
CH3
C
O
S
CoA
Malonyl-CoA
(Methylmalonyl-CoA)