docKapitoly z bioorganické chemie (OCH/KBCH)
download 
Stížnost Transkript
Kapitoly z bioorganické chemie (OCH/KBCH)
Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Kapitoly z bioorganické chemie Lucie Brulíková Milan Urban Olomouc 2015 Recenzenti: Mgr. Jiří Voller, Ph.D. Mgr. Radim Nencka, Ph.D. Skripta vznikla v rámci realizace projektu OP VK CZ.1.07/2.2.00/28.0184 s názvem „Inovace ve vzdělávání v chemii a biologii s ohledem na aktuální trendy v biomedicinálním výzkumu“. 1. vydání © Lucie Brulíková, Milan Urban, 2015 © Univerzita Palackého v Olomouci, 2015 Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv a může zakládat občanskoprávní, správněprávní, popř. trestněprávní odpovědnost. ISBN 978-80-244-4543-4 Předmluva Tato skripta jsou učební pomůckou k předmětu Kapitoly z bioorganické chemie, věnovanému vývoji antivirotik a cytostatik. Historie výuky tohoto předmětu je spojena s prof. Antonínem Holým, který v minulosti pořádal kurz Bioorganické chemie pro studenty Univerzity Karlovy v Praze a Univerzity Palackého v Olomouci. Postupně jsme převzali jeho koncepci výuky a přeformovali ji do dnešní podoby. Proto bychom tato skripta rádi věnovali památce profesora Antonína Holého a jeho skvělým úspěchům při vývoji nukleosidových léčiv. Při koncipování současné podoby přednášek předmětu Kapitoly z bioorganické chemie jsme vycházeli z předpokladu určitých znalostí studentů v oborech organické chemie, biochemie a molekulární biologie. V úvodu jsme se snažili podat přehled základních znalostí nezbytných pro pochopení dějů souvisejících s antivirovou i protinádorovou terapií. Poté následuje podrobnější rozbor a popis látek, které se uplatňují při terapii, případně jsou doposud ve stádiu vývoje. Cílem předloženého textu není vyčerpávajícím způsobem popsat vše, co s vývojem antivirotik a cytostatik souvisí, ale poukázat na některé, z našeho pohledu důležité, oblasti. Olomouc, 28. února 2015 Autoři Obsah 1. Úvod .............................................................................................................................. 8 1.1. Vymezení základních pojmů, souvislostí .................................................................. 9 1.2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění ................................. 10 1.2.1. Virová onemocnění .......................................................................................... 10 1.2.2. Nádorová onemocnění – vymezení pojmů ....................................................... 11 1.2.3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě............................................................... 12 1.3. Buněčný cyklus ...................................................................................................... 14 1.3.1. Regulace buněčného cyklu .............................................................................. 15 1.3.2. Mikrotubuly ...................................................................................................... 16 1.4. Chemoterapie nádorových onemocnění – pojmy.................................................... 19 1.5. Centrální dogma a genová regulace....................................................................... 20 1.5.1. Replikace ......................................................................................................... 20 1.5.2. Transkripce ...................................................................................................... 22 1.5.3. Translace ......................................................................................................... 23 1.5.4. Stručný náhled do regulace genové exprese ................................................... 23 1.6. Principy stavby virů, jejich taxonomie ..................................................................... 28 1.6.1. Klasifikace virů ................................................................................................. 28 1.7. Životní cyklus virů................................................................................................... 29 1.7.1. Rozmnožování jednotlivých typů virů ............................................................... 30 1.7.2 Jednotlivé fáze životního cyklu virů ................................................................... 32 1.7.3. Cesty infekce organizmu viry ........................................................................... 32 1.7.4. Některé pojmy související s viry ....................................................................... 32 1.8. Viry a nádorová onemocnění ................................................................................. 32 1.9. Vakcíny .................................................................................................................. 33 1.9.1. Typy vakcín ..................................................................................................... 33 1.10. Viry způsobující závažná onemocnění a epidemie u lidí....................................... 35 1.11. Terapie onemocnění člověka způsobených viry ................................................... 36 1.12. Virové infekce, které v minulosti způsobily závažné epidemie .............................. 36 2. Struktura a funkce nukleových kyselin ..................................................................... 44 2. 1. RNA ...................................................................................................................... 46 2. 2. DNA ...................................................................................................................... 47 2.3. Interakce malých molekul s nukleovými kyselinami ................................................ 47 4 2.3.1. Reakce s nukleofily .......................................................................................... 48 2.3.2. Reakce s elektrofily.......................................................................................... 49 2.3.3. Malé molekuly s reversibilní vazbou na dvoušroubovici DNA ........................... 51 3. Biosyntéza a metabolizmus nukleových kyselin ...................................................... 54 3.1. Biosyntéza nukleosidů de novo .............................................................................. 54 3.1.1. De novo biosyntéza pyrimidinových nukleosidů ............................................... 54 3.1.2. Enzymy biosyntézy pyrimidinových nukleotidů a možnost terapeutických cílů . 55 3.1.3. Biosyntéza purinových nukleosidů ................................................................... 56 3.2. Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů ...................................................... 60 3.2.1. Odbourávání purinů ......................................................................................... 60 3.2.2. Odbourávání pyrimidinových nukleosidů .......................................................... 60 3.2.3. Šetřící dráha (salvage pathway) ...................................................................... 62 3.3. Poruchy metabolizmu purinů .................................................................................. 62 3.4. Přehled základních enzymů biosyntézy a katabolizmu nukleových kyselin a jejich složek, které mohou být cíleny terapeutiky .................................................................... 63 3.4.1. Enzymy biosyntézy složek NK ......................................................................... 64 3.4.2. Enzymy katabolizmu složek nukleových kyselin .............................................. 69 4. Chemie nukleosidů, nukleotidů a oligonukleotidů ................................................... 71 4.1. Syntéza nukleosidů ................................................................................................ 71 4.1.1. Tvorba glykosidické vazby ............................................................................... 72 4.1.2. Syntéza a transformace nukleobází ................................................................. 76 4.1.3. Modifikace cukerné složky ............................................................................... 80 4.2. Syntéza nukleotidů ................................................................................................. 81 4.3. Syntéza oligonukleotidů ......................................................................................... 83 4.3.1. Fosfodiesterová metoda .................................................................................. 83 4.3.2. Fosfotriesterová metoda .................................................................................. 84 4.3.3. H-fosfonátová metoda ..................................................................................... 84 4.3.4. Fosforamiditová metoda .................................................................................. 85 4.3.5. Chránicí skupiny .............................................................................................. 88 4.3.6. Aktivátory ......................................................................................................... 89 4.3.7. Komerčně dostupné fosforamidity .................................................................... 89 4.3.8. Syntéza oligoribonukleotidů ............................................................................. 90 5. Inhibitory jednotlivých stupňů rozmnožování virů................................................... 93 5.1. Látky ovlivňující adsorpci virionu na povrch buňky ................................................. 93 5 5.2. Látky interagující s povrchovou strukturou virionu .................................................. 94 5.3. Inhibitory syntézy virových nukleových kyselin ....................................................... 95 5.3.1. Analoga substrátu ............................................................................................ 96 5.3.2. Analoga produktu............................................................................................. 97 5.3.3. Inhibitory herpesvirové helikasy-primasy ......................................................... 97 5.3.4. Inhibitory RNA-dependentní-RNA polymerasy ................................................. 99 5.3.5. Inhibitory DNA-dependentní RNA-polymerasy ............................................... 100 5.4. Inhibitory viru HIV ................................................................................................. 101 5.4.1. Inhibitory průniku do buňky ............................................................................ 102 5.4.2. Nukleosidové inhibitory reversní transkriptasy (NRTIs) .................................. 103 5.4.3. Nukleotidové inhibitory reversní transkriptasy (NtRTIs) .................................. 106 5.4.4. Nenukleosidové inhibitory reversní transkriptasy (NNRTIs) ........................... 106 5.4.5. Inhibitory HIV integrasy a inhibitory transkripce virové RNA ........................... 108 5.4.6. Inhibitory HIV proteasy .................................................................................. 109 5.4.7. Současná antiretrovirová terapie pacientů s HIV infekcí ................................ 112 5.5. Inhibitory HBV ...................................................................................................... 112 5.6. Inhibitory HCV ...................................................................................................... 114 5.7. Inhibitory serinové HCMV proteasy ...................................................................... 118 5.8. Inhibitory cysteinové rhinovirové proteasy ............................................................ 118 6. Acyklické nukleosidy a nukleosidfosfonáty ........................................................... 119 6.1. Acyklické nukleosidy ............................................................................................ 120 6.2. Acyklické nukleosidfosfonáty ................................................................................ 124 6.3. Nové cyklické fosfonáty ........................................................................................ 129 7. Protinádorová a antileukemická chemoterapie ...................................................... 131 7.1. Alkylační léčiva .................................................................................................... 131 7.1.1. Mechanizmus účinku DNA alkylačních cytostatik ........................................... 131 7.1.2. Skupiny alkylačních léčiv ............................................................................... 133 7.2. Komplexy platiny .................................................................................................. 141 7.3. Cytostatika se selektivním účinkem v hypoxických buňkách ................................ 143 7.4. Inhibitory topoizomeras ........................................................................................ 146 7.4.1. Specifické inhibitory topoizomerasy I ............................................................. 148 7.4.2. Inhibitory topoizomerasy II ............................................................................. 149 7.5. Inhibitory angiogeneze ......................................................................................... 150 7.6. Inhibitory thymidinfosforylasy ............................................................................... 152 6 7.7. Látky s radiomimetickým účinkem ........................................................................ 153 7.8. Telomerasa a její inhibitory .................................................................................. 157 7.8.1 Inhibitory telomerasy jako potenciální protinádorová léčiva ............................. 159 7.9. Antimitotické látky interagující s tubulinem ........................................................... 162 7.10. Inhibitory proteinkinas ........................................................................................ 163 7.11. Inhibitory prenylace proteinů .............................................................................. 165 7.12. Mnohočetná léková rezistence (MDR) ................................................................ 166 7.13. Steroidní hormony v protinádorové terapii .......................................................... 166 7.13.1. Hormonální léčba karcinomu prsu ............................................................... 167 7.13.2. Hormonální léčba zhoubných i nezhoubných nádorů prostaty ..................... 170 8. Literatura ................................................................................................................... 173 7 1. Úvod V několika posledních dekádách došlo k mohutnému rozvoji vědních disciplín studujících biologické systémy a z klasických oborů jako jsou biologie a chemie se postupně odštěpily biochemie, bioorganická chemie, chemická, molekulární a strukturální biologie a mohli bychom jmenovat ještě celou řadu interdisciplinárních nauk zabývajících se interakcemi organizmů s prostředím, chemickými sloučeninami a s jinými organizmy. Znalost těchto interakcí je klíčová pro vývoj nových léčiv. Z historického hlediska má vývoj léčiv několik zásadních etap. Odpradávna byly při léčbě nemocí používány léčiva přírodního původu. Jednalo se o produkty z rostlin, živočichů, hub, ale i o anorganické sloučeniny, u kterých se empiricky zjistilo, že zmírňují symptomy chorob, proti kterým byly používány. Rozvoj chemie a následné zlepšení analytických metod během konce 19. a začátkem 20. století umožnilo izolaci a identifikaci složek extraktů, které byly za jejich příznivé účinky zodpovědné. Následovala éra syntéz chemických analogů pomocí acetylace alkoholů a aminů, esterifikace karboxylových kyselin a jiných modifikací funkčních skupin, které přinášely molekuly s lepším účinkem než původní látky. V průběhu 20. století došlo k postupnému odhalení principů fungování živých organizmů. Byly objeveny klíčové struktury a funkce proteinů, DNA nebo RNA, bylo formulováno centrální dogma. Rentgenostrukturní analýza, nukleární magnetická rezonance, hmotnostní spektroskopie a řada dalších metod pomohly odhalit struktury důležitých proteinů a jejich interakce s dalšími molekulami. Úroveň vědění se dostala do stádia, které přímo vybízelo navrhovat nová léčiva na základě tzv. racionálního designu. Existuje několik výkladů, co je to racionální design. Asi nejširší definice je, že se jedná o optimalizaci struktury léčiva na základě zpětné vazby z výsledků biologického testování. Tento přístup je používán již dlouho a za jeho zakladatele někdy bývá označován Paul Ehrlich, který už ve 20. letech 20. století používal modely malárie, aby na nich vylepšoval vlastnosti antimalarik, derivátů methylenové modři, chinolinů a akridinů. Novější definice považuje za racionální design vývoj léčiva na základě pochopení molekulárního patofyziologického mechanizmu onemocnění. Tento přístup postupně přešel do stádia hledání konkrétního cíle, na který lze terapii zaměřit. Na tento cíl se pak provádí základní screening nových terapeutik. V případě, že samotný cíl není možné samostatně izolovat, lze tento screening provést sledováním náhradního parametru (například přežití buněk, změna v chování zvířete). Za významné průkopníky takovéhoto přístupu jsou považováni George Hitchings a Gertrude Elion, kteří se zaměřili na rozdílnost v metabolizmu složek nukleových kyselin u normálních lidských buněk, nádorových buněk, protozoí, bakterií a virů a využili jí k vývoji nových terapeutik na bázi analogů nukleových bází. Tato snaha se vyplatila a již během 50. let objevili, že diaminopurin a thioguanin blokují syntézu DNA a jsou využitelné pro léčbu leukémie. Během následujících let objevili řadu dalších významných terapeutik a za inovativní přístup jim spolu s Jamesem Blackem byla v roce 1988 udělena Nobelova cena za lékařství a fyziologii. Tento přístup se pořád zdokonaluje a během posledních dvaceti let bývá cíl často i izolován a screening se provádí přímo na něm. Někdy se ukazuje, že pro řešení dané nemoci nestačí pouze navrhnout inhibitor jednoho klíčového proteinu. Organizmy disponují celou řadou kompenzačních 8 mechanizmů; může například dojít ke zvýšení produkce inhibovaného enzymu nebo jeho roli převezme protein jiný. Tak tomu často bývá např. u nádorových onemocnění. Přesto však existuje řada terapeutik zaměřených na jeden cíl, ze starších terapeutik je to např. penicilin, betablokátory, ACE inhibitory. Racionální design zaměřený na konkrétní cíl pak vedl k vývoji revolučních léčiv, jako jsou antiretrovirotika, nové látky proti hepatitidě C apod. V poslední době významnou část nově registrovaných léčiv tvoří protilátky a objevují se i léčiva založená na nukleových kyselinách (RNAi apod.). Tyto přístupy se označují jako tzv. biologická léčba. Tato skripta si kladou za cíl zjednodušenou formou popsat interakce některých kancerostatik a virostatik s jejich terapeutickými cíli. Rádi bychom studentům přiblížili mechanizmus vzniku a průběhu některých nádorových a virových onemocnění, seznámili je s klíčovými proteiny, na které jsou zaměřena současná terapeutika a s mechanizmy, jak tato léčiva fungují. V neposlední řadě bude diskutován historický vývoj těchto sloučenin a jejich chemická syntéza. 1.1. Vymezení základních pojmů, souvislostí Chemoterapie je léčba pacientů pomocí chemických léků s cílem zastavit onemocnění, zmírnit jeho průběh a omezit symptomy. Používá se pro léčbu onkologických, bakteriálních, virových, parazitárních onemocnění, ale i u metabolických, imunitních poruch apod. V onkologii používaná protinádorová chemoterapie je podávání léků s cílem zabít nádorové buňky nebo zabránit jejich množení. Používaná léčiva můžeme rozdělit do řady skupin. Z terapeutického hlediska jsou to například cytostatika, antiinfektiva, analgetika atd. Z anatomického hlediska například léky ovlivňující centrální nervovou soustavu, kardiologika, léčiva respiračního systému atd. Vývoj léčiva má několik základních fází a celková doba od objevení aktivní sloučeniny do uvedení léčiva na trh bývá v současnosti okolo 10–15 let. Skládá se z preklinické fáze, klinické fáze a z fáze schvalovací. Po jejich úspěšném absolvování může být léčivo uvedeno na trh. V preklinické fázi je testována účinnost látky na modelech a na zvířatech a jeho ADME-TOX (adsorpce, distribuce, metabolizmus, exkrece, toxikologie) vlastnosti. V klinické fázi testování je zkoumána účinnost a vedlejší účinky potencionálního terapeutika na dobrovolnících z řad zdravých i nemocných lidí, někdy jen nemocných. Během klinického používání daného léčiva dochází ke sběru informací od pacientů, vyhodnocují se případné vedlejší účinky, a v případě problémů může dojít ke stažení již používaného léčiva z trhu. Cena uvedení jedné sloučeniny na trh se pohybuje okolo 1 – 2 miliard dolarů. Při testování nových potenciálních léčiv hrají hlavní roli dvě protichůdná kritéria – bezpečnost vs. rychlost (a cena) uvedení přípravku na trh. Stále více se klade důraz na bezpečnost, rostou tak náklady a prodlužuje se čas mezi objevem účinného derivátu a jeho uvedením na trh, k nehodám však dnes oproti minulosti dochází minimálně. Při konečném schvalování nového léčiva hraje významnou roli i skutečnost, jestli nové léčivo přináší dostatečné zlepšení vlastností oproti již používaným látkám. Hlavními důvody úmrtí mladých lidí do 45 let věku jsou infekční choroby – AIDS, TBC, malárie, spalničky, průjmová onemocnění, pneumonie, řada z nich má převážně virový původ. Se stoupajícím věkem pak roste incidence onemocnění metabolických a nádorových. V těchto skriptech se dále budeme věnovat hlavně virovým a nádorovým onemocněním a sloučeninám používaných pro jejich léčbu. 9 1.2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění 1.2.1. Virová onemocnění Viry můžeme rozdělit na DNA viry, RNA viry a retroviry. Dále existuje podrobnější dělení podle mechanizmu, jakým dané viry fungují, a podle genetické příbuznosti jednotlivých virů. DNA viry jsou viry, jejichž genetická informace je uchovávána ve formě DNA, často se jedná o dvoušroubovici. Virová částice obvykle obsahuje tuto DNA a několik proteinů, důležitých pro replikaci viru. Takovými proteiny mohou být primasa/helikasa, virální DNA dependentní DNA polymerasy, RNA polymerasy apod. Nejdůležitějšími zástupci DNA virů způsobujících infekce u obratlovců a potažmo u člověka jsou viry z řádu Herpesvirales (čeleď Herpesviridae) a z čeledí Adenoviridae, Asfarviridae, Iridoviridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae a Poxviridae. DNA virů však existuje celá řada a napadají v podstatě všechny typy živých organizmů od bakterií přes hmyz až po člověka. Přestože řada DNA virů je velmi rozšířena v lidské populaci a obvykle nezpůsobuje vážné infekce, u pacientů s deficitem imunity způsobují oportunní infekce s velmi závažným průběhem. DNA viry jsou také často spojeny se vznikem nádorových onemocnění. RNA viry mají svoji genetickou informaci uloženou ve formě RNA. RNA viry mutují mnohem rychleji než DNA viry, a tak ztěžují jak možnost ochrany vakcinací, tak léčbu chemoterapeutiky – vznikají snadno rezistence. RNA viry lze dále dělit podle toho, zda mají jednoduchý řetězec RNA (ssRNA, z anglického single stranded DNA), anebo RNA duplex (dsRNA viry, z anglického double stranded) a ssRNA viry pak ještě podle toho, zda obsahují pozitivní (+) nebo negativní (-) řetězec RNA. Pozitivní řetězec je identický s virální mRNA (neobsahuje 5‘ čepičku a poly-A konec), proto může být rovnou využit pro translaci v hostující buňce. Negativní řetězec musí být nejdříve replikován do pozitivního řetězce a pak teprve může být použit pro syntézu proteinů. Příklady RNA virů způsobujících infekce u obratlovců a potažmo u člověka jsou viry čeledi Flaviviridae – např. žlutá horečka, západonilská horečka, hepatitida C, horečka dengue (+ ssRNA viry), čeled Orthomyxoviridae – např. viry chřipky, Bunyaviridae – např. hantaviry, Rhabdoviridae – např. vzteklina (-ssRNA viry) a Reoviridae (dsRNA viry). Retroviry bychom teoreticky mohli zařadit mezi RNA viry, protože jejich genetická informace se nachází ve formě RNA. Nicméně, oproti běžným RNA virům využívají specifickou formu replikace, která zahrnuje přepsání genetické informace z virální RNA do DNA (reversní transkripce) a inkorporaci této DNA do jaderné DNA hostujících buněk. Proto se vyčleňují do samostatné skupiny – retroviry. Pro reprodukci retrovirů je zásadní existence tří klíčových enzymů, které se proto staly cíli léčby. Jedná se o reversní transkriptasu, integrasu a proteasu. O některých typech virů, jejich reprodukčních cyklech a mechanizmu infekcí bude podrobnější zmínka v kapitole o virech. Závažná virová onemocnění a významnou úmrtnost způsobují zejména tyto viry: chřipka, rotaviry (patogeny vyvolávající gastroenteritidu u kojenců), varicela zoster (plané neštovice), lidské cytomegaloviry (HCMV – kolitida, zánět oční sítnice, pneumonie), enteroviry (napadají CNS), rhinoviry (rýmové viry), virus lidské žloutenky typu A („infekční žloutenky“), virus lidské žloutenky typu B (HBV – specificky lidský virus), virus lidské žloutenky typu C (HCV – chronické onemocnění), virus varioly (pravé neštovice), virus 10 neštovic opic (monkeypoxvirus – příbuzný variole, mortalita však „jen“ 1–2%), viry vyvolávající hemoragické horečky (Lassa, ebola, argentinská hemoragická horečka, bolivijská hemoragická horečka, krymská hemoragická horečka a další), hantaviry (virus Sin Nombre – plicní pneumonie) a retroviry (HIV – původci onemocnění AIDS). Tyto infekce jsou v současnosti nejdůležitějšími cíli vývoje protivirových vakcín a chemoterapeutik. Pomocí vakcinace se podařilo úplně vymýtit virus pravých neštovic, jedná se asi o největší úspěch této metody. 1.2.2. Nádorová onemocnění – vymezení pojmů Nádor = Tumor = Neoplazma – maligní nebo benigní hmota tkáně, která nemá fyziologickou funkci, vzniká z buněk existující tkáně a nevyvolává zánětlivou reakci, někdy lokálně expanduje invazí nebo metastázami. Maligní nádor = zhoubný, při růstu ničí okolní tkáně a/nebo zakládá dceřiná ložiska, metastázy. Benigní nádor = nezhoubný, nezakládá dceřiná ložiska a roste omezeně, ale při růstu může utlačovat okolní tkáně. Více se podobá původní tkáni než maligní nádor. Karcinom – maligní tumor epiteliálního původu. Sarkom – maligní neoplazma vznikající v mesodermální tkáni (kosti, chrupavky, pojivová tkáň, příčně pruhované svaly). Osteosarkom – sarkom odvozený od kostní tkáně. Chondrosarkom – sarkom odvozený od pojivové tkáně. Hemoblastom – maligní tumor odvozený z embryonálních ganglií. Embryonální karcinom – maligní nádor varlat nebo vaječníků. Adenokarcinom – maligní nádor odvozený od žlázové tkáně. Metastáza – sekundární růst maligního tumoru – obecně přenos nádorové tkáně na jiné místo těla. Lymfom – maligní tumor lymfatické tkáně. Myelom – primární tumor kostní dřeně obvykle zahrnující několik různých kostí (mnohočetný myelom). Leukémie – akutní nebo chronické onemocnění krvetvorných orgánů, charakterizované vzrůstem počtu bílých krvinek, tj.: lymfocytů, lymfoblastů, myeloblastů, monocytů, promyelocytů, keratinocytů, T-buněk (retrovirální leukémie). Myelodysplastický syndrom (preleukémie) – onemocnění krvetvorby, které postihuje kmenové buňky, funkční poruchy všech krvetvorných řad, hlavně u starších lidí. Myeloproliferační syndrom (primární proliferace kmenových buněk) – porucha kmenových buněk v kostní dřeni, nadměrná tvorba buněk krevních řad vede k polycytémii – nadprodukci červených krvinek; esenciální trombocytémii – nadprodukci krevních destiček; primární myelofibróze – nadprodukci krevních destiček a vaziva v kostní dřeni; chronické myeloidní leukémii – nadprodukci bílých krvinek (granulocytů). Akutní leukémie se projevuje rychlým vzrůstem nezralých krevních buněk; kostní dřeň není schopná produkovat normální buňky; je nutná okamžitá léčba (jinak rozšíření do krve, ostatních orgánů, CNS), častěji se vyskytuje u dětí. 11 Chronická leukémie se projevuje zvýšenou tvorbou defektních krevních buněk; většinou trvá měsíce až roky, než se projeví; většinou se neléčí okamžitě – monitorování a snaha o efektivní léčbu „v pravý čas“. Lymfoblastická leukémie je leukémie buněk kostní dřeně, ze kterých vznikají lymfocyty, léčí se chemoterapií. Myeloidní leukémie je leukémie buněk kostní dřeně, ze kterých vznikají červené krvinky (erytrocyty) a některé typy bílých krvinek (leukocytů) a destiček (trombocytů), léčba transplantací kostní dřeně. 1.2.3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Antimetabolity jsou chemicky obměněné přirozené metabolity (analoga metabolitů), které ovlivňují metabolické procesy, probíhající v buňce (Obr. 1–4). Jejich působení je vždy spojeno s ovlivněním průběhu enzymové reakce nebo jejího produktu. Jejich účinek je založen na principu podobnosti struktury modifikované látky k látce přirozené a na jejím rozpoznání enzymem. Výsledkem může být pevná vazba s enzymem a jeho úplná inaktivace, kompetitivní inhibice, vznik modifikovaného produktu neschopného další metabolické přeměny, vznik modifikovaného produktu inhibujícího enzym, vznik modifikovaného produktu jiných fyzikálně-chemických parametrů nebo produktu se změněnou biologickou aktivitou, terminace růstu polymerního řetězce (proteiny, nukleové kyseliny). Na principu antimetabolitů jsou založena cytostatika, protivirové látky a antiprotozoální látky. Na stejných principech působí také přípravky regulující průběh některých metabolických onemocnění, vyvolaných hyperfunkcí nebo dysfunkcí enzymů. Antimetabolity mohou působit přímo nebo až po předchozí aktivaci. Jejich účinek v buňce je podmíněn transportem přes buněčnou membránu, případnou aktivací a působením na cílový enzym. Ideální situace nastává, je-li kterýkoli z těchto tří kroků specifický pro transformovanou nebo infikovanou buňku, tzn., že látka je transportována pouze do těchto buněk, je tam specificky aktivována, nebo interaguje pouze s enzymy této buňky (případně parazita). Relativní účinek antimetabolitů v buňce je charakterizován tzv. chemoterapeutickým indexem nebo indexem selektivity účinku (poměr koncentrace, při které je látka účinná na cílové buňky vůči koncentraci toxické vůči normálním buňkám). Ke zlepšení farmakologických parametrů či zvýšení selektivity účinku se používají profarmaka, deriváty antimetabolitů, které se lépe transportují nebo jen omezeně degradují, a poskytují antimetabolit teprve působením specifických enzymů v buňce. Obrázek 1. Příklad antimetabolitů, analoga p-aminobenzoové kyseliny. 12 Obrázek 2. Příklad antimetabolitů, analoga kyseliny listové. Obrázek 3. Příklad možných antimetabolitů, analogů pyrimidinových bází. Obrázek 4. Analoga purinových bází, některé fungují jako antimetabolity. 13 1.3. Buněčný cyklus Buněčný cyklus je proces, během kterého z buňky mateřské vzniknou dvě buňky dceřiné. Existuje i alternativní buněčný cyklus, kdy dojde k replikaci, ale mitóza je přerušena před vlastní cytokinezí a vzniká tak buňka se znásobenou genetickou výbavou (polyploid). Tento jev se nazývá endoreplikace a nebudeme se mu dále věnovat. Obvyklý buněčný cyklus má dvě základní fáze: 1. Interfáze G0-fáze Buňky často přecházejí z G1-fáze do klidové fáze G0. Z této fáze můžou po nějaké době opět vstoupit do buněčného cyklu a začít se dělit. G1-fáze – postmitotická fáze, 1. přípravná fáze V G1 fázi buňka zvětšuje svůj objem, vytváří se zásoba nukleotidů a syntetizují se enzymy pro budoucí replikaci jaderné DNA, leží zde hlavní kontrolní uzel cyklu. Tato fáze je zpravidla nejdelším úsekem buněčného cyklu. S-fáze – syntetická fáze Dochází k replikaci jaderné DNA, syntetizují se histony, aby se mohly tvořit nové nukleozomy a chromatinové vlákno. Během S-fáze probíhá pečlivá kontrola na několika úrovních, která zajišťuje, aby replikace DNA proběhla správně a buňka byla před následným dělením v pořádku. G2-fáze – 2. přípravná Tato fáze je závislá na dokončení replikace DNA v S fázi. Jedná se fázi premitotickou, při níž dochází ke zvýšené syntéze a aktivaci proteinů a k tvorbě mitotického aparátu. Tato fáze končí zahájením mitózy. 2. M fáze (fáze dělení jádra, karyokineze); mitóza Při mitóze dochází k jadernému dělení a po ní následuje cytokineze. Chromozomy jsou ohraničeny, sesterské chromatidy odděleny a přemístěny k protilehlým pólům buňky (vlastní mitóza). Dceřiné buňky obdrží 2 kompletní sady chromozomů a shodnou výbavu cytoplazmatických organel (Obr. 5). Profáze – je počáteční stádium mitózy, při kterém dochází ke kondenzaci chromatinu, rozpad jaderné membrány, dále zaniká jadérko – oblast jádra, kde během interfáze dochází k mohutné transkripci ribozomální RNA, vzniká dělící vřeténko. Každý chromozom se nyní skládá ze dvou identických molekul DNA (chromatid) spojených v místě centromery. Prometafáze – zaniká jaderná membrána a dochází k připojení chromozomů na mikrotubuly dělícího vřeténka pomocí kinetochorů. Za pomoci molekulárních motorů začínají chromozomy postupovat směrem k ekvatoriální rovině buňky. Metafáze – chromozomy se přesunují do ekvatoriální roviny. Pohyb chromozomů po mikrotubulech dělícího vřeténka směrem do středu buňky je zprostředkován kinetochory, proteinovými komplexy nacházejícími se v oblasti centromery každého z chromozomů. Anafáze – sesterské chromatidy se od sebe oddělí a jsou taženy mikrotubuly dělícího vřeténka k opačným pólům, zároveň se od sebe tyto póly (zpravidla tvořené 14 centrozomy) vzdalují, jak se vůči sobě posouvají polární mikrotubuly z opačných pólů vřeténka. Telofáze – chromatidy se přesunou k opačným pólům vřeténka, kde dekondenzují, výsledkem je vznik zárodků dvou dceřiných buněčných jader a oddělení cytoplazmy, dochází k obnově jadérka, chromatinu a jaderného obalu. V ekvatoriální rovině se zatím tvoří konstrikční rýha pro rozdělení cytoplasmy a organel. Cytokineze – dochází k postupnému zaškrcení spojnice mezi 2 dceřinými buňkami, proběhne rekonstrukce buněčného jádra obou buněk do interfázové podoby, chromosomy jsou ve svých euchromatinových úsecích rozvolněny a DNA je transkribována, jadérko je obnoveno, což umožňuje zahájit procesy G1 fáze. Obrázek 5. Schematické znázornění mitózy. http://www.illustrationsource.com/stock/image/481372/the-process-of-cell-division-bymitosis/ 1.3.1. Regulace buněčného cyklu Existují dva typy molekul, které hrají zásadní roli při regulaci buněčného cyklu. Jsou to cykliny a cyklin dependentní kinasy (CDK). Tyto kinasy jsou v buňce přítomné neustále, ale jsou neaktivní. V přítomnosti cyklinů se aktivují a začnou fosforylovat (a tím aktivovat 15 nebo deaktivovat) cílové proteiny, které buňku navedou do další fáze buněčného cyklu. Aktivací různých CDK se ovlivní různé proteiny tak, jak buňka postupuje fázemi buněčného cyklu. Jedná se o kaskádovitý děj. Po obdržení extracelulárního pro-mitotického signálu se aktivuje CDK, která připraví buňku na přechod do S fáze. Zahájí syntézu transkripčních faktorů, které jsou nutné pro expresi S cyklinů a enzymů potřebných pro replikaci DNA. Také způsobí degradaci molekul, které inhibují přechod buňky do S fáze (prostřednictvím ubiquitinylace z nich učiní substrát pro proteasom). Další CDK fosforylují proteiny prereplikačních komplexů a tím je jednak aktivují a jednak zabrání vzniku nových prereplikačních komplexů. Důvodem je, aby jich bylo správné množství a celý genetický materiál byl zkopírován právě jednou. Aktivací dalších cyklin-CDK a proteinů dojde k přechodu do G2 fáze. Během S a G2 fáze se syntetizují neaktivní mitotické cyklin-CDK, ty se aktivují na přechodu do M fáze. Kontrolní uzly Během buněčného cyklu existuje několik kontrolních bodů, kdy buňka zjišťuje připravenost na další fázi buněčného cyklu a pokud zjistí, že připravena není, pak přechod zablokuje, případně zahájí apoptózu. Prvním kontrolním uzlem je přechod G1/S. Pokud jsou vnější podmínky nepříznivé pro dělení anebo existuje poškození buňky, zablokuje se přechod z G1 do S fáze. Druhým kontrolním uzlem je přechod G2/M. Zde se buněčný cyklus zastaví v případě poškození DNA. Buňky zůstanou v G2 fázi, dokud není DNA plně replikovaná, případně pokud je poškozená. Třetím kontrolním uzlem je přechod metafázní. Buněčný cyklus se zastaví při přechodu z metafáze do anafáze, pokud nejsou chromozómy dokonale připojené k dělícímu vřeténku. Z hlediska léčby nádorových onemocnění je podrobná znalost buněčného cyklu zásadní. Na rozdíl od běžných somatických buněk, které se vyskytují především v G 0 fázi, se významná část populace nádorových buněk vyskytuje ve fázi mitózy nebo v přípravných fázích. Je to tedy vlastnost, která nádorovou tkáň odlišuje od normální tkáně a zásah do buněčného cyklu může zaručit selektivní likvidaci nádorových buněk. 1.3.2. Mikrotubuly Důležitou roli v mitóze hrají mikrotubuly. Vznikají polymerizací tubulinu. Tubulinové dimery tvoří 13 protofilament, která jsou vzájemně posunuta o 9 nm a vytváří tak levotočivou šroubovici. Na jednom konci je tzv. plus-konec mikrotubulu, na němž polymerace tubulinu probíhá rychleji (vystavuje β-podjednotku tubulinu s E-vazebným místem pro nukleotid). Vznik a zánik mikrotubulů je dynamický proces. Mikrotubuly mají dvě vazebná místa pro GTP nebo GDP a na tom, zda v těchto místech je GDP nebo GTP závisí jejich stabilita. V případě, že je tam navázáno GTP, jsou stabilnější a proces depolymerizace je pomalejší než proces polymerizace, mikrotubuly tedy rostou. V případě, že je tam navázán GDP, depolymerizace převáží a mikrotubuly se zkracují. Samotná 16 polymerizace tubulinu do mikrotubulů probíhá na úkor štěpení GTP. Polymerizace a a depolymerace tubulinu je znázorněna na Obr. 6. Obrázek 6. Polymerizace a depolymerace tubulinu. (Microtubules as a target for anticancer drugs, Mary Ann Jordan & Leslie Wilson; Nature Reviews Cancer 4, 253-265 (April 2004); doi:10.1038/nrc1317). http://www.nature.com/nrc/journal/v4/n4/fig_tab/nrc1317_F4.html V rámci mitózy fungují mikrotubuly tak, že po rozvolnění jaderné membrány narostou od pólů buňky k jednotlivým chromozómům, připojí se k jejich centrálním částem pomocí motorových proteinů a transportují je do ekvatoriální oblasti buňky. Ke každé kopii daného chromozómu je připojen mikrotubul vedoucí z centromery na jiné straně buňky. Mikrotubuly připojené k centromerám se začnou zkracovat a motorové proteiny po nich posouvají chromatidy každou k jinému pólu buňky. V každé polovině dělící se buňky se tak ocitne jeden kompletní set chromozomů. Při metafázi (Obr. 7) se chromozómy seřadí v ekvatoriální oblasti dělícího vřeténka. Z centrozomů, které jsou umístěné na pólech vřeténka, vyrostou mikrotubuly směrem k chromozómům a obě sesterské chromatidy každého chromozómu se připojí k těmto mikrotubulům (zelené) prostřednictvím svých kinetochorů. Kromě těchto mikrotubulů jsou v dělícím vřeténku přítomné dva další typy mikrotubulů – polární mikrotubuly (červené), které vybíhají z obou centrozomů a v ekvatoriální oblasti se překrývají a astrální mikrotubuly (modré), které rostou z centrozomů směrem k okraji buňky. Všechny tři typy mikrotubulů mají (-) konec u centrozomů a (+) konec směrem od centrozomů. 17 Obrázek 7. Mitotické vřeténko při metafázi. https://wikispaces.psu.edu/pages/viewpage.action?pageId=112526877&navigatingVersion s=true Obrázek 8. Při anafázi se oddělí sesterské chromatidy a pohybují se směrem k pólům buňky. Děje se tak prostřednictvím mikrotubulů připojených ke kinetochorům (viz detail obrázku). Tyto mikrotubuly se zkracují na svých (+) koncích a současně motorové proteiny připojené ke kinetochorům posouvají chromatidy podél zkracujícího se vlákna směrem k () konci, sesterské chromatidy tak zůstávají připojeny ke zkracujícím se mikrotubulům. https://wikispaces.psu.edu/pages/viewpage.action?pageId=112526877&navigatingVersion s=true 18 Jak je z výše uvedených informací patrné, správně synchronizovaný proces polymerizace a depolymerizace tubulinů je důležitou součástí mitózy a zásah do tohoto procesu může buňku v průběhu dělení zlikvidovat. Na tomto principu funguje řada používaných terapeutik. 1.4. Chemoterapie nádorových onemocnění – pojmy Chemoterapie nádorových onemocnění může být rozdělována do následujících typů: (a) Primární – základní metoda léčby (b) Adjuvantní – doplňuje primární metodu léčby, většinou se podává po operaci nebo po radioterapii s cílem podpořit účinek (c) Neoadjuvantní – tato chemoterapie bývá podávána před operací nebo radioterapií s cílem zlepšit operabilitu a usnadnit vlastní výkon nebo také na: (d) Kurativní – podání chemoterapie s cílem vyléčit. Někdy též radikální. Běžné jsou vysoké dávky a tedy i vyšší nežádoucí účinky. (e) Paliativní – udržovací či doplňková podávána pro zlepšení stavu pacienta po operačním výkonu s cílem zamezit opětnému růstu nádoru nebo dokonce dosáhnout různě dlouhé remise. Typy nádorů v souvislosti s chemoterapií dělíme na: (a) chemosenzitivní – nádor je citlivý na chemoterapii bez ohledu na to, jak příznivé je to pro samotnou léčbu (b) chemokurabilní – nádor je citlivý na chemoterapii a navíc je podání cytostatik pro pacienta zjevně přínosné (c) chemorezistentní – nádor není citlivý na chemoterapii Chemoterapeutika dělíme do několika základních skupin, které jsou popsány níže spolu s významnými zástupci z každé skupiny. 1. Alkylační cytostatika – dusíkatá analoga yperitu (chlorambucil, chlormethin, cyklofosfamid, ifosfamid, melfalan), busulfan, dakarbazin, mechlorethamin, prokarbazin, temozolomid, thioTEPA, uramustin. 2. Antimetabolity – deriváty kyseliny listové (aminopterin, methotrexát, pemetrexed, raltitrexed), purinová analoga (cladribin, clofarabin, fludarabin, merkaptopurin, thioguanin), pyrimidinová analoga (kapecitabin, catarabin, fluorouracil, gemcitabin). 3. Rostlinné alkaloidy – taxol (docetaxel, paclitaxel), vinca alkaloidy (vinblastin, vincristin, vindesin, vinorelbin). 4. Cytotoxická/protinádorová antibiotika – anthracykliny (dunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxandron, valrubicin), bleomycin, hydroxyurea, mitomycin. 5. Inhibitory topoizomeráz – topotecan, irinotecan, podofyllotoxiny (etoposid, teniposid). 6. Fotosenzitizéry – aminolevulová kyselina, methyl aminolevulinát, porfimer sodium, verteporfin. 19 7. Inhibitory kináz – dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, milotinib, sorafenib, sumitimib, vandetamib. 8. Biologická léčiva – Monoklonální protilátky – alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab, gemtuzumab, panitumumab, rituximab, tositumomab, trastuzumab. 9. Ostatní – alitretinoin, altretamin, amsacrin, anagrelid, arsenic trioxid, asparaginase, bexaroten, bortezomib, denileukin diftitox, estramustin, hydrxykarbamid, pentostatin, masoprocol, mitotan, pegaspargase, tretinoin. Tabulka 1. Historický vývoj léků proti nádorům a leukemii. 1948 metotrexát Farber 1967 carmustin 1953 mitomycin C Yamamoto 1969 fludarabin 1954 6-merkaptopurin Hitchings, Elion 1969 doxorubicin 1954 actinomycin Yamamoto 1971 mithramycin A 1957 5-fluorouracil Heidelberger 1972 streptozotocin 1958 cyklofosfamid Arnold 1972 lomustin 1958 busulfan 1976 ftorafur 1960 cytarabin 1978 misonidazol 1961 vinkristin, vinblastin 1980 doxyfluridin 1963 hydroxyurea 1981 mitaxanthron Cheng Montgomery 1985 karboplatina Smith 1963 nitrosomočoviny Svoboda 1963 daunorubicin Dimarco 1986 topotecan (kamptothecin) 1965 cisplatina Rosenberg 1988 gemcitabin 1966 bleomycin Ume Zawa 1992 taxol Dimarco Hiller Ukeda 1.5. Centrální dogma a genová regulace 1.5.1. Replikace Replikace je proces, kterým se kopíruje genetická informace z mateřské DNA do nové, dceřiné molekuly. Jednotlivé řetězce v dvoušroubovici DNA jsou vzájemně komplementární, vytváří kanonické páry bází A-T, G-C. Při replikaci se vlákna od sebe oddělí a ke každému vláknu dosyntetizují polymerasy vlákno nové, opět komplementární. 20 Tento proces je základním předpokladem pro existenci života na Zemi. Přesnost při přenosu informací zajišťuje to, že dceřiné organizmy fungují podobně nebo stejně jako organizmus mateřský. Nepřesnosti při replikaci naopak vedou k mutacím a ke vzniku odlišností a spolu se selekčním tlakem umožňují evoluci – vývoj nových forem života s novými vlastnostmi. Při replikaci může nejčastěji dojít k bodovým mutacím, to znamená k záměně jednoho písmena genetického kódu za jiné. Je nutné podotknout, že většina chyb při replikaci se nijak neprojeví na fenotypu nového organizmu. Proces replikace je sám o sobě velmi přesný a většina chyb je hned zpočátku opravena. Navíc, zdaleka ne všechny zbylé mutace se projeví, protože se můžou vyskytnout v nekódujících oblastech DNA, mohou být synonymní (mutovaný kodón kóduje stejnou aminokyselinu), případně záměna aminokyseliny nemusí ovlivnit funkci proteinu. Naprostá většina bodových mutací je tedy bez následků, velmi malé procento má negativní vliv a ještě mnohem menší množství mutací má vliv pozitivní, například ve zvýšené aktivitě enzymu nebo jeho jiné funkci. Replikace je součástí buněčného cyklu. Na základě vnějšího nebo vnitřního signálu buňka spustí proces, během něhož kromě mnoha dalších věcí začne replikovat DNA. V určitém místě vznikne replikační vidlička (Obr. 9). DNA helikasa (často spojená s primasou) zruší Watson-Crickovy vodíkové vazby a rozvolní vlákna DNA od sebe. V určitém úseku tak vzniknou dva úseky jednovláknové DNA a vzhledem k tomu, že jsou antiparalelní a DNA polymerasy umí pracovat jen v jednom směru (syntéza probíhá ve směru 5´-3´ tedy templát musí být orientován opačně, 3´-5´), probíhá replikace každého z nich odlišně. Jedno vlákno se nazývá vedoucí (leading) a druhé opožďující se (lagging). Na vedoucím vlákně probíhá syntéza nové DNA kontinuálně. Na opožďujícím se vlákně musí replikační mašinérie počkat, až je rozpletený dostatečně dlouhý úsek (obvykle několik set bází dlouhý), a pak začne syntéza RNA primeru, který poskytne požadovaný 3‘ konec, a následně vlastní DNA, která proběhne až k původnímu místu vzniku vidličky. Tam se zastaví. Tomuto vzniklému úseku se říká Okazakiho fragment. Mezitím probíhá dále rozplétání dvoušroubovice a syntéza na vedoucím vlákně. Až se odhalí další dostatečně dlouhý úsek opožďujícího se vlákna, zopakuje se celá syntéza RNA primeru a DNA. Tímto způsobem vznikne proti vedoucímu vláknu nové vlákno DNA a proti opožďujícímu se vláknu řada krátkých vláken DNA, každé začínající RNA primerem. V tento okamžik přistoupí znovu DNA polymerasa (pol u eukaryot), která odstraní primery a nahradí je DNA. Nakonec enzym ligasa přerušené úseky DNA spojí do jednoho vlákna. Vznik RNA primeru pomocí primáz je nezbytný, protože DNA dependentní DNA polymerasy neumí syntetizovat oligonukleotidový řetězec de novo, umí pouze prodlužovat již existující vlákno. Pro replikaci jsou potřebné tyto enzymy a proteiny: Helikasa odděluje komplementární vlákna DNA, zdrojem energie je ATP. Jednovláknovou DNA vážící protein se váže na jednoduché vlákno DNA po oddělení helikasou, aby zabránil opětovnému spojení do dvoušroubovice. RNA primasa začne de novo syntetizovat RNA vlákno komplementární k DNA vláknu. Poté, co je RNA primer cca 7-14 nukleotidů dlouhý, vystřídá RNA primasu DNA polymerasa (pol ), která vytvoří DNA primer, cca 35 nukleotidů dlouhý. Nakonec jiná DNA polymerasa (pol a pol dokončí syntézu řetězce (až několik tisíc bází). Ligasa spojuje kratší úseky DNA do jednoho řetězce. 21 Obrázek 9. Replikační vidlička. https://biotechkhan.wordpress.com/2014/10/05/replication-forks-and-origins-of-replication/ Replikace celého genomu eukaryotické buňky probíhá na mnoha místech současně, replikační vidlička se obvykle vytváří jedna na úsek o několika tisících nukleotidů. Při replikaci vznikají z jedné dvoušroubovice DNA dvě dvoušroubovice a v obou nových dvoušroubovicích pochází jedno vlákno z původní DNA a druhé je nově syntetizované, jedná se tedy o semikonzervativní proces. V eukaryotických organizmech je známo okolo sedmnácti DNA polymeras lišících se mechanizmem rozpoznání správných nukleotidů, které mají zabudovat, každá pracuje s jinou přesností, některé mají čistě opravné funkce. Specifické DNA polymerasy jsou v bakteriích a virech a jsou tak zajímavým cílem pro selektivní inhibici. Jejich inhibicí je možno zpomalit replikaci patogenů, v jiných případech je mikroorganizmus schopen využít replikačního mechanizmu hostujících buněk. DNA polymerasy jsou obecně vhodné cíle léčby nádorových onemocnění, protože v nádorové tkáni probíhá replikace v daleko větším měřítku než v normální tkáni a její inhibice tak poškodí více nádor než zdravou tkáň. 1.5.2. Transkripce DNA je hlavním nositelem genetické informace většiny organizmů a transkripce je proces přenosu této informace na jinou formu – mRNA, která potom slouží jako matrice pro syntézu proteinů. Transkripce probíhá v jádře, kde DNA dependentní RNA polymerasy syntetizují řetězec RNA, který je komplementární k jaderné DNA. Tato RNA se označuje jako pre-mRNA a obsahuje tzv. introny a exony. Exony nesou vlastní genetickou informaci, introny jsou oblasti primárního transkriptu, jež nejsou přeloženy do struktury proteinu. Finální mRNA vznikne z pre-mRNA odstraněním intronů a připojením polyA konce a 5‘čepičky. Toto jsou charakteristiky, podle kterých buňka pozná, že se jedná o mRNA, tedy matrici pro syntézu proteinů a mRNA je těmito částmi chráněna před degradací nukleasami. 22 Obrázek 10. Transkripce a translace. Encyclopedia Brittanica. Transkripce je regulována pomocí tzv. transkripčních faktorů (TF), které se váží na promotorové oblasti cílových genů. Celá řada signálních drah ovlivňuje chování TF – jejich schopnost vázat se na cílové sekvence, stabilitu a lokalizaci. Regulace transkripce bude probrána v rámci podkapitoly Genová regulace. Vzniklá mRNA je transportována z jádra do cytoplazmy, kde dochází k translaci. 1.5.3. Translace Translace, tedy přepis informace z mRNA do primární struktury proteinu, probíhá na ribozómech. Ribozóm se skládá z malé a velké podjednotky a tvoří jej RNA s funkcí katalyzátoru a podpůrné proteiny. Molekula mRNA slouží jako matrice. K ribozómu dále přistupují tRNA, které mají v jedné části molekuly navázané příslušné aminokyseliny a jiné části molekuly obsahují sekvenci tří nukleotidů (kodonů) specifických pro každou aminokyselinu. Nukleotidová sekvence tRNA je komplementární k sekvenci v mRNA a tedy pořadí trojic nukleotidů (tripletů, kodonů) v mRNA určuje pořadí aminokyselin ve vznikajícím proteinu. 1.5.4. Stručný náhled do regulace genové exprese 23 Genová regulace existuje ve všech živých organizmech a je naprosto nezbytná pro jejich adaptabilitu, díky ní jsou schopny exprimovat proteiny, když je potřebují. Existuje řada mechanizmů, kterými organizmy regulují transkripci genů a finální koncentraci kódovaného proteinu. Buňky jsou schopné ovlivnit v podstatě všechny kroky exprese genů od iniciace transkripce až po posttranslační modifikace proteinů. U mnohobuněčných organizmů genová regulace umožňuje diferenciaci tkání – tvorbu buněk s různým expresním profilem. Typy mechanizmů Prvním způsobem genové regulace je modifikace DNA. Vědní disciplína epigenetika studuje dlouhodobé změny transkripčního potenciálu buňky, které nejsou způsobené pořadím nukleotidů v DNA, ale jinými mechanizmy. Epigenetické změny na molekule DNA můžeme rozdělit na strukturální (způsob a hustota sbalení DNA má vliv na frekvenci transkripce) nebo chemickou (např. methylace DNA nebo acetylace histonů). Transkripce může být regulována i navázáním určitých proteinů na cílové úseky DNA. Některé modifikace jsou dědičné! Dále existuje regulace transkripce (např. transkripční faktory, viz dále), post-transkripční regulace (např. alternativní sestřih, regulace transportu mRNA) a regulace translace. Regulace transkripce Regulace transkripce je umožněna existencí transkripčních faktorů, které se váží na promotor, úsek DNA, na který se váže RNA polymerasa spolu s dalšími faktory. Ovlivňují sílu vazby RNA polymerasy k tomuto promotoru a tím i ovlivňují, zda RNA polymerasa bude vytvářet na daném úseku pre-mRNA. Existují tři druhy transkripčních faktorů: • • • Represory se váží k operátoru, kódující sekvenci v DNA řetězci, která je v prostorové blízkosti nebo přesahuje oblast promotoru. Tím zabraňuje RNA polymeráze v postupu podél řetězce DNA a tím omezuje expresi genu. Obecné transkripční faktory umístí RNA polymerasu na začátek sekvence kódující určitý protein, a pak ji uvolní a ona provede transkripci. Aktivátory posilují interakci mezi RNA polymerasou a promoterem, což zvýší expresi genu. Aktivátory to mohou učinit zvýšením přitažlivosti mezi RNA polymerasou a promotorem přímo prostřednictvím interakcí s podjednotkami RNA polymerasy nebo nepřímo změnou struktury DNA. Transkripční faktory jsou klíčové molekuly při syntéze proteinů a hrají tak důležitou roli v podstatě ve všech buněčných procesech. Některé z nich jsou proto-onkogeny (normální geny, jejichž mutací vzniká onkogen), jiné ovlivňují nádorové supresory. Jsou schopné ovlivnit, jaké velikosti může buňka dosáhnout a také určit, kdy se rozdělí na dvě dceřiné. V nádorových buňkách jsou exprimovány jiné geny než v buňkách zdravé tkáně. Exprese je často spuštěna ovlivněním transkripčních faktorů pomocí signálních drah, které jsou v normálních buňkách neaktivní. Blokací těchto signálních drah může dojít k omezení 24 exprese proteinu důležitého pro nádor, čímž dojde o omezení jeho růstu. Tímto mechanizmem fungují například kinasové inhibitory. V této oblasti probíhá intenzivní výzkum a vypadá to, že řada cytostatik s dosud neznámými mechanizmy účinku blokuje signální dráhy vedoucí k aktivaci/deaktivaci transkripčních faktorů důležitých pro růst nádorů. Obrázek 11. Příklad funkce transkripčního faktoru – represoru transkripce enzymu laktasy. 1: RNA Polymerasa, 2: Represor, 3: Promotor, 4: Operátor, 5: Laktóza, 6 – 8 geny. Nahoře: represor je připojený k operátoru a brání RNA polymeráze v syntéze pre-mRNA kódující enzym laktasa. Dole: v buňce se kvůli nedostatku laktasy nahromadila laktóza. Represor má pro laktózu vazebné místo a dosáhne-li její koncentrace v buňce určité hladiny, laktóza se do něj naváže. Tím se oslabí vazba represoru k operátoru, represor se uvolní a RNA polymerasa provede transkripci, v buňce dojde k translaci a vzniknou molekuly laktasy. Laktasa rozštěpí laktózu, tím klesne její koncentrace, molekuly laktózy oddisociují z vazebných míst na represorech a represor znovu nasedne na operátor, čímž zastaví transkripci genu laktasy. Po čase se koncentrace laktasy zmenší, dojde k nahromadění laktózy a cyklus se zopakuje. Pro snazší pochopitelnost zde ukazujeme modelový bakteriální systém, u eukaryot (živočichů), kterých se týká tato kapitola, je funkce TF podstatně složitější záležitost. http://en.wikipedia.org/wiki/Repressor Post transkripční regulace RNA interference: RNA-interference (RNAi) je proces vedoucí k umlčení (silencing) endogenních genů. RNA ve formě dvoušroubovice (dsRNA) je eukaryotickou buňkou vnímána jako cizorodá a potenciálně nebezpečná molekula, obvykle virového nebo bakteriálního původu. Proto se vyvinul důmyslný mechanizmus sloužící k její likvidaci. V průběhu evoluce začaly organizmy využívat stejný mechanizmus i pro kontrolu exprese 25 vlastních genů. Proces funguje prostřednictvím krátkých RNA (RNAi), které jsou komplementární k určitým úsekům mRNA, kódujícím cílový protein, jehož koncentrace má být snížena. V případě potřeby omezit translaci tohoto genu buňka vyrobí RNAi (v tomto případě se nazývá microRNA) komplementární s jeho mRNA. RNAi může s mRNA vytvořit duplex, což samo o sobě zpomaluje translaci na ribozómu, pro niž je nutná volná jednořetězová mRNA. Dále může vyvolat štěpení mRNA speciální nukleasou anebo v komplexu s proteiny (P-bodies), kde se sice mRNA může nacházet i neporušená, ale existuje několik mechanizmů, které ji mohou degradovat. V každém případě tento proces vede ke snížení koncentrace cílového proteinu v buňce. Obrázek 12. Původ siRNA a miRNA. Srovnání exogenní (modrá, siRNA) a endogenní (zelená, miRNA) RNA interference. Exogenní RNAi může být do buňky dodána buď formou transgenního vektoru a transkribována in vivo do shRNA-mir nebo shRNA (short hairpin RNA), které se dále chovají analogicky jako pri-miRNA nebo pre-miRNA. Další možností je zavést siRNA duplexy přímo do cytoplazmy a tak způsobit RNA interferenci. Xue Gao , Pumin Zhang; Physiology 22, 161-166, 2007. http://physiologyonline.physiology.org/content/22/3/161 26 Obrázek 13. RNAi mechanizmus, rozlišení osudu mRNA v závislosti na komplementaritě RNAi s cílovou mRNA. Kim and Rossi Nature Reviews Genetics 8, 173–184 (March 2007) | doi:10.1038/nrg2006 Mechanizmus je následující. Krátké úseky RNAi (21–23 nukleotidů), které jsou schopné umlčení genů způsobit, můžeme rozdělit dle původu na siRNA a microRNA (miRNA). SiRNA (short interfering RNA) se vyznačují tím, že jejich prekurzory – delší úseky dsRNA – jsou do buňky transportovány zvnějšku (infekce, experiment, léčivo). Pomocí nukleasy/helikasy DICER jsou tyto prekurzory zkráceny na požadovanou délku a je z nich uvolněna jednovláknová siRNA. MiRNA se vyznačuje tím, že pochází z vlastní buňky. Vznikají tak, že v jádře je RNA polymerasami vytvořena tzv. pri-miRNA, dlouhý řetězec RNA, který má určité úseky k sobě komplementární a obsahuje tzv. vlásenkové struktury. Pri-miRNA je štěpena ještě v jádře nukleasovým systémem na pre-miRNA. PremiRNA je potom transportována z jádra do cytoplazmy proteinem exportinem. Tam je dále odštěpen požadovaný úsek dvouvláknové RNA pomocí jiné nukleasy (např. DICER), který je následně rozpojen na dva samostatné řetězce (DICER má i helikasovou aktivitu). Od tohoto okamžiku se siRNA a miRNA chovají podobně. SiRNA/miRNA se naváže na další nukleasu, například argonauta (na obrázku je AGO2) a na RISC (RNA induced silencing 27 complex) a tento superkomplex vytvoří duplex s cílovou mRNA. Nakonec argonaut rozštěpí tuto cílovou mRNA. Alternativní možnost nastává, pokud není siRNA nebo miRNA dokonale (nebo téměř dokonale) komplementární k cílové mRNA. Pak dojde k represi transkripce (může se vytvořit duplex bez nukleasy apod.) anebo může dojít k sequestraci mRNA do P-bodies (komplexů mRNA s proteiny, kde může dojít ke štěpení mRNA nebo jejímu uskladnění). 1.6. Principy stavby virů, jejich taxonomie Viry jsou patogeny na hranici živých organizmů a neživé hmoty, ke své reprodukci potřebují buňku a dodnes se o jejich vzniku vedou spory. Označují se také jako tzv. nebuněčné organizmy. Virové částici se říká virion. Nejjednodušší viry obsahují pouze svoji genetickou informaci ve formě DNA nebo RNA a několik málo proteinů tvořících virový obal a kapsidu. Proteiny jsou v kapsidě uspořádány symetricky a opakovaně v tzv. podjednotkách, výsledný útvar – nukleokapsida – je helikální nebo ikosohedrální dvacetistěn. Složitější viry mohou navíc obsahovat 1–2 obalové membrány pocházející z napadené buňky. Vnější membrána obvykle obsahuje virové proteiny, sloužící k rozpoznání hostitelské buňky a k usnadnění průniku. Viry mohou obsahovat i enzymy, které jim mají usnadnit invazi do buňky a expresi své DNA či RNA. Příkladem těchto enzymů mohou být virové DNA nebo RNA polymerasy, integrasa, reversní transkriptasa atd. Viry nemohou samostatně existovat, bez hostitelské buňky se nemohou samy reprodukovat a ani skladovat volnou energii. Buňka a její replikační, transkripční a translační aparát pak slouží viru k replikaci a vyrábí molekuly potřebné pro vznik nových virů. Poté, co se v buňce vytvoří dostatek materiálu na stavbu nových virů, dochází k jejich uvolnění z buňky (a případně její destrukci). Nové viry se šíří dál i mimo napadený organizmus. Tento proces se nazývá lytický cyklus. 1.6.1. Klasifikace virů Klasifikace virů podle hostitele Viry prokaryot (např. bakteriofágy) Rostlinné viry Živočišné viry – (např. hmyzí, obratlovců) Viry hub (mykofágy) Klasifikace virů podle morfologie kapsidy a její geometrické symetrie Ikosaedrální kapsida – Ikosaedr – dvacetistěn, je trojrozměrné těleso v prostoru, jehož stěny tvoří dvacet stejných rovnostranných trojúhelníků. Virus musí celý tento útvar vystavět z proteinů. Bude-li umístěn jeden virový protein do každého rohu všech trojúhelníků, vychází minimální požadavek na 60 kapsidových proteinů. Jsou možné i násobky čísla 60, ty jsou pro každý druh viru charakteristické a udává je tzv. triangulační číslo. Tento typ kapsidy má např. virus dětské obrny nebo herpetické viry. 28 Helikální kapsida – má ji např. virus chřipky nebo virus tabákové mozaiky. Má zpravidla válcovitý až vláknitý tvar a je tedy zorientována podél jediné, podélné osy. Vzniká šroubovicovitým kladením kapsidových proteinů kolem dokola s pozvolným stoupáním. Pro helikální kapsidy je typické, že se na ně nukleová kyselina zevnitř váže a stáčí, čímž poměrně věrně kopíruje jejich šroubovicovité uspořádání. Klasifikace virů podle typu genoforu (struktury nesoucí genetickou informaci) – podle charakteru nukleové kyseliny, která může být jednovláknová i dvouvláknová DNA viry RNA viry Retroviry – (+) ssRNA viry nesoucí nebo využívající reversní transkriptasu 1.7. Životní cyklus virů Zatímco buňky obsahují celý aparát pro replikaci, transkripci a translaci a jsou schopné samostatně fungovat, u virů řada procesů probíhá pouze v součinnosti s aparátem hostitelské buňky. Pro srovnání viz Obr. 14, kde je schematicky znázorněný princip replikace eukaryotních nebo prokaryotních organizmů. Obrázek 14. Schéma replikace, transkripce a translace v prokaryotických a eukaryotických organizmech. 29 1.7.1. Rozmnožování jednotlivých typů virů Rozmnožování i proteosyntéza virů mají jisté odlišnosti od buněčných organizmů (Obr. 15 a 16). DNA viry mají svou genetickou informaci ve formě DNA. Po napadení buňky se virální DNA dostává do jádra hostitelské buňky (někdy se integruje a někdy ne) a je dále využita k replikaci, transkripci a následné translaci, které poskytují dostatek virových proteinů, např. DNA polymeráz, proteinů tvořících kapsidu apod. K replikaci jsou používané buď speciální virové DNA helikasy/primasy a polymerasy nebo replikační aparát buňky. V druhém případě virus může ovlivnit buněčný cyklus, navést buňku do fáze mitózy a někdy tím nastartovat nádorové onemocnění. Transkripce a translace probíhá v systémech hostitelské buňky. Schematické znázornění rozmnožování DNA virů je v Obr. 15. Rozpoznání, proniknutí, rozbalení a přenos DNA do jádra Obrázek 15. Schéma množení DNA virů. RNA viry mají svoji genetickou informaci uloženou v RNA řetězci a rozlišujeme je dle orientace tohoto řetězce na (+) a (-); (+) znamená, že má stejnou orientaci jako mRNA. (-) ssRNA viry obsahují genetickou informaci ve formě negativního RNA řetězce. Při replikaci virová polymerasa replikuje tento řetězec do pozitivního řetězce a z něj se vytvoří mRNA. Na základě této mRNA se syntetizují virové proteiny. Dále virová polymerasa 30 replikuje tyto pozitivní řetězce zpět do negativních, ty potom asociují s virovými proteiny a tvoří základ nového virionu (Obr. 16). (+) ssRNA viry obsahují genetickou informaci ve formě pozitivního RNA řetězce, která je po úpravě hned použitelná jako mRNA. Pro rozmnožení viru je ale zapotřebí její replikace, která nejdřív vyrobí negativní RNA řetězec, a ten je zpětně replikován na kvantum pozitivních řetězců (Obr. 16). Retroviry obsahují (+) ssRNA řetězec, ale jejich rozmnožování je složitější. Nejdříve dojde k reversní transkripci tohoto řetězce do negativního řetězce DNA enzymem reversní transkriptasou. Tento řetězec je dále replikován do pozitivního DNA řetězce, který vytvoří s negativním řetězcem DNA duplex. Enzym integrasa přenese tento duplex do jádra hostitelské buňky, rozštěpí jadernou DNA a integruje do ní virální DNA. Dále probíhá replikace i transkripce s translací stejně jako u DNA virů (Obr. 15). Obrázek 16. Schéma množení různých typů RNA virů. Poznámky pod čarou: Viry si s sebou obvykle nesou základní sadu enzymů nezbytnou pro jejich rozmnožení v hostitelské buňce, ale v průběhu infekce se na základě virové genetické informace vytváří množství materiálu (nukleových kyselin, polymeráz, kapsidových proteinů, receptorů atd.) potřebného pro vznik nových virových částic. Nakonec při určité koncentraci těchto částic uvnitř buňky dojde k uvolňování nových virů z jejího povrchu, lýze a k zániku buňky. Genetická informace RNA virů bývá uvnitř virové částice ve formě několika řetězců RNA, nikoliv jen jednoho. Virové proteiny často vznikají jako jeden polyprotein a virus obsahuje speciální proteasu, která tento polyprotein štěpí na specifické 31 proteiny. Tato proteasa, podobně jako virové primasy, polymerasy a integrasy, může být cílem antivirotik. 1.7.2 Jednotlivé fáze životního cyklu virů 1. Adsorpce na povrch buněk – virus je rozpoznán určitými receptory (protein, cukr, lipid) na povrchu buněk, obvykle se jedná o iontové interakce mezi receptorem buňky a virovým receptor-vazebným proteinem. Buňka bez příslušného receptoru nemůže být atakována. 2. Penetrace – vstup do buňky obvykle probíhá tzv. endocytózou, může dojít i k fúzi s plazmatickou membránou, nebo přímo k přechodu přes plazmatickou membránu. 3. Obnažení infekční nukleové kyseliny – rozbalení virionu a uvolnění virové NK, případně i proteinů důležitých pro reprodukci virů (polymeráz, reversní transkriptasy, proteas apod.) 4. Syntéza virových nukleových kyselin replikace RNA a DNA transkripce do mRNA 5. Translace virových proteinů 6. Skládání (maturace, zrání) virionů 7. Uvolnění nových virionů z buňky 1.7.3. Cesty infekce organizmu viry infekcí buněk sliznice – dojde k onemocnění horních cest dýchacích nebo zažívacího traktu (rhinoviry, influenzaviry, coronaviry, rotaviry, RSV) infekce buněk sliznice a následný přenos nervovými vlákny nebo krví – dojde k onemocnění v cílových tkáních (herpesviry, picornaviry, poxviry; spalničky, příušnice) přímým přenosem krví – dojde k onemocnění v cílových buňkách nebo tkáních (flaviviry, alfaviry, bunyaviry, HIV, HBV; vzteklina) 1.7.4. Některé pojmy související s viry infekčnost – míra schopnosti viru infikovat buňku – kvantitativní měřítko, vyjadřuje se v infekčních jednotkách, např. PFU (plaque formation unit), titru viru střední infekční dávka – ID50 – stačí k infekci poloviny přítomných jedinců (buněk, zvířat) latentní infekce – infekce, při níž nelze až do aktivace prokázat přítomnost infekčních virových částic viremie – přítomnost virových částic v krvi virurie – přítomnost virových částí v moči virulence – schopnost vyvolat onemocnění 1.8. Viry a nádorová onemocnění Bylo prokázáno, že mnohé viry mohou indukovat nádorová onemocnění. Nádorové onemocnění může být způsobeno různými typy virů, jak DNA viry tak RNA viry. Poprvé byla souvislost nádorového onemocnění a virové infekce rozpoznána u rakoviny děložního čípku způsobené lidským papilomavirem (HPV). Z dalších prokázaných onemocnění jsou to pak hepatocelulární karcinom způsobovaný virem žloutenky typu C (HCV virus); 32 Burkittův lymfom, nasofaryngeální karcinom a Hodgkinův lymfom způsobované virem Epstein-Barrové (EBV virus, mononukleóza); mozkové nádory způsobované JC virem (John Cunningham polyoma virus). Onkoviry vyvolávají nádorová onemocnění jen u malého procenta pacientů, velmi často je za jeho rozvoj zodpovědný souběh infekce příslušným onkovirem a imunodeficience pacienta (nedostatečnosti imunity) způsobené např. pokročilou infekcí HIV, jiným onkologickým onemocněním nebo imunosupresivy podávanými např. při transplantacích apod. Dalšími významnými vlivy jsou genetická predispozice a s ní související vrozená imunita pacienta. 1.9. Vakcíny Vakcíny jsou přípravky, které se podávají živým organizmům k vyvolání imunity, které je podmíněno imunitní odpovědí vůči antigenům na povrchu virionu. Většina vakcín sníží pravděpodobnost infekce očkovaného a v populaci zabrání vzniku epidemií, ale k jednotlivým případům onemocnění stále může docházet. Z toho vyplývá nutnost vývoje antivirotik i proti chorobám, na které máme účinné vakcíny. Vakcína musí být účinná, neškodná a dobře imunogenní. Kolektivní imunita je stav, kdy je populace proočkována nad určitý limit. V tom případě je v ní natolik malé množství potenciálně infikovatelných jedinců, že se virus nemůže efektivně šířit, nevzniká epidemie, i když k ojedinělým nákazám může dojít. Např. u viru spalniček je nutná proočkovanost >95 %, aby se zabránilo vzniku epidemie. Důkladným očkováním byla úplně eradikována infekce pravých neštovic. Dle mezinárodní úmluvy je dnes virus pravých neštovic uchováván pouze ve dvou přísně střežených medicínských centrech v USA a Rusku. Poznámky pod čarou: Plošné očkování proti spalničkám je u nás zavedeno od roku 1969, do té doby se vyskytovalo ročně asi 60 000 až 80 000 případů, z nichž 50–100 končilo smrtí pacienty. V letech 1996 se již objevilo pouze 10 případů, v roce 1997 14 případů, v roce 1998 – 19 případů, a v roce 1999 – 1 případ. Naproti tomu Nizozemí v roce 1999 zaznamenalo epidemii spalniček v oblasti tzv. „Bible Belt,“ kde 85 % populace odmítá z náboženských důvodů očkování. Vyskytlo se 2300 případů, 3 úmrtí, v 53 případech pak komplikace s vážnými následky. V současnosti (2013–2014) propuká epidemie spalniček v USA, kde byla tato nemoc v roce 2000 označena za vymýcenou. Souvisí to s obavami rodičů, že vakcinace vyvolává autismus. Tyto obavy vyvolal svojí podvodnou studií Dr. Andrew Wakerfield, a přestože byla opakovaně vyvrácena, laická veřejnost je jí stále do určité míry ovlivněna. Vzhledem k dobrovolnosti vakcinace na území USA proto klesla na mnoha místech proočkovanost populace pod úroveň nutnou pro navození/udržení kolektivní imunity a cestovatelé do zemí, kde se spalničky ještě běžně vyskytují, zavlekli virus zpět do USA. Takovéto antivakcinační kampaně jsou velmi nebezpečné zejména proto, že část lidské populace nemůže být očkována ze zdravotních důvodů (např. imunodeficience, alergie apod.) a musí tak spoléhat právě na účinek kolektivní imunity, která chrání i je. 1.9.1. Typy vakcín Tradiční typy vakcín 33 Živá vakcína (vakcína s živým virem) Virulentní – už se nepoužívá (např. variolizace, dnes se z nouze zkouší u pacientů nakažených ebolou, protože zatím není jiná oficiální léčba krom podpůrné). Heterologní – použití kmene, který u člověka nevyvolává onemocnění, ale má podobnou strukturu antigenu (vakcinace proti variole). Atenuovaná – virus kultivovaný v buňkách cizích hostitelů ztrácí infekčnost. Inaktivovaná Celobuněčná – často používaná u bakteriálních infekcí, používají se celé bakteriální buňky, které jsou ale umrtvené, takže nemohou způsobit infekci. Toxoidová – část organismu, obvykle toxin zbavený toxického účinku (toxoid, často se toxicita ztrácí inkubací s formaldehydem). Subjednotková S purifikovaným antigenem – antigen je izolován z původce onemocnění. Se syntetickým antigenem – antigen je uměle připravený. Ribozomální – ribozómy izolované z bakterií působících onemocnění jsou schopné navodit imunitu proti těmto bakteriím. Rekombinantní typy vakcín Subjednotková S deletovaným genem – používá se mikroorganismus, u něhož byl odstraněn jeden nebo více genů a stal se tak neinfekční. Vektorová – vektor kódující specifický antigen se vloží do neškodné bakterie, např. e. coli a na jejím povrchu se vytvoří tyto antigeny. Lidský organizmus si pak proti nim vyvine imunitní odpověď. DNA vakcíny Do organizmu se vpraví vektor, úsek DNA (např. plazmid), obsahující geny pro jeden nebo dva specifické antigeny z původce onemocnění. Přítomnost těchto antigenů vyvolá imunitní odpověď a vytvoření protilátek. Tyto protilátky pak vakcinovaného chrání před případnou infekcí. Vektory pro antigeny musí být vysoce expresní, obvykle obsahují silný virový promoter, který zajistí, že je hodně exprimován a vysoká koncentrace antigenů napomůže vytvořit dostatečné množství protilátek. Nejdůležitější protivirové vakcíny jsou v současné době proti těmto nemocem: Variola (ve většině zemí byl tento program ukončen, dnes opět nabývá na významu – bioterorismus), polio (obrna), žlutá zimnice, spalničky, zarděnky, vzteklina, hepatitida B, chřipka a klíšťová encefalitida. 34 1.10. Viry způsobující závažná onemocnění a epidemie u lidí RNA viry Čeleď Paramyxoviridae: Rody Paramyxovirus (parainfluenza 1–4), Morbillivirus (spalničky), Rubulavirus (příušnice), Pneumovirus (RSV). Čeleď Rhabdoviridae: Lyssavirus (vzteklina). Čeleď Filoviridae: Ebolavirus (Marburgská hemoragická horečka, Ebola). Čeleď Orthomyxoviridae: Influenzavirus (Chřipka A, B, C). Čeleď Bunyaviridae: Rody Bunyavirus (kalifornská encefalitida, Tahyna), Phlebovirus (horečka papatači – sandfly fever, horečka Rift Valley), Nairovirus (krymská hemoragická horečka), Hantavirus (Hantaan virus). Čeleď Arenaviridae: Rody Arenavirus (hemoragické horečky Lassa, Machupo, Junin), Deltavirus (hepatitida delta). Čeleď Picornaviridae: Enterovirus (poliovirus 1–3, obrna; coxsackie A1-A22, B1-B6), Rhinovirus 1–113 (rýmy), Hepatovirus (hepatitida A), Cardiovirus (encefalomyokarditida), Parechovirus (echovirus). Čeleď Caliciviridae: Cardiovirus (hepatitida E). Čeleď Astroviridae: Astrovirus (lidský astrovirus způsobující gastroenteritidy). Čeleď Coronaviridae: Coronavirus (virus infekční bronchitidy). Čeleď Togaviridae: Rody Alfavirus (viry encefalitid koní), Rubivirus (zarděnky). Čeleď Flaviviridae: Rody Flavivirus (virus žluté zimnice, horečky dengue, klíšťové, japonské a západonilské encefalitidy), Hepacivirus (hepatitida C). Čeleď Reoviridae: Rody Rotavirus (rotavirus A), Coltivirus (virus koloradské klíšťové horečky), Orbivirus (virus horečky Orungo, Kemerovo). DNA viry Čeleď Parvoviridae: Dependovirus (adeno asociovaný virus 2). Čeleď Papilomaviridae: Papillomavirus (HPV 1–48, papilomaviry, 9 kmenů prokazatelně působí nádorová onemocnění). Čeleď Polyomaviridae: Polyomavirus (progresivní leukoencefalopatie). Čeleď Adenoviridae: Mastadenovirus (lidské adenoviry, adenovirové pneumonie, konjunktivitidy) Čeleď Poxviridae: Chordopoxvirus (variola – kravské neštovice, vaccinia), Molluscipoxvirus (molluscum contagiosum). Čeleď Herpesviridae: Rody Simplexvirus (HSV-1 – orální herpes, HSV-2 – genitální herpes), Varicellavirus (VZV – varicella zoster virus, plané neštovice, pásový opar), Cytomegalovirus (HCMV, retinitida), Roseolovirus (HHV-6, HHV-7 – roseola infantum, šestá nemoc), Lymphocryptovirus (Epstein-Barr virus – EBV, HHV-4, mononukleóza, Burkitův lymfom, HHV-8, Kaposiho sarkom). Retroviry a viry používající reversní transkriptasu Čeleď Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus (hepatitida B). Tyto viry mají svojí genetickou informaci uloženou ve formě DNA. Replikují se ale prostřednictvím RNA intermediátu, který musí být dále replikován zpět do DNA (cDNA) pomocí reversní transkriptasy. Čeleď Retroviridae: Rody Oncovirus, Spumavirus (lidský spumavirus), Lentivirus (HIV, Maedi/Visna, FIV, SIV) 35 1.11. Terapie onemocnění člověka způsobených viry Pro řadu virových onemocnění jsou již vyvinuté vakcíny. Běžně dostupné a používané jsou pro polioviry (obrna), hepatitidu A a B, zarděnky, žlutou zimnici, horečku dengue, klíšťovou encefalitidu, vzteklinu, příušnice, spalničky, chřipková onemocnění, papillomaviry, variolu. Pro mnohé viry existuje také dostupná farmakoterapie. Jsou to např. hepatitida B a C, chřipka, HIV, herpesviry (HSV1 a HSV2, varicella zoster, cytomegalovirus). Řada antivirotik je v současnosti také ve vývoji a i pro infekce, které mají v praxi používaná terapeutika, se hledají nová léčiva, výhodná například při vzniku rezistencí. Přes všechny úspěchy v léčbě virových onemocnění stále existuje řada infekcí, na které ani vakcíny, ani lékové terapie neexistují. Jako příklady jmenujme v současnosti (2014) velké problémy způsobující virus eboly, ale také řadu dalších exotických virů (Lassa, Sandfly, West Nile), hemoragické horečky, z herpesvirů pak je to mononukleóza. V těchto případech je obvyklou terapií podpůrná léčba na jednotkách intenzivní péče, kde jsou pacientům zajištěny všechny tělesné funkce, ale organizmus se s viry musí vypořádat sám. Zvláštním případem je infekce retroviry (HIV), kde sice existuje účinná chemoterapie, ale vzhledem k faktu, že virová DNA je integrována do genetické informace v jádře napadených buněk, se dosud u nikoho nepodařilo virus z těla úplně odstranit. Léčba však prodlužuje život pacientů o desítky let a nemoc se tak stává spíše chronickým onemocněním. 1.12. Virové infekce, které v minulosti způsobily závažné epidemie Z historického hlediska byly asi nejzávažnějšími virovými infekcemi pandemie pravých neštovic a chřipky, které zapříčinily miliony úmrtí, v současnosti je pak velmi závažnou pandemie HIV. Ostatní epidemie byly spíše lokálního charakteru a s výrazně menším počtem obětí. V posledním roce (2014) se stává problémem stále sílící epidemie eboly. Pravé neštovice Tato nemoc je jedinou lidskou infekcí, která byla již zcela vymýcena vakcinací. Od roku 1977 se nevyskytly žádné případy, neštovice však provázely lidstvo od starověku a měly výrazný vliv na průběh dějin. Ročně na pravé neštovice umíraly stovky tisíc lidí, při velkých epidemiích to pak bylo řádově víc. Data WHO ukazují, že ještě v roce 1967 bylo nakaženo touto nemocí 15 miliónů lidí a 2 milióny zemřely. Odpradávna byla zkoušena imunizace pomocí vdechování suchých strupů nebo hlenů z nakažených lidí, tento materiál obsahuje většinou neaktivní viriony a imunitu skutečně vytvoří, metodě se říká variolizace. Při této proceduře však vzhledem k virulenci varioly docházelo u mnoha lidí k infekci, která sice měla mírnější projevy než obvyklá infekce, ale stejně vedla u asi 1–2 % (dle některých zdrojů až 5 %) variolizovaných ke smrti, infikovaní byli navíc schopni infekci dál šířit. Roku 1796 pozoroval Dr. Edward Jenner, že imunitu je možno zajistit i tak, že se lidé naočkují virem kravských neštovic. Tento virus je příbuzný variole, nezpůsobuje však zdaleka tak vážné následky jako virus pravých neštovic. Nazval toto očkování vaccine z latinského vacca (kráva) a původce neštovic nazval virus. Během 19. století byl virus kravských neštovic nahrazen virem vaccinia, jak k tomu došlo, není známo. Dnes se očkuje živou vakcínou vaccinie obvykle do ramene, která na místě vpichu 36 udělá velký puchýř, ten se časem vyprázdní a na místě vznikne strup a posléze jizva. Vytvořené protilátky fungují proti všem virům ze skupiny orthopoxvirus a dostatečná ochrana se vytváří u 95 % očkovaných lidí. Vakcína má i vedlejší účinky a u asi 1 člověka z 1000 dochází k závažnějším alergickým reakcím, u zhruba 1 člověka z miliónu pak ke smrti způsobené post vakcinační encefalitidou nebo vážnou nekrózou šířící se z místa vpichu. Proto byla po potvrzení kompletní eradikace viru plošná vakcinace ukončena. K totálnímu vymýcení varioly pomohla, krom usilovné systematické vakcinace (program WHO byl vedený českým epidemiologem Karlem Raškou), i šťastná souhra několika okolností. Asi nejdůležitější je, že virus napadá pouze člověka, a tak neexistuje přirozený rezervoár v přírodě, živočišný druh, ve kterém by virus po jeho vyhubení mezi lidmi přežil a po nějaké době znovu přešel na lidi. Druhým faktem je, že se jedná o DNA virus, který mutuje daleko méně než např. chřipkové viry, a tak se nestačil přizpůsobit selekčnímu tlaku a přežít systematickou vakcinaci. Třetí výhoda je, že infekce jinými a daleko méně nebezpečnými viry ze stejné skupiny navozuje dostatečnou imunitu proti všem virům této skupiny. Naneštěstí viry eboly, chřipky nebo HIV nesplňují ani jednu tuto podmínku a jejich kompletní eradikace bude daleko komplikovanější a nejspíš není možná. Poliovirus Polioviry jsou původci dětské obrny. Přestože je pravděpodobné, že tato infekce provázela lidstvo již od starověku, až koncem 19. a ve 20. století se stala postrachem lidí během letních měsíců. Šíří se hleny a kontaktem mezi lidmi, u většiny pacientů se projeví mírně, ale u 1 – 2 % se virus dostane do nervové soustavy, kde způsobuje závažné infekce vedoucí až k dočasné nebo trvalé invaliditě, případně ke smrti. Paradoxně se projevy této infekce na lidskou populaci začaly zhoršovat se zlepšujícími se hygienickými standardy. Možné vysvětlení uvádí, že ve špinavém prostředí se nejspíš děti infikovaly velmi brzy, když byl jejich imunitní systém podpořen protilátkami od matky a vyvinuli si tak imunitu. Při dostatečné hygieně pak docházelo k infekci později a se závažnějším průběhem. Infekce polioviry je dnes velmi dobře řešitelná vakcinací, jichž existují dva typy a tak se povedlo polio ve většině zemí světa eradikovat. Je poměrně velká šance na úplnou eradikaci i této virové infekce. Chřipka Chřipka je jedno z nejběžnějších virových onemocnění, které způsobuje stovky tisíc úmrtí ročně, obvykle u starších nebo imunosuprimovaných pacientů, pro většinu populace však není chřipková infekce fatální. Existuje více kmenů virů chřipky a čas od času, když se různé kmeny těchto (-) ssRNA virů potkají v jednom hostiteli, zkombinují segmenty genomu do agresivní formy (genetický shift), která je schopná vyvolat pandemie s milióny mrtvými. Viry chřipky mají 11 vlastních proteinů. Ty jsou kódované ve formě sedmi nebo osmi krátkých samostatných úseků RNA. U chřipkových virů dochází k častým mutacím, protože virová RNA polymerasa, která je nutná pro replikaci viru, nemá opravnou funkci a sama o sobě pracuje s průměrnou chybovostí 1 mutace na 1000 inkorporovaných nukleotidů. Z hlediska systematiky patří virus chřipky mezi Orthomyxoviry, pro které je charakteristická afinita k mukopolysacharidům (myxa = sliz) zakončených kyselinou sialovou (fungují jako receptory). Existují tři kmeny: A (výskyt u savců a člověka, mohou se 37 vzájemně infikovat), B (výskyt pouze u člověka) a C (výskyt u člověka a prasat). Virus má průměrnou morbiditu (nemocnost) asi 10 % u dospělé populace a 30 % u dětí. Významná je vysoká morbidita a mortalita v kategorii nad 65 let (např. v USA 10–40 tisíc úmrtí ročně, ekonomické náklady cca 12 miliard US $ ročně). Pandemie chřipky: opakují se po 10–40 letech, postihují až 50 % světové populace, z nejvýznamnějších pandemií jsou popsány: Ruská chřipka (1889) – cca 1 mil. mrtvých (typ H2N2) Španělská chřipka (1918) – cca 20 mil. obětí (typ H1N1) Asijská chřipka (1957) – cca 1 – 1.5 mil obětí (typ H2N2) Hongkongská chřipka (1968) – cca ¾ mil – 1 mil. obětí (typ H3N2) Mexická chřipka (2009) – (typ H1N1) Obrázek 17. Virus chřipky. Virion chřipky má dva hlavní povrchové proteiny: HEMAGLUTININ – zprostředkovává vazby mezi virionem a receptory na povrchu buněk respiračního traktu obsahujících vazby kyseliny sialové (typy H1-H13); NEURAMINIDASA – umožňuje uvolnění nových virionů z povrchu buňky a zabraňuje jejich agregaci – štěpí terminální vazby sialové kyseliny hostitelské buňky (typy N1-N9). Inhibitory neuraminidasy nesnižují infekčnost viru, ale omezují jeho šíření. Vakcíny proti chřipce mají nízkou účinnost, cca 70 – 90 % a vzhledem k častým mutacím virů je nutné každoročně vyvíjet vakcíny nové a opakovat očkování. Mutace obvykle způsobují drobné změny ve struktuře neuraminidasy i hemaglutininu, dochází k tzv. antigenovému driftu a postupně se vyvine kmen, který je více či méně rezistentní proti existujícím protilátkám, a tím protilátky částečně ztrácí účinnost. 38 Dalším problémem je, že viry mají několik přirozených rezervoárů (ptáci, prasata), čas od času se v jednom hostiteli sejde několik odlišných kmenů virů, které si navzájem vymění geny kódující pro ně vhodné proteiny a vznikne tak kmen s novou kombinací genů (antigenový shift). Tyto nové kmeny jsou natolik odlišné proti svým předchůdcům, že existující protilátky proti nim nejsou účinné vůbec. U antigenového driftu, kde část lidské populace je vzhledem k podobnostem nového viru s jeho předchůdci imunní, nejsou epidemie tak závažné. Kmeny vzniklé antigenovým shiftem jsou naopak schopné vyvolat pandemie s miliony mrtvých. Obrázek 18. Protichřipková léčiva. Tabulka 2. Přehled protichřipkových látek. Komerční název Symmetrel Mantadix Amantan Flumadine Relenza Tamiflu Virazole, Virazid, Viramid Generický název amantadin rimantidin zanamavir oseltamivir ribavirin Výrobce Novartis Aliance/Valeant Roche Pharmaceuticals Forest Laboratories GlaxoSmithKline Roche Pharmaceuticals Valeant Pharmaceuticals HIV Virus HIV je virus obsahující genetickou informaci ve formě (+) ssRNA řetězce, ale na rozdíl od RNA virů je k jeho multiplikaci nutná reversní transkripce tohoto RNA řetězce do (-) DNA řetězce zprostředkovaná enzymem reversní transkriptasa. Tento enzym dále zkopíruje (-) DNA řetězec do (+) DNA a vznikne tak DNA duplex. Enzym integrasa přenese tento duplex do jádra hostitelské buňky a zabuduje ho do její DNA. Pak dochází k transkripci této virální DNA do RNA, z níž vzniká jak virální (+) ssRNA tak mRNA. Tyto ribonukleové kyseliny pak opustí jádro a mRNA slouží k translaci virálních genů do polyproteinu. Polyprotein pak virální proteasa štěpí na jednotlivé proteiny potřebné pro virus, např. proteiny kapsidy, povrchové antigeny, které viru umožňují rozpoznat cílové buňky, reversní transkriptasu, integrasu a proteasu. Virus se přenáší při pohlavním styku nebo při kontaktu s nakaženou krví (například při konzumaci syrového masa infikovaných lidoopů). Doba latence je několik týdnů až měsíců, 39 v této době není virus v pacientovi identifikovatelný obvyklými metodami, pak se vytváří protilátky, pomocí kterých lze infekci odhalit. Krátce po nákaze dochází k prudkému poklesu množství T-lymfocytů v krvi, ale jejich počet se brzy obnoví. Někdy dochází k projevům typickým pro virové infekce, bolení v krku, teplota apod. V následujícím období, které trvá i několik let, se infekce nijak neprojevuje, pouze pomalu klesá množství lymfocytů v krvi. Pokud je infekce neléčená, poklesne jejich počet pod určitou kritickou mez a pacientovi postupně selhává imunita, je napadán oportunními infekcemi a na ně obvykle po několika dalších letech umírá (AIDS – acquired immunodeficiency syndrom). Léčba v současnosti prodlužuje období, než propukne AIDS až na několik desítek let. Oportunními infekcemi jsou obvykle infekce kvasinkami (závažná je například meningitida způsobená houbou cryptococcus), herpesviry (způsobují často netypická maligní onemocnění jako Kaposiho sarkom, ale také retinitidu [CMV], pásový opar), tuberkulózou, salmonelou, hepatitidou B, bakteriemi způsobujícími průjmová onemocnění atd. Virus HIV má několik důležitých vlastností. Napadá pouze T-lymfocyty a další buňky s glykoproteinovým CD4 receptorem na svém povrchu. Vzhledem k tomu, že virová genetická informace je přímo integrována do genetické informace cílových buněk, neexistuje dosud způsob, jak pacienta nakaženého tímto virem kompletně této virové informace zbavit. Reversní transkriptasa je poměrně chybující enzym a tak virus často mutuje, což může vést k rezistencím. Vakcína neexistuje. Na druhou stranu má HIV virus hned několik specifických enzymů, které jsou nezbytné pro jeho replikaci a to jsou vhodné cíle chemoterapeutik. Existuje řada sloučenin inhibujících reversní transkriptasu, integrasu a proteasu a v současnosti se k léčbě používají formulace obsahující kombinace těchto sloučenin. Tím je zamezeno vzniku rezistencí a koncentrace viru v krvi pacienta se na dlouhá léta daří snížit pod detekovatelné hladiny. Onemocnění se tak stává spíše chronickým problémem s tím, že pacient musí jednou denně užít lék. Nedodržením režimu dochází k rezistencím. Konkrétní léčiva budou probrána v kapitole „Inhibitory jednotlivých stupňů multiplikace virů.“ Další virové infekce Picornaviry Tyto viry se replikují v cytoplazmě a jsou schopné se rozmnožovat i v buňkách bez jádra. Lyzují buňky (kromě hepatitidy A) a jsou charakteristické tím, že mají ikosahedrální kapsidu a nemají obálku. Příkladem je poliovirus se nejdříve množí na sliznici nosohltanu, v tenkém střevě (horečnaté onemocnění) a lymfatickém systému. Pokud nejsou v těle protilátky, dojde k pomnožení v CNS (paralytická fáze, asi u 1 % pacientů). Čeleď Picornavirus obsahuje rody Enterovirus (Poliovirus), Rhinovirus (viry rýmy), Hepatovirus A a Parechovirus (echovirus). Chemoterapie obvykle není, ale často existuje vakcína, která pomůže předejít onemocnění. Enteroviry dle statistik v USA způsobují 10–15 milionů případů ročně, mohou napadat CNS a jsou hlavními původci virových meningitid (600 tisíc ročně v USA), dále působí respirační onemocnění, záněty plic a neexistuje proti nim žádná chemoterapie. Rhinoviry dle statistik v USA způsobují asi 1 miliardu případů ročně (z toho 66 milionů vyžaduje lékařskou péči) a neexistuje proti nim žádná chemoterapie. 40 Hepatitida A je známá z Evropy, první zmínka se objevuje v 8. století, říká se jí také „nemoc špinavých rukou“ nebo „infekční žloutenka“ a její výskyt je asi 9 případů/100 000 obyvatel (USA). Není žádná chemoterapie. Flaviviry Flaviviry způsobují těžká onemocnění lidí a zvířat, přenášejí se např. členovci sajícími krev – komáři, klíšťata, patří mezi ně i klíšťová encefalitida (neurotropní) a horečka Dengue, dále žlutá zimnice (neurotropní, poškozuje játra a ledviny). Asi nejdůležitějším onemocněním způsobovaným flavivirem je Hepatitida C, proto jí budeme věnovat samostatnou podkapitolu: Hepacivirus – hepatitida C: Dříve „NON-A, NON-B;“ patří do čeledi Flaviviridae, rodu Hepacivirus a je častým původcem chronických virových hepatitid. V USA má 1,8 % populace protilátky, 74 % z nich má prokázanou chronickou infekci s virémií (číselně: 3,9 milionů nakaženo, 2,7 milionu trpí chronickým onemocněním). Během 10–30 let působí cirhózu jater a hepatocelulární karcinom (každoročně u 2–5 % u nakažených pacientů). V USA se ročně vyskytuje 8 000 -10 000 úmrtí, statistika pro celý svět uvádí, že na hepatitis C zemřelo 16 000 pacientů a 196 000 lidí zemřelo na karcinom jater vzniklý v souvislosti s touto infekcí. Hepatitida C je nejčastější příčina transplantací jater. Jedná se o (+) ssRNA virus, u infikovaného jedince vznikne cca trilion virových částic denně. Virální RNA polymerasa nemá opravnou funkci a dochází k rychlým mutacím. Virové proteiny jsou syntetizovány jako polyprotein, který je následně štěpen na jednotlivé strukturní a nestrukturní proteiny virální proteasou. Léčba HCV bude zmíněna v kapitole 5.6. Rotaviry Rotaviry jsou dsRNA viry způsobující často závažná průjmová onemocnění, velmi nebezpečné jsou tyto infekce u kojenců a malých dětí. Celkem se odhaduje 150 milionů případů ročně a 3 miliony mrtvých, zejména v rozvojových zemích. Vakcína existuje, ale její účinnost není dostatečně prokázána. Ve vazebných místech pro rotaviry v buňkách střevní sliznice jsou patrně glykokonjugáty s N-acetylneuraminovou kyselinou (Neu-Ac). Nadějnými kandidáty na terapeutikum se jeví syntetické sialylfosfolipidy, které jsou schopné vytvořit lipozomovou dvojvrstvu s Neu-Ac na povrchu buňky, která pak reaguje s virem a ten není schopen se navázat na buněčný receptor. Togaviry obalené (toga = plášť) Rubivirus – zarděnky Alfaviry – přenášejí krev sající členovci – bezpříznaková infekce Coronaviry respirační onemocnění – SARS. DNA viry Polyomaviry John Cunningham virus (JCV), BK virus 41 Tyto viry mohou způsobit vážná onemocnění u pacientů se sníženou imunitou (progresivní multifokální leukoencefalopatie, hemorhagická cystitda), terapie neexistuje žádná (používá se cidofovir (Obr. 8). Lidské papillomaviry (HPV) – Viry obvykle způsobují bradavice, některé kmeny malignizující – rakovina děložního čípku, kožní léze u pacientů se sníženou imunitou (AIDS), terapie není žádná (někdy se používá cidofovir). Poxviry – variola – byla jí věnována samostatná podkapitola, chemoterapie žádná (cidofovir). Hepadnaviry – Hepatitida B způsobuje chronickou hepatitidu, dle WHO bylo v roce 2004 nakaženo necelých 5 % populace na Zemi, tedy asi 350 milionů lidí a 600 tisíc nemocných zemřelo. Risk při krevní transfuzi je odhadován na 1: 63 000, proti nemoci existuje účinná vakcína s efektivitou asi 88 %. Onemocnění zasahuje játra (chronická hepatitida, cirhóza jater, hepatocelulární karcinom). Kromě lidského HBV viru se vyskytují příbuzné kmeny i u zvířat, např. WHV (woodchuck hepatitis virus, 70% homologie), DHBV (duck hepatitis B virus, 40% homologie), GSHV (ground squirrel hepatitis virus). U 65 % nakažených dojde k bezpříznakové infekci s úplným vyléčením postiženého. U 25 % dochází k akutní hepatitidě, z těchto pacientů se 99 % postupně úplně vyléčí, u 1 % dojde k úmrtí. U 10 % nakažených se vyvine chronická hepatitida a z nich cca 70 % se stane nosičem viru bez jakýchkoliv závažných problémů a u zhruba 30 % dochází k cirhóze jater a případně k hepatocelulárnímu karcinomu. Proti hepatitidě B je účinná vakcína a řada chemoterapeutik, většina z nich je založená na inhibici reversní transkriptasy a je jim věnována část kapitoly Inhibitory jednotlivých stupňů multiplikace virů. V klinickém testování je potom celá řada přístupů založených na RNAi, které jsou v tomto případě vhodné díky dobré dostupnosti siRNA v jaterních buňkách na rozdíl od jiných tkání. Herpesviry – Existuje zhruba 100 herpesvirů, všechny napadají obratlovce a osm způsobuje infekce u člověka. HSV-1 herpes labialis, keratitis (oční), neonatální herpes HSV-2 genitální herpes VZV varicela – chicken pox, plané neštovice, může ale zasáhnout i CNS – pásový opar, může způsobit pneumonii, u pacientů s imunitní nedostatečností těžké infekce. CMV retinitida, kongenitální infekce plodu – malformace EBV mononukleosa – “kissing“ “honeymoon“ disease, napadá B-lymfocyty (horečka, zduřelé uzliny), Burkittův lymfom (Afrika), nasofaryngeální karcinom (jižní Asie) Herpesviry 6, 7, 8 Pro terapii herpesvirových infekcí se používají inhibtory herpesvirové DNA polymerasy (acyklické nukleosidy), např. cidofovir (CMV) (Obr. 19). 42 Obrázek 19. Sloučeniny používané jako léky při herpesvirových infekcích. Tabulka 3. Přehled antiherpetických látek. Komerční název Inhibitory HSV a VZV Zovirax Zelitrex, Valtrex Denavir, Vectavir Famvir Herpid, Stoxil, Idoxene, Virudox Viroptic Zostex, Brivirac, Zerpex Inhibitory CMV Cymevene, Cytovene Valcyte Foscavir Vistide Vitravene Generický název Výrobce aciclovir valaciclovir penciclovir famciclovir idoxuridin trifluridin brivudin GlaxoSmithKline GlaxoSmithKline Novartis Novartis Yamanouchi, Astellas Glaxo Wellcome Berlin Chemie, Menarini ganciclovir valganciclovir foscarnet cidofovir fomivirsen Roche Pharmaceuticals Roche Pharmaceuticals Astra Zeneca Pfizer Isis 43 2. Struktura a funkce nukleových kyselin Nukleové kyseliny jsou základními nositeli dědičné informace v živých organizmech, mají však i řadu dalších funkcí, například katalytickou nebo transportní. Primárně jsou to lineární molekuly vzniklé polymerizací nukleotidů, v závislosti na funkci pak mohou zaujímat i složitější prostorové struktury (cirkulární, větvené apod.). Nukleotidy se skládají z nukleové báze (pyrimidinové – uracil, thymin, cytosin, purinové – adenin, guanin), sacharidové složky (D-ribosa, 2-deoxy-D-ribosa) a jedné nebo více molekul fosfátu. Obrázek 20. Nukleové báze a číslování jejich atomů. V nukleových kyselinách jsou jednotlivé nukleotidy řetězeny pomocí fosfodiesterových vazeb. Genetická informace je zakódována v primární struktuře, tedy v lineárním pořadí jednotlivých nukleotidů v řetězci. Pořadí nukleotidů je při transkripci přepsáno z DNA do mRNA a při translaci určuje primární strukturu proteinů, tedy sekvenci jednotlivých aminokyselin v rostoucím peptidovém řetězci. Proces přenosu informace z DNA do proteinu (genová exprese) je regulován na několika úrovních, u eukaryotických organizmů dochází např. k sestřihu, při kterém se ze vznikající pre-mRNA vybrané úseky – introny – odstraní. Primární struktura proteinu tak neodpovídá přesně pořadí nukleotidů v DNA, ale chybí v ní odstraněné části. Odstraněním různých úseků ze stejného primárního transkriptu vznikají různé mRNA a tím pádem i různé proteiny s různými vlastnostmi. Jeden gen, jedna sekvence DNA, tak může nést informaci hned pro několik proteinů. V lidském organizmu bylo doposud identifikováno asi dvacet čtyři tisíc genů a jim odpovídajících proteinů je několikanásobně více. Obrázek 21. Nukleosidy a nukleotidy. Nukleosid = nukleová báze + cukerná složka; nukleotid = nukleová báze + cukerná složka + fosfát. O nukleových kyselinách (podobně jako o proteinech) platí, že mají tak zvaný směr, to znamená, že se dají jednoznačně odlišit oba konce. Směr vláken se označuje podle 44 orientace (deoxy)ribózy v něm, tedy: směr 3'→5' a opačný směr 5'→3'. Podle konvence se pořadí nukleotidů zapisuje směrem 5'→3' (např. ctcgactctt agcttgtcgg ggacggtaac je prvních 30 z 1621 nukleotidů lidského alfa tubulinu). V řetězcích nukleových kyselin je fosfodiesterovou vazbou obvykle spojen C-3´ jedné (deoxy)ribózy s C-5´ druhé. Vazby v jiné orientaci jsou vzácné a slouží ke speciálním účelům, například „5´ čepička“ v mRNA (na jejím 5‘ konci je navázán 7-methylguanosin pomocí vazby 5´-5´, což slouží k rozpoznání a ochraně mRNA před degradací). Obrázek 22. Duplex DNA se znázorněnými vodíkovými vazbami; pro názornost jsou báze nakresleny v rovině nákresu, ve skutečnosti by byly kolmé na ní. Báze v páru jsou skoro přesně v jedné rovině a roviny jednotlivých párů v rámci DNA jsou spolu rovnoběžné. Nukleové báze obsahují donory a akceptory vodíkových vazeb, které jsou orientovány v prostoru tak, že dochází samovolně k tvorbě párů, adenin vytváří dvě vodíkové vazby s thyminem (DNA) nebo uracilem (RNA) a guanin tři vodíkové vazby s cytosinem. Máme-li v jednom roztoku přítomny komplementární řetězce oligonukleotidů, samy se spojí do dvoušroubovice (duplex). V duplexu jsou řetězce nukleových kyselin orientovány každý v opačném směru, 3‘ konec jednoho řetězce je komplementární s 5‘ koncem druhého řetězce. Stabilita duplexu závisí zejména na typu párů, stabilnější jsou duplexy s více C-G páry, protože tyto báze mají mezi sebou tři vodíkové vazby, kdežto A-T nebo A-U jen dvě. Dále stabilitu ovlivňuje délka duplexu, čím delší řetězec, tím je duplex stabilnější. Velmi negativní vliv pak má přítomnost chyb v párování. Specificita párování bází je základem přesnosti kopírování informace z mateřské DNA do dceřiné DNA při replikaci nebo do mRNA při transkripci. Vznik A-T(U) a G-C párů je energeticky výrazně výhodnější než vznik tzv. mismatch párů A-G, A-C, T-G, T-C. Z termodynamické analýzy polymerace DNA 45 vyplývá, že nesprávný pár samovolně vznikne s pravděpodobností asi 1 : 1 000 až 1 : 1 000 000. Tato selektivita je pak ještě umocněna dalšími mechanizmy, takže při kopírování lidské DNA, která má asi 4 miliardy párů bází, dochází v průměru ke dvěma až třem chybám. Kromě obvyklého párování bází, které se dle objevitelů DNA duplexu jmenuje Watson-Crickovo, existuje ještě několik alternativních typů párování. Umožňuje to fakt, že báze se mohou nacházet i v minoritních tautomerních formách, případně použijí jiného akceptoru nebo donoru vodíkové vazby než je obvyklé (např. N-7 v purinech). Nejčastěji se vyskytuje párování Hoogsteenovo nebo kolísavé (wobble) párování. Právě tyto minoritní typy párování mohou napomáhat vzniku mismatch. Obrázek 23. Příklady možností párování nukleových bází. Watson-Crickovo párování je energeticky nejvýhodnější. 2. 1. RNA Předpokládá se, že RNA je evolučně starší než DNA a byla tedy zřejmě původním nositelem dědičné informace na samém začátku vzniku života. RNA je obecně variabilnější a reaktivnější, proto má také v organizmech více funkcí než DNA. Základním rozdílem oproti DNA je, že RNA obsahuje výhradně D-ribosu a jako báze jsou v ní zastoupené cytosin, guanin, adenin, uracil, spolu s dalšími minoritními bázemi, jako jsou například pseudouridin, dihydrouridin, inosin a 7-methylguanosin (m7G). Tyto minoritní báze se nacházejí v RNA se specifickými úkoly (tRNA, malé RNA účastnící se sestřihu, v obecné mRNA je pouze m7G v čepičce). RNA zaujímá velmi rozmanitá prostorová uspořádání, některé typy sekundárního uspořádání jsou tak časté, že se jim dostalo vlastního pojmenování (např. hairpin – vlásenka). RNA může tvořit i duplex, ale na rozdíl od DNA, kde duplex tvoří obvykle dva různé komplementární DNA řetězce, u RNA často duplex tvoří dva úseky stejného RNA vlákna (navíc u RNA obvykle nebývá komplementarita úplná). RNA duplexy jsou méně stabilní než DNA duplexy. Existují i hybridní duplexy DNA-RNA, které vznikají například při transkripci. RNA může být i v současnosti nositelem genetické informace. Nejdůležitější je z tohoto hlediska mRNA, která vzniká transkripcí DNA v jádře a po transportu ven z jádra slouží jako matrice k syntéze proteinů na ribozómu. RNA je také hlavním nositelem dědičnosti u některých virů (RNA viry a retroviry). RNA často vystupují v roli katalyzátorů chemických reakcí podobně jako enzymy. Tyto RNA enzymy byly objeveny koncem 70. let a jsou nazývány ribozymy (ribonucleic acid + enzyme = ribozyme). Typickým příkladem je ribozóm, který se sice skládá z proteinové části a z RNA, nicméně za katalytickou funkci odpovídá právě ta RNA část. Z dalších funkcí RNA můžeme jmenovat transportní (tRNA) a regulační (siRNA a microRNA) a určitě bychom nalezli mnoho jiných příkladů. 46 2. 2. DNA DNA nejspíš až v průběhu evoluce nahradila méně stabilní RNA v roli nositele genetické informace, čímž byl umožněn mnohem přesnější přenos této informace z generace na generaci. Z tohoto hlediska je tedy „vylepšenou“ RNA. Vylepšení spočívá zejména v její stabilizaci odstraněním reaktivní 2’-OH skupiny a v náhradě uracilu za thymin. Zatímco RNA je nestabilní již v mírně bazickém prostředí (pH 9 a více) a její rozklad je katalyzován řadou chemických sloučenin a enzymů, protože na něm přímo participuje 2’OH skupina ribózy, DNA, která 2’OH skupinu nemá, je mnohem odolnější. Navíc se pro její stabilizaci uplatňují další mechanizmy, např. methylace bází (cytosinu), přítomnost histonů a dalších proteinů v chromozomu. DNA obsahuje daleko méně minoritních bází než RNA, za zmínku stojí především významný podíl 5-methylcytosinu, kterému se pro jeho významné zastoupení říká pátá báze. Hraje klíčovou roli v epigenetice. Změny ve struktuře DNA jsou při replikaci monitorovány některými DNA polymerasami, které ihned opravují chyby, další proteiny pak vyhledávají DNA léze a za pomoci polymeráz je umí opravit. Náhrada uracilu za thymin, tedy „methylovaný uracil“ poskytuje pak další evoluční výhodu. Jednou z častých nechtěných změn v DNA je deaminace cytosinu, kterou vzniká uracil. Kdyby byl v DNA přítomen uracil jako přirozená báze, bylo by rozpoznání takového místa velmi složité a docházelo by tak k častým mutacím. Vzhledem k tomu, že uracil vzniklý deaminací cytosinu je v DNA cizí prvek, je pro reparační proteiny snadné jej najít, odstranit a nahradit cytosinem. Funkce DNA jako nositele genetické informace je naprosto dominantní, byla sice také nalezena např. katalytická aktivita DNA, ale její význam je nejspíš podružný. DNA se vyskytuje zejména jako duplex dvou komplementárních řetězců, který má tvar pravotočivé (většinou) dvoušroubovice (double helix). Šroubovice má charakteristický malý a velký žlábek, ty jsou důležité pro možnost přístupu enzymů k DNA. Dvoušroubovice může mít v závislosti na podmínkách různou geometrii, existují tři základní formy, A, B a Z. B forma je nejčastější formou výskytu DNA, A forma většinou vzniká její dehydratací, např. při přípravě vzorků pro krystalografické studie. Z forma je levotočivá a najdeme ji u některých methylovaných DNA. Přesto se většinou jedná o dvoušroubovice, variabilita, kterou tak dobře známe u RNA, se zde vyskytuje podstatně vzácněji. Ve výjimečných případech se vyskytují i triplexy DNA, u kterých se uplatňuje alternativní Hoogsteenovo párování bazí. O něco častěji (hlavně v telomerech) existují kvadruplexy, v nichž spolu vodíkové vazby vytváří čtyři guaniny. Pro stabilitu tohoto komplexu je nutná koordinace s iontem kovu, obvykle draslíku nebo sodíku. Kvadruplexy se často vyskytují na koncích chromozomů, v telomerách, které jsou bohaté na guanosiny a vznikají koordinací čtyř úseků téhož vlákna DNA. 2.3. Interakce malých molekul s nukleovými kyselinami Nukleové kyseliny obsahují několik typů reaktivních funkčních skupin – cukerné hydroxyly, aromatické aminoskupiny a kyselý fosfát. Reaktivní mohou být i atomy dusíku, které jsou součástí aromatických cyklů a oxoskupiny na bázích. Z tohoto důvodu nukleové kyseliny reagují s řadou malých molekul, jsou nestabilní v příliš kyselém nebo příliš bazickém prostředí a jsou citlivé na nukleofily, elektrofily, radikály atd. Krom toho tvoří řada 47 sloučenin s nukleovými kyselinami nekovalentní komplexy. Ionty kovů se asociují s fosfodiesterovou kostrou, aromatické planární sloučeniny vytváří hydrofobní interakce s aromatickými bázemi. To vše působí nejen degradaci samotných nukleových kyselin, ale může to také mít vliv na funkci proteinů, které s nukleovými kyselinami interagují, např. polymeráz, transkripčních faktorů, adaptorových proteinů atd. To vede například k chybám při replikaci a tím pádem k mutacím, zastavení replikace, stejně tak může být omezena transkripce. 2.3.1. Reakce s nukleofily Nukleofily reagují s pyrimidinovými bázemi v polohách 4 a 6. Typickým příkladem je hydrazinolýza, kdy postupným sledem reakcí (Schéma 1) dochází k nahrazení nukleové báze molekulou hydrazinu. Podobně napadá polohu 6 a následně i 4 v pyrimidinových bazích i hydroxylamin (Schéma 2) a hydrogensiřičitan. Ve všech případech dochází k totální změně poloh donorů a akceptorů vodíkových vazeb a takto modifikované místo v DNA je možným zdrojem mutací. Schéma 1. Hydrazinolýza. Schéma 2. Reakce pyrimidinových bází s hydroxylaminem a s hydrogensiřičitanem. Obě molekuly se nejdřív adují na dvojnou vazbu mezi atomy 5 a 6 (do polohy 6), čímž dojde k nestabilitě aminoskupiny v poloze 4, která je následně substituována. 48 2.3.2. Reakce s elektrofily Reakcí s halogeny dochází k halogenaci bází, čímž lze poměrně snadno připravit 5chlor-(nebo brom-)uridiny a 8-chlor-(nebo brom-)puriny. Reakcí s dusitany nebo kyselinou dusitou dochází k deaminaci (Schéma 3). Formaldehyd reaguje s aminoskupinami a spojuje je kovalentní vazbou, methylenovými můstky. Alkylační činidla (dimethylsulfát, diazomethan, methyl methansulfonát, alkylhalidy, N-methyl-N-nitroso močovina) alkylují nukleové kyseliny v polohách: G-N-7, A-N-1, A-N-3 a T-N-3. Podobně alkylují molekuly nukleových kyselin bidentátní alkylační činidla jako bis-(2-chlorethyl)sulfid, dusíkatý yperit apod., která vzhledem k tomu, že mohou alkylovat dvě místa, vytváří kroslinky (Schéma 4). Schéma 3. Reakce s kyselinou dusitou a dusitany vede k deaminaci cytosinu a adenosinu, vzniká deoxyuracil a deoxyinosin. Schéma 4. Reakce dvou guanosinových zbytků s bidentátním alkylačním činidlem za vzniku kroslinku. Guanosinové zbytky mohou pocházet například ze dvou sousedních guanosinů v molekulách duplexu DNA, které jsou prostorově ve vhodné vzdálenosti. Na principu alkylace DNA funguje několik protinádorových léčiv. Prvním příkladem je temozolomid (Schéma 5), který byl objeven Malcomem Stevensem a od roku 1998 se používá orálně pro léčbu mozkových nádorů. Temozolomid ve tkáni spontánně hydrolyzuje a dále se rozpadá za vzniku velmi reaktivního alkylačního činidla, methyldiazoniového iontu. Tento ion alkyluje guaninové zbytky v místě, kterým zasahují do velkého žlábku (O6). Selektivita účinku pro nádorové buňky nejspíš spočívá v různé rychlosti rozpadu výchozí molekuly v závislosti na pH, které se v nádorových buňkách mírně odlišuje od nenádorových. Navíc buňky mozkových nádorů a melanomů jsou citlivé na alkylaci O6, protože nemají dostatečnou aktivitu O6-alkylguanin-DNA alkyl transferasy, která je 49 schopná tento typ poškození opravit (odstraněním methylu). V současnosti jsou používány léky druhé generace využívající obdobný princip a vykazující lepší farmakologické vlastnosti, např. mitomycin C, pyrrolobenzodiazepiny (anthramycin, tomaymycin) a spirocyklopropany (CC-1065) (Obr. 10 a 11). Schéma 5. Temozolomid. Aktivace – vznik methyldiazoniového iontu a jeho reakce s guaninem. Mitomycin je přírodní látka aziridinového typu, je to protinádorové antibiotikum (Streptomyces caespitosus) s alkylačním účinkem, které pro aktivaci vyžaduje enzymatickou redukci chinonové části na hydrochinon. Tato redukce probíhá v prostředí s nedostatkem kyslíku, které je typické pro nádory. Po redukci následuje řada samovolných reakcí, která začíná nejspíš eliminací methanolu, čímž vznikne produkt, který možňuje jednofunkční nebo bifunkční alkylaci (Schéma 6). S DNA interaguje v pozicích: G-O-6, AN-6 a G-N-2. Na deset jednoduchých alkylací připadá jeden kroslink. Alkylace začíná navázáním 2-NH2 skupiny guaninu na C-1 aktivovaného mitomycinu; tato alkylace probíhá zejména na sekvencích CG. Druhým krokem může být alkylace 2-NH2 skupiny dalšího guaninu prostřednictvím C-10 aktivovaného mitomycinu. NMR studie prokázaly, že mitomycin zůstává navázán v malém žlábku DNA. Lék se podává intravenózně při léčbě některých gastrointestinálních nádorů. Schéma 6. Mitomycin C, mechanizmus aktivace a způsob vazby na DNA. Azinomycin je dalším alkylačním činidlem, může alkylovat pomocí svého aziridinového nebo oxiranového cyklu. Anthramycin a tomaymycin spolu se sibiromycinem a neothramycinem A a B patří mezi velmi účinná protinádorová antibiotika, která se získávají ze skupiny gram pozitivních bakterií rodu actinomycetes. První tři z nich se váží kovalentně do malého žlábku DNA pomocí kovalentní vazby na G-N-2, přednostně na sekvence typu 5-Purin-G-Purin. 50 Obrázek 24. Azinomycin B a anthramycin. 2.3.3. Malé molekuly s reversibilní vazbou na dvoušroubovici DNA Molekuly vážící se reversibilně na DNA můžeme rozdělit do tří podskupin. První se váží na DNA zvenku, tedy ze strany deoxyriboso-fosfátové kostry, která je polární a nabitá, a proto se většinou váží pomocí nespecifických elektrostatických interakcí s cukernou složkou, fosfátem nebo oběma částmi. Příkladem mohou být ionty, polyaminy apod. Z terapeutického hlediska nejsou tyto sloučeniny významné. Druhou skupinou jsou interkalátory, sloučeniny, které se “vmezeří” do prostoru mezi sousedními páry bází uvnitř DNA kolmo na osu DNA, a tím znemožní průběhu standardních procesů probíhajících na DNA. Jedná se vždy o planární nebo téměř planární molekuly, které jsou na místě udržovány hydrofobními interakcemi s aromatickými bázemi. Tyto sloučeniny často slouží jako protinádorová léčiva, mnohé z nich jsou však podobně jako DNA alkylátory karcinogenní, genotoxické, mutagenní apod. Můžeme je rozdělit na klasické (dokonale planární, mají většinou nežádoucí účinky), neklasické (nejsou úplně rovinné a zčásti nejsou aromatické, do této skupiny patří mnoho terapeutik) a bisinterkalátory (sloučeniny se dvěma interkalujícími uskupeními spojenými obvykle spojovacím řetězcem – linkerem). Obrázek 25. Interkalátory DNA. 51 Obrázek 26. Příklad bisinterkalátoru DNA. Bisanthracyklin WP631: Dvě molekuly daunorubicinu jsou kovalentně spojeny p-xylenovým linkerem prostřednictvím jejich 3-NH2 skupin. Poslední skupinou sloučenin jsou deriváty vážící se v malém nebo velkém žlábku DNA. Jsou to relativně dlouhé molekuly, které mají na vhodných místech donory a akceptory vodíkových vazeb, které přímo interagují částmi bází, které zasahují do malého nebo velkého žlábku. Tyto molekuly se váží na určitou sekvenci DNA o délce několika málo nukleotidů (Obr. 28). Obrázek 27. Znázornění polohy důležitých donorů/akceptorů vodíkových vazeb zasahujících do malého a velkého žlábku. Osa molekuly DNA je kolmá na rovinu nákresny, ve které jsou páry znázorněny. 52 Obrázek 28. Molekuly vážící se nekovalentně do malého žlábku. 53 3. Biosyntéza a metabolizmus nukleových kyselin 3.1. Biosyntéza nukleosidů de novo Většina živých organizmů není schopna získat dostatečné množství nukleosidů z potravy, proto v jejich buňkách probíhá de novo syntéza. Biosyntéza pyrimidinových a purinových nukleosidů se významně liší, purinový heterocyklus je postupně vystavěn z 5fosforibosyl-1-aminu, kdežto u pyrimidinů nejdříve vznikne báze a ta je potom navázána na ribózu. Významným zdrojem nukleosidů je i šetřící dráha (salvage pathway, viz dále). 3.1.1. De novo biosyntéza pyrimidinových nukleosidů V prvním kroku syntézy pyrimidinových nukleosidů de novo dochází ke vzniku karbamoyl fosfátu. Reakce je katalyzovaná enzymem karbamoylfosfátsyntetasou. Aminoskupinu poskytuje glutamin, ze kterého při reakci vzniká kyselina glutamová, zdrojem fosfátu a energie jsou dvě molekuly ATP, při reakci se dále spotřebovává molekula vody (Schéma 7). Schéma 7. Vznik orotátu. Karbamoyl fosfát je velmi reaktivní meziprodukt, který za katalýzy aspartát transkarbamoylasou kondenzuje s kyselinou asparagovou za vzniku karbamoyl aspartátu (bez spotřeby ATP). Následně dojde k dehydrataci na cyklický dihydroorotát, jehož oxidací vzniká orotát (Schéma 7). Oxidace je ireverzibilní a katalyzovaná enzymem dihydroorotátdehydrogenasou. V dalším kroku je orotát navázán na ribózu, která do reakce vstupuje aktivovaná, jako fosforibosylpyrofosfát (PRPP). Vzniká orotidin-5´-monofosfát (OMP). Potřebná energie je získávána hydrolýzou PPi, katalyzátorem je enzym pyrimidinfosforibosyltransferasa. Následuje dekarboxylace OMP za tvorby UMP, kterou katalyzuje enzym OMPdekarboxylasa. Nukleosid monofosfát kinasy následně fosforylují UMP na UDP a 54 UTP. CTP syntetasa je schopná naaminovat UTP za vzniku CTP, zdrojem dusíku je glutamin, ze kterého vznikne kyselina glutamová (Schéma 8). Pro syntézu DNA potřebují živé organizmy vyprodukovat thymidin. Výchozím nukleotidem pro biosyntézu thymidinu je deoxyuridin monofosfát dUMP (redukce hydroxylu na C-2‘ je popsána za biosyntézou purinových nukleotidů). Methylová skupina pochází z N5,N10-methylentetrahydrofolátu a mechanizmus jejího přenosu na dUMP pomocí enzymu thymidylát synthasy je znázorněn ve Schématu 9. Dalším produktem této reakce je dihydrofolát, který musí být následně regenerován. Nejdříve dochází k redukci dihydrofolátu enzymem dihydrofolát reduktasou s koenzymem NADPH+H+ a následně je na tetrahydrofolát přenesena methylenová skupina ze serinu pomocí enzymu serinhydroxymethyltransferasy. Toto je jediný způsob, kterým živé organizmy syntetizují dTMP a správná funkce všech složek je tedy nutná pro syntézu DNA během replikace. Nesprávná funkce thymidylát synthasy může v extrémním případě vést ke smrti z nedostatku thymidinu. Schéma 8. Vznik UMP, UTP a CTP z orotátu a fosforibosyl pyrofosfátu. 3.1.2. Enzymy biosyntézy pyrimidinových nukleotidů a možnost terapeutických cílů Enzym dihydroorotátdehydrogenasa obsahuje FMN a nehemové Fe. Je lokalizována na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je reoxidována chinony. Inhibice dihydroorotát dehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů v T-lymfocytech a tak potlačuje autoimunitní onemocnění revmatoidní arthritidu. Na tomto principu funguje například v klinice používané léčivo leflunomid. Ostatní enzymy jsou cytosolární. Pyrimidinfosforibosyltransferasa je velmi důležitým enzymem, protože se také podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází, jako jsou uracil a cytosin v tzv. salvage pathway 55 (viz dál). Enzym OMPdekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP 2 x 1023 krát a je tak jedním z nejúčinnějších enzymů vůbec. Vzhledem k tomu, že řada negativních procesů v organizmu, např. růst tumorů, je spojen s výrazně rychlejší replikací v nádorové tkáni a tedy i vyšší spotřebou dTTP, je thymidylátsyntasa důležitým cílem chemoterapeutik. Z protinádorových inhibitorů thymidylát synthasy můžeme jmenovat např. 5-fluoruracil. Blokáda syntézy thymidinu přivodí buňce smrt z jeho nedostatku, přesný mechanizmus účinku bude probrán dále. Schéma 9. Biosyntéza dTMP pomocí thymidylát syntasy. 3.1.3. Biosyntéza purinových nukleosidů Na rozdíl od biosyntézy pyrimidinových nukleosidů, kde nejdříve dojde k syntéze nukleové báze a ta je pak připojena k molekule aktivované ribózy, probíhá výstavba purinové báze přímo na molekule ribózy. Výchozím materiálem je -D-ribosyl-5-fosfát, na který následně enzym ribosafosfátpyrofosfátkinasou přenese pyrofosfát z molekuly ATP, vzniká 5-fosforibosyl--pyrofosfát (PRPP). V následném reakčním kroku dochází ke vzniku 5-fosforibosyl-1-aminu (PRA). Do reakce vstupuje PRPP, který je aminován v poloze 1’ pomocí enzymu glutaminfosforibosylamidotransferasy. Aminová skupina pochází z glutaminu, do reakce vstupuje molekula vody a produktem jsou kromě aminované ribózy ještě pyrofosfát a kyselina glutamová. Zdrojem energie je makroergická vazba pyrofosfát~ribóza. Reakce je formálně nukleofilní substitucí s SN2 mechanizmem, který se projevuje charakteristickým Waldenovým zvratem konfigurace na stereogenním centru (Schéma 10). Jedná se o kontrolní krok celé biosyntézy purinových nukleosidů. Dále do vznikající molekuly vstupují atomy C-4, C-5 a N-7 (Schéma 11). Atomy pochází z molekuly glycinu, ten vytváří peptidovou vazbu s PRA (reaguje amin z PRA a karboxyl z Gly) a vzniká glycinamidribotid (GAR). Reakce je katalyzována enzymem GAR syntetasou. 56 Následuje vstup purinového atomu C-8. Volná aminoskupina GAR je formylována N10formyl THF za tvorby formylglycinamidribonukleotidu (FGAR). Reakce je katalyzována enzymem GAR transformylasou. Schéma 10. Vznik 5-fosforibosyl-1-aminu. Dále je do molekuly inkorporován purinový atom N3. Vstupuje ve formě Gln a energii dodá štěpení ATP ADP + Pi. Reakce je katalyzována enzymem FGAM syntetasou. Následuje uzavření imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzací se tvoří 5aminoimidazolribonukleotid (AIR), energii k tomuto kroku opět dodá hydrolýza ATP ADP + Pi; reakci katalyzuje enzym AIRsyntetasa. C6 atom purinu se do molekuly dostane v následujícím kroku, kterým je reakce aminoskupiny AIR s HCO 3- za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR) (Schéma 11). Schéma 11. Vznik karboxyaminoimidazol ribonukleotidu. Dále do molekuly vstoupí N1 atomu purinu. Nejdříve se vytvoří amidická vazba mezi aminoskupinou kyseliny asparagové a C6 (který je ve formě karboxylu), energii dodá 57 hydrolýza ATP ADP + Pi, meziproduktem je 5-aminoimidazol-4-(Nsukcinylokarboxamid) ribotid (SACAIR), reakce je katalyzována enzymem SAICAR syntetasou. Poté se z SACAIR odštěpí fumarát, tato reakce je podobná reakcím, ke kterým dochází v rámci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4karboxamidribotid (AICAR). Enzymem katalyzujícím tento proces je adenylosukcinát lyasa. Následně je do molekuly zabudován C2 atom purinu. Dochází ke druhé formylaci za účasti N10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR). Obě formylace jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové kyseliny. Eznymem katalyzujícím tuto reakci je AICAR transformylasa. Hlavním produktem celého tohoto sledu je univerzální meziprodukt syntézy purinových nukleotidů inosin monofosfát (IMP). Vzniká v posledním kroku cyklizací a eliminací vody. Zde není nutno štěpit ATP, reakce je katalyzována enzymem IMP cyklohydrolasou (Schéma 12). Schéma 12. Výstavba šestičlenného kruhu purinových bazí. Inosin monofosfát (IMP) se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí na AMP a GMP. AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. Na IMP se nejdřív naváže aspartát, což je spojeno s hydrolýzou GTP GDP a Pi. V další reakci se eliminuje fumarát z adenylsukcinátu za tvorby AMP. GMP se syntetizuje z IMP také ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje za účasti NAD+ za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým krokem je vstup dusíku, který původně pochází z Gln; energii dodá současné štěpení ATP AMP + PPi (Schéma 13). V B a T lymfocytech, odpovídajících za imunitní odpověď organizmu, je vysoká aktivita IMP dehydrogenasy vedoucí ke zvýšené tvorbě GMP nutných pro proliferaci. Produkt plísně, mykofenolová kyselina, tento enzym inhibuje, a proto se využívá jako imunosupresivum po transplantacích. 58 Schéma 13. Zavedení aminoskupin do purinových bazí. Syntéza deoxyribonukleotidů spočívá v redukci 2’-CHOH skupiny ribózy na 2’-CH2 skupinu a probíhá na úrovni difosfátu. Enzymem, který reakci katalyzuje je ribonukleotidreduktasa (RNR). Redukce má poměrně složitý mechanizmus, který není ještě plně potvrzen. Předpokládá se, že nejdřív RNR odejme radikál vodíku z atomu C-3’ prostřednictvím svého radikálu cysteinu Cys439, potom dojde k protonaci 2’-OH skupiny protonem z cysteinového zbytku a následné eliminaci molekuly vody za vzniku C-2’ karbokationtu. Následuje transfer atomu vodíku z Cys225 na C-2’ a v molekule RNR se vytvoří disulfidický můstek. Posledním krokem je navrácení vodíkového radikálu z RNR na C-3’ (Schéma 14). Schéma 14. Biosyntéza deoxynukleotidů. Regulace syntézy nukleotidů probíhá na několika základních úrovních. Fosforibosylpyrofosfátsyntetasa je inhibována purinovými i pyrimidinovými nukleosid trifosfáty a difosfáty. Dále je syntéza jednotlivých nukleotidů regulována zpětnou vazbou. Hlavním kontrolním krokem v syntéze deoxyribonukleotidů je regulace nukleosiddifosfát 59 reduktasy (ribonukleotidreduktasy), kterou aktivují nukleosid trifosfáty a inhibuje jí deoxyadenosin trifosfát (dATP). 3.2. Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů Většina potravy obsahuje nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny jsou odolné ke kyselému prostředí žaludku a jsou odbourávány až v tenkém střevě pankreatickými nukleasami a střevními fosfodiesterasami. Iontová povaha nukleotidů jim nedovoluje procházet přes buněčné membrány, a proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy. Nukleosidy jsou ve střevní stěně hydrolyzovány nukleosidasami a nukleosidfosforylasami: Nukleosidasa: Nukleosid + H2O báze + ribosa Nukleosidfosforylasa: Nukleosid + Pi báze + ribosa-5-fosfát Recyklováno je jen velmi malé množství bází nukleových kyselin z potravy, proto musí probíhat biosyntéza de novo. Ribóza-1-fosfát, jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PNP), je prekurzorem PRPP. Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PNP. Jsou deaminovány adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na odpovídající deriváty ionosinu, které jsou dále degradovány až na kyselinu močovou. Léčivo pentostatin (deoxycoformycin) je inhibitorem ADA (analog tranzitního stavu) a byl schválen k léčení některých typů leukemií. 3.2.1. Odbourávání purinů Odbourávání purinů hraje důležitou roli v kosterním svalstvu. Xanthinoxidasa (XO) převádí hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou kyselinu (Schéma 15). U savců je XO v játrech a v lemu tenkého střeva. XO je homodimer obsahující FAD a Mo komplex cyklující mezi Mo6+ a Mo4+. Koncovým akceptorem elektronů je O2 při čemž vzniká H2O2, což je nebezpečné silné oxidační činidlo, proto jej ihned štěpí katalasa na H2O a O2. 3.2.2. Odbourávání pyrimidinových nukleosidů Živočišné buňky degradují pyrimidinové nukleotidy na jejich báze. Reakce probíhají přes defosforylace, deaminace a štěpení glykosidových vazeb. Vznikající uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně, na rozdíl od purinových bází. Konečnými produkty jsou -alanin a -aminoisobutyrát. Obě sloučeniny jsou dále převáděny transaminací a aktivací na malonyl-CoA a methylmalonyl CoA (Schéma 16). Malonyl CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl CoA je převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl CoA. Produkty degradace pyrimidinových nukleotidů tak přispívají k energetickému metabolizmu buňky. 60 Schéma 15. Katabolizmus purinových bází. Schéma 16. Katabolizmus pyrimidinových bází. 61 3.2.3. Šetřící dráha (salvage pathway) Při degradaci nukleových kyselin se uvolňují báze adenin, guanin a hypoxanthin. V případě, že nejsou dále degradovány, mohou být tyto báze znovu recyklovány na nukleosidy cestou odlišnou od biosyntézy. U savců jsou puriny recyklovány dvěma enzymy adenin fosforibosyl transferasou (APRT) katalyzující reakci: Adenin + PRPP AMP + PPi a hypoxanthin guanin fosforibosyl transferasou (HGPRT) katalyzující reakci: Hypoxanthin + PRPP IMP + Ppi a Guanin + PRPP GMP + PPi (viz Schéma 17). S poruchou šetřící dráhy souvisí tzv. Lesch-Nyhamův syndrom – deficit HGPRT způsobuje akumulaci PRPP u chlapců, což vede k vysoké hladině močové kyseliny v moči, krvi a tkáních, což souvisí s neurologickými potížemi a agresívním či destruktivním chováním. Schéma 17. Salvage pathway. 3.3. Poruchy metabolizmu purinů V souvislosti s metabolizmem nukleosidů je asi nejznámějším onemocněním dna, která je způsobená zvýšenou hladinou kyseliny močové v tělesných tekutinách, ta krystalizuje ve formě sodné soli a způsobuje záněty kloubů. Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené vylučování tohoto produktu odbourávání purinových bází, dalším může být např. nedostatečnost HGPRT (Lesch-Nyhamův syndrom) vedoucí k nadměrné produkci kyseliny močové z důvodů akumulace PRPP. Dna se léčí podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu, což je strukturní analog hypoxanthinu. XO allopurinol hydroxyluje na alloxanthin, který se pevně naváže na redukovanou formu enzymu, a tím ho ireverzibilně inhibuje. Jedná se o příklad „suicide inhibitoru“ nebo „mechanism-based“ substrátu. Časté jsou geneticky podmíněné změny v aktivitách enzymů metabolizmu purinů, jejichž klinické projevy jsou pestré a nespecifické, např. poškození ledvin, kloubů (dna), 62 postižení imunitního systému, anémie, nadprodukce kyseliny močové. Vyskytuje se např. polymorfizmus enzymů, který může způsobit zvýšenou či sníženou aktivitu, jejímž následkem je hromadění fyziologických či atypických metabolitů v tkáních nebo tělesných tekutinách, a tím může dojít k poškození organizmu. Příklady nejběžnějších poruch mohou být: deficit hypoxanthin nebo guanin fosforibosyltransferasy (nadprodukce kyseliny močové, zvýšená syntéza purinů de novo – poškození ledvin, poškození nervového systému, sebepoškozování) deficit adeninfosforibosyltransferasy (tvorba 2,8-dihydroxyadeninu, špatně rozpustný metabolit, vytváří močové konkrementy (kameny), může dojít až k akutnímu selhání ledvin) deficit xanthinoxidasy (zvýšené vylučováni xanthinu a hypoxanthinu močí) deficit/zvýšená aktivita adenosindeaminasy (deficit způsobuje těžký kombinovaný imunodeficit) deficit purinnukleosidfosforylasy (poškození imunitního systému – T lymfocytů) deficit myoadenylátdeaminasy (enzymový defekt ve svalech) deficit adenylosukcinátlyasy (poškození CNS, retardace) zýšená aktivita fosforibosyldifosfátsynthetasy (opožděný vývoj, ataxie, dysmorfické rysy) 3.4. Přehled základních enzymů biosyntézy a katabolizmu nukleových kyselin a jejich složek, které mohou být cíleny terapeutiky Enzymy biosyntézy složek NK nukleosiddifosfátreduktasa (NDPreduktasa), někdy se ribonukleotidreduktasa (RNR) – vznik 2´-deoxyribonukleotidů dihydrofolátreduktasa – ovládá AICAR-formyltransferasu polyglutamylovatelné inhibitory nepolyglutamylovatelné inhibitory typu A – „neklasické“ antifoláty thymidylátsynthasa – konverze dUMP na dTMP IMPdehydrogenasa – konverze IMP na XMP označuje jako Biosyntéza pyrimidinů je cílem antiparazitárních léčiv, u nichž lze využít rozdílů v biochemických drahách u parazita a u člověka Např. parazit Toxoplasma gondii (toxoplasmóza) může způsobit oslepnutí, neurologické dysfunkce a u lidí se sníženou imunitou i smrt. Místem zásahu je karbamoylfosfátsyntetasa II, enzym, který se strukturou i kineticky liší od savčího. Parazit není schopen využít pyrimidinové báze hostitele a proto je musí syntetizovat de novo. Enzymy katabolismu NK cytidindeaminasa – degradace cytosinových nukleosidů a nukleotidů adenosinaminohydrolasa – zahajuje sled degradace nukleosidů adeninu adenylátdeaminasa – konverze AMP na IMP 63 purinnukleosidfosforylasa – štěpí nukleosidovou vazbu na inosinu a 2´deoxyinosinu za vzniku hypoxanthinu a riboso-alfa-fosfátu, resp. 2-deoxyriboso-alfa-fosfátu xanthinoxidasa/xanthindehydrogenasa – katalyzuje oxidaci xanthinu na kyselinu močovou uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa – štěpí nukleosidovou vazbu pyrimidinů za vzniku U nebo T a D-riboso--fosfátu, resp. 2-deoxy-D-riboso--fosfátu 3.4.1. Enzymy biosyntézy složek NK Nukleosiddifosfátreduktasa (ribonukleotidreduktasa, NDPreduktasa) Jedná se o klíčový enzym pro přísun deoxyribonukleotidů v buňce (Schéma 18) a je tedy nejvíce potřebný tam, kde dochází ke zvýšené replikaci, např. v nádorových buňkách, proto je NDPreduktasa důležitým cílem pro protinádorovou terapii. Inhibitory NDPreduktasy (Obr. 29 a 30) můžeme rozdělit do několika základních skupin: 1. Hydroxymočovina a příbuzné látky 2. Thiosemikarbazony, např. triapin 3. Hydroxamové kyseliny, např. didox, trimidox 4. Analoga substrátu, např. gemcitabin, kladribin, DMDC, 2-fluoro-AraA; tyto sloučeniny jsou často po převedení na trifosfát inhibitory DNA nebo RNA polymeráz. Schéma 18. Funkce NDPreduktasy (ribonukleotidreduktasy). Obrázek 29. Nenukleosidové inhibitory NDPreduktasy. Obrázek 30. Nukleosidové inhibitory NDPreduktasy 64 IMPdehydrogenasa IMP je uzlovým bodem syntézy obou purinových nukleotidů, GMP a AMP. Jako je thymidylátsynthasa nutná pro syntézu dTMP a thymidinu v buňce, je IMPdehydrogenasa klíčová pro guaninové nukleotidy a nukleosidy. Enzym katalyzuje konverzi IMP na xanthosin-5-fosfát (XMP). Enzym se aduje jednou ze svých SH skupin do polohy C-2 imidazolového kruhu hypoxanthinu. Po adici následuje oxidace působením NAD a posléze hydrolýza v poloze C-2 doprovázená odštěpením enzymu (Schéma 19a). Funkce NH-CO v xanthinové bázi XMP je pak převedena za spoluúčasti ATP na aminoskupinu (Schéma 19b). Schéma 19a. Funkce IMPdehydrogenasy Schéma 19b. Význam IMPdehydrogenasy v syntéze GMP. Inhibitory IMPdehydrogenasy (Obr. 31). 1. analoga substrátu a produktů (inosin, IMP, xanthosin, XMP) 2. analoga nikotinamidu 3. analoga nikotinamidadenindinukleotidu (NAD) a jejich prekurzory 4. mykofenolová kyselina a její deriváty Jedním z analogů substrátu je ribavirin, který se používá pro léčbu HCV (virus žloutenky typu C) v kombinaci s interferonem a inhalačně pro léčbu RSV (respirační syncytinální virus), je účinný i proti řadě dalších nebezpečných virů (flaviviry, virové hemorrhagické horečky). Jeden z mechanizmů účinku zřejmě spočívá v tom, že při poklesu koncentrace G nukleotidů dochází na jeho místě k misinkorporaci. 2-Vinyl a 2ethynyl- analoga jsou kovalentní inhibitory enzymu. Thiazofurin je analogem NAD a je pevněji vázaný k IMP-dehydrogenáze než přirozený NAD. Důsledkem deplece guaninových nukleotidů, vyvolané inhibicí IMPdehydrogenasy, je zastavení mitotického cyklu v S-fázi. Náhrada atomu síry v thiazofurinu selenem dává silné cytostatikum selenazofurin, tento účinek však doprovází vysoká toxicita (Obr. 31). 65 Obrázek 31. Inhibitory IMPdehydrogenasy. Mykofenolová kyselina se klinicky využívá jako imunosupresivum, má i protivirový účinek (v řádově nižších koncentracích, než kterých je potřeba k dosažení imunospuresivního účinku). 6-merkaptopurin (MP) se používá při léčbě akutní leukémie. Od něj odvozený thioanalog IMP, inhibuje syntézu GMP a AMP, ale neinkorporuje se do NK (Obr. 31). 6-Thioguanin (TG) se transformuje na thioanaloga GDP a GTP, inkorporuje se do RNA i DNA. V případě, že jsou tyto sloučeniny podány jako volné báze, jsou převedeny na nukleosid monofosfáty pomocí hypoxantinguaninfosforibosyltransferasy, jednoho z enzymů šetřící dráhy, vznikají tak thioanaloga IMP a GMP, která ovlivňují biosyntézu adeninových i guaninových nukleosidů. Jako zajímavost je možno uvést, že MP a TG byly spolu s mnoha dalšími terapeutiky objeveny Gertrudou Elion a Georgem Hitchingsem jako výsledek jejich systematického výzkumu rozdílů v metabolizmu normálních a nádorových buněk. Na základě znalostí metabolických cest pak navrhli struktury sloučenin, které byly schopné selektivně zničit nádorové buňky, čímž jako první použili racionální přístup k vývoji léčiv a po zásluze byli v roce 1988 odměněni Nobelovou cenou za fyziologii a medicínu. Dihydrofolátreduktasa a thymidylátsyntasa Pro schematické znázornění funkce obou enzymů (Schéma 9). Jako inhibitory dihydrofolátreduktasy fungují většinou antifoláty (Obr. 32). Typickým příkladem je methotrexát nebo pemetrexed. Antifoláty nejsou jen blokátory DNA syntézy, ale vzhledem k tomu, že methylentetrahydrofolát je koenzymem řady methyltransferáz, tyto sloučeniny inhybují např. i syntézu methioninu. Klasické antifoláty obsahují v molekule kyselinu glutamovou. Mají určité terapeutické nevýhody, např. omezený transport, musí být 66 přítomen specifický transportní systém, koncová aminokyselina musí být buňkou polyglutamylována, aby vznikla profarmaka pomalu uvolňující aktivní látku, jinak probíhá rychlý eflux. Jsou proto často používány neklasické antifoláty, které mají místo zbytku glutamové kyseliny jinou elektronegativní skupinu (např. 2-amino-4-sulfobutanovou kyselinu). Inhibitory dihydrofolátreduktasy se někdy používají i jako antiparazitární léky. Obrázek 32. Kyselina listová, tetrahydrolistová a antifoláty. Inhibitory thymidilátsyntasy jsou významnější díky klíčové roli tohoto enzymu při syntéze thymidinu (Schéma 9). Jeho zablokováním dochází k tzv. “thymidineless death”. Sloučeniny, které tento enzym blokují, jsou používány jako cytostatika nebo antivirotika, neboť inhibují syntézu DNA. Obrázek 33. Inhibitory thymidylátsyntasy. Pro terapeutické účely mohou být použity volné báze (Obr. 33), protože jsou z nich v organizmu syntetizovány nukleosidy a dále nukleotidy (Schéma 20), které mají inhibiční aktivitu proti thymidylátsyntase. Mechanizmus účinku spočívá v tom, že atom vodíku v poloze 5 uracilu je nutný k poslednímu kroku syntézy thymidinu, konkrétně k eliminaci enzymu (Schéma 9). Je-li tento atom H nahrazen fluorem nebo jinou funkční skupinou, která nemůže snadno odstoupit, zůstává enzym trvale zablokován. Existuje i řada proléčiv odvozených od fluorouracilu, např. kapecitabin nebo tegafur. 67 Schéma 20. Mechanizmus účinku inhibitorů thymidylátsyntasy, jejich biotransformace na nukleotidy. Adenosindeaminasa (adenosinaminohydrolasa) a cytidindeaminasa (Obr. 6) Tyto enzymy jsou cílem některých antibiotik, která mívají zároveň cytostatické účinky. Příklady jednotlivých antibiotik jsou na Obr. 35. Koformycin (pentostatin) je schválené léčivo. Sloučeniny se často chybně zařazují do DNA a působí na metabolizmus adenosinu. Obrázek 34. Reakce katalyzované adenosindeaminasou a cytidindeaminasou. Obrázek 35. Nukleosidová antibiotika s inhibiční aktivitou proti adenosindeaminase. 68 Obrázek 36. Nukleosidová léčiva s inhibiční aktivitou proti cytosindeaminase. 3.4.2. Enzymy katabolizmu složek nukleových kyselin Uridinfosforylasa a thymidinfosforylasa Tyto enzymy metabolizují některá nukleosidová léčiva a jejich zvýšená aktivita může vést ke snížení koncentrace léčiva ve tkáních. Proto se někdy používá kombinace nukleosidového cytostatika a inhibitoru těchto dvou enzymů, příklady inhibitorů jsou v Obr. 37. Inhibitory jsou např. 1. 2. 3. 4. Thymindeoxyglukopyranosid 5-benzylpyrimidiny Acyklonukleosidy Anhydronukleosidy Obrázek 37. Inhibitory uridinfosforylasy. Purinnukleosidfosforylasa Purinnukleosidfosforylasa je enzym katabolizmu adenosinu, který štěpí nukleosidovou vazbu pomocí fosfátu. Přednostními substráty jsou inosin a 2´-deoxyinosin, které vznikají deaminací adenosinu a 2´-deoxyadenosinu. Enzym může katalyzovat reakce v obou směrech, záleží na systému, se kterým je spřažen. Ve spojení s xanthinoxidasou je enzymem katabolizmu purinů, ve spojení s hypoxanthin/guanin-fosforibosyltransferasou je enzymem salvage pathway. Inhibitory tohoto enzymu můžeme najít například mezi deriváty 9-deazapurinu, 8aminoguaninu, analogy ACV a velmi aktivní deriváty immucilinu (Obr. 38). 69 Obrázek 38. Inhibitory purinnukleosidfosforylasy. U dětí s dědičným nedostatkem PNPasy se projevuje těžká imunodeficience T buněk, zatímco B buňky si svou aktivitu zachovávají. Deficienci vyvolá 2´-deoxyguanosin, který se v buňkách hromadí, protože může být rozkládán jedině deficitní PNPasou. Fosforyluje se na dGTP a zřejmě působí jako allosterický inhibitor ribonukleosidifosfátreduktasy: poruší se rovnováha mezi deoxynukleosidtrifosfáty v buněčné hotovosti, čímž je narušena syntéza DNA. 70 4. Chemie nukleosidů, nukleotidů a oligonukleotidů Syntetické metody vedoucí k tvorbě nukleosidů, nukleotidů či oligonukleotidů jsou dnes nedílnou součástí výzkumu a vývoje nových léčiv. Moderní syntézy, díky nimž jsme schopni získat např. modifikovaná analoga přírodních nukleosidů, nám umožňují jejich mnohostranné využití. Mohou být účinnými inhibitory metabolizmu nukleových kyselin nebo je můžeme inkorporovat do syntetických oligonukleotidů, které pak nachází řadu terapeutických aplikací v antigenové nebo antisense terapii, při studiu struktury DNA či RNA, studiu interakcí mezi DNA a proteiny, atd. Velká pozornost je také věnována výzkumu modifikovaných nukleosidů jako potenciálních antivirotik či cytostatik. Díky tomu našly své uplatnění např. araA a araC (arabino nukleosidy adenosinu a cytidinu) jako antivitorika a antileukemika, 5-jodouridin pro léčbu Herpes simplex infekcí oka a takto bychom mohli jmenovat celou řadu dalších léčiv na bázi složek nukleových kyselin. V této kapitole se zaměříme na možnosti syntézy samotných nukleosidů, transformace cukerné složky nukleosidů, transformace na heterocyklické bázi a na syntézu nukleotidů a oligonukleotidů. 4.1. Syntéza nukleosidů Syntéza nukleosidů vychází ze 3 principiálních strategií, které jsou naznačené ve Schématu 21. Cesta A znázorňuje formaci glykosidické vazby mezi cukrem a bází, cesta B naznačuje výstavbu heterocyklické purinové báze s využitím amino substituentu na C-1 cukerného zbytku a cesta C vyjadřuje vznik purinové báze z imidazol-ribonukleosidu. Schéma 21. Strategie syntézy nukleosidů. 71 4.1.1. Tvorba glykosidické vazby Existuje několik metod tvorby nukleosidů, avšak nejvýhodnější jsou ty, které zaručují stereoselektivitu (tvorbu výhradně -anomeru) i regioselektivitu (glykosylace pyrimidinových bází na dusíku N-1 a purinových na N-9). Mezi tyto reakce patří především reakce se solemi kovů, Hilbert-Johnsonova reakce a její modifikace. Starší metody také využívají reakci v tavenině. Nejčastěji využívané cukerné prekurzory při syntézách nukleosidů jsou znázorněny na Obr. 39. Obrázek 39. Nejčastěji využívané cukerné prekurzory při syntézách nukleosidů. 4.1.1.1. Reakce v tavenině U této metody reaguje kyselý heterocyklický systém, např. 2,6-dichlorpurin, s peracetylovaným cukrem při teplotě 150–155°C v tavenině za tvorby intermediátů, které dále reagují na nukleosid ve výtěžku 54 %, vedlejším produktem je kyselina octová (Schéma 22). Tato reakce se obvykle provádí za přítomnosti katalytického množství Lewisových kyselin, které podporují vznik elektrofilního cukerného kationtu. Kyselým heterocyklem může být také imidazol, purin, triazol nebo pyrazol. Výtěžky zřídka přesahují 60–70%. Schéma 22. Reakce v tavenině. 72 4.1.1.2. Reakce se solemi kovů Mezi tyto reakce můžeme řadit širokou škálu metod využívajících stříbrných, rtuťnatých nebo sodných solí. Nejstarší z nich je metoda využívající rtuťnaté soli purinů (Schéma 23), které mohou reagovat s ekvivalentním množstvím cukrů, např. ribosou, za vzniku N-3 nukleosidů a ty po zahřátí s HgBr2, HgCl2 nebo Hg(CN)2 přesmykují na N-9 nukleosidy. Schéma 23. Rtuťnatá metoda syntézy nukleosidů. Obdobně je tomu při reakci pyrimidinů, kdy nejprve vznikají O-2 substituované deriváty, které se v přítomnosti HgCl2 přesmykují na N-1 isomery. Důležité však je, aby v poloze 2 reagujícího cukru byla acylová chránící skupina, která zajišťuje tvorbu intermediátu (obdobného jako ve Schématu 22), jenž má zásadní vliv na stereoselektivitu reakce ve prospěch -anomeru. Obecně metoda využívající rtuťnatých solí není příliš vhodná, protože kromě malých výtěžků a vzniku směsi produktů zůstává v reakci i stopové množství toxické rtuti, které zkresluje výsledky biologického testování. Proto je výhodnější použít syntézu nukleosidů, která využívá sodné soli purinů a příbuzných kyselých heterocyklických systémů, které jsou připraveny in situ reakcí s NaH nebo analogickou bází (Schéma 24). Tyto soli reagují s chráněným cukrem v acetonitrilu za tvorby odpovídajících beta nukleosidů SN2 substitucí chloro skupiny v poloze 1 cukerného zbytku. Schéma 24. Syntéza nukleosidů ze sodných solí. 4.1.1.3. Hilbert-Johnsonova reakce a její modifikace V roce 1930 Hilbert a Johnson zaznamenali, že substituované pyrimidiny jsou dostatečně nukleofilní k přímé reakci s halogencukry bez potřeby elektrofilního 73 katalyzátoru. Tato metoda zahrnuje alkylaci 2-alkoxypyrimidinu halogencukrem. Nejprve dochází ke vzniku kvartérní soli, která při vyšší teplotě eliminuje alkylhalogenid za tvorby kondenzačního produktu. Ten může dále podléhat reakci s hydroxidem sodným na glykosilovaný uracil nebo být aminován čpavkem na cytidinový analog. Tato kondenzační metoda obvykle poskytuje směs - i -anomeru. Schéma 25. Hilbert Johnsonova reakce. Nezávisle na sobě publikovali Nishimura, Birkofer a Wittenberg vylepšenou variaci klasické Hilbert Johnosonovy metody, jež využívá silylované báze. Silylace (např. hexamethyldisilazanem) zajišťuje celou řadu výhod – převádí často poměrně nerozpustné pyrimidinové báze na lipofilní silylované sloučeniny, které mohou být destilovány a které se ochotně rozpouští v organických rozpouštědlech, tedy je umožněna homogenní reakce. Silylované heterocykly jsou lepšími nukleofily než odpovídající alkoxyderiváty. Vzhledem k vysoké mobilitě trimethylsilyl skupiny vždy obdržíme termodynamicky nejstabilnější silylovaný heterocyklus. Silylová metoda bývá často používána v kombinaci s Lewisovými kyselinami jako katalyzátory (např. TMSOTf (trimethylsilyl triflát) nebo chlorid cíničitý) a nazývána jako Vorbrüggenova metoda (Schéma 26). Stereoselektivita je opět zajištěna formací intermediárního acyloxoniového kationtu (Schéma 27). Schéma 26. Vorbrüggenova reakce 74 Schéma 27. Mechanizmus Vorbrüggenovy reakce. 4.1.1.4. Syntéza β-ribonukleosidů otevíráním 1,2-oxiranů Další z možností stereospecifické syntézy nukleosidů je metoda vycházející z 2-Otosyl-5-O-trityl-D-(nebo L-)arabinosy, která vícestupňovou syntézou reaguje se sodnou solí heterocyklické báze. Klíčovým krokem reakce je tvorba 1,2-oxiranu s konfigurací ribo, který se otevírá aniontem báze za vzniku -anomeru. Schéma 28. Syntéza β-ribonukleosidů otevíráním 1,2-oxiranů. 75 4.1.2. Syntéza a transformace nukleobází 4.1.2.1. Syntéza pyrimidinových nukleobází Pyrimidinovou bázi lze vystavět několika způsoby, přičemž uvedené reakce využívají C-1 substituent daného cukru. První z metod (Schéma 29) vychází z chráněného -Dribopyranosylaminu, který podléhá cyklizaci za vzniku chráněného uridin-5-etylkarboxylátu. Kysele katalyzovanou hydrolýzou a následnou dekarboxylací získáme požadovaný uridin. Schéma 29. Výstavba pyrimidinového cyklu z -D-ribofuranosylaminu. Druhá z metod využívá D-arabinosu, která reakcí s kyanamidem poskytne C-1 subsituovaný arabinosid (Schéma 30). Ten pak dále podléhá cyklizaci s ethyl esterem kyseliny propynové za vzniku 2,2´-anhydrouridinu. Působením kyseliny chlorovodíkové a následnou redukcí vzniklého 2´-chlorderivátu tributylstannanem získáme 2´-deoxyuridin, který můžeme nakonec konvertovat na 2´-deoxycytidin. Alkalicky katalyzovanou hydrolýzou 2,2´-anhydrouridinu lze získat uracilarabinosid. Schéma 30. Výstavba pyrimidinového cyklu z 2´-amino-D-arabinofuro-1,2-oxazolinu. 76 Oxazolinový derivát vzniklý z D-arabinosy lze také cyklizovat s nitrilem kyseliny propynové za vzniku 2,2´-anhydrocytidinového analoga (Schéma 31), který následně může podléhat alkalické hydrolýze za vzniku cytosinarabinosidu. Schéma 31. Vznik cytosinarabinosidu. 4.1.2.2. Transformace pyrimidinových nukleobází V literatuře je známa celá řada reakcí vedoucích k transformaci pyrimidinových bází a některé z nich jsou znázorněny v následujícím schématu (Schéma 32). Uracilový analog můžeme chlorovat pomocí POCl3 a následně substituovat triazolem za vzniku 4triazolového analoga. Ten může dále podléhat reakci s amoniakem, alkylaminem nebo dialkylaminem za vzniku cytosinových derivátů. Samotný N-1-substituovaný uracil lze připravit i z cytosinového analoga jeho reakcí s kyselinou dusitou. Necháme-li reagovat N1-substituovaný uracil s P2S5 získáme 4-thiouracil, který lze dále alkylovat alkylhalogenidem za vzniku 4-alkylsulfanyl derivát. Jeho následnou reakcí s hydrazinem vzniká 4-hydrazino analog a aminolýzou analog cytosinu. 4-Thiouracily můžeme s výhodou využít k přípravě poměrně reaktivních sulfanyl derivátů. 77 Schéma 32. Transformace pyrimidinových nukleobází. Uracily jsou také často využívány k syntéze jejich 5-analog (Schéma 33), z nichž mnohé prokázaly významné biologické účinky, zvláště cytostatické a antivirální. Velmi rozšířená je halogenace uracilu v poloze C5 následovaná couplingem s organokovy za vzniku derivátů uracilu substituovaných v poloze 5. S výhodou lze reaktivnosti C5 skupiny uracilu využít i k Mannichově reakci s formaldehydem a aminem, která poskytuje 5aminomethyl deriváty, jež lze redukovat na deriváty thyminu. Schéma 33. Transformace pyrimidinových nukleobází v poloze C5. 78 4.1.2.3. Syntéza purinových nukleobází Výstavba purinové nukleobáze může probíhat několika způsoby. První z možností využívá reakce cukerného aminu s 2-amino-4,6-dichlorpyrimidinem a následné působení orthoformiátu na vzniklý meziprodukt. Vzniklý 6-chlorpurinový analog dále reaguje s amoniakem za vzniku adenosinu a reakce je ukončena kysele katalyzovaným štěpením ketalové chránící skupiny (Schéma 34). Schéma 34. Výstavba purinové nukleobáze. Samotnou purinovou nukleobázi můžeme získat i reakcí ethyl 2-amino-2-kyanoacetátu s amidinem (Schéma 35). Vzniklý ethyl 5-amino-1H-imidazol-4-karboxylát pak působením amoniaku následovaným reakcí s orthoesterem převedeme na požadovaný purinový analog. Schéma 35. Výstavba purinové nukleobáze z ethyl 2-amino-2-kyanoacetátu. 79 4.1.2.4. Transformace purinových nukleobází Stejně jako u pyrimidinových bází, i u purinových může probíhat celá řada reakcí vedoucích k záměně substituentu. Výhodným derivátem pro celou řadu konverzí je 6chlorpurin, který snadno podléhá amonolýze, aminolýze nebo hydrazinolýze za vzniku odpovídajících dusíkatých C6 subsituovaných purinů. Tento 6-chlorpurin můžeme připravit z inosinu chlorací thionylchloridem. Chlorace POCl3 následovaná reakcí s triazolem pak vede ke vzniku triazolyl derivátů, které působením aminů poskytují N6-substiutované deriváty adeninu. Deaminací adeninu působením isoamylnitritu v přítonosti methylenjodidu získáme 6-jod derivát. Tento jod analog je velmi výhodným substrátem pro couplingové reakce s organokovy, jež poskytují různé C6-alkyl a aryl puriny. Schéma 36. Transformace purinových analog. 4.1.3. Modifikace cukerné složky Je známá celá řada biologicky aktivních látek, jež mimikují přirozeně se vyskytující nukleosidy. Proto byly vyvinuty syntetické postupy, které jednoduchým způsobem konvertují přirozené cukerné složky na modifikované (Schéma 37). Velice výhodným prekurzorem pro tyto postupy je 2,2´-anhydronukleosid získaný z C5 substituovaného uridinu reakcí s difenylkarbonátem nebo N,N´-thiokarbonyldiimidazolem. Takto získaný 2,2´-anhydrouridin můžeme využít k syntéze 2´-chlor derivátu, jenž vzniká atakem bezvodého chlorovodíku a SN2 reakcí v poloze C´2. Vzniklý 2´-chlornukleosid můžeme dále konvertovat na 2´-deoxynukleosid redukcí tributylstannanem. Stejným mechanizmem (SN2 reakce) dochází i k reakci s azidem lithným za vzniku 2´-azido derivátu, který můžeme dále redukovat na 2´-amino-2´-deoxyuridin. Bazickou hydrolýzou dochází k ataku na C-2 nukleobáze za vzniku epimerního nukleosidu arabinouridinu. 80 Schéma 37. Modifikace cukerné složky pyrimidinových nukleobází. Podobně jako u pyrimidinových nukleosidů lze k tvorbě purinových modifikovaných analog s výhodou využít reaktivity anhydronukleosidů (Schéma 38). Reaktivita purinové nukleobáze v poloze C-8 umožňuje tvorbu brom derivátu, jenž v přítomnosti báze nebo aktivací přes methansulfonyloxy deriváty uzavírá anhydro vazbu za vzniku 5´,8anhydronukleosidu nebo 2´,8- anhydronukleosidu. Oba tyto deriváty lze bazicky otvírat za vzniku příslušných 8-hydroxynukleosidů. Schéma 38. Modifikace nukleosidů. 4.2. Syntéza nukleotidů Monoestery kyseliny fosforečné navázané na hydroxylovou skupinu cukerné složky, lze připravit jak enzymaticky tak synteticky. Synteticky můžeme 5´-nukleotidy připravit 81 pomocí vhodného fosforylačního činidla, nejčastěji POCl3, v trimethylfosfátu jako rozpouštědle. Tato reakce probíhá specificky na 5´-hydroxylové skupině cukerné složky (Schéma 39). Schéma 39. Syntéza 5´-nukleotidů. Tyto 5´-nukleotidy můžeme dále konvertovat na odpovídající nukleosidifosfáty (NDP), a to aktivací zbytku kyseliny fosforečné reakcí s morfolinem a DCC a následnou rekací s tributylamoniovou solí kyseliny fosforečné. Použijeme-li tributylamoniovou sůl kyseliny difosforečné, lze vzniklý morfolidát konvertovat na odpovídající nukleosidtrifosfát (NTP) (Schéma 40). Výhodnější metodou pro syntézu NTP je dvoustupňová reakce provedená v jedné baňce bez mezizpracování. K produktu reakce nukleosidu s POCl3 v trimethylfosfátu se přidá roztok tetrabutylammonium pyrofosfátu v DMF a tributylamin, reakce je hotová po několika hodinách a po zpracování nalitím do triethylammonium bikarbonátového pufru lze izolovat přímo nukleosid trifosfát pomocí iontoměničové kolony. Schéma 40. Syntéza 5´-nukleosiddifosfátů a 5´-nukleosidtrifosfátů. 82 4.3. Syntéza oligonukleotidů Chemická syntéza oligonukleotidů představuje přípravu relativně krátkých fragmentů nukleových kyselin (desítky jednotek), a to přesně definované struktury. Syntéza probíhá na pevné fázi, kterou bývá nejčastěji CPG (controlled pore glass) nebo polystyren. Jedná se o plně automatizovaný proces, který probíhá směrem 3´ → 5´ (na rozdíl od enzymatické syntézy 5´ → 3´). Obvykle jsou připravené oligodeoxynukleotidy či oligonukleotidy jednovláknové s průměrnou délkou 15–50 bází. Délka syntetických oligonukleotidů je limitovaná vzhledem k vznikajícím vedlejším produktům na cca 200 nukleotidů. Syntéza oligonukleotidů našla široké uplatnění v molekulární biologii a medicíně, kde se využívá syntetických oligonukleotidů jako primerů pro DNA sekvenování či PCR amplifikaci, antisense oligonukleotidů, small interfering RNA a existuje mnoho dalších využití. Samotná syntéza oligonukleotidů může probíhat čtyřmi metodami: (a) fosfodiesterovou, (b) fosfotriesterovou, (c) H-fosfonátovou a (d) fosforamiditovou metodou. Nejstarší z nich – fosfodiesterová metoda – byla vyvinuta Khoranou jako metoda syntézy oligonukleotidů v roztoku. Poté byla nahrazena účinnější fosfotriesterovou metodou (Letsinger a Reese) na kterou navázala H-fosfonátová (Todd, Froehler, Matteucci). Přelom však znamenala fosfitová metoda, jež položila základy pro dnes nejpoužívanější fosforamiditový přístup automatizované syntézy oligonukleotidů na pevné fázi (Caruthers). 4.3.1. Fosfodiesterová metoda Dnes již historická metoda je založena na reakci 5´-chráněného deoxyribonukleosidu s 3´-chráněným deoxyribonukleotid-5´-fosfomonoesterem. Nejprve je 3´-chráněný nukleosid-5´-fosfát aktivován např. DCC (N,N´-dicyklohexylkarbodiimid) nebo TsCl (4toluensulfonyl chlorid). Takto získáme silnější fosforylační činidlo, které je schopno reagovat s 3´ hydroxylovou skupinou za vzniku dinukleosid fosfodiesteru. Nevýhodou této reakce je její pomalost, často probíhá i několik dní s výtěžky 30–80%. Vzniklý produkt je také velmi náchylný k další fosforylaci za vzniku trisubstiutovaného pyrofosfátu. Schéma 41. Formace internukleotidové vazby fosfodiesterovou metodou. 83 4.3.2. Fosfotriesterová metoda Fosfotriesterový přístup byl vyvinut v 60. letech Letsingerem a Reesem pro reakce v roztoku a až v 80. letech pak byl aplikován na syntézu na pevné fázi. Hlavní rozdíl od předchozího fosfodiesterového přístupu spočíval v ochraně fosfátového zbytku např. kyanoethyl nebo 2-chlorfenyl skupinou. Při této metodě reaguje tedy 5´-O-substituovaný fosfát s hydroxylovou skupinou druhého deoxynukleosidu za přítomnosti aktivačního činidla, kterým může být MSNT (mesitylensulfonyl 3-nitro-1,2,4-triazolid). Tato metoda vedla k rapidnímu snížení časové náročnosti syntézy a odstartovala tak éru automatizované syntézy oligonukleotidů na pevné fázi. Schéma 42. Formace internukleotidové vazby fosfotriesterovým přístupem. 4.3.3. H-fosfonátová metoda Vzhledem k tomu, že H-fosfonátová vazba v oligonukleotidech je za podmínek oligonukleotidové syntézy stabilní, nevyžaduje protekci fosfátové skupiny. V tomto smyslu můžeme jako protektivní skupinu uvažovat samotný atom H. 2´-Deoxyribonukleosid 3´-Hfosfonát lze připravit reakcí deoxyribonukleosidu s PCl3 a imidazolem nebo triazolem za přítomnosti bazického katalyzátoru (např. triethylaminu nebo N-methylmorfolinu) následovanou hydrolýzou. Takto připravený deoxyribonukleosid 3´-O-(H-fosfonát) je nejprve aktivován sterický objemným acyl chloridem (v tomto případě pivaloyl chloridem) a získaný H-fosfonát diester reaguje s hydroxylovou skupinou dalšího nukleosidu. Výsledný H-fosfonát diester je relativně inertní k další fosfitylaci. Následuje oxidace všech P-center. Výhodou této metody je možnost přípravy dalších derivátů, použijeme-li místo oxidačního činidla jiný nukleofil, např. boran. Ovšem velkou nevýhodou této metody je vznik četných vedlejších produktů, pokud dojde k reakci H-fosfonátu s aktivačním činidlem dříve než ke couplingové reakci. H-fosfonáty také rychle dimerizují za tvorby symetrických fosfitových anhydridů. Všechny tyto nežádoucí reakce pak v konečném důsledku snižují celkový výtěžek reakce. 84 Schéma 43. Formace internukleotidové vazby H-fosfonátovou metodou. 4.3.4. Fosforamiditová metoda Podstatou dnes nejpoužívanější metody je heterogenní kondenzační reakce mezi deoxynukleosidem v roztoku (fosforamiditem) a nukleosidem vázaným na pevný nosič. Zmíněný fosforamidit můžeme připravit reakci 5´-O-chráněného nukleosidu s 2kyanoethyl-N,N´-(diisopropyl)-chlorfosforamiditem za přítomnosti báze (např. N,N´diisopropylethyldiamin) (Schéma 44). Takto získaný fosforamidit vstupuje do reakce s nukleosidem vázaným k pevnému nosiči za účasti aktivátoru a tvorby fosfit triesterové internukleotidové vazby. Oxidace jodem pak vede ke vzniku fosfotriesterové vazby. 85 Schéma 44. Syntéza chráněného fosforamiditu. Schéma 45. Základní kroky syntézy oligonukleotidu. V současné době je tato metoda syntézy plně automatizovaná a využívá tzv. DNA/RNA (příp. LNA) syntetizérů. Syntéza probíhá na pevném nosiči, jenž je nejčastěji CPG (controlled pore glass) nebo polystyren. CPG nosiče jsou komerčně prodávány s různou velikostí částic i pórovitostí a jsou chemicky inertní ke všem reakcím využívaným při syntéze oligonukleotidů. Tyto komerčně dostupné nosiče již obsahují navázaný nukleosid ochráněný v poloze 5´ dimethoxytritylovou skupinou, který je od pevné fáze oddělen dlouhým spacerem tak, aby byla zajištěna přístupnost všech reagentů. Na Obr. 40 je znázorněn příklad takovéhoto CPG. 86 Obrázek 40. Nukleosid navázaný na CPG pomocí spaceru. Samotná čtyřkroková syntéza začíná detritylací 5´-O-dimethoxytritylové chránicí skupiny deoxynukleosidu vázaného na pevnou fázi. Tato reakce bývá uskutečněna za pomocí kyseliny dichlor- nebo trichloroctové v dichlormethanu. Během detritylace dochází k uvolnění dimethoxytritylového kationtu intenzivní oranžové barvy, jež je často využíván k spektrofotometrickému měření účinnosti kondenzačního kroku. Ve druhém kroku je provedena kondenzační reakce nukleosidu vázáného na nosič na 5´-hydroxylové skupině a 3´-O-fosforamiditu za tvorby fosfit triesterové internukleotidové vazby. Třetím krokem cyklu je pak tzv. capping, jehož podstatou je zablokovat všechny nezreagované hydroxylové skupiny a zabránit tak růstu kratších řetězců. K této reakci je nejčastěji používána směs acetanhydridu s 2,6-lutidinem a N-methylimidazolem v THF. Fosfit triester v posledním kroku cyklu podléhá oxidaci jodem za vzniku fosfátu. Pyridin nebo 2,6-lutidin při tom neutralizují uvolněnou kyselinu jodovodíkovou. Schéma 46. Cyklus 4 základních reakcí syntézy oligonukleotidů. 87 Takto se zmíněné procesy opakují až do vzniku oligonukleotidů požadované délky a sekvence. Poté následuje uvolnění finálního produktu z pevné fáze působením koncentrovaného hydroxidu amonného při teplotě 55°C po dobu 16 hodin, kdy současně dochází k eliminaci kyanoethylové skupiny z fosfátu stejně tak jako odstranění protektivních skupin z endocyklických amino skupin jednotlivých bází. Syntéza je tedy uskutečněna v 3´→ 5´ směru. 4.3.5. Chránící skupiny V průběhu syntézy je důležité selektivně a reversibilně ochránit všechna reaktivní místa, jako jsou hydroxylové skupiny a v případě dC, dG a dA také exocyklické amino skupiny tak, aby nedošlo k nežádoucím reakcím. Mezi nejčastěji používané protektivní skupiny -NH2 skupin heterocyklických bází patří benzylová (Bz) a isobutyrylová (iBu) skupina, méně používaná je také fenoxyacetylová (PAC) skupina. Obrázek 41. Protektivní skupiny exocyklických amino skupin. Protektivní skupiny používané k reversibilnímu pokrytí 5´-hydroxylových skupin jsou pak znázorněny na Obr. 42. Jsou to trifenylmethyl (Tr), (4-methoxyfenyl)difenylmethyl (MMTr), [bis-(4-methoxyfenyl)fenylmethyl] (DMTr) a [tris-(4-methoxyfenyl)methyl] (TMTr) skupiny. Všechny tyto skupiny jsou kysele labilní a k jejich odstranění můžeme použít např. kyselinu dichlor- nebo trichloroctovou. Obrázek 42. Protektivní skupiny 5´-hydroxylových skupin. 88 4.3.6. Aktivátory Mezi nejčastěji používané aktivátory patří tetrazol či jeho analoga, aktivátorem však může být i imidazoldikarbonitril nebo pyridinium chlorid. Obrázek 43. Komerčně dostupné aktivátory. 4.3.7. Komerčně dostupné fosforamidity Výhodou automatizované syntézy oligodeoxynukleotidů je snadná komerční dostupnost fosforamiditů, které jsou již připravené s 5´-chráněnou hydroxylovou skupinou i chráněnými endocyklickými amino skupinami jednotlivých bází. Nejčastěji používané komerční fosformidity jsou uvedeny na Obr. 44. Obrázek 44. Komerčně dostupné fosforamidity. 89 4.3.8. Syntéza oligoribonukleotidů Až doposud jsme hovořili o syntéze oligodeoxyribonukleosidů. V případě oligoribonukleosidů je syntéza komplikována přítomností 2´-hydroxylové skupiny, kterou je také nutné reversibilně pokrýt tak, aby nedošlo k nežádoucím reakcím na této skupině. Mezi nejčastěji používané skupiny sloužící k selektivnímu chránění 2´-hydroxylových skupin řadíme tert-butyldimethylsilyl (TBDMS), 1-(2-fluorfenyl)-4-methoxypiperidin-4-yl (Fpmp) nebo tri-iso-propylsilyloxymethyl (TOM) skupiny. Tyto skupiny jsou labilní v přítomnosti fluoridových aniontů a lze je po skončení všech požadovaných reakcí vedoucích k syntéze oligoribonukleotidu odstranit např. pomocí NaF, tetra-nbutylammonium fluoridu (TBAF), pyridin hydrofluoridu (HF-Py) nebo triethylamin hydrofluoridu (HF-NEt3). Obrázek 45. Protektivní skupiny 2´-hydroxylových skupin ribonukleosidů. Některé z používaných reakcí jsou znázorněny ve Schématu 47. První reakce vystihuje selektivní chránění 2´-hydroxylové skupiny. V menší míře je při této reakci přítomen i 3´-substituovaný izomer. Po ukončení požadovaných reakcí pak můžeme TBDMS skupinu odstranit působením fluoridových iontů např. pomocí TBAF. Druhá reakce na Obr. 47 pak popisuje selektivní chránění 3´- a 5´-hydroxylových skupin a následné reversibilní pokrytí 2´-hydroxylové skupiny pomocí Fpmp. Schéma 47. Příklady chránění ribonukleosidů. Samotná automatizovaná syntéza probíhá naprosto stejným čtyřkrokovým mechanizmem jako v případě oligodeoxyribonukleotidů. Jediným rozdílem je přítomnost další chránící skupiny v poloze 2´, přičemž při výběru této skupiny musí být zohledněna její 90 netečnost vůči všem činidlům používaných při tomto procesu. Reaktivita ribonukleotidových fosforamiditů je menší než jejich 2‘-deoxyanalogů, proto je také obvykle nutné prodloužit reakční čas pro coupling z 2 minut na 10 minut. Čtyři základní opakující se kroky syntézy oligoribonukleotidů jsou znázorněny ve Schématu 48. Pro syntézu komerčních RNA oligomerů se často používá i jiná sestava orthogonálního chránění, kdy 2‘-OH je ochráněna orthoesterem labilním v kyselém prostředí. Syntéza na pevné fázi probíhá s jinými činidly a výsledkem je RNA s ochráněnou 2‘-OH skupinou a je tedy odolná proti rozkladu, dobře se skladuje a dlouho vydrží. Takto se distribuuje zákazníkům a ti si ji těsně před použitím zahřejí s mírně kyselým acetátovým pufrem, tím se RNA odchrání a je rovnou použitelná pro biochemické aplikace. Schéma 48. Cyklus 4 základních reakcí syntézy oligoribonukleotidů. Syntéza oligoribonukleotidů je v současné době využívána především k získání modifikovaných oligonukleotidů, na něž jsou kladeny zvláštní požadavky a to v souvislosti s tím, k čemu takový modifikovaný oligonukleotid má sloužit. Nejčastějším požadavkem je stabilita vůči nukleázám či vysoká afinita k cílové sekvenci RNA nebo DNA, atd. Jedním z modifikovaných oligonukleotidů využívaných v klinické praxi je např. Vitravene (fomivirsen), což je 21 mer schválený proti CMV retinitidě v i.v. podání (Obr. 46). Mechanizmus účinku je takový, že se váže na HCMV mRNA. Dnes se už nepoužívá, ale v roce 2013 byl schválen další oligonukleotidový přípravek mipomersen (KynamroTM), který se používá ke snížení hladiny cholesterolu. 91 Obrázek 46. Fomivirsen. (http://en.wikipedia.org/wiki/Fomivirsen#mediaviewer/File:Fomivirsen_composite.png) 92 5. Inhibitory jednotlivých stupňů rozmnožování virů Působení antivirových chemoterapeutik (virostatik) je založeno na několika rozdílných mechanizmech souvisejících s inhibicí jednotlivých stádií životního cyklu virů. Některá antivirotika mohou zasahovat již do samotné adsorpce virionu na buněčnou membránu, některá interagují s povrchovou strukturou virionu, avšak převážná část antivirotik interferuje s produkcí virového potomstva v buňce. Následující přehled přibližuje rozdělení antivirotik v této kapitole: 1. Látky ovlivňující adsorpci virionu na povrch buňky 2. Látky interagující s povrchovou strukturou virionu 3. Inhibitory syntézy virových NK (analoga substrátu nebo produktu, acyklické nukleosidy, chelatační činidla, interkalátory, látky interagující s molekulou polymerasy, inhibitory herpesvirové helikasy-primasy, inhibitory RNA-dependentní RNA-polymerasy, inhibitory helikasy HCV) 4. Inhibitory viru HIV (Inhibitory průniku do buňky, nukleosidové inhibitory reversní transkriptasy (NRTI), nukleotidové inhibitory reversní transkriptasy (NtRTI), nenukleosidové inhibitory reversní transkriptasy (NNRTI), inhibitory HIV integrasy a transkripce virové RNA, inhibitory HIV proteasy 5. Inhibitory HBV 6. Inhibitory virových proteas – proteasy jsou enzymy, které štěpí syntetizované virové polyproteinové řetězce, vznikající translací virové RNA, na menší funkční proteiny s enzymovou aktivitou a strukturální proteiny, které pak tvoří části struktury virionu. V této kapitole budou pojednávány tři proteasy (rozdělené podle katalytických skupin ve vazebném místě): (a) (b) (c) aspartátové – např. aspartátová proteasa viru HIV serinové – nejdůležitější je serinová proteasa viru hepatitidy C – HCV NS34A proteasa, která vyštěpuje z polyproteinu několik nestrukturálních proteinů cysteinové – např. cysteinová proteasa 3C lidského rhinoviru 5.1. Látky ovlivňující adsorpci virionu na povrch buňky Působení těchto látek je obvykle založeno na blokádě buněčného receptoru nutného k navázání virových částic k povrchu buňky nebo na interakci s buněčnou membránou, v jejímž důsledku dochází k zamezení fúze viru s buňkou. Byla vyvíjena celá řada takových látek (Obr. 47), avšak u většiny z nich převládaly nežádoucí vedlejší účinky nad samotným terapeutickým efektem, proto pouze jediný derivát z Obr. 47 je klinicky používán – n-dokosanol (behenylalkohol, C22-alkohol, lidakol). Tato látka byla licencována a v roce 2000 schválena v USA a Kanadě pod komerčním názvem AbrevaTM k léčbě herpes labialis (opar). V Evropě se používá pod názvem ErazabanTM. Tento přípravek je používán ve formě krému obsahující 10% dokosanolu. Inhibuje fúzi mezi buněčnou membránou a virovým (HSV) obalem, brání tak průniku do buňky. 93 Obrázek 47. Povrchově aktivní látky ovlivňující adsorpci virionu na buněčnou membránu. Bicyklamy jsou specifickou skupinou sloučenin, které inhibují koreceptory CXCR4 na T4 lymfocytu. Zde zcela jistě stojí za zmínku bicyklam plerixafor (AMD-3100) objevený De Clercqem pro potencionální použití při léčbě HIV. Plerixafor blokuje koreceptor CXCR4. Bohužel byl výzkum této látky vzhledem k nedostatečné orální dostupnosti a častým srdečním poruchám ukončen. Nicméně výzkum této látky nebyl zbytečný, neboť je používána jako imunostimulans (MozobilTM). Obrázek 48. Struktura plerixaforu. 5.2. Látky interagující s povrchovou strukturou virionu Látky patřící do této skupiny jsou založeny na obsazení receptoru na povrchu virionu, čímž dochází k zabránění interakce virionu s receptory na povrchu buňky. Látky tohoto typu jsou vyvíjeny např. proti chřipce a pikornavirům. Mechanizmus účinku protichřipkových látek vychází ze stavby virionu chřipky, který obsahuje dva povrchové proteiny – hemaglutinin a neuraminidasu. Jak již bylo řečeno dříve, hemaglutinin zprostředkovává vazby mezi virionem a receptory na povrchu buněk respiračního traktu obsahujícími zbytek kyseliny sialové. Neuraminidasa štěpí nové viriony z povrchu buňky, a tím brání jejich agregaci – štěpí terminální vazby sialové kyseliny hostitelské buňky. A právě na inhibici neuraminidasy je založena celá řada protichřipkových antivirotik, jejichž struktura mimikuje (alespoň částečně) kyselinu sialovou (Obr. 49). Nejvýznamnějšími látkami jsou zanamavir (RelenzaTM) podávaný ve formě aerosolu a oseltamivir (TamifluTM) určený k perorálnímu podání. 94 Obrázek 49. Protichřipkové látky. Druhou zmíněnou skupinou jsou látky působící proti pikornavirům, jako jsou enteroviry, polioviry nebo rhinoviry. Na Obr. 50. jsou uvedeny struktury některých látek. Pleconaril (PicovirTM) je látka vyvíjena firmou Sanofi-Aventis a licencována firmou ViroPharma v roce 1997. Klinická fáze II byla ukončena v roce 2007. V orálním podání je účinný zejména proti enterovirům a rhinovirům. Arildon je rovněž účinný proti picornavirům, a to proti polioviru a coxsackie viru. Poslední zmíněný pirodavir (R 77975) vykazuje antivirotické účinky proti rhinovirům. Obrázek 50. Antivirotika účinná proti picornavirům. 5.3. Inhibitory syntézy virových nukleových kyselin Proces replikace DNA je poměrně složitý a podílí se na něm několik enzymů, které jednotlivé kroky tohoto procesu katalyzují. DNA polymerasy jsou nezbytně nutné pro syntézu nové DNA, a proto je na základě jejich inhibice založen účinek celé řady antivirotik. Podle mechanizmu účinku na replikaci virové DNA dělíme inhibitory na: (a) (b) analoga substrátu analoga produktu 95 (c) (d) (e) (f) chelatující látky interkalátory látky inaktivující DNA-polymerasy (DNA-pol) látky interagující s molekulou DNA-pol mimo aktivní místo 5.3.1. Analoga substrátu První skupina látek zahrnuje nukleosidové antimetabolity založené na strukturní podobnosti s přirozeným substrátem, kdy se vazebné místo enzymu musí přizpůsobit změněné konformaci modifikované molekuly. Patří sem celá řada látek, z nichž některé jsou znázorněny na Obr. 51. Jedná se o analoga thymidinu jako idoxuridin, brivudin, aedurid nebo trifluridin a na cukru modifikované nukleosidy sorivudin a vidarabin (arabinosidy). Ve všech případech je nutná aktivace fosforylací. Obrázek 51. Struktury některých antivirotik – analoga substrátu. Všechny uvedené látky působí jako inhibitory herpesvirových DNA-polymeras. Nejstarší z této skupiny látek je 5-jod-2´-deoxyuridin (Idoxuridin, IUDR, IDU, HerpidTM, StoxilTM, IdoxenTM), který byl syntetizován W. Prusoffem na konci 50. let minulého století. Původně byl vyvinut jako protinádorová látka, avšak později se ukázaly jeho antivirální účinky a stal se tak v roce 1962 prvním nukleosidovým antivirotikem. Je to doposud užívaná látka, a to v očním lékařství k léčbě herpesvirové keratitidy. Stejné použití má i 5ethyl-2´-deoxyuridin (AeduridTM). Brivudin (BVDU, ZostexTM, HelpinTM, ZerpexTM, ZonavirTM, BridicTM) je analog thymidinu, který byl poprvé syntetizován v 70. letech na Birminghamské univerzitě. V roce 1979 výzkum vedený Erikem De Clercqem poukázal na účinky této látky jako potenciálního inhibitoru herpes simplex viru typu 1 a varicella zoster viru a během 80. let 96 následovalo uvedení této látky na trh, dnes je používána k léčbě VZV infekcí, herpes labialis nebo herpesvirové keratitidy. Ukázalo se, že brivudin je mnohem efektivnější než idoxuridin. Fosforyluje se do prvního a druhého stupně herpesvirovými kinasami. Poněkud odlišným mechanizmem, avšak se stejným použitím (oční lékařství k léčbě HSV konjunktivitidy), působí trifluridin (ViropticTM, TrifluridineTM). Nejdříve je konvertován na 5´-fosfát, avšak nepůsobí jako inhibitor virové polymerasy, ale inhibuje thymidylátsynthasu. Jako inhibitory herpesvirové DNA-polymerasy působí i vidarabin a sorivudin. Adeninarabinosid (VidarabinTM, ara-A) je antivirotické léčivo působící proti herpes simplex a varicella zoster viru, poxvirům, rhabdovirům, hepadnavirům. Tato látka byla poprvé syntetizována v roce 1960 na Stanford Research Institute jako potenciální protinádorové léčivo, avšak již v roce 1964 byly popsány antivirální účinky. Vidarabin byl rovněž indikován k léčbě neonatální herpetické encefalitidy. Vzhledem k nízké rozpustnosti této látky se však od jejího používání upouští a je nahrazována acyklovirem, který má vyšší selektivitu, nižší inhibiční koncentraci a je účinnější. Druhým arabinosidem zmíněným v této kapitole je sorivudin (UsevirTM, BrovavirTM). Jedná se o látku účinnou proti herpes virům, zejména HSV-1, VZV a EBV virům. 5.3.2. Analoga produktu Vznik řetězce DNA či RNA z nukleosidtrifosfátů působením DNA-polymeráz je doprovázen i vznikem ekvimolárního množství difosfátu (Obr. 52). Pokud se nám však podaří dopravit do buňky analog difosfátu, který nemůže být účinkem pyrofosfatas degradován, může působit jako inhibitor produktu. Tento účinek byl skutečně prokázán např. u látky foskarnet (FoscavirTM), který působí jako inhibitor všech herpesvirů (HSV, VZV, CMV, atd.) Obrázek 52. Vznik difosfátu a analog produktu. 5.3.3. Inhibitory herpesvirové helikasy-primasy Herpes simplex virus může za určitých okolností způsobit život ohrožující infekce, například herpetickou encefalitidu, a žádná terapie (ani doposud hojně užívaný acyklovir) nedokáže eliminovat virus v latentním stádiu. Proto se intenzivně vyvíjí látky působící jiným mechanizmem než inhibicí DNA polymerasy nebo thymidinkinasy. 97 Pomocí mutageneze bylo zjištěno, že pro replikaci HSV virů je nezbytná přítomnost (a exprese) sedmi genů – UL5, UL8, UL9, UL29, UL30, UL42 a UL52. Podrobnější analýza ukázala, že geny UL5 a UL52 kódují proteiny zodpovědné za 5‘-3‘ DNA helikasovou a DNA primasovou aktivitu a tvoří komplex s proteinem kódovaným genem UL8, který stimuluje syntézu primeru. Tento komplex – HSV-1 helikasa-primasa (Obr. 53a.) je nezbytný pro zahájení polymerace virové DNA. Helikasa rozplétá dvoušroubovici DNA a s ní spojená RNA primasa začne de novo syntetizovat RNA primer komplementární k DNA vláknu. Když primer dosáhne délky asi 7–14 nukleotidů, polymerizaci převezme virová DNA polymerasa (gen UL30) dokončí syntézu celého řetězce DNA, odstraní primer a nahradí ho DNA. Inovativní přístup k léčbě herpesvirových onemocnění dnes představují inhibitory komplexu helikasa-primasa (HPIs) herpesvirů (Obr. 53b), které ve výsledku selektivně inhibují syntézu herpesvirové DNA. Obrázek 53. Mechanizmus fungování helikasa-primasa komplexu a jejich inhibitorů. http://www.nature.com/nm/journal/v8/n4/fig_tab/nm0402-327_F1.html 98 Ze studií věnovaných výzkumu inhibitorů komplexu helikasa-primasa vzešly tři velmi účinné látky určené k prevenci a léčbě herpes simplex viru, z nichž dvě jsou v současné době ve fázi II klinických testování (Obr. 54). Pritelivir (BAY 57–1293, AIC316) je vysoce aktivní a specifický inhibitor herpes simplex virů, je aktivní proti herpes labialis (HSV-1) a herpes genitalis (HSV-2) a zatím si zachovává aktivitu i vůči virům, které jsou rezistentní k doposud používaným přípravkům. Oproti nukleosidovým analogám nevyžaduje aktivaci virovou thymidinkinasou v infikované buňce, zachovává si dlouhou životnost a má velmi příznivé dávkování (jedna tableta na celou léčbu). Amenamevir (ASP2151) je aktivní proti herpes simplex virus HSV-1, HSV-2 a varicella-zoster viru (VZV) v kombinaci s ACV a PCV. Ukazuje se, že by tato látka mohla být použitelná i pro případ závažných onemocnění jako jsou herpetická encefalitida nebo u pacientů se zhoršenou imunitou. V současnosti je rovněž ve druhé fázi klinického výzkumu. Třetí látkou je BILS 179 BS firmy Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, která vykazuje vysokou efektivitu na vaginální a kožní léze. Obrázek 54. Inhibitory hepresvirové helikasy-primasy. 5.3.4. Inhibitory RNA-dependentní-RNA polymerasy RNA-dependentní-RNA polymerasa syntetizuje RNA vlákno podle RNA předlohy. Virové RNA-dependentní RNA polymerasy katalyzují syntézu řetězce (-)RNA na templátu (+)RNA a ten pak použijí jako templát k pomnožení (+)RNA. Nejsou schopné ani kontroly (proofreading), ani opravy (vyskytuje se zde přibližně 100 × více chyb než u DNApolymeráz). Inhibitory RNA-dependentní-RNA polymerasy můžeme rozdělit do dvou strukturních typů, nukleosidové a nenukleosidové. Jejich výzkum přinesl nové poznatky hlavně v léčbě viru hepatitidy C (HCV). Na tomto místě můžeme zmínit látky, jejichž struktury jsou 99 znázorněny na Obr. 55. Sofosbuvir blokuje RNA-dependentní RNA polymerasu označovanou jako NS5B, která hraje klíčovou roli při replikaci HCV (viz kapitola 5.6.). Látka R1479 (4´-azidocytidin) vykazuje účinky proti HCV viru, které jsou založeny na inhibici NS5B polyproteinu (RNA-dependentní-RNA polymerasa). V roce 2007 vstoupil do klinických studií valopicitabin (NM283), který v preklinickém výzkumu prokázal vliv na replikaci viru hepatidy C specifickou inhibicí HCV RNA polymerasy. V současné době probíhá fáze IIb, kde se sleduje efekt kombinované terapie valopicitabinem s pegylovaným interferonem. PSI-6130 je nukleosid určený rovněž k experimentální léčbě hepatitidy typu C. Jeho účinek je, stejně jako u předchozích, založen na inhibici NS5B polymerasy. Mericitabin je látka vyvinuta k léčbě HCV infekcí. Jedná se o tzv. prodrug látky PSI-6130, cytidinový nukleosidový analog působící rovněž jako inhibitor HCV RNA polymerasy. Látka R7128 ukázala in vitro aktivitu proti všem nejběžnějším HCV genotypům (1,2,3 a 4). V roce 2008 zahájily firmy Pharmasset, Roche a InterMune studie kombinovaného přípravku INFORM-1 obsahujícího právě R7128 v kombinaci s danoprevirem (ITMN191/R7227; proteasový inhibitor). Tato studie je právě ve fázi II klinického testování. Obrázek 55. Inhibitory RNA-dependentní-RNA polymerasy. 5.3.5. Inhibitory DNA-dependentní RNA-polymerasy DNA-dependentní-RNA polymerasa je enzym, který produkuje primární transkript RNA a je nezbytný pro tvorbu řetězce RNA podle templátu DNA. Některé z inhibitorů tohoto enzymu jsou znázorněny na Obr. 56. Ribavirin (VirazoleTM, VirazidTM, ViramidTM) je neukleosidový analog, který byl poprvé syntetizován před více než 35 lety a v in vitro testech vykazuje široké spektrum účinků proti několika RNA i DNA virům. V současné době je schválen k léčbě pneumonií vyvolaných respiračním syncitiálním virem (RSV) a 100 v kombinované terapii s interferonem alfa také k léčbě infekcí vyvolaných virem hepatitidy C. Často je také volbou k léčbě život ohrožujících virových infekcí jako jsou horečka Lassa a hemoragické horečky způsobené viry z čeledi bunyaviridae a arenavirida. Prodrug ribavirinu nazývaný taribavirin (Viramidin, ICN 3142) je také účinný proti mnoha DNA i RNA virům (HCV, HBV, žlutá zimnice). Právě se nachází ve fázi III klinických studií. Obrázek 56. Inhibitory DNA-dependentní-RNA polymerasy. 5.4. Inhibitory viru HIV Reversní transkriptasa (RT) je RNA-dependentní-DNA polymerasa, která přepisuje retrovirovou RNA do DNA, která je následně integrována do genomu infikované buňky. Reversní transkripci využívají tzv. retroviry, jejichž nejznámější zástupce je virus HIV, původce onemocnění AIDS a také hepadnaviry a jejich zástupce virus hepatitidy typu B. Onemocnění AIDS (syndrom získaného imunodeficitu) bylo poprvé popsáno v roce 1981 a o dva roky později pak byl objeven původce tohoto onemocnění – virus HIV. Tento retrovirus preferenčně infikuje buňky s receptorem CD4+, hlavně T-lymfocyty, ale i další buněčné typy (makrofágy a glie). V současné době je na trhu přes 30 samostatných nebo kombinovaných přípravků s různými mechanizmy účinku, avšak jejich vývoj neustále pokračuje, protože virus HIV si snadno vytváří rezistenci na používaná léčiva, zejména prostřednictvím mutací. Mechanizmu účinku anti-HIV přípravků: Látky používané k léčbě HIV můžeme dělit do několika skupin. Podle zásahu do klíčových funkcí enzymů HIV rozlišujeme: (a) (b) (c) (d) inhibitory průniku do buňky inhibitory reversní transkriptasy inhibitory HIV integrasy inhibitory proteasy Podle chemické struktury pak dělíme inhibitory RT na: (a) (b) nukleosidové inhibitory (NRTI) nukleotidové inhibitory (NrRTI) 101 (c) nenukleosidové inhibitory (NNRTI) Obrázek 57. Místa zásahu inhibitorů viru HIV. http://www.biology.arizona.edu/immunology/tutorials/aids/treatment.html 5.4.1. Inhibitory průniku do buňky Vstup do buňky je zahájen interakcí receptorů (CD4) a koreceptorů (CXCR4 nebo CCR5) přítomných na povrchu hostitelské buňky s glykoproteiny (gp120 gp41) na povrchu virionu. Klíčová je interakce glykoproteinu gp120, který se pomocí koreceptoru naváže na receptor CD4. Dochází tak ke konformační změně glykoproteinu gp120, která umožní rozvinutí gp41 a ten svými hydrofobními konci proniká přes buněčnou membránu. Vstup viru HIV může být blokován specifickými látkami, které interagují s receptory či glykoproteiny a znemožní tak samotnou fúzi. Jednou z takovýchto látek je maraviroc (SelzentryTM, CelsentriTM) (Obr. 58). Působí jako antagonista CCR5 koreceptoru. Naproti tomu enfuvirtid (FuzeonTM) je oligopeptid modifikovaný na N a C, který mimikuje povrchový protein gp41 a působí tak jako inhibitor fúze virionu. Vzhledem k faktu, že léčba enfuvirtidem je velmi nákladná, používá se v případě rezistence na ostatní retrovirové látky jako tzv. „šetřící terapie“. 102 Obrázek 58. Struktura maravirocu. 5.4.2. Nukleosidové inhibitory reversní transkriptasy (NRTIs) Na Obr. 59 jsou uvedeny některé nukleosidové inhibitory RT. Nejstarší z nich azidothymidin (AZT, ZDV, zidovudin, RetrovirTM) byl schválen k léčbě HIV v roce 1987. Byl však objeven mnohem dříve, v roce 1964 Horwitzem, jako látka s potenciálními protinádorovými účinky. Po objevení viru HIV začaly komplexní testy dosud připravených nukleosidových přípravků z hlediska jejich antiretrovirových účinků a právě azidothymidin se ukázal jako perspektivní. Jeho účinek v buňce je podmíněn fosforylací za vzniku 5´trifosfátu, který se inkorporuje do DNA. Stavudin (d4T, ZeritTM) patří k nejpoužívanějším antiretrovirotikům a je součástí tzv. HAART (highly aggresive anti retroviral therahy; metoda používaní existujících léků proti HIV, která spočívá v kombinaci NRTI + NNRTI + inhibitoru aspartátové proteasy). Dále zde můžeme zmínit dideoxynukleosidy zalcitabin a didanosin. Zalcitabin (dideoxycytidin, ddC, HividTM), jehož prodej byl však v roce 2006 zastaven v důsledku snížené poptávky. Didanosin (dideoxyinosin, ddI, VidexTM) se rovněž používá v kombinované terapii HAART. Abacavir (ABC, ZiagenTM) je látka, která se v buňkách transformuje deaminací a fosforylací na příslušný 5-trifosfát guanidinového analogu. Používá se dále v kombinované formulaci se zidovudinem a lamivudinem (TrizivirTM) a také s abacavirem a lamivudinem (KivexaTM nebo EpziconTM). Emtricitabin (FTC, Emtrivabvb TM) a lamivudin (3TC, EpivirTM) patří mezi 3thioanaloga L-řady nukleosidů, které jsou účinné také proti HBV. 103 Obrázek 59. Nukleosidové inhibitory reversní transkriptasy. Následující schéma zachycuje jednu z metod syntézy azidothymidinu. Výchozí 2´deoxythymidin je nejprve tritylován za vzniku 5´-chráněného nukleosidu. Reakcí 3´hydroxylové skupiny s methylsulfonyl chloridem vzniká mesyl derivát. Následným působením methoxidu sodného připravíme anhydronukleosid, který podléhá nukleofilnímu ataku azidem sodným. Detritylací v kyselém prostředí např. trifluoroctové kyselině dostáváme azidothymidin. Schéma 49. Syntéza azidothymidinu. 104 Následující tabulka ukazuje nukleosidové inhibitory reversní transkriptasy včetně roku jejich schválení k použití v klinické praxi. Tabulka 4. Přehled nukleosidových inhibitorů reversní transkriptasy. Komerční název Generický název Výrobce Retrovir Videx Hivid Zerit Epivir Combivir Ziagen Videx EC zidovudin, azidothymidin AZT, ZDV didanosin, dideoxyinosin, ddI zalcitabin, dideoxycytidin, ddC stavudin, d4T lamivudin, 3TC lamivudin – zidovudin abacavir sulfat, ABC didanosin: enterosolventni tobolky, ddI EC abacavir – zidovudin – lamivudin tenofovir disoproxil fumarat, TDF emtricitabin, FTC abacavir – lamivudin GlaxoSmithKline BristolMeyers-Squibb Hoffmann-La Roche BristolMeyers-Squibb GlaxoSmithKline GlaxoSmithKline GlaxoSmithKline BristolMeyers-Squibb Rok schválení (FDA) 1987 1991 1992 1994 1995 1997 1998 2000 GlaxoSmithKline Gilead Sciences Gilead Sciences GlaxoSmithKline 2000 2001 2003 2004 – Gilead Sciences 2004 Trizivir Viread Emtriva Epzicom (USA) Kivexa (EU) Truvada tenofovir disoproxil emtricitabin fumarat Od roku 2009 jsou v klinických testech další látky působící jako nukleosidové inhibitory reversní transkriptasy (Obr. 60). Amdoxovir byl objevený R.F. Schinazi na Emory Universitě a C.K. Chu na University of Georgia. Tato látka je vyvíjena společností RFS Pharma a v současnosti je ve fázi II klinických testů. Dalšími experimentálními NRTI jsou látky strukturně podobné lamivudinu a emtricitabinu. Elvucitabin je vyvíjený společností Achillion Pharmaceuticals, Inc. V současnosti je ve fázi II klinických testů. Apricitabin (AVX754, SPD754, ATC) v roce 2009 ukončil fázi IIb klinických testů a chystá se jeho schvalování. Podle posledních informací firmy Avexa z roku 2013 vyplývá, že přípravek ještě do klinické fáze III nevstoupil. Obrázek 60. Další nukleosidové inhibitory reversní transkriptasy. 105 Všechny doposud zmíněné inhibitory reversní transkriptasy viru HIV působí společným mechanizmem založeným na terminaci syntézy DNA řetězce. Modifikovaný nukleosid, který atakuje řetězec DNA, nemá v poloze 3´ žádnou hydroxylovou skupinu, se kterou by mohlo dojít k další reakci. Proto je inkorporací modifikované molekuly do nově vznikajícího řetězce DNA růst této molekuly ukončen (Obr. 61B). Obrázek 61. Znázornění syntézy řetězce DNA reakci s nukleosidtrifosfátem (A), terminace růstu DNA inkorporací modifikovaného analoga (B). 5.4.3. Nukleotidové inhibitory reversní transkriptasy (NtRTIs) Pro aktivaci antimetabolitu je klíčová jeho přeměna na trifosfát. Fosfátová vazba není příliš stabilní a snadno se enzymaticky degraduje, proto se hledala analoga fosfátů, která by vůči těmto nukleolytickým enzymům byly stabilní. Proto byly syntetizovány tzv. acyklické fosfonáty (viz. Kapitola 6) a z dlouholetých výzkumů vzešel jeden přípravek – tenofovir (TDF, VireadTM), účinný ve formě disoproxil fumarátu. Tato látka je účinná nejen proti viru HIV, ale také HBV. K této látce se ještě vrátíme v kapitole 6. Obrázek 62. Nukleotidové inhibitory reversní transkriptasy. 5.4.4. Nenukleosidové inhibitory reversní transkriptasy (NNRTIs) Nenukleosidové inhibitory reversní transkriptasy se váží přímo k reversní transkriptase v blízkosti nukleosidu. Historie jejich výzkumu začala v 70. letech, kdy bylo zjištěno, že látky založené na struktuře benzodiazepinonu a benzodiazepinthionu mají mimořádný účinek, avšak brzy dochází k vytvoření rezistence. Proto byla vyvíjena další analoga, 106 jejichž struktura obsahuje např. diarylpyrimidin, benzoxazinon, pyridinylpiperazin nebo benzodiazepin. Z těchto výzkumů vzešla celá řada látek, z nichž některé jsou uvedeny na Obr. 63. První generace zahrnuje nevirapin, delavirdin, efavirenz, emivirin a capravirin, z další generace můžeme uvést etravirin. Nevirapin (NVP, ViramuneTM) byl prvním schváleným NNRTI. V roce 1996 byl v USA schválen pro dospělé a v roce 1998 pro děti, v Evropě v roce 1997. Delavirdin (DLV, RescriptorTM) byl schválen jen o rok později v roce 1997. V roce 1998 se k prvním dvěma přidal efavirenz (EFV, SustivaTM (USA), StocrinTM (EU)). Trojkombinace látek efavirenz – emtricitabine – tenofovir disoproxil fumarát byla schválena v roce 2006 pod komerčním názvem AtriplaTM. Emivirin a Capravirin představují látky, jejichž vývoj byl ukončen ve fázi IIb klinických testů z důvodu nižší aktivity oproti již používaným látkám a také z důvodu interakce s jinými látkami proti HIV, které se v kombinaci používaly. V roce 2008 byl v USA schválen etravirin (ETR, IntelenceTM, TMC125). Obrázek 63. Nenukleosidové inhibitory reversní transkriptasy první generace. Od roku 2009 jsou v klinických studiích také další látky, z nichž jsou na Obr. 64 uvedeny tři z nich. Zatím poslední z této skupiny klinicky používaných přípravků proti viru HIV je rilpivirin, který v roce 2009 úspěšně ukončil fázi III klinických testů a v roce 2011 následovalo jeho schválení pro klinické použití pod komerčním názvem CompleraTM. Dapivirin (TMC120) je právě ve fázi III klinických testů. Zkouší se také jeho kombinace s maravirocem (inhibitor průniku do buňky). Calanolid A je experimentální NNRTI poprvé izolovaný ze stromu Calophyllum lanigerum v roce 1987. Jeho totální syntéza byla publikována v roce 1996. 107 Obrázek 64. Nenukleosidové inhibitory reversní transkriptasy druhé generace. Tabulka 5. Přehled nenukleosidových inhibitorů reversní transkriptasy. Komerční název Viramune Rescriptor Sustiva (USA) Stocrin (EU) Intelence Complera (USA) Eviplera (EU) Generický název Výrobce nevirapin, NVP delavirdin, DLV efavirenz, EFV Boehringer Ingelheim Pfizer BristolMeyers-Squibb Rok schválení (FDA) 1996 1997 1998 etravirin, ETV rilpivirin, TMC278 Tibotec Therapeutics Tibotec Therapeutics 2008 2011 5.4.5. Inhibitory HIV integrasy a inhibitory transkripce virové RNA HIV integrasa je další enzym klíčový pro replikaci retroviru, integruje retrovirový genom do hostitelské DNA. Její funkční ekvivalent v lidských buňkách neexistuje. Retrovirová integrasa katalyzuje dvě reakce: (a) štěpení 3´-koncového dinukleotidu G-T z jednoho nebo obou 3´-konců virové DNA, (b) přenos řetězce virové DNA, ve kterém je 3´-konec virové DNA kovalentně vázán k hostitelské chromozomální DNA. První schválený inhibitor HIV integrasy je raltegravir (MK-0518, RAL, IsentressTM). FDA schválila tento přípravek v roce 2007 pro použití v kombinované terapii při infekci virem HIV. Elvitegravir (GS-9136, EVG, VitektaTM) byl schválen v roce 2012 pro použití v kombinované terapii pod názvem Stribild, v roce 2014 potom ve formě tablet pod komerčním názvem Vitekta. Poslední z trojice na Obr. 65 je látka S-1360, jejíž vývoj byl však v klinických testech ukončen. Obrázek 65. Inhibitory HIV integrasy 1. generace. 108 Druhá generace inhibitorů integrasy přinesla několik přípravků, z nichž jeden je klinicky používán. Jsou znázorněny na Obr. 66. Dolutegravir (DTG, S/GSK1349572 nebo 572) je licencován firmou GlaxoSmithKline pod komerčním názvem Tivicay a byl schválen v roce 2013. V lednu 2014 byl pak schválen i pro použití v EU. Cabotegravir (S/GSK1265744) je zatím neschválené léčivo v současnosti ve fázi IIb klinických testů. V experimentální fázi jsou také další dva inhibitory retrovirové inegrasy a to MK-0536 a MK-2048. Obrázek 66. Inhibitory HIV integrasy 2. generace. Tabulka 6. Přehled inhibitorů HIV integrasy. Komerční název Generický název Výrobce Isentress Vitekta Tivicay raltegravir, RAL elvitegravir, GS-9136, EVG, dolutegravir, DTG Merck Co.,Inc. Gilead Sciences GlaxoSmithKline Rok schválení (FDA) 2007 2012 2013 5.4.6. Inhibitory HIV proteasy Proteasy (proteinasy) jsou enzymy, které štěpí virové polyproteinové řetězce, vznikající translací virové RNA, na menší funkční proteiny s enzymovou aktivitou a na strukturní proteiny, které pak tvoří virion. Inhibitory proteasy HIV narušují kompletaci a sestavování a zrání (maturaci) virů, nedochází tak k jeho reprodukci a infikování dalších buněk. Mezi tyto inhibitory řadíme látky znázorněné na Obr. 67. Ritonavir (RTV, NorvirTM) byl pro klinické použití schválen v roce 1996. Indinavir (IDV, CrixivanTM) byl schválen rovněž v roce 1996. O rok později byl schválen nelfinavir (AG1343, ViraceptTM) jehož hlavním nežádoucím projevem je průjem. Zajímavostí je, že kromě virostatických účinků vykazuje nelfinavir i významnou protinádorovou aktivitu a od roku 2008 je v klinických testech proti rakovině slinivky břišní (v současnosti fáze II). Saquinavir (FortovaseTM) byl 109 k léčbě HIV schválen v roce 1997, avšak jeho prodej byl v roce 2006 v důsledku snížené poptávky zastaven. K dalším schváleným inhibitorům HIV proteasy se v roce 1999 přidal amprenavir (APV, AgeneraseTM) a o rok později lopinavir (ABT-378, KaletraTM), který se používá ve dvojkombinaci s ritonavirem. Obrázek 67. Inhibitory HIV proteasy 1. generace. V druhé generaci inhibitorů HIV proteasy byly prozatím ke klinickému užití schváleny 4 látky (Obr. 68). Fosamprenavir (FOS-APV, LexivaTM, TelzirTM) byl schválen v roce 2003, často se podává v kombinaci ritonavirem a je levnější než jeho předchůdce lopinavir. Ve stejném roce byl schválen inhibitor atazanavir (ATV, ReyatazTM), který se podává jen jednou denně a má nohem menší nežádoucí účinky. Tipranavir (TPV, AptivusTM) inhibuje replikaci virů, které jsou rezistentní k jiným typům proteasových inhibitorů. Byl schválen v roce 2005, pro pediatrii pak v roce 2008. Stejně jako lopinavir a atazanavir se používá v tzv. záchranné terapii, když se u pacienta vyvine rezistence vůči jiným přípravkům. Atazanavir i tipranavir se používají v kombinované terapii s ritonavirem. Zatím poslední ze schválených látek působících jako inhibitory HIV proteasy je darunavir (DRV, PrezistaTM), který byl schválen v roce 2006 pro rezistentní mutace HIV. 110 Obrázek 68. Inhibitory HIV proteasy 2. generace. Tabulka 7. Přehled inhibitorů HIV proteasy. Komerční název Generický název Invirase Norvir Crixivan Viracept saquinavir mesylat, SQV ritonavir, RTV indinavir, IDV nelfinavir mesylat, NFV Fortovase Agenerase Kaletra Reyataz Lexiva (USA) Telzir (EU) Aptivus Prezista Výrobce Hoffmann-La Roche Abbott Laboratories Merck Agouron Pharmaceuticals saquinavir Hoffmann-La Roche amprenavir, APV GlaxoSmithKline lopinavir – ritonavir, LPV/r Abbott Laboratories atazanavir sulfat, ATV BristolMeyers-Squibb fosamprenavir kalcium, FOS- GlaxoSmithKline APV tipranavir, TPV Boehringer Ingelheim darunavir, DRV Tibotec, Inc. Rok schválení (FDA) 1995 1996 1996 1997 1997 1999 2000 2003 2003 2005 2006 111 5.4.7. Současná antiretrovirová terapie pacientů s HIV infekcí Hlavním problémem antiretrovirové terapie jsou nežádoucí účinky jednotlivých přípravků a také častý vznik rezistence. Některé z přípravků jsou při delším používání nefrotoxické (např. acyklické nukleosidfosfonáty), některé vedou k laktátové acidóze, zvýšení hladiny cukru a plazmatických lipidů. Tento problém se pak řeší přechodem na jiné léčivo. Druhým problémem je, jak již bylo řečeno výše, vytvoření rezistence vůči používanému léčivu. Ta je častá především u NNRTI a někdy dochází i k tzv. křížové rezistenci, tzn., že zmutovaný vir je rezistentní nejen vůči jednomu léčivu, ale k celé třídě léčiv. Proto se v současné době využívá především kombinovaná terapie tří nebo více léčivých přípravků, kterou nazýváme HAART (highly active antiretroviral therapy) nebo nověji cART. Většinou se jedná o kombinaci dvou nukleosidových inhibitorů reversní transkriptasy (NRTI) a proteasového inhibitoru (PI) nebo dvou nukleosidových (NRTI) a jednoho nenukleosidového inhibitoru (NNRTI). Výhodou těchto kombinací oproti podávání jen jednoho léku je potlačení vzniku rezistence na jednotlivé přípravky. Tento přístup významně přispěl ke zlepšení prognózy u HIV infikovaných pacientů. cART v těhotenství je považována za bezpečnou, výrazně snižuje riziko přenosu infekce na plod při porodu (ve vyspělých zemích je vždy proveden císařský řez). Bohužel však zatím neexistuje přípravek, který by vedl k eradikaci infekce. Protože terapie několika látkami současně byla pro pacienty poněkud složitá (musí se brát několik tablet denně v různou denní dobu), farmaceutické společnosti začaly spolupracovat a spojovat více léčivých přípravků do jedné tablety (např. Combivir, Kivexa, Truvada, Atripla, atd.) 5.5. Inhibitory HBV Virus hepatitidy B (HBV) je virus z rodu Orthohepadnavirus a čeledi hepadnavirů. HBV virus je původcem hepatitidy B, chronická infekce však může vést až k cirhóze jater nebo hepatocelulárnímu karcinomu. Během rozmnožovacího cyklu také využívá reversní transkripci. Virus hepatitidy B má kruhový genom (cccDNA – covalently closed circular DNA), který je po vstupu do buňky přepsán do pre-genomové RNA a polyadenylován. Poté reversní transkriptasa přepíše RNA na DNA (Obr. 69; http://de.wikipedia.org/wiki/HepatitisB-Virus). Deriváty experimentálně testované proti viru HBV působí z hlediska mechanizmu jako nukleosidové inhibitory reversní transkriptasy (Obr. 70). Z historického pohledu byla první objevenou účinnou látkou FMAU, další experimenty pak ukázaly, že je vzhledem k závažným vedlejším účinkům na CNS při léčbě HBV nepoužitelná. Její analog fialuridin v klinických zkouškách významně snižoval titr viru, avšak vykazoval nepřijatelnou toxicitu způsobující smrt 5 z 15 pacientů v důsledku selhání jater. L-analog FMAU clevudin (LevovirTM, RevovirTM) byl ke klinickému použití schválen v Jižní Koreji a Filipínách, avšak stažen kvůli projevům myopatie u některých pacientů. Emtricitabin je nukleosidový inhibitor reversní transkriptasy viru HIV, avšak v klinických testech se jeví jako účinný také proti viru HBV. Doposud nebyl k léčbě HBV schválen. Famciclovir se v preklinických studiích také ukázal jako účinný proti HBV. 112 Obrázek 69. Životní cyklus HBV. Obrázek 70. Nukleosidová analoga s anti-HBV aktivitou. Klinicky jsou k léčbě žloutenky typu B používány látky zobrazené níže (Obr. 71). Adefovir, entecavir, telbivudine, and tenofovir jsou schváleny k léčbě dospělých, pro děti ve věku 2 až 7 let je možné použít lamivudin. Lamivudin (EpivirTM, ZeffixTM, HeptovirTM, 113 EpivirTM, and Epivir-HBVTM) je přípravek účinný jak proti HBV, tak proti HIV. Jeho nevýhodou při léčbě HBV je snadno vznikající rezistence. (Lamivudin vykazuje také účinky vůči ebole). Entecavir (ETV, BaracludeTM) se používá u pacientů po transplantaci jater, aby se předešlo HBV infekcím a také k léčbě HIV pozitivních pacientů trpících žloutenkou typu B. Telbivudin (LdT, SebivoTM (EU), TyzekaTM (USA)) je fosforylován na trifosfát, který je kompetitivní inhibitor DNA polymerasy HBV. Klinické studie ukázaly, že je účinnější než lamivudin a adefovir a méně často podléhá vzniku rezistence. Další dva přípravky na Obr. 71 jsou nukleotidové inhibitory reversní transkriptasy. Adefovir (HepseraTM, PreveonTM) se ve formě adefovir dipivoxilu používá jako orální profarmakum, které je účinné na lamivudin-rezistentní mutanty. Používá se k léčbě HBV, účinky vykazuje také proti herpes simplex virovým infekcím. Byl testován i jako anti-HIV přípravek, avšak při léčbě viru HIV selhal. Naproti tomu tenofovir (VireadTM - tenofovir disoproxil fumarate) je účinný jak při léčbě HBV tak HIV. Pro léčbu HBV byl schválen v roce 2008. Obrázek 71. Klinicky používaná nukleosidová analoga s anti-HBV aktivitou. 5.6. Inhibitory HCV Standardní léčba hepatitidy C s příznaky zánětu jater zahrnuje použití kombinace pegylovaného interfetonu alfa s léčivem ribavirin. V posledních letech se však objevily nové látky a nové kombinace léčiv, např. kombinace bocepreviru nebo telapreviru s ribavirinem nebo sofosbuvir s ribavirinem. Použití vhodných kombinací a délky léčby (obvykle několik měsíců) se řídí genotypem konkrétního viru a také tím, zda se jedná o počáteční stádium infekce nebo o chronickou fázi. Řada léčiv je v současnosti předmětem schvalovacích řízení a jeví se, že hepatitida C bude v blízké budoucnosti medikamentózně vyřešený problém. K léčbě hepatitidy C se používají následující léčiva/skupiny léčiv: 114 1. Pegylovaný interferon alfa Interferony jsou proteiny produkované buňkami imunitního systému, jejich syntéza je vyvolána patogenními, nádorovými či mitogenními podněty. V podstatě pomáhají tělu bránit se před těmito „vetřelci“. Při podávání v dávkách mnohem vyšších, než v jakých je tvoří samotný organizmus, dokáže interferon likvidovat viry a zastavit jejich množení. Pegylace pak znamená navázání polyethylenglykolu (PEG) na molekulu bílkoviny za účelem zlepšení farmakokinetických vlastností proteinů – pegylací proteinů je dosaženo vyšší rozpustnosti, snížení rychlosti proteolýzy, snížení imunogenicity, snížení renální eliminace, zvýšení poločasu cirkulace v plazmě, změn v distribuci a absorpci. Pegylované proteiny jsou obvykle též snadněji skladovatelné jako hotové přípravky. Tabulka 8. Interferony. Komerční název PegIntron Pegasys Generický název peginterferon alfa-2b peginterferon alfa-2b Status schválený schválený Výrobce Merck Genentech 2. Nukleosidová analoga Nukleosidová analoga používaná v léčbě HCV zahrnují především ribavirin. Samotný ribavirin je v léčbě HCV nepoužitelný, avšak v kombinované léčbě hraje významnou roli. Přestože je ribavirin používán již mnoho let, doposud není zcela objasněn jeho přesný mechanizmus účinku. Obrázek 72. Struktura ribavirinu. Tabulka 9. Nukleosidová analoga. Komerční název Generický název Copegus, Rebetol, ribavirin Ribasphere, Moderiba Status schválený Výrobce Genentech, Merck, Kadmon 3. Inhibitory serinové NS3/4A proteasy Proteasové inhibitory (PI) brání štěpení polyproteinu HCV a tím inhibují tvorbu proteinů potřebných pro replikaci HCV. Nejvíce klinických zkušeností s inhibitory NS3/4A serinové proteasy přinesly přípravky telaprevir a boceprevir (Obr. 73). 115 Obrázek 73. Anti-HCV přípravky. Tabulka 10. Inhibitory serinové NS3/4A proteasy. Komerční název Victrelis Olysio Sunvepra n/a n/a n/a Incivek Generický název boceprevir simeprevir asunaprevir vaniprevir paritaprevir grazoprevir telaprevir Status schválený schválený Fáze III Fáze III Fáze III Fáze III stažen 16.10.2014 Výrobce Merck Janssen and Medivir AB Bristol-Myers Squibb Merck AbbVie Merck Vertex 4. Nukleosidové a nukleotidové inhibitory NS5B polymerasy Tyto látky blokují RNA-dependentní-RNA polymerasu (označovanou také jako NS5B ), která hraje klíčovou roli při replikaci HCV. Sofosbuvir je používán k léčbě genotypů 1,2,3 a 4 a v současné době se studuje jako součást kombinované pilulky s NS5A inhibitorem ledipasvirem k léčbě genotypu 1. Tabulka 11. Nukleosidové a nukleotidové inhibitory NS5B polymerasy. Komerční název Sovaldi n/a Generický název sofosbuvir mericitabin Status schválený Fáze III Výrobce Gilead Sciences Roche 5. Inhibitory NS5A NS5A je HCV protein, který je součástí HCV replikačního komplexu. V současné době jsou tyto látky ve Fázi III testování v kombinaci s ostatními skupinami léčiv. 116 Tabulka 12. Inhibitory NS5A. Komerční název Daklinza n/a n/a n/a n/a Generický název daclatasvir ledipasvir ombitasvir GS-5816 elbasvir Status Fáze III Fáze III Fáze III Fáze III Fáze III Výrobce Bristol-Myers Squibb Gilead Sciences AbbVie Gilead Sciences Merck 6. Nenukleosidové inhibitory NS5B polymerasy Jsou účinné proti NS5B, ale odlišným mechanizmem než předchozí skupina NS5B inhibitorů. Tabulka 13. Nenukleosidové inhibitory NS5B polymerasy. Komerční název Exviera n/a n/a Generický název dasabuvir beclabuvir ABT-072 Status Fáze III Fáze III Fáze III Výrobce AbbVie Bristol-Myers Squibb AbbVie 7. Kombinované látky V současné době se testuje nová strategie v léčbě hepatitidy typu C, a to specificky cílená antivirová terapie (STAT-C; specifically targeted antiviral therapy for hepatitis C). Jedná se o kombinovanou terapii, kdy se používá inhibitor nestrukturální (NS)3/4A serinové proteasy a HCV NS5B RNA-dependentní-RNA polymerasy (RdRp). V klinických testech I a II se jeví tato terapie jako nadějná, proto se stále pracuje na objasnění mechanizmu účinku ribavirinu a jeho molekulárních interakcí s STAT-C. Tabulka 14. Kombinované látky. Komerční název Harvoni Viekira Pak Viekirax n/a n/a Generický název sofosbuvir + ledipasvir (ombitasvir + paritaprevir + ritonavir ) + dasabuvir ombitasvir + paritaprevir + ritonavir asunaprevir + daclatasvir + BMS-791325 grazoprevir + elbasvir Status schválený schválený Výrobce Gilead Sciences AbbVie Fáze III AbbVie Fáze III Bristol-Myers Squibb Fáze III Merck 117 5.7. Inhibitory serinové HCMV proteasy Serinová proteasa má za úkol rozštěpit strukturní proteiny v polyproteinu, které jsou důležité pro sestavení nové virové částice. Mezi inhibitory serinové HCMV proteasy patří tzv. salcominy, komplexní sloučeniny kobaltu se symetrickými N-substituovanými 2hydroxyfenylaldiminy a ketiminy (Obr. 74). Obrázek 74. Přehled inhibitorů HCMV proteasy. 5.8. Inhibitory cysteinové rhinovirové proteasy Rhinoviry patří do skupiny virů, které způsobují záněty horních dýchacích cest včetně rýmy. Dosud známe 99 typů lidských rhinovirů, na tyto viry neexistuje zatím žádný lék ani vakcína. Proto je vývoji látek působících proti rhinovirům věnována značná pozornost. Mezi účinné inhibitory patří deriváty uvedené na Obr. 75. Obrázek 75. Inhibitory rhinovirové proteasy. 118 6. Acyklické nukleosidy a nukleosidfosfonáty Acyklické nukleosidy a nukleosidfosfonáty představují významnou skupinu léčiv, která dnes hraje důležitou roli při léčbě různých onemocnění virového původu. Struktura těchto látek byla odvozena od první generace nukleosidů obsahujících cyklický cukerný zbytek. První generace těchto antimetabolitů však neřeší problém spojený s přirozenými katabolickými procesy, jako jsou (a) reakce na heterocyklické bázi, (b) štěpení nukleosidové vazby fosforolýzou nebo hydrolýzou a (c) štěpení fosfomonoesterové vazby (Obr. 76). Obrázek 76. Hlavní druhy katabolických reakcí v nukleosidech a nukleotidech. U acyklických analog nukleosidů je cyklická cukerná složka nahrazena otevřeným řetězcem, jehož výhodou je konformační adaptabilita, analog se tak může lépe přizpůsobit požadavkům aktivního centra molekuly enzymu, na druhou stranu je to nevýhodné z entropického hlediska (navázáním acyklického analogu do aktivního místa dojde ke ztrátě stupňů volnosti). Acyklické nukleosidfosfonáty jsou fosfonomethylethery acyklických nukleosidů obsahující fosfonátový zbytek, který je oproti klasickému fosfátovému enzymaticky stabilní a nedegradovatelný (Obr. 77). Obrázek 77. Znázornění nukleosidfosfonátů. strukturálních výhod acyklických nukleosidů a 119 6.1. Acyklické nukleosidy V této kapitole budou zmíněny různé acyklické nukleosidy, které můžeme rozdělit do dvou skupin. První z nich jsou látky, které vyžadují aktivaci fosforylací (acyclovir, ganciclovir, valaciclovir, valganciclovir, famciclovir, penciclovir) a do druhé skupiny řadíme látky, jež aktivaci fosforylací nevyžadují (DHPA, AHPA, eritadenin). Nejdříve se zaměříme na první skupinu látek, jejichž struktury jsou znázorněny na Obr. 78. Všechny tyto látky vykazují významné antiherpetické účinky. Obrázek 78. Acyklické nukleosidy. Acyclovir (HerpexTM, ZoviraxTM, atd.) je širokospektré antiherpetikum. Je fosforylován virovými thymidin kinasami na acyclovir monofosfát, který je dále buněčnými kinasami transformován na acyclovir trifosfát (ACV-TP). ACV-TP inhibuje HSV DNA polymerasu a tím dochází k inhibici syntézy virové DNA. Jeho nízká rozpustnost ve vodě vedla k vývoji druhé generace acyklických nukleosidů, které na postranním acyklickém řetězci nesou Lvalylovou esterovou funkci. Metod vedoucích k přípravě acycloviru je více, významná je např. syntéza vycházející z 1,3-dioxolanu (Schéma 50). 1,3-Dioxolan reaguje s acetylchloridem za vzniku methyl 3-(chloromethoxy)propanoátu. Ten pak za kyselé katalýzy atakuje N2,N9-diacetylguanin. Vznikají dva regioizomery (N-7 a N-9), které se od sebe dělí krystalizací. Schéma 50. Syntéza acycloviru. 120 Ganciclovir (DHPGTM, CytoveneTM, CymeveneTM, VitrasertTM) je účinný proti onemocněním způsobeným cytomegaloviry. Stejně jako acyclovir je virovými kinasami fosforylován na odpovídající monofosfát. Buněčné kinasy převedou monofosfát na trifosfát, který má dvojí mechanizmus účinku. Jednak je kompetitivním inhibitorem inkorporace dGTP do nově vznikajícího řetězce DNA s tím, že inhibuje virální DNA polymerasy mnohem účinněji než buněčné DNA polymerasy. Dále je ganciclovir i inhibitorem elongace řetězce DNA. Syntéza gancicloviru popsaná ve schématu 51 vychází z epichlorhydrinu, který je varem v kyselině chlorovodíkové převeden na 1,3-dichlorpropan-2-ol. Ten pak následnou reakcí s benzylalkoholem poskytuje 1,3-bis(benzyloxy)propan-2-ol, který dále podléhá reakci s paraformaldehydem v kyselině chlorovodíkové za vzniku chlormethylovaného produktu. Alkylací 2-amino-6-chlorpurinu, následným varem v kyselině chlorovodíkové a deprotekcí benzylových skupin získáme ganciclovir. Schéma 51. Syntéza gancicloviru. Valaciclovir (ValtrexTM, ZelitrexTM) je proléčivo acycloviru, kde přítomnost Lvalylového zbytku zvyšuje orální biodostupnost přípravku. Na aktivní acyclovir je konvertován esterasami. Stejně jako acyclovir je širokospektrálním antiherpetikem účinným proti celé řadě hereps virů (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV). Valganciclovir (ValcyteTM, CymevalTM, ValcytTM, ValixaTM, DarilinTM, RovalcyteTM, PatheonTM, SyntexTM) je dalším L-valyl modifikovaným proléčivem a má tedy shodné spektrum účinků s mateřskou sloučeninou – ganciclovirem. Penciclovir a famciclovir představují karboanaloga acyklických nukleosidů. Penciclovir je guanosinový analog, který se používá topicky jako aktivní součást některých léků proti oparům (DenavirTM, VectavirTM). Famciclovir (FamvirTM) je profarmakum pencicloviru se zlepšenou orální biodostupností. Syntéza pencicloviru (Schéma 52) vychází z 2-amino-6-chlorpurinu, který je alkylován a následnou reakcí s methanolem poskytuje dimethylesterpurinový analog. Ten je redukován tetrahydridoboritanem sodným a bazicky hydrolyzován za vzniku konečnému produktu. 121 Schéma 52. Syntéza pencicloviru. V další části této kapitoly bude pojednáno o antivirotikách, jež nevyžadují aktivaci fosforylací. Jsou to acyklické nukleosidy, které působí jako inhibitory methylačních reakcí (viz. Inhibitory jednotlivých stupňů multiplikace viru). Strukturně hovoříme o analogách adenosinu a jednotlivé látky jsou znázorněny na Obr. 79. Obrázek 79. Inhibitory methylačních reakcí. Nejjednodušší sloučenina této řady je (S)-DHPA (9-(2,3-dihydroxypropyl)adenin, DuviraTM). Jedná se o první acyklický nukleosidový analog, o kterém je již od roku 1978 známo, že disponuje širokým spektrem účinků proti RNA i DNA virům. Inhibuje Sadenosylhomocysteine (SAH) hydrolasu, enzym, který je zodpovědný za degradaci SAH, vedlejšího produktu methylačních reakcí v organizmu (methylačním činidlem je Sadenosylmethionin). Komerčně byl prodáván pod názvem Duviragel jako mast proti oparům. Syntéza (S)-DHPA (Schéma 53) vychází z adeninu, který může být jednoduše alkylován dioxolanovým derivátem a následně kysele katalyzovaným otevřením ketalu vzniká (S)-DHPA. Jiná metoda vychází opět z adeninu, který je alkylován do polohy N9 122 pomocí chráněného oxiranového derivátu. Působením kyseliny je odchráněna hydroxylová skupina a vzniká finální produkt. Schéma 53. Syntéza (S)-DHPA. Zatímco (S)-DHPA reversibilně inhibuje SAHasu, AHPA (3-(adenin-9-yl)-2hydroxypropanová kyselina) a eritadenin ji ireversibilně inaktivují. Příprava AHPA je možná dvěma metodami uvedenými ve Schématu 54. Přímá jednostupňová syntéza zahrnuje alkylaci adeninu ethyloxiran-2-karboxylátem. Druhá metoda vychází z adeninu, který alkylací bromoacetalem poskytne 6-amino-9-(2,2-diethoxyethyl)purin. Acetalová chránící skupina je kysele labilní, a proto již mírným okyselením reakční směsi dochází k jejímu rozkladu za vzniku 6-aminopurin acetaldehydu. Vzniklý aldehyd reaguje s kyanidem sodným za vzniku kyanhydrinu. Kysele katalyzovanou hydrolýzou nitrilové skupiny je získán požadovaný AHPA. Schéma 54. Syntéza AHPA. 123 6.2. Acyklické nukleosidfosfonáty Acyklické nukleosidfosfonáty představují analoga mononukleotidů, které obcházejí první fosforylační krok. Obsahují N-alkylovou vazbu rezistentní proti působení hydroláz a fosforyláz a dále izopolární fosfonomethyletherovou vazbu rezistentní proti enzymatické degradaci. Dlouholetý výzkum v této oblasti přinesl 4 strukturně obdobné skupiny sloučenin (Obr. 80), které se liší charakterem postranního řetězce: a) b) c) d) N-[2-(fosfonomethoxy)ethyl] deriváty (PME) N-[2-(fosfonomethoxy)propyl] deriváty (PMP) N-[3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl] deriváty (HPMP) N-[3-fluor-2-(fosfonomethoxy)propyl] deriváty (FPMP) Obrázek 80. Přehled struktur jednotlivých acyklických nukleosidfosfonátů. Existují dvě varianty přípravy acyklických nukleosidfosfonátů. První možnost zahrnuje přípravu acyklického nukleosidu alkylací báze a na volnou hydroxylovou skupinu postranního řetězce je pak navázán fosfonomethylový zbytek. Druhá varianta vychází z přípravy synthonu, kterým je celý postranní řetězec a tím je pak alkylována báze. Schéma 55 vystihuje dvě možnosti přípravy fosfonátového alkylačního činidla. 124 Schéma 55. Syntéza fosfonátových synthonů. Adefovir (PMEA, HepseraTM, PreveonTM) je látka aktivní proti celé řadě retrovirů (HIV, SIV, MSV, FLC) a DNA virům (HBV, HSV). Jeho orální profarmakum adefovir dipivoxil (Obr. 81) byl v roce 2002 schválen k léčbě infekcí spojených s virem hepatitidy B, zvláště u pacientů, u kterých se vytvořila rezistence vůči lamivudinu. Z hlediska mechanizmu je substrátem i inhibitorem reversních transkriptas. Pro zajímavost zde uvádíme cenu za jedno balení Hepsery (30 tablet = 1 měsíc), která činí $ 340 (v USA) a 740 € (v EU). Obrázek 81. Struktura adefoviru a jeho orálního profarmaka. Schéma 56. Syntéza adefoviru. 125 Syntéza adefoviru (Schéma 56) vychází z adeninu, který je 1,3-dioxolan-2-onem alkylován do polohy N9 a následnou kondenzací s diisopropyl-ptolylsulfonyloxymethylfosfonátem vzniká diester adefoviru. Esterová funkce je nakonec odštěpena bromtrimethylsilanem s následnou hydrolýzou. Tenofovir ((R)-PMPA, VireadTM) působí jako nukleotidový inhibitor reversní transkriptasy a je tak velmi aktivní proti HIV a HBV virům. Jeho orální profarmakum tenofovir disoproxil fumarát (Obr. 82) byl v roce 2001 schválen (USA) k léčbě HIV a následně v roce 2008 k léčbě chronické hepatitidy typu B dospělých a dětí nad 12 let. Je účinný i proti mutantům HIV rezistentním vůči NRTI, NNRTI. Tenofovir byl syntetizován Antonínem Holým z ÚOCHB AV ČR již v roce 1984, pouhý rok po objevení viru HIV, avšak jeho anti-HIV účinky byly publikovány až v roce 1992. Obrázek 82. Struktura tenofoviru a jeho orálního profarmaka. Tenofovir je rovněž používán v kombinaci s dalšími přípravky. V roce 2004 byla schválena TruvadaTM vyvinutá firmou Gilead Sciences kombinující tenofovir a nukleosidový inhibitor emtricitabin. Zajímavostí je, že Gilead Sciences připravuje tablety ve dvou odlišných barvách. V USA a Evropě je k dostání ve fomě tmavě modré tablety, kdežto do rozvojových zemí se dostává v barvě světle modré. Důvod je prostý. Gilead Sciences se v rámci svého tzv. Gilead Access Program snaží, aby přípravky k léčbě HIV byly finančně dostupné v rozvojových zemích, kde je nejvíce HIV infikovaných osob, a proto do těchto zemí dodává potřebné přípravky jako je Truvada bez finančního zisku. K rozlišení léků pro USA a Evropu a rozvojové země slouží právě zmíněná barva tablety. V roce 2006 následovalo uvedení přípravku AtriplaTM, který spojuje tenofovir, emtricitabin a nenukleosidový inhibitor reversní transkriptasy efavirenz. Cena měsíční dávky Atriply dosahuje přibližně 1,150 USD. Čtyřkombinace elvitegravir, cobicistat, emtricitabin a tenofovir pod komerčním názvem Stribild byla schválena v roce 2012. Princip syntézy tenofoviru (Schéma 57) je obdobný jako u předchozího adefoviru. Adenin je nejprve alkylován (R)-4-methyl-1,3-dioxolan-2-onem a produkt následně reaguje 126 s diisopropyl-p-tolylsulfonyloxymethylfosfonátem. získaného dialkylesteru bromtrimethylsilanem. Tenofovir pak získáme štěpením Schéma 57. Syntéza tenofoviru. Cidofovir ((S)-HPMPC, VistideTM) byl v roce 1996 schválen v USA a EU k léčbě HCMV retinitidy u osob trpících onemocněním AIDS. Klinicky je dále používaný k léčbě infekcí způsobených papilomaviry a poxviry, proti anogenitálnímu herpesu (HSV-2). Je rovněž velmi účinný proti variole in vitro a zatím jediný přípravek, který je schválen k léčbě varioly v případě nákazy. Podává se ve formě infuzí nebo lokálními injekcemi, případně v krémech a gelech. Ve formě aerosolu inhalovaný cidofovir se dostává do plicních buněk a může tak být použit pro profylaxi orthopox viry (smallpox a monkeypox) způsobených infekcí. Velmi perspektivní se jeví i orální profarmakum Brincidofovir. Jedná se o experimentální látku vyvíjenou firmou Cimerix s antivirotickými účinky proti cytomegalovirům, adenovirům, smallpox viru, herpes simplex viru a ebole. Lipofilní postranní řetězec zlepšuje prostupnost přes buněčnou membránu a orální biodostupnost. Brincidofovir je právě ve fázi III klinických zkoušek, kde se studuje účinek proti cytomegaloviru a adenoviru a smallpox viru. V roce 2014 FDA povolila také fázi II testů k léčbě infekce vyvolané virem ebola. Obrázek 83. Struktura cidofoviru a jeho profarmak. 127 Cidofovir můžeme připravit alkylací chráněného cytosinu trityloxymethyl-(S)-oxiranem a následnou kondenzací s diisopropyl-p-tolylsulfonyloxymethylfosfonátem (Schéma 58). Kysele katalyzovaným štěpením tritylové skupiny, odchráněním exocyklické amino skupiny působením methoxidu sodného a následným štěpením dialkylesterových funkcí bromtrimethylsilanem získáme cidofovir. Schéma 58. Syntéza cidofoviru. (S)-HPMPA je aktivní proti DNA virům. Mimoto vykazuje antiparazitární aktivitu proti rodům Plasmodium, Leishmania a Trypanosoma. PMEDAP (N-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurin) je aktivní proti retrovirům, avšak hlavním směrem studia jsou jeho cytostatické účinky. V roce 1999 bylo zveřejněno, že terapie samotným PMEDAP u krys (5 mg/kg.d) aplikovaným do bezprostředního okolí lymfomu vyvolává pokles hmotnosti lymfomu, snížení mitotické aktivity jeho buněk, zvýšenou kondenzaci chromatinu a změněnou morfologii neoplastických buněk. Tento efekt však trvá pouze po dobu podávání látky. Proto byly vyvíjeny další látky založené na struktuře PMEDAP, u kterých by došlo ke zlepšení farmakologických parametrů. Tak vznikla např. látka (6-cyklopropyl-N-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurin) vystupující jako proléčivo PMEG, který z něj vzniká enzymatickou degradací. Významnějším objevem, který upoutal pozornost široké veřejnosti, byla syntéza a studium protinádorových vlastností látky GS-9219, která byla klinicky studována na psech se spontánními nádory lymfatických uzlin tzv. neHodgkinského typu. V roce 2008 bylo zveřejněno, že látka GS-9219 vstoupí do nádorové buňky, kde je hydrolyticky přeměněna na meziprodukt N6-cyprPMEDAP, ten je deaminován na výsledný účinný PMEG. PMEG se fosforyluje a díky tomu je schopen začlenit se jako nukleotidový analog do nukleové kyseliny, čímž dojde k zastavení replikace DNA a nádorová buňka hyne. Tento přípravek byl mimořádně účinný. Jediná injekce látky GS-9219 dokázala zbavit psa nádoru za šest dní a dosavadní pokusy potvrdily její vysoký účinek a poměrně nízkou toxicitu. V roce 2010 však přišlo velké zklamání, když bylo zjištěno, že u zvířat jinak velmi účinná látka 128 GS-9219 měla na lidi příliš velké toxické účinky, takže trpěli silnou nevolností a narušovala se jim kostní dřeň. Testy byly přerušeny v prvním stadiu, kdy se zkoumají právě vedlejší účinky léků na lidský organizmus. Nicméně tato látka našla uplatnění ve veterinární medicíně. Obrázek 84. Struktura PMEDAP a jeho analog. 6.3. Nové cyklické fosfonáty Pozornost byla věnována i výzkumu a vývoji cyklických nukleosid fosfonátů, kterých je však podstatně méně. Za zmínku stojí čtyři látky uvedené na Obr. 85, deoxythreosylfosfonáty PMDTT, PMDTA a látky GS-9148 a GS-9131. Fosfonáty PMDTT a PMDTA se ukázaly účinné proti HIV, avšak zatím nejsou dostupné bližší informace jako farmakologické, farmakokinetické nebo toxikologické parametry. Dále byl připraven fosfonomethoxy-2’-fluoro-2’,3’-dideoxy-2’,3’-didehydroadenosin (GS-9148), který projevil příznivý profil rezistence na širokou řadu NRTI mutací zahrnující TAMs, K65R, L74V a M184V. Proto se tato látka jeví jako atraktivní kandidát pro klinický vývoj terapie a/nebo profylaxe HIV infekcí. 129 Obrázek 85. Struktury některých cyklických nukleosid fosfonátů. 130 7. Protinádorová a antileukemická chemoterapie 7.1. Alkylační léčiva Objev protinádorového účinku této skupiny léčiv je historicky spojován s nechvalně proslulými účinky bojového plynu yperitu (bis(2-chlor-ethyl)sulfid). Objev yperitu Frederikem Guthrie je datován do roku 1860 a jeho první použití v první světové válce německou císařskou armádou proti Britům a Kanaďanům v roce 1917. Do černé historie yperitu se také zapsala „nehoda“ v italském pobřežním městě Bari, kde v roce 1943 kotvily zásobovací lodě postupujících Spojenců a obětí náletu Luftwaffe se stala i loď John Harvey, která potají převážela letecké bomby s yperitem. Ty měly být na dosah v případné odvetě za možný německý chemický útok. V důsledku úniku plynu z John Harvey však později zemřelo 68 námořníků (v Bari šlo ke dnu 27 dalších lodí, zemřelo na 2000 lidí). Spojenci se nehodu snažili ututlat z obavy, že pokud se o nákladu bomb poblíž fronty Němci doslechnou, mohli by sami preventivě bojové látky nasadit. Yperit způsobuje bolestivé puchýře a popáleniny, které však vznikají až několik hodin po expozici. U přeživších bylo pozorováno snížení počtu bílých krvinek (lymfopenie) v důsledku snížené proliferace. To vedlo k nápadu použít alkylátory jako imunosupresiva a cytostatika. Mechanizmus účinku těchto imunosupresiv je založen na inhibici syntézy DNA jakožto základního předpokladu aktivace a proliferace buněk imunitního systému. 7.1.1. Mechanizmus účinku DNA alkylačních cytostatik S poškozením DNA souvisí mnohdy vysoká toxicita alkylátorů. Alkylační léčiva alkylují báze DNA (Schéma 59) a tím zabraňují replikaci DNA a její transkripci do RNA. Schéma 59. Příklad alkylace DNA. Přítomnost alkylované báze také vede ke vzniku zlomů v DNA. Může docházet ke spontánní hydrolýze, ale řetězec může být přerušen i reparačními enzymy při neúspěšném pokusu o odstranění alkylované báze. Alkylace může způsobit i chybnou inkorporaci nukleotidů změnou normálního párování bází (tautomerie). Příkladem porušení klasického párování bází např. guaninových a cytosinových bází je párování alkylovaného guaninu s thyminem, jak je naznačeno na Obr. 86. 131 Obrázek 86. Příklad porušení klasického párování bází. Většina alkylačních cytostatik je bifunkčních, tzn., že obsahují dvě reaktivní centra, která jsou schopna propojovat jedno vlákno DNA s jinými centry na DNA, příp. s proteiny (Obr. 87). Mohou propojovat jednotlivé nukleobáze uvnitř jednoho řetězce, mezi dvěma řetězci či mezi dvěma jednotlivými vlákny dvou různých DNA, popř. mohou spojovat DNA s proteiny. Obrázek 87. Příklady příčných spojů na DNA. (AL = alkylační látka) Alkylační látky alkylují převážně endocyklické atomy dusíku N7 guaninu, N1 adeninu, N3 cytosinu a thyminu nebo alkylují O-6-guaninu, možné jsou však i alkylace na jiných heteroatomech nukleobáze (Obr. 88). 132 Obrázek 88. Příklady meziřetězových vazeb. 7.1.2. Skupiny alkylačních léčiv Alkylační léčiva můžeme rozdělit do několika skupin: (a) (b) (c) (d) (e) dusíkatá analoga yperitu alkylsulfonáty aziridiny nitrosomočoviny oxirany a jejich profarmaka 7.1.2.1. Dusíkatá analoga yperitu Význačnou vlastností dusíkatých analog yperitu je přítomnost bis(2-chloroethyl)amino skupiny. Cytotoxický účinek těchto látek spočívá v tom, že nejprve vznikne 2chlorethylaziridiniový ion, který představuje vlastní alkylační činidlo (Schéma 60). Schéma 60. Mechanizmus účinku dusíkatých yperitů. 133 Pro samotný atak DNA alkylačním činidlem bylo navrženo několik možností, z nichž dvě jsou znázorněny níže. První z mechanizmů (Schéma 61) popisuje atak DNA chlormethinem, a to na guaninové bázi v poloze N-7. Nejdříve vzniká monoadukt, který může následně atakovat druhou nukleobázi za vzniku bisalkylované N-7-N-7 meziřetězové formace. Schéma 61. Navržený mechanizmus meziřetězové DNA-DNA mechlorethaminu – vznik monomerního aduktu a N7 – N7 cross-linku. formace atakem Druhý mechanizmus znázorněný ve Schématu 62 popisuje reakci N7-substituovaného guaninového derivátu s další molekulou chlormethinu za vzniku dvojnásobně alkylovaného produktu. Ten je opět schopen tvořit aktivní aziridinový cyklus a tak kovalentně alkylovat další nukleobázi. Schéma 62. Navržený mechanizmus mechlorethaminu – dimerizace. DNA-DNA meziřetězové formace atakem 134 Do skupiny dusíkatých analog yperitu řadíme celou řadu významných cytostatik, jejichž struktury jsou znázorněny na Obr. 89. Obrázek 89. Struktury yperitu a jeho dusíkatých analog. Jedním z nejstarších derivátů yperitu je chlormethin (mechlorethanin, mustargen), jež se používá k regresi tumorů lymfatického systému. Melfalan (AlkeranTM, SarkoklorinTM) je využíván k léčbě mnohočetného myelomu, primární amyloidózy, nádorů ovarií a příležitostně také k léčbě maligního melanomu. Orální forma chlorambucilu (LeukeranTM) je používána zejména k léčbě chronické lymfatické leukémie a dále také k léčbě nádorů ovarií. Cyklofosfamid (CytoxanTM, CyclostinTM, EndoxanTM, LedoxinaTM) představuje látku obsahující oxazofosforinový skelet a je v kombinaci s ostatními cytostatiky široce používán k léčbě celé řady nádorů, k léčbě ALL, CLL nebo Hodgkinova lymfomu. Jedná se o proléčivo, které je na aktivní formu (aldofosfamid) konvertováno v játrech. Dále se spontánně rozkládá na toxický fosforamid-N-yperit odpovědný za poškození DNA. Cyklofosfamid rovněž představuje jedno z nejúčinnějších imunosupresiv používaných při léčbě autoimunitních onemocnění (hemolytická anémie, trombocytopenie), chronické membranózní glomerulonefritidy, vaskulitidy. Nízké dávky cyklofosfamidu eliminují regulační T-lymfocyty (které potlačují rozvinutí autoimunitních chorob udržováním tolerance vůči tělu vlastním tkáním). Tohoto jevu se užívá v imunoterapii nádorů, kde jsou T-regulační buňky obvykle zvýšené a jejich redukcí lze lépe indukovat protinádorovou imunitu. Bývá aplikován perorálně i intravenózně. Jeden ze syntetických postupů vedoucí k přípravě cyklofosfamidu je znázorněn na schématu 63. Tento proces vychází z hydrochloridu bis(2-chlorethyl)aminu, který reakcí s POCl3 poskytuje dichlorid kyselliny N,N-bis(2-chlorethyl)fosforamidové. Závěrečný krok 135 syntézy je cyklizace cyklofosfamidu. s 3-aminopropanolem v přítomnosti triethylaminu za vzniku Schéma 63. Syntéza cyklofosfamidu. Další alkylační činidlo ze skupiny oxazofosforinů je izomer cyklofosfamidu a to ifosfamid (HoloxanTM). Tato látka bývá indikována na řadu nádorů (především hodgkinské i nehodgkinské lymfomy, testikulární karcinomy, sarkomy měkkých tkání, bronchogenní karcinom, karcinom děložního čípku), avšak jeho jaterní aktivace je pomalejší než u cyklofosfamidu a je potřeba zhruba 4 × vyšší dávky k dosažení stejného účinku jako u předchozího analoga. Trofosfamid (IxotenTM) je další z léčiv podobných cyklofosfamidu. Tato orálně dostupná látka je užívána k léčbě CLL a dalších nádorů. Nejdříve je metabolizována na ifosfamid, který je dále jaterními cytochromy P450 metabolizován na aktivní ifosfamid, jenž alkyluje DNA a způsobuje tak inhibici DNA i RNA syntézy. Mafosfamid na rozdíl od cyklofosfamidu nevyžaduje jaterní aktivaci a je metabolizován na 4-hydroxycyklofosfamid. Je používán k intratekální léčbě neoplastické meningitidy (intratekální podání = podání do prostoru mezi mozkem nebo míchou a mozkomíšními obaly, popř. do mozkových komor). Stejné použití má i 4hydroxyperoxyfosfamid. Další ze skupiny bifunkčních alkylačních cytostatik je spiromustin. Obsahuje poměrně lipofilní hydantoinovou skupinu, která slouží jako transportér přes hematoencefalickou bariéru, používá se tedy k léčbě mozkových nádorů, avšak je značně neurotoxický. 7.1.2.2. Aziridiny Skupina aziridinů je díky podobnému mechanizmu účinku příbuzná dusíkatým yperitům. Vzhledem k tomu, že aziridinový kruh je elektroneutrální, vykazují tyto látky nižší reaktivitu než dusíkaté yperity. Aziridiny také mohou vznikat jako reaktivní intermediáty intramolekulárních cyklizací alkylačních cytostatik, které ve své struktuře obsahují 2chlorethylovou skupinu vázanou na primární nebo sekundární aminoskupinu. Otvíráním trojčlenného cyklu pak dochází k alkylaci. Na Obr. 90 jsou zachyceny některé z aziridinů, z nichž nejvíce používané jsou thiotepa (Thio-TepaTM, ThioplexTM) a mitomycin C. Thiotepa je používána pro léčení prsních nádorů, karcinomu ovaria, Hodgkinových i ne-Hodgkinových lymfomů a u transplantace kostní dřeně. Zatímco jeden ze starších derivátů – triethylenmelamin (TretaminTM) – má dnes již omezené použití, velmi slibnými se naproti tomu jeví diaziridinylchinony. Z nich jsou velmi intenzivně zkoumány jednoduchý diaziridinylchinon (DZQ) a především diazichon (AZQ), který je v současné době ve fázi III klinických testů (NCI – National Cancer Institute) proti nádorům mozku. 136 Na Obr. 90 jsou dále znázorněna protinádorová antibiotika mitomyciny a porfiromyciny, z nichž se jako protinádorové léčivo používá mitomycin C (MutamycinTM, AmetycinTM, Mito-medacTM) rovněž obsahující aziridinový heterocyklus. Toto přírodní antibiotikum je jedno z nejpoužívanějších cytostatik (tržby z prodeje této látky dosáhly v roce 2010 9 mld $ v USA a celosvětově 70,7 mld $) účinné proti nádorům prsu, zažívacího traktu a močového měchýře. Obrázek 90. Přehled alkylačních léčiv – aziridiny. I v případě alkylačních látek obsahujících akridinový tříčlenný cyklus bylo navrženo několik mechanizmů, jakými atakují DNA. Pro diaziridinylchinon byl navržen mechanizmus znázorněný na Schématu 64. Redukcí chinonového systému vzniká kladný náboj, který dodatečně aktivuje aziridinový kruh a ten již atakuje DNA stejně jako u předchozích analog yperitu. Stejným mechanizmem působí i AZQ, který atakuje guaniny v komplementárních řetězcích DNA. Schéma 64. Znázornění účinku diaziridinylchinonu. 137 7.1.2.3. Alkylsulfonáty Dalším typem alkylačních cytostatik jsou estery alkoholů s alkylsulfonovými kyselinami, z nichž nejpoužívanějšími jsou busulfan (1,4-butandioldimesylát, TM TM TM Cytoleukon , Myleran , Leucosulfan ) a threosulfan (OvastatTM). Protinádorové vlastnosti in vitro vykazují i piposulfan, improsulfan a hepsulfam. Obrázek 91. Alkylační látky – alkylsulfonáty. Busulfan je bifunkční sloučenina, kterou můžeme připravit reakcí 1,4-butandiolu s methansulfonylchloridem (mesylchloridem). Používá se zejména k léčbě primární polycytemie a CML, ovšem při jeho použití se vždy musí volit kompromis mezi protinádorovými účinky a vedlejšími účinky, neboť busulfan je velmi toxický. Naproti tomu jeho dihydroxy analog threosulfan se používá zejména proti nádorům ovarií, je také účinný na ALL a vykazuje imunosupresivní aktivitu. Schéma 65. Syntéza busulfanu. Schéma 66. Alkylace DNA busulfanem. 138 7.1.2.4. Nitrosomočoviny β-Chlorethylderiváty nitrosomočovin alkylují DNA mechanizmem založeným na tvorbě 2-chloroethyldiazoniového kationtu. Schéma 67 zachycuje takovéto působení chlorethylnitrosomočoviny na DNA za vzniku dC-dG meziřetězových vazeb. Schéma 67. Mechanizmus působení chlorethylnitrosomočoviny na DNA. Nejvýznamnější zástupci jsou uvedeni na Obr. 92. Kromě toho, že chlorethylnitrosomočoviny alkylují DNA, jsou také v organizmu degradovány na izokyanáty, které reagují s proteiny a tak mohou poškodit enzymy účastnící se oprav alkylované DNA. Vzhledem k jejich poměrně lipofilnímu charakteru mohou pronikat přes hematoencefalickou bariéru a tak být použity k léčbě nádorů mozku. Karmustin (BCNU, CarmustineTM, NitrumonTM) je používán k léčbě primárního intracerebrárního tumoru a mnohočetného myelomu. Zajímavostí je přípravek GliadelTM (Gliadel afer), používaný k léčbě opakovaně se vyskytujících gliomů a který byl schválen FDA v roce 1995. Jedná se o biodegradovatelný polymer obsahující karmustin. Aplikuje se postoperačně s cílem eliminovat neodstraněné nádorové buňky. Dalšími léčivy z této skupiny jsou lomustin (CCNU, LomustineTM, BelustinTM) používaný k léčbě nádoru CNS a lymfomů, a jemu podobný semustin, který byl používán k léčbě gastrointestinálních tumorů, avšak vzhledem k jeho vysoké karcinogenitě nakonec stažen z trhu. Do skupiny nitrosomočovin řadíme i přírodní látku streptozotocin a její semisyntetický analog chlorozotocin. Streptozotocin (Streptozocin, STZ, ZanosarTM) je 139 schválen FDA k léčbě nádorů slinivky břišní, vzhledem k vysoké nefrotoxicitě je jeho použití omezeno. Oproti tomu semisyntetický analog chlorozotocin (CLZ, CZT, DCNU) je méně nefrotoxický a vykazuje protinádorové i imunomodulační účinky. V současné době probíhá jeho klinické hodnocení. Obrázek 92. β-Chlorethylderiváty nitrosomočovin. 7.1.2.5. Oxirany Oxirany zastupují skupinu látek, jež působí podobným mechanizmem účinku jako předchozí aziridiny. Mezi tato alkylační cytostatika řadíme např. bifunkční derivát dianhydrogalaktitol (VAL-083), který snadno prostupuje hematoencefalickou bariérou a je účinný na nádory mozku a močového měchýře. V současné době je ve fázi I/II klinického testování. Protinádorovou aktivitu vykazoval i teroxiron, avšak jeho výzkum byl ukončen ve fázi I klinického testování. Obrázek 93. Alkylační léčiva – oxirany. Mnohé dusíkaté yperity jsou poměrně toxické látky, proto byly hledány různé strategie jak snížit tuto inherentní toxicitu: 140 (a) cílením léčiva – reaktivní uskupení se vnáší do biomolekul, u kterých se očekává, že je rychle rostoucí tumor bude vychytávat více, než zdravá tkáň (např. melfalan). (b) použitím proléčiva – netoxická látka, která je na aktivní formu látky konvertována až působením specifických intracelulárních enzymů., např. cyklofosfamid (c) lokálním podáním – např. mitomycinem napuštěné stenty, aby nedošlo k restenóze, busulfan na poly(alkyl kyanoakrylátovém) polymeru 7.2. Komplexy platiny Výzkum protinádorových komplexů platiny započal objevením schopnosti cisplatiny blokovat buněčný cyklus. Samotná cisplatina byla poprvé popsána již před 150 lety Michelem Peyronem, ale až mnohem později (v 60. letech minulého století) byly objeveny její protinádorové vlastnosti. V roce 1965 Barnett Rosenberg a jeho kolegové na Michiganské státní univerzitě zkoumali vliv elektrického pole na růst kultury E. coli s použitím platinových elektrod v přítomnosti NH4Cl. Po vložení elektrického napětí došlo k zastavení dělení buněk, avšak jejich růst pokračoval (pozorovaná filamenta se zvětšila až 300x oproti původní délce). Další studie vedly k poznatku, že za tohle nezvyklé chování je odpovědný vznikající komplex, který byl nazván cisplatina. Toto pozorování podnítilo hypotézu, že by tyto komplexy mohly zastavit i dělení buněk nádorových a to se také pozdeji podařilo dokázat. V současnosti jsou cisplatina a její další analog karboplatina (Obr. 94) nejčastěji používaným protinádorovým lékem v léčbě řady karcinomů, zejména karcinomů varlat, ovaria, hlavy, krku, močového měchýře, urogenitálního traktu a malobuněčného karcinomu plic. Cis-platina (cis-diammindichlorplatina, cis-DDP, PlatinexTM, PlatidiamTM, PlatinolTM) je jedno z nejúčinnějších cytostatik, avšak její použití je limitováno rezistencí některých buněk a rozsáhlými vedlejšími účinky na organizmus (nefrotoxicita a neurotoxicita). Často se používá v kombinaci s jinými cytostatiky (vincristin, vinblastin, atd.). Důležitým faktorem klíčovým pro aktivitu tohoto komplexu je geometrie molekuly (a to se obecně týká všech komplexů platiny). Zatímco cisplatina je účinné protinádorové léčivo, její trans isomer je neaktivní a vykazuje jistou mutagenitu. Odstupující chloridové ligandy se u transplatiny nacházejí v poloze trans, což vede k pomalému uzavírání bifunkčních můstků v jednom řetězci a neschopnosti vytvářet 1,2-adukty ze sterických důvodů. Karboplatina (CycloplatinTM, ParaplatinTM) má stejné použití, avšak její výhodou je její nižší nefrotoxicita. Dalším v klinické praxi používaným komplexem platiny je oxalipaltina (EloxatinTM, TranspaltinTM). Ostatní látky uvedené na Obr. 94 se v klinické praxi zatím nepoužívají, avšak velmi slibným derivátem je trojjaderný komplex platiny BBR3464. V preklinických studiích prokázal cytotoxickou aktivitu na buněčné linie rezistentní vůči cisplatině a v současné době je ve fázi II klinického testování. Projevuje účinky u pacientů s karcinomem ovaria nebo malobuněčným karcinomem plic. 141 Obrázek 94. Protinádorové sloučeniny platiny. Na schématu 68 je uvedena syntéza cisplatiny a karboplatiny. Výchozí tetrachloroplatnatan draselný reaguje s jodidem draselným za vzniku tetrajodoplatnatanu draselného. Ten se následně působením vodného amoniaku převede na diaminokomplex, který reaguje s dusičnanem stříbrným za vzniku intermediátu, který výměnou ligandů s chloridem draselným poskytne cisplatinu. Použijeme-li místo dusičnanu stříbrného síran stříbrný a vzniklý komplex necháme reagovat s 1,1-cyklobutandikarboxylátem barnatým, získáme karbopaltinu. Schéma 68. Syntéza cisplatiny a karboplatiny. Předpokládá se, že cytotoxické vlastnosti cisplatiny a jí podobných derivátů jsou následkem inter- a intrařetězcových cross-linků mezi úseky DNA bohatými na deoxyguanosin (Schéma 69). Vznikají kovalentní vazby mezi řetězci a brání tak jejich oddělení při replikaci a zároveň tak dochází k inhibici transkripce. 142 Schéma 69. Tvorba kovalentních vazeb mezi cisplatinou a DNA. Na závěr této části kapitoly je uvedena tabulka 15. s přehledem některých alkylačních léčiv a jejich ročními obraty v USA a ve světě. Lze říci, že cisplatina je stále nejprodávanějším chemoterapeutikem a dodnes existuje v 1250 různých přípravcích. Tabulka 15. Roční obraty pro některá alkylační chemoterapeutika a platinové komplexy. Látka chlormethin busulfan methoxalen mitomycin C chlorambucil cyklofosfamid melfalan ifosfamid altretamin cisplatin karboplatin USA mld $ 1 40,3 3,9 9 7 60,4 82,2 17,1 1,2 10,1 38,8 Celosvětově mld $ 1,1 69 10,1 70,7 12,5 115,7 96,3 72,1 2.1 150,3 315,6 7.3. Cytostatika se selektivním účinkem v hypoxických buňkách Přítomnost hypoxických oblastí v solidních nádorech, které vznikají v důsledku neadekvátní angiogeneze, významně přispívá k jejich chemorezistenci i agresivnějšímu chování. Nádorová tkáň je nedostatečně prokrvená a snížený přívod krve má za následek i snížený přívod cytostatika. Vzhledem k nedostatku kyslíku zde nemůžou působit látky, které jsou založené na radikálových mechanizmech. V takovýchto nádorových tkáních však můžeme využít redukčního prostředí pro selektivní aktivaci specifických léčiv. Příkladem takovýchto cytostatik se selektivním účinkem v hypoxických nádorových buňkách jsou nitroderiváty, které jsou samy o sobě neúčinné a na aktivní formu látky (aminoderivát) jsou díky redukčním mechanizmům převedeny až v organizmu. Některé z látek působících tímto mechanizmem jsou znázorněny na Obr. 95. Mitomycin C byl již zmíněn v předchozí kapitole a jeho mechanizmus účinku, založen na 143 alkylaci, souvisí se selektivním účinkem v hypoxických buňkách. Mitomycin C je široce používané chemoterapeutikum, např. k léčbě adenokarcinomu žaludku a pankreatu. Obrázek 95. Cytostatika selektivní v hypoxických buňkách. Mechanizmus účinku těchto látek je znázorněn ve schématu 70. Uvedené látky představují chinonové deriváty, které jsou v buňce redukovány za vzniku radikálů: Ty jsou v normálních dostatečně okysličených buňkách oxidovány zpět na chinon, avšak v hypoxických buňkách zůstávají jako radikály a mohou tak atakovat DNA. Uvedený mechanizmus je znázorněn pro mitomycin C. Schéma 70. Redukce mitomycinu C. Redukce chinonového centra je následována dvěma sekvenčně specifickými Nalkylacemi, a to na guaninových nukleosidech v sekvenci 5'-CpG-3' (Schéma 71). 144 Schéma 71. Přeměna mitomycinu C. Mezi cytostatika se selektivním účinkem v hypoxických buňkách patří i nitroaromáty uvedené na Obr. 96. Obrázek 96. Cytostatika se selektivním účinkem v hypoxických buňkách – nitroaromáty. Nejzajímavější z této skupiny je látka CB 1954 (tretazicar), dinitrobenzamid, který je za přítomnosti enzymu nitroreduktasy převeden na bifunkční alkylační cytostatikum. CB 1954 bylo rovněž zkoumáno v genové terpii GDEPT (gene-directed enzyme prodrug therapy), která využívá vnesení tzv. sebevražedného genu do nádorové buňky. Terapie je založena na distribuci genu do nádorové buňky, který kóduje aktivační enzym. Distribuce genu je následována podáním proléčiva specificky aktivovaného v dané nádorové tkáni. Tak je neškodná látka přeměněna selektivně na toxickou. 145 Obrázek 97. Znázornění mechanizmu genové terapie (GDEPT). http://www.elkortho.com/irm/content/technology-platform.aspx?RID=287&RedirectCount=1 Samotný mechanizmus ataku DNA je založen na redukci profarmaka CB 1954 nitroreduktasou na 2- a 4-hydroxylamino deriváty, načež více cytotoxický 4-hydroxylamino derivát reaguje s acetyl CoA za tvorby cytotoxického bifunkčního alkylačního činidla schopného cross-linků v DNA. Následkem tvorby kovalentních vazeb mezi vlákny DNA je apoptóza nádorových buněk. Schéma 72. Mechanizmus interakce CB1954 s DNA. 7.4. Inhibitory topoizomeras Topoizomerasy jsou enzymy, které relaxují superhelikální vinutí DNA (například při replikaci), dále štěpí/odstraňují komplexy DNA vyššího řádu, DNA uvádějí do „normálního stavu“. Jedná se např. o narovnávání vzájemně propojených helixů a cyklických struktur, řetězových struktur, struktur vzniklých při nedokonalém oddělení DNA od polymerační vidlice. Topoizomerasy jsou tak důležitou součástí opravných mechanizmů, slouží při oddělení chromozómů a pro jejich kondenzaci a dekondenzaci při buněčném dělení. Fungují obvykle tak, že rozštěpí jedno nebo obě vlákna duplexu DNA, rozvolní komplex vyššího řádu a opětovně vlákno(a) spojí. Topoizomeras existuje několik základních typů, nejvýznamnější je topoizomerasa I, která štěpí jen jedno vlákno DNA a topoizomerasa II, která štěpí vlákna obě (Obr. 98 a 99). Topoizomerasy se vyskytují u prokaryot, eukaryot i 146 virů, u jednotlivých skupin živých organizmů se liší a to umožňuje vyvinout inhibitory cílené jen na enzym specifický pro určitou skupinu organizmů, příkladem mohou být antibakteriální chinolony. Topoizomerasy mají v aktivním centru tyrosinové postranní řetězce, které se vážou na fosfodiesterové vazby řetězce superhelikální DNA a rozpojí ho. Energie na změnu konformace komplexu enzym-DNA dodá hydrolýza ATP, u topoizomerasy II je tak umožněn vektorový průchod druhého duplexu, u topoizomerasy I se celá struktura protočí kolem nerozštěpeného řetězce a tím se zruší superhelix (Obr. 98 a 99). Nakonec topoizomerasa rozštěpený řetězec (řetězce) znovu spojí. Vzhledem k významu topoizomeras při buněčném dělení se zásahu do jejich funkce používá k omezení růstu nádorů. Inhibice topoizomeras obvykle vede k apoptóze. Inhibitory topoizomeras můžeme rozdělit dle jejich mechanizmu účinku: Inhibitory vazby ATP na komplex (Novobiocin), interkalující inhibitory, neinterkalující inhibitory, přímé inhibitory katalyzovaného děje. Obrázek 98. Mechanizmus funkce topoizomerasy I. Dekker N H et al. PNAS 2002;99:12126-12131. http://www.pnas.org/content/99/19/12126/F1.expansion.html 147 Obrázek 99. Funkce topoizomerasy II. Seychelle M. Vos, Elsa M. Tretter, Bryan H. Schmidt & James M. Berger; Nature Reviews Molecular Cell Biology 12, 827-841 (December 2011). http://www.nature.com/nrm/journal/v12/n12/fig_tab/nrm3228_F3.html 7.4.1. Specifické inhibitory topoizomerasy I Supresory topoizomerasy I inhibují samotný enzym, topoizomerasové jedy inhibují zpětnou ligaci DNA řetězce. Používané inhibitory jsou deriváty camptotecinu (Obr. 100; přírodní látka, izolována z camptotheca acuminata, sama je příliš toxická) topotecan a irinotecan. Na camptoteciny nevzniká mnohočetná léková rezistence. Obrázek 100. Specifické inhibitory topoizomerasy I, deriváty camptothecinu. 148 7.4.2. Inhibitory topoizomerasy II Tyto inhibitory lze rozdělit do několika skupin, které zasahují do různých center enzymu i do jeho jednotlivých aktivit (religace, aktivace ATP, …), většina z nich obsahuje planární aromatickou část schopnou interkalace: demethylepipodofylotoxiny – etopozid, tenipozid; antracykliny – doxorubicin, daunorubicin; elipticiny; aminoakridiny a chinolinkarboxamidy; aktinomyciny; anthraceny a anthrapyrazoly; pyridobenzoxaziny; pyridoakridiny. Demethylepipodofylotoxiny jsou deriváty podofylotoxinu a jsou využívány v medicíně již po staletí. Jedná se o přírodní látky izolované z Podophyllum peltatum a Podophyllum emodi. Nejdůležitějšími epipodofylotoxiny jsou v současnosti používané semisyntetické deriváty etoposid a teniposid. Etoposid se využívá například při léčbě rakoviny varlat, plic, Kaposiho sarkomu, lymfomů, méně využívaný teniposid pak při léčbě lymfomů. Obrázek 101. Interkalující topoizomerasové jedy s účinkem na topoizomerasu II. Deriváty epipodofylotoxinu a antracyklinu. Deriváty antracyklinů jsou inhibitory topoizomerasy II fungující na principu interkalace. Jsou to tzv. topoizomerasové jedy, vytváří stabilní komplexy s topoizomerasou II a DNA. Cukerná složka je důležitá pro stabilizaci komplexu. V místě účinku vytváří radikály. Používanými léčivy jsou daunorubicin (léčba akutní lymfocytární a myeloidní leukémie); 149 doxorubicin (léčba solidních tumorů prsou, dětských rakovin, sarkomů měkkých tkání a lymfomů); mitoxantron (léčba rakoviny prsu, Hodgkinova i non-Hodgkinových lymfomů). Obrázek 102. Inhibitory topoizomerasy II – analoga ellipticinu a akridinu. Deriváty ellipticinu (Obr. 102) byly poprvé získány z Ochrosia elliptica. Prostřednictvím DNA interkalace blokují RNA a DNA polymerasy a jsou schopné alkylovat DNA. Deriváty akridinu působí mechanizmem interkalace do DNA. Bylo vyvinuto léčivo m-AMSA (Obr. 102), které se používá na léčbu maligních lymfomů a akutních leukemií. Vytváří ternární komplex (multisubstrátový enzym, struktura např. enzym-kofaktor-substrát nebo enzym-substrát1-substrát2) s DNA a topoizomerasou II a blokuje zpětné spojení rozpojeného řetězce DNA. Další skupinou interferující s topoizomerasami jsou aktinomyciny, sloučeniny získané z plísní (např. Streptomyces). Používá se například Aktinomycin D (Dactinomycin). Jsou to jednak DNA interkalátory a zároveň se tyto sloučeniny váží do malého žlábku dvoušroubovice DNA. Interkalace probíhá přednostně mezi GC báze. Komplex DNAaktinomycin je velmi stabilní, tím pádem nemůže dojít k rozvinutí dvojšroubovice DNA a RNA polymerasa nemůže syntetizovat novou RNA. Používá se při léčbě sarkomů, pediatrických nádorů, nádorů varlat apod. Poslední skupinou jsou bidentátní interkalátory, tedy sloučeniny, které obsahují dvě interkalující skupiny spojené linkerem. Tyto deriváty interkalují DNA na dvou místech a vzdálenost těchto míst závisí na délce toho linkeru. Používanou sloučeninou je diterkalinium a některé deriváty chinoxalinu, například echinomycin nebo triostin. Existují také deriváty, které inhibují přímo aktivitu topoizomeras, tyto deriváty mohou mít jak synergický tak antagonický efekt s topoizomerasovými jedy. Tímto mechanizmem působí některé antracykliny, např. aklarubicin, který je zároveň silným interkalátorem a zabraňuje topoizomeráze se na DNA navázat. Používá se k léčbě akutní myeloidní leukémie. 7.5. Inhibitory angiogeneze Angiogeneze je proces vzniku nových krevních kapilár z již existující vaskulatury. Pro zajímavost, celkový povrch krevních kapilár u dospělého člověka je 6300 m2. Povrch kapilár je tvořen jednovrstevnou bazální membránou endoteliálních buněk (tyto buňky pokrývají všechny krevní cévy) s různě velkými mezerami mezi nimi, které dovolují průchod i poměrně velkých molekul. Angiogeneze je přirozený proces probíhající např. při 150 vývoji embrya a hojení ran, při ovulačním a menstruačním cyklu. Je to mnohastupňový děj, spočívající v aktivaci endoteliálních buněk bazální vrstvy kapilár, jejich následné proliferaci, migraci a vytvoření nových trubic. Angiogeneze je důležitá pro růst nádorů, už nádor o rozměrech nad 1–2 mm musí mít vlastní přísun živin a kyslíku prostřednictvím krevních kapilár. Buňky nádoru z tohoto důvodu vylučují faktory, které stimulují buňky krevních kapilár v jeho okolí k vysílání výběžků k němu. Důležitými faktory při angiogenezi jsou VEGF (vascular endothelial growing factor), kyselý FGW (fibroblast growing factor), bazický FGW, angiotenzin a PDEGF (platelet-derived endothelial growth factor). PDEGF je identický s thymidinfosforylasou, jejíž vysoká hladina je markerem mnoha typů nádorů. Inhibitory angiogeneze se používají při léčbě hemangiomů, Kaposiho sarkomu, psoriasy, neovaskularizace oka, revmatické artritidy, aterosklerózy a nádorů. Aktivátory angiogeneze jsou naopak vhodné při následné léčbě a hojení ran po chirurgických zákrocích (rekonstrukce), při ischemii myokardu a mozkové ischemii. Obrázek 103. Inhibitory angiogeneze působící různým mechanizmem. Marimastat a Prinomastat jsou inhibitory matrixových metaloproteináz, PD166866 je inhibitor FDFR (fibroblast growing factor receptor), ZD4190 je inhibitorem VEGF-R (vaskulární endotheliální růstový faktor). Možné mechanizmy inhibice angiogeneze spočívají v inhibici matrix-metaloproteináz (enzymů působících štěpení bazální membrány kapilár) – marimastat, batimastat, AG3340, Neovastat, PEX, Amiloride; dále v inhibici kolagenáz (působí štěpení kolagenu) – minocyklin, tetracykliny; prostřednictvím ovlivnění integrinů (integriny jsou specifické adhezní molekuly na povrchu aktivovaných endotheliálních buněk; jejich vyvázáním dojde k zábraně působení angiogenních faktorů a následné apoptóze aktivovaných buněk bazálního epithelu); efektorů proliferace aktivovaných endotheliálních buněk (endogenní faktory – angiostatin, endostatin), cytokinů (interferony, IL-12), inhibitory NOsyntasy, combretastatin, thalidomid, linomide. Dále jsou významné inhibitory různých růstových faktorů důležitých pro angiogenezi, např. PD166866 a ZD4190, viz Obr. 103. 151 Obrázek 104. Další příklady inhibitorů angiogeneze. Látky podporující angiogenezi pak jsou inhibitory růstových faktorů (distamyciny, suramin, SU5416) a inhibitory cyklooxygenasy (aspirin); modulátory mezibuněčných signálů – inhibice Tyr-kinasy (lavendustin, genistein). 7.6. Inhibitory thymidinfosforylasy Thymidinfosforylasa je enzym, který štěpí 5-substituované 2‘-deoxyuridiny užívané v terapii virových chorob a nádorů a snižuje tak účinnost terapie (Obr. 73). Proto se její inhibitory často používají při léčbě nádorových onemocnění těmito deriváty. Schéma 73. Funkce thymidinfosforylasy. Obrázek 105. Inhibitory thymidinfosforylasy. 152 7.7. Látky s radiomimetickým účinkem Radiomimetika představují specifickou skupinu látek, které způsobují štěpení vazeb mezi jednotlivými nukleotidovými jednotkami v DNA řetězci, přičemž tato destrukce se podobá poškození DNA způsobené ionizujícím zářením. Štěpení probíhá radikálovým mechanizmem na uhlíkových atomech 2´-deoxyribózového zbytku v polohách C1´, C4´ nebo C5´ na obou vláknech DNA. Mezi radiomimetika s protinádorovými účinky patří následující skupiny přírodních látek: (a) (b) (c) (d) bleomycin a jeho analoga endiynová antibiotika (neokarcinostatin a kedarcidin, kalicheamiciny a esperamiciny, dynemicin A) leinamycin streptonigrin a lavandomycin Bleomyciny, fleomyciny a peplomyciny Tato skupina antibiotik byla izolována z plísně Streptomyces verticillus (Obr. 106). Jejich protinádorový účinek spočívá ve štěpení DNA, které způsobuje zlomy na jednom nebo obou vláknech. Některé studie také naznačují, že bleomycin také inhibuje inkorporaci thymidinu do DNA. Obrázek 106. Struktura bleomycinů, peplomycinů a fleomycinů. 153 Štěpení DNA bleomyciny a podobnými látkami je závislé na přítomností kyslíku a kovových iontů (Fe, Cu). Přesný mechanizmus není zcela ozřejmen a v literatuře můžeme najít dvě hypotézy. První z nich předpokládá vznik chelátu bleomycinu s ionty železa nebo mědi, který se chová jako pseudoenzym. Ten reaguje s kyslíkem za tvorby superoxidových (hyperoxidových) a hydroxidových volných radikálů, které atakují DNA. Druhá hypotéza je pak založena na myšlence, že se bleomycin inkorporuje do specifického místa DNA a indukuje homolytické štěpení vazby C4´-H. S ionty železa nebo mědi vytváří pevné komplexy, které vyvolají vznik hydroperoxidového radikálu. Koligací těchto dvou radikálů vzniká hydroperoxy intermediát, který podléhá tzv. Criegeeho přesmyku, dojde ke štěpení vazby C3´-C4´a uvolňuje se fosfodiester. Vzniklý intermediát se pak rozpadá na fosfodiesterový analog a 3-(thymin-1-yl)-1-propenal. Tento atak probíhá přednostně na 5´ GT3´, méně často pak na 5´GC3´. Bleomycin A2 (BleocinTM, BlenoxanTM) je používán při terapii Hodgkinových lymfomů, testikulárních nádorů, karcinomu děložního čípku nebo kožních karcinomů. Peplomycin (PeplocinTM) má obdobné použití jako bleomycin, účinný je i u karcinomu prostaty. K třetí generaci belomycinových analog řadíme Tallysomycin indikován k léčbě nádorů kůže, Hodgkinových i nehodgkinových lymfomů nebo karcinomu děložního čípku. Schéma 74. Předpokládaný mechanizmus působení belomycinů. 154 Endiynová antibiotika Jedná se o přírodní látky vykazující protinádorové účinky, jejichž působení je založeno na tvorbě aromatických biradikálů. Strukturně obsahují makrocyklický kruh a konjugovaný systém obsahující nejméně jednu dvojnou a jednu trojnou vazbu. Jejich negativní stránkou je vysoká toxicita, jež limituje terapeutické aplikace. Neocarzinostatin A (ZinostatinTM) je makrocyklický systém izolovaný ze Streptomyces macromomyceticus (Obr. 107). Obsahuje dvě části, labilní chromofor zahrnující bicyklický dienediynový systém a apoprotein složený ze 113 aminokyselin, ke kterému je vázán nekovalentní vazbou s vysokou afinitou. Za protinádorové účinky odpovídá chromofor, apoprotein má pouze ochranou roli. Neocarzinostatin může (a) štěpit řetězec DNA (přednostně štěpí jednovláknovou DNA na T-vazbách, mnohem méně pak na A-vazbách) nebo (b) vytvářet kovalentní adukt DNA se svou chránící bílkovinou. Obrázek 107. Struktura chromoforu neocarzinostatinu A. Mechanizmus působení neocarzinostatinu je založen na tvorbě aromatického biradikálu vznikajícího cykloaromatizací endiynového systému. Celý sled událostí vzniku biradikálu je poměrně složitý, zahrnuje otvírání epoxidového kruhu přítomného na chromoforu za reduktivních podmínek, propargylový přesmyk iniciovaný přítomností aminů a končí tzv. Bergmanovou cyklizací. Vzniklý biradikál (Schéma 75) pak homolyticky štěpí vazbu C-H v poloze 5´, následuje adice kyslíku za vzniku hydroperoxidu, který se působením sulfanylové sloučeniny rozštěpí na odpovídající aldehyd a volnou fosfátovou skupinu. Schéma 75. Mechanizmus štěpení DNA endiynovými antibitoiky. 155 Neocarzinostatin je schválen v Japonsku ke klinické léčbě rakoviny jater. Do skupiny jeho analog pak můžeme řadit actinoxanthin, kedarcidin a maduropeptin. Stejným mechanizmem založeným na generování biradikálů působí i další endiynová antibiotika jako kalicheamiciny, dynemiciny a esperamiciny (Obr. 108). Kalicheamicin γ1 je izolován z Micromanospora echinospora, štěpí přednostně sekvenci TCCT-AGGA ve dvouvláknové DNA od 5´-konce. Přestože je to velmi účinné cytostatikum, je příliš toxické ke klinickému využití. Jeden z kalicheamycinů je také součástí konjugátu Gemtuzumab ozogamicin (MylotargTM), monoklonální protilátky používané od roku 2000 k léčbě akutní myelogenní leukémie, která však byla v roce 2010 stažena z trhu. Podobný konjugátem je i Inotuzumab ozogamicin, který v současné době prochází řadou klinických testů, např. fází II proti non-Hodgkinovu lymfomu. Dynemicin A je izolován z Micromanospora chersina, obsahuje antrachinonový chromofor. Mechanizmus vzniku benezenového biradikálu vychází z redukované (hydrochinonové) formy antibiotika a spočívá v otevření oxiranového cyklu následovaným adicí vody na vzniklou dvojnou vazbu. Vytváří se diolový systém, který pak snadno přechází na biradikál. Obrázek 108. Struktura endiynových antibiotik. Leinamycin Leinamycin je přírodní antibiotikum s protinádorovými účinky (in vivo) získávané z několika druhů Streptomyces atroolivaceus. Strukturně je charakterizováno přítomností neobvyklého 1,3-dioxo-1,2-dithiolanu, který je spiro můstkem vázán na 18-ti členný makrolaktamový cyklus. Reaktivní dithiolanonové seskupení je zodpovědné za generování radikálu a štěpení jednovláknové DNA. 156 Obrázek 109. Struktura leinamycinu. Streptonigriny a lavendamycin Tato antibiotika s protinádorovým účinkem byla izolována ze Streptomyces flocculus a Streptomyces lavendulae. Jsou vzájemně příbuzná, lavendamycin je pravděpodobně prekurzorem biosyntézy streptonigrinu, tvoří pevné komplexy s kovy Mg2+, Ca2+, Cu2+ a Zn2+. Streptonigrin (Bruneostatin, BruneomycinTM) inhibuje topoizomerasu II, ale neinterkaluje s DNA. Hlavní účinek však spočívá ve štěpení DNA. Přesný mechanizmus není zcela objasněn, avšak předpokládá se, že ho NADH redukuje a vzniklá redukovaná forma podléhá autooxidaci za vzniku hydroperoxidového radikálu. Lavendamycin je rovněž účinné cytostatikum, avšak jeho použití při terapii vzhledem k nízké rozpustnosti ve vodě a nespecifické cytotoxicitě selhalo. Obrázek 110. Struktura streptonigrinu a lavendamycinu. 7.8. Telomerasa a její inhibitory Telomery jsou nukleoproteinové struktury na konci eukaryotických chromozomů, pro které je charakteristické mnohonásobné opakování krátkých úseků DNA, např. u lidských buněk jsou telomery tvořeny až 2000 repetic krátkých hexanukleotidových sekvencí 5´TTAGGG-3´. Váží se se specifickými proteiny a chrání chromozomy proti ataku exonukleáz. Vzhledem k nemožnosti plně doreplikovat opožďující se vlákno DNA (po odbourání posledního RNA primeru již není další Okazakiho fragment, který by sloužil jako donor 3 157 konce) dochází při každé replikaci ke zkrácení chromozomu. Z tohoto důvodu jsou na konci chromozomů telomery obsahující nekódující DNA, které zabraňují ztrátě genetické informace z konců chromozomů. Délka telomer souvisí s kapacitou buňky dělit se a je tedy markerem replikativního stárnutí buněk. Po zkrácení telomer pod určitou mez se buňka přestává dělit, dochází k replikativní senescenci. Některé buňky, např. pohlavní nebo kmenové, jsou schopné telomery opět prodlužovat činností enzymu telomerasy. Telomerasa je enzymový komplex s charakterem RNA-dependentní-DNA polymerasy (reversní trasnkriptasy), jenž disponuje schopností prodlužovat sekvence telomer. Telomerasa obsahuje aktivní reversní transkriptasu (TERT), vlastní RNA (TR) sekvenci 3'-CAAUCCCAAUC-5´ použitelnou jako templát k elongaci řetězce a další dvě regulační proteinové subjednotky. Umí přidat první nukleotid templátu k poslednímu na sekvenci telomery a vytvořit novou sekvenci 5'-GGTTAG-3'. Vzniká tak nový 3´-konec a proces se opakuje až do dosažení patřičné délky. Existují i alternativní mechanizmy prodloužení telomer založené na rekombinaci. Většina telomerové sekvence je duplex, ale koncová část asi 200 nukleotidů je v přesahu jako jednovláknový řetězec bohatý na guanin. Tento řetězec pak za účasti iontů Na+ nebo K+ vytváří tzv. kvadruplexy, rovinné systémy čtyř 2´-deoxyguanosinů navzájem stočených o 90° interagujících navzájem na základě hoogsteenovského párování bází. Obrázek 111. G-kvadruplex. Za normálních okolností, bez přítomnosti telomerasy, proběhne buněčný cyklus 5070 x (v závislosti na buněčném typu) než se buněčné dělení zastaví a dojde k senescenci. Za přítomnosti telomerasy je v buňce chybějící část DNA doplněna a buňka se tak může dělit v podstatě neomezeně. Exprese telomerasy je však přísně regulována, fyziologicky nacházíme telomerasu v buňkách během embryonálního vývoje, u dospělého jedince pak v kmenových buňkách. Za patologických podmínek je telomerasová aktivita zvýšena v nádorových buňkách, což přispívá k jejich neomezenému dělícímu potenciálu. Telomerasa byla prokázána ve > 85 % nádorových buněk. Za výzkum telomeras byla v roce 2009 udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu trojici vědců – Jacku W. Szostakovi, Elizabeth Blackburnové a Carol W. Greiderové. V současné době se vývoji inhibitorů telomeras věnuje biotechnologická společnost Geron. 158 7.8.1 Inhibitory telomerasy jako potenciální protinádorová léčiva Nádorové buňky obsahující telomerasu jsou díky ní víceméně „nesmrtelné“, jelikož jim umožňuje stále se dělit. Protože se telomerasa nevyskytuje ve většině somatických buněk, její inhibice by mohla selektivně potlačovat růst nádorových buněk s minimálními vedlejšími efekty, nejlépe v kombinaci s radioterapií a chemoterapií. Existuje několik přístupů inhibice telomerasy z nichž uvádíme následující: 1. Vzhledem k tomu, že telomerasa je jedinečný enzym, jehož primární funkcí je syntetizovat telomerní DNA, nabízí se přímá inhibice enzymu. Aktivní místo můžeme inhibovat látkami, které napodobují strukturu telomery, dále nukleotidovými substráty a existují také allosterické inhibitory telomerasové reversní transkriptasy. Výhodou tohoto přístupu je, že se jedná o standardní farmakologický přístup umožňující vývoj malých molekul a oligonukleotidů, nevýhodou pak dlouhá časová prodleva mezi podáním látky a klinickou odpovědí. Do skupiny přímých inhibitorů telomerasy můžeme řadit látku GRN163L (Imetelstat), vážící se do aktivního místa enzymu, který je ve fázi I a I/II klinického vývoje proti CLL (chronická lymfatická leukémie), solidním tumorům a mnohononásobnému myelomu jako samotný přípravek, proti nemalobuněčnému plicnímu karcinomu (NSCLC) v kombinaci s paclitaxelem a karboplatinou. Zatím na počátku vývoje je látka BIBR 1532 (HY-17353), selektivní inhibitor telomerasy s IC50 100 nM. Studie indikují, že tato látka inhibuje reversní transkriptasovou aktivitu telomerasy. 2. Druhý přístup je založen na aktivní imunoterapii a vedl k vývoji řady látek, které jsou v klinickém vývoji. Tyto látky jsou navrženy tak, aby stimulovaly pacientův imunitní systém (T-lymfocyty) proti nádorovému antigenu odvozenému z proteinu TERT. Metoda je založena na tom, že jsou izolovány pacientovy dendritické buňky (antigen-prezentující) a in vitro vystaveny působení peptidových fragmentů kódujících TERT. Následně je pacient takto stimulovanými dendritickými buňkami vakcinován. Peptidy, jež jsou pomoci hlavního histokompatibilního komplexu navázány na povrch antigen-prezentující buňky, vyvolávají aktivaci a expanzi TERT-specifických T buněk (CD8+ cytotoxických T lymfocytů), které zabijí nádorovou buňku obsahující na svém povrchu antigen TERT. Mezi takovéto látky patří produkty založené na syntetickém TERT peptidu, mRNA, plazmidová nebo virální DNA, antigen-prezentující buňky jsou typicky autologní nebo alogenní dendritické buňky nebo B-buňky. Nejvíce studované z této skupiny látek jsou GV1001 a GRNVAC1. GRNVAC1 je autologní dendritická buněčná vakcína, která se nachází ve Fázi I proti rakovině ledvin a prostaty, ve Fázi II proti AML. GV1001 je subjednotková peptidová vakcína. Ve Fázi I a I/II k mnohonásobným indikacím – NSCLC, melanomy, rakovina slinivky břišní. Ve Fázi II proti NSCLC a ve Fázi III proti rakovině slinivky břišní. P450-548 je TERT peptid p450-548, který se nachází ve Fázi I proti rakovině prsu a prostaty a ve Fázi II proti NSCLC. VxO1 ve Fázi II proti NSCLC a TLI ve fázi I proti rakovině prostaty. 3. Třetí přístup využívá látky, které narušují strukturu telomer. Změna struktury telomery pak vede k ukončení buněčného dělení a buněčné smrti. Jejich účinek souvisí se schopností stabilizovat G-kvadruplex a jejich účinky byly zatím prokázány in vitro. Na 159 interakci s G-kvadruplexem jsou zaměřeny látky, jež do určité míry mimikují jeho strukturu (Obr. 112). Jsou to pyrrolový (porfyrinový) derivát a isoxazol-thioxazolový telomestatin. Obrázek 112. Analoga G-kvadruplexu. Inhibiční aktivita zaměřená na G-kvadruplex byla in vitro zjištěna i u látek obsahujících planární systém substituovaný dvěma postranními dvouuhlíkatými řetězci obsahujících amidovou funkci (Obr. 113). Kvarternizace dusíkových nábojů je podle SAR studií pro aktivitu zcela nezbytná. Obrázek 113. Planární (interkalujcí) inhibitory telomerasy. 4. Sebevražedná genová terapie (Suicide gene therapy), která využívá toho, že nádorové buňky exprimují transkripční faktor (TF) aktivující promotor TERT. Do buněk se vpraví vektor nesoucí gen pro toxin zařazený za tento promotor. Tato terapie je zatím v preklinické fázi. 160 5. Pátý přístup je založený na inhibici exprese telomerasy. Na tomto místě můžeme zmínit protisměrné (antisense) oligonukleotidy, ribozymy nebo siRNA cílené na TERT nebo hTR (lidská telomerasová RNA). Doposud předmětem in vitro i in vivo studií. Inhibující účinky projevily in vitro i následující látky, jejichž struktury jsou znázorněny na Obr. 114. Retinová kyselina se má podílet na negativní regulaci (down-regulation) telomerasy, rubromycin, purpuromycin, griseorhodin a platinový derivát působí jako interkalátory. Obrázek 114. Inhibitory telomerasy. Cytostatický účinek in vitro v nanomolárních koncentracích na principu inhibice telomerasové aktivity byl zjištěn i u následujících antrachinonových derivátů substituovaných silně bazickými skupinami (Obr. 115) Obrázek 115. Antrachinonové inhibitory telomerasy. 161 7.9. Antimitotické látky interagující s tubulinem Specifickou skupinou sloučenin, které mají vliv na polymerizaci a depolymerizaci tubulinu jsou analogy GTP (Obr. 116). Guanosin-5’-(β,γ-methylentrifosfát) a guanosin5’- (β,γ-imidotrifosfát) jsou nehydrolyzovatelné analogy GTP, které podporují elongační fázi polymerizace tubulinu a chrání mikrotubuly před depolymerizací; 2’,3’dideoxyguanosin-5’-difosfát je hydrolyzovatelný analog, který účinně podporuje iniciační i nukleační fázi polymerace tubulinu; 2’,3’-dideoxyguanosin-5’-trifosfát je hydrolyzovatelný analog, který podporuje iniciační i elongační fázi polymerace tubulinu, stabilizuje vzniklý monomer; guanosin-5’- (α,β-methylentrifosfát) podporuje polymerizaci tubulinu a vzniklé mikrotubuly chrání před depolymerizací; guanosin-5’-O-(3-thio)trifosfát se chová obdobně jako guanosin-5’- (α,β-methylentrifosfát), podporuje polymerizaci tubulinu, mikrotubuly vzniklé tímto analogem jsou velmi stabilní dokonce i za snížené teploty. Obrázek 116. Analoga guanosintrifosfátu, která zasahují do polymerace a depolymerace tubulinu. Další léčiva zasahující do tvorby tubulinů jsou na Obr. 117. Můžeme je rozdělit na: Sloučeniny rozvolňující strukturu mikrotubulů, které mohou působit na dvou různých vazebných místech mikrotubulů 1. Na vazebném místě kolchicinu Podofylotoxin Epipodofylotoxin Steganacin Combretastatin Amphetinil Benzpyrazinové karbamáty 2. Na vazebném místě vinkristinu vinca alkaloidy (Vinkristin, Vinblastin, Vindesin, Vindolin, Navelbin) makrolidy (maytansin, ansamitociny, rhizoxin) 162 peptidy (phomopsin A, dolastin) Sloučeniny stabilizující struktury mikrotubulů paclitaxel (Taxol) Obrázek 117. Příklady sloučenin, které zasahují do tvorby a degradace tubulinových vláken. Další léčiva, která zasahují do M fáze buněčného cyklu, jsou deriváty blokující kinesin Eg5, který je důležitý pro oddělení centrozomů. Jeho inhibice znemožňuje vznik normálního dělícího vřeténka, příklady inhibitorů kinesinu Eg5 jsou v Obr. 118. Obrázek 118. Ingibitory kinesinu Eg5. 7.10. Inhibitory proteinkinas Proteinkinasy jsou enzymy, které regulují aktivitu, stabilitu a lokalizaci proteinů pomocí jejich fosforylace. Fosforylace způsobí konformační změnu v molekule proteinu a tím i změnu v aktivitě. Zdrojem fosfátu je ATP a fosforylují se specifické aminokyseliny daného 163 proteinu. Tyto fosforylace hrají významnou roli při spouštění jednotlivých stupňů buněčného cyklu, dále při diferenciaci buněk, spouštění signálních drah iniciovaných cytokininy a transdukci signálu v eukaryotních buňkách. Podle cílové aminokyseliny je dělíme na tyrosin kinasy, serin-threonin kinasy a histidin kinasy. Protein kinasy se podílí na regulaci většiny biologických procesů včetně těch, které souvisí s nádorovými onemocněními, hlavně s dělením buněk, jejich diferenciací a smrtí, angiogenezí a metastazováním. Inhibitory proteinkinas jsou proto často používaná cytostatika. Většina inhibitorů proteinkinas se váže do aktivního místa pro ATP. Obrázek 119. Příklady různých typů inhibitorů proteinkinas. Obrázek 120. Příklady komerčních inhibitorů proteinkinas. 164 Typickým příkladem kinas jsou cyklin dependentní kinasy. Tyto kinasy jsou určené k regulaci buněčného cyklu, fosforylují cílové proteiny na jejich serinových nebo threoninových postranních řetězcích, což tyto proteiny obvykle aktivuje. Tyto kinasy jsou samy aktivovány tzv. cykliny (proto cyklin dependentní) a zvýšená aktivita těchto cyklinů, potažmo některých cyklin dependentních kinas je často asociována s nádorovými onemocněními. Některé CDK inhibitory inhibují nejen kinasy buněčného cyklu (CDK1/2), ale protinádorovému účinku přispívá i schopnost inhibovat CDK spojené s transkripcí (CDK7/9), příkladem jsou sloučeniny na obr. 121. Obrázek 121. Příklady inhibitorů cyklin dependentních kinas. 7.11. Inhibitory prenylace proteinů Proteiny, zejména ty které se účastní signálních drah, bývají posttranslačně modifikovány dlouhým mastným řetězcem – prenylovány. Jedná se buď o zavedení farnesylové (C15) nebo geranylové (C20) skupiny. Tato modifikace obvykle proteiny ukotví v membráně, kde jsou aktivní. Obrázek 122. Princip vzniku farnesylovaných Ras proteinů a jejich ukotvení v membráně. Jedním typem prenylovaných proteinů jsou tzv. Ras proteiny, které se nacházejí v buňkách eukaryotických organizmů a účastní se signálních drah, podporují zejména růst a dělení buněk. Zkratka Ras pochází z anglického rat sarcoma, protože tyto proteiny byly poprvé izolovány z myší se sarcomem. Ras proteiny váží GTP (jsou to GTPasy), v normálních buňkách je jejich aktivita kontrolována poměrem GTP/GDP. Mutace Ras genů vedou ke stálé přítomnosti aktivních Ras proteinů v buňce a to může mít za následek vznik nádoru. Zvláště významné jsou mutace v K-ras. Farnesylaci katalyzuje enzym farnesyl 165 transferasa a k modifikaci dochází na cysteinu (čtvrtém od C-terminálního konce). Odštěpí se koncový tripeptid a farnesylovaný cystein se methyluje. Vzniklý modifikovaný ras protein se poté váže k plazmatické membráně. Inhibitory farnesyl transferasy blokují prenylaci a u mutovaných Ras proteinů se tak snižuje aktivita. Tyto inhibitory mají mimořádně nízkou toxicitu. Obrázek 123. Příklady inhibitorů farnesyl transferasy. 7.12. Mnohočetná léková rezistence (MDR) Při léčbě cytostatiky se často stává, že po určité době si nádorové buňky na ně vyvinou rezistenci. Asi nejčastějším mechanizmem vzniku takové rezistence je exprese genu MDR1, jehož produktem je P-glykoprotein, což je ATP dependentní pumpa se širokou substrátovou specificitou. Tato pumpa je schopná odstraňovat z buňky široké spektrum xenobiotik včetně cytostatik, energii k tomu získává hydrolýzou ATP. MDR lze omezit současným podáváním cytostatika a antagonistů Ca2+ kanálu, což má ovšem vedlejší účinky na srdeční činnost. Obrázek 124. Léčiva potlačující mnohočetnou lékovou rezistenci, Verapamil je příklad antagonisty Ca2+ kanálu a Amiodaron je inhibitor P-glykoproteinu. 7.13. Steroidní hormony v protinádorové terapii Steroidní hormony jsou hormony lipofilního charakteru, které vznikají z cholesterolu. Dělí se na dvě základní skupiny. Steroidní hormony vylučované (a) kůrou nadledvinek (např. aldosteron, kortisol) a (b) pohlavními žlázami (např. progesteron, testosteron, estradiol). Aldosteron je mineralotropní kortikoid, který zvyšuje retenci sodíku v ledvinových tubulech. Kortisol (glukortikoid) stimuluje glukoneogenezi a potlačuje zánětlivé procesy. Progesteron je prekurzor ostatních hormonálních steroidů, je vylučován žlutým tělískem, brání ovulaci během těhotenství a připravuje dělohu pro 166 implantaci vajíčka. Estradiol patří mezi estrogeny, stimuluje vývoj samičích pohlavních znaků. Testosteron patří mezi androgeny a stimuluje vývoj samčích pohlavních znaků a má anabolické účinky. Steroidní hormony ovlivňují mnoho procesů v organizmu a mohou mít vliv na některá nádorová onemocnění (např. nádory prsu nebo nádory prostaty). Účinek steroidních hormonů je závislý na přítomnosti steroidních receptorů (receptory pro estrogeny, androgeny a gestageny). Jsou exprimovány v pohlavních orgánech, hypothalamu, adenohypofýze, prsní žláze a v mnoha dalších tkáních (estrogenní receptory jsou bohatě přítomny v játrech, ledvinách, kostech a v cévním endotelu). Z toho vyplývá, že analoga steroidů mohou mít více účinků a kromě protinádorové terapie mohou být využívány i k léčbě jiných nemocí, např. osteoporózy, hormonálních poruch, snížení hladiny cholesterolu a triglyceridů v krvi, mohou fungovat i jako antikoncepce. Zatímco receptory pro většinu hormonů se nacházejí na cytoplazmatické membráně, receptory pro steroidní hormony jsou umístěny v cytoplazmě nebo v jádře. Steroidní hormony snadno prochází plazmatickou membránou a v buňce vytváří s receptorem tzv. hormon-receptorový komplex, který funguje jako transkripční faktor a moduluje genovou expresi. Cílem hormonální protinádorové léčby je potlačení účinku hormonu, který má vliv na rozvoj nádorového onemocnění. V minulosti se nejdříve volilo chirurgické odstranění endokrinních žláz (vaječníků nebo varlat) produkujících stimulující hormony a následovala hormonální terapie hormonem s opačným účinkem, než má stimulující hormon (estrogenem k léčbě nádorů prostaty, testosteronem k léčbě nádorů prsu). Objevení buněčných receptorů pak umožnilo zcela nový směr léčby, využívající blokádu estrogenních (nádor prsu) a androgenních receptorů (nádor prostaty). Obecně lze hormonálně závislé nádory inhibovat několika způsoby: (a) ablativní léčbou – odstranění žláz produkujících daný hormon nebo omezení hormonální sekrece (chirurgická, radiační nebo farmakologická kastrace) (b) kompetitivní léčbou – podáváním antihormoů (antiestrogenů, antiprogestinů, antiandrogenů) – blokují receptory pro příslušný hormon antiestrogeny v léčbě karcinomu prsu antiandrogeny – v léčbě nádorů prostaty (c) inhibiční léčbou – inhibitory syntézy hormonů (d) aditivní léčbou – vysoké dávky gestagenů (vysoké dávky estrogenů nebo androgenů se dnes již nepoužívají) 7.13.1. Hormonální léčba karcinomu prsu Estrogeny představují primárně ženské pohlavní steroidní hormony, ale v malé míře se vyskytují i v těle mužů. Aktivují produkci růstových faktorů, stimulují expresi receptorů pro růstové faktory. Porušení rovnováhy v tvorbě estrogenů (po ukončení aktivní funkce vaječníku) může vést až k proliferaci nádorových buněk. Před menopauzou jsou estrogeny produkovány v ovariích, po menopauze jsou syntetizovány aromatizací androgenů (testosteronu a androstendionu). Předpokládá se, že komplex receptoru s estrogenem vstupuje do jádra epitelových buněk mléčné žlázy, kde způsobí zrychlení exprese 167 některých genů a celkového metabolizmu. Nádory prsu patří k nejčastějším zhoubným nádorům u žen v postmenopauzálním období. 7.13.1.1. Inhibitory aromatasy U postmenopauzálních žen pokračuje zbytková syntéza estrogenů z testosteronu a androstendionu, probíhá v tukové tkáni, v nadledvinách a játrech a také v nádoru. Je katalyzována enzymem aromatasou (Schéma 76). Aromatasa je komplex složený z flavoproteinu, NADPH a dvou specifických forem cytochromoxidasy P-450. Třístupňová oxidace hemovým komplexem Fe3+ zahrnuje adici kyslíku, odštěpení methylové skupiny C19 a aromatizaci kruhu A. Schéma 76. Přeměna testosteronu na estradiol a úloha aromatasy. Enzym má dvě hlavní vazebná místa (pro ionty železa a pro steroidní molekuly) a podle toho můžeme zmínit dva strukturní typy inhibitorů aromatasy používaných při léčbě nádorů prsu. steroidní inhibitory aromatasy – analoga androstendionu nesteroidní inhibitory aromatasy – látky, které interagují s komplexem Fe3+ v cytochromu P-450 Z první skupiny látek můžeme zmínit exemestan a formestan. Exemestan (AromasinTM) je analog androgenu, váže se do aktivního místa enzymu a zabraňuje tak konverzi testosteronu na estradiol. Formestan (LentaronTM) již vzhledem k nízké orální dostupnosti není populární. Obrázek 125. Struktura analog androstendionu. 168 Z druhé skupiny nesteroidních inhibitorů aromatasy můžeme zmínit např. anastrazol (ArimidexTM) nebo letrozol (FemaraTM) (Obr. 126). Obě látky soutěží s endogenními substráty o cytochrom P450 aromatasy, kde reversibilně inhibují železo hemové složky. Obrázek 126. Struktura inhibitorů aromatasy. Anastrozol a letrozol a steroidní inhibitor exemestan mají vyšší účinnost než tamoxifen (uvedený níže), nemají vedlejší účinky, jsou však podstatně dražší a nejsou s nimi zatím zkušenosti z dlouhodobého podávání. 7.13.1.2. Antiestrogeny Jedná se o nesteroidní látky s afinitou k estrogennímu receptoru (ER). Soutěží s estrogeny o vazebné místo na příslušných receptorech v buněčném jádru. Širší uplatnění našly tzv. selektivní modulátory estrogenních receptorů (SERM; selective estrogen receptor modulators). Jsou to látky schopné modulovat funkce estrogenních receptorů, ve srovnání s přirozenými estrogeny však mají tkáňově specifické účinky v estrogen-dependentních orgánech. Po vazbě na estrogenní receptor se naváží na HRE (hormony regulované elementy; hormon response element) v DNA a působí odlišné změny v genové expresi než estrogeny, snižují proliferační aktivitu, indukují apoptózu nádorových buněk. Mezi tyto látky patří např. tamoxifen, toremifen nebo raloxifen, které vykazují určité estrogen-agonistické účinky. Mezi jejich vedlejší účinky patří riziko hluboké žilní trombózy (raloxifen méně) a také snižují hladinu cholesterolu a triacylglycerolů v krvi. Tyto látky však také zvyšují kostní denzitu, přičemž raloxifen se používá jako prevence osteoporózy u žen po menopauze. Po dlouhá léta byl nejdůležitějším hormonálním léčivem karcinomu prsu Tamoxifen (TamoxifenTM, NolvadexTM), který se chová jako antagonista ER, zabraňuje vazbě pohlavních hormonů na receptory. Terapie tamoxifenem má však i celou řadu nežádoucích, mnohdy i život ohrožujících komplikací, zejména vznik tromboembolických příhod nebo karcinom endometria. Chlorderivát tymoxifenu Loremifen (FarestonTM) působí analogicky, avšak jeho účinek je ještě silnější (a to i co se negativních účinků týče). Raloxifen (Evista) má estrogenní účinek na kost a antiestrogenní účinek na dělohu a prsy. Používá se k prevenci osteoporózy u žen po menopauze. Je také stejně účinný jako tamoxifen při snižování výskytu rakoviny prsu u některých vysoce rizikových skupin žen, riziko vedlejších účinků je u raloxigenu ve srovnání s tamoxifenem snížené. 169 Mezi tzv. selektivní deregulátory estrogenních receptorů patří např. antiestrogen fulvestrant (FaslodexTM), který bývá indikován k léčbě metastazujícího karcinomu prsu. Obrázek 127. Antiestrogeny. 7.13.2. Hormonální léčba zhoubných i nezhoubných nádorů prostaty Androgeny jsou mužské pohlavní steroidní hormony vznikající ve velké míře ve varlatech (85–90%) a také v kůře nadledvin (10–15%). Jsou zodpovědné za vývoj i růst pohlavních orgánů a také vývoj sekundárních pohlavních znaků během puberty. Do skupiny androgenů patří testosteron a dihydrotestosteron (DHT), který vzniká z testosteronu účinkem enzymu 5--reduktasy (Schéma 77). Schéma 77. Redukce testosteronu 5α-reduktasou. V buňkách prostaty jsou přítomny tzv. androgenní receptory (AR), které mohou být aktivovány testosteronem nebo DHT. S přibývajícím věkem zůstává hladina dihydrotestosteronu (DHT) normální, avšak po 60. roce postupně přibývá množství estrogenů. Existuje hypotéza, že pod vlivem estrogenů jsou ve zvýšené míře exprimovány receptory pro DHT a dochází tak ke stimulaci růstu prostaty. Ke zbytnění tkáně prostaty 170 může dojít v centrální části (tzv. benigní hyperplazie prostaty, BHP) nebo v periferní části (zpravidla maligní nádor). Androgenní receptory jsou přítomny i v nádorových buňkách, proto je nádor androgeny stimulován k růstu. Existují však látky – antiandrogeny – antagonisté androgenního receptoru schopné navázat se na androgenní receptor a zabránit tak navázání testosteronu a dihydrotestosteronu. Klíčovou roli v chemoterapii nádoru prostaty hraje také enzym 5-α-reduktasa, který redukuje dvojnou vazbu v testosteronu za vzniku dihydrotestosteronu. Inhibice 5--reduktasy pak snižuje hladinu DHT a v důsledku jeho inhibice přestává prostata růst. Antiandrogeny můžeme rozdělit do dvou skupin: (a) steroidní antiandrogeny odvozené od gestagenů (cyproteron acetát) a (b) nesteroidní antiandrogeny – flutamid (FlucinomTM, EulexinTM), bicalutamid (CasodexTM) a nilutamid (AnandronTM). Obrázek 128. Antiandrogeny. 5-α-Reduktasu lze inhibovat např. dusíkatým analogem androsteronu finasteridem (EulexidTM, ProscarTM) používaným k léčbě BHP. Objev finasteridu vychází z pozorování dětí s intersexuální poruchou, které anatomicky vykazovali znaky obou pohlaví. V roce 1974 J. Imperato-McGinely prezentovala na konferenci o novorozeneckých defektech výsledky studie dětí, které zpočátku života vyrůstaly jako děvčata, avšak se začátkem puberty došlo k nárůstu mužského zevního genitálu a projevům dalších mužských charakteristik. Bylo zjištěno, že tyto děti vykazují genetickou mutaci způsobenou nedostatkem enzymu 5--reduktasy, což vede k nedostatku dihydrotestosteronu. Byla u nich pozorována menší prostata a také další jev – menší sklon k plešatosti. Na základě těchto poznatků pak byla navržena látka, dusíkatý analog androsteronu, která by mohla mimikovat jev pozorovaný u dětí a sloužit tak k léčbě starších mužů trpících benigní hyperplazií prostaty. Finasterid je rovněž používán k léčbě alopecie. Obrázek 129. Inhibitor 5α-reduktasy. 171 Při léčbě BHP se uplatňují také léčiva působící jiným mechanizmem jako α-blokátory, anticholinergika (spasmolytický účinek na svalovinu močového měchýře), inhibitory 5fosfodiesterasy (PDE5) a fytoterapeutika. 172 8. Literatura 1. Molecular Basis of Drug Design and Resistance, Volume 114, Parts 5-6, 1997, Cambridge university press. edited by Leslie H. Chappell, Graham H. Coombs, S. L. Croft. 2. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2002). Molecular Biology of the Cell. Garland Science. ISBN 0-8153-3218-1. 3. Holý A.: Principy bioorganické chemie ve vývoji antivirotik a cytostatik, Univerzita Palackého v Olomouci, Olomouc 2004. 4. Blackburn, G.M. et al: Nucleic acids in chemismy and biology, The Royal Society of Chemistry, Cambridge 2006. 5. (a) Watson JD, Crick FH (1953). "A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid" (PDF). Nature 171 (4356): 737–738. Bibcode:1953Natur.171..737W. doi:10.1038/171737a0. PMID 13054692. (b) Crick, F (August 1970). "Central dogma of molecular biology.". Nature 227 (5258): 561–3. Bibcode:1970Natur.227..561C. doi:10.1038/227561a0. PMID 4913914. (c) Hoogsteen K (1963). "The crystal and molecular structure of a hydrogen-bonded complex between 1-methylthymine and 9-methyladenine". Acta Crystallographica 16: 907– 916. doi:10.1107/S0365110X63002437. (d) Crick F (1966). "Codon–anticodon pairing: the wobble hypothesis". J Mol Biol 19 (2): 548–55. doi:10.1016/S0022-2836(66)80022-0. PMID 5969078. 6. Luis P. Villarreal, Victor R. DeFilippis, J. Virol. August 2000 vol. 74 no. 15 7079-7084 7. Forterre P, Filée J, Myllykallio H. Origin and Evolution of DNA and DNA Replication Machineries. In: Madame Curie Bioscience Database [Internet]. Austin (TX): Landes Bioscience; 2000-. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6360/ 8.Katerina Gurova Future Oncol. 2009 December ; 5(10): 1685. doi:10.2217/fon.09.127. 9. Rajski, S. R.; Williams, R. M. Chem. Rev. 1998, 98 (8), 2723-2795. 10. (a) Lozano, R (2012-12-15). "Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.". Lancet 380 (9859): 2095–128. doi:10.1016/S0140-6736(12)617280. PMID 23245604. (b) Ryan KJ, Ray CG (editors), ed. (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed.). McGraw Hill. pp. 551–2. ISBN 0838585299. (c) Gravitz L. (2011). "A smouldering public-health crisis". Nature 474 (7350): S2–4. doi:10.1038/474S2a. PMID 21666731. (d) "Hepatitis C“. World Health Organization (WHO). June 2011. Retrieved 2011-07-13. 11. Lehninger Principles of Biochemistry sixth edition: Nelson L. D., Cox M. M. Macmillan Higher Education, International edition, Basingstoke, England. 173 RNDr. Lucie Brulíková, Ph.D. RNDr. Milan Urban, Ph.D. Kapitoly z bioorganické chemie Výkonná redaktorka prof. PaedDr. Libuše Ludíková, CSc. Odpovědná redaktorka Vendula Drozdová Technická redakce autor Grafické zpracování obálky Jiří Jurečka Publikace ve vydavatelství neprošla technickou ani jazykovou redakční úpravou. Vydala a vytiskla Univerzita Palackého v Olomouci Křížkovského 8, 771 47 Olomouc www.vydavatelstvi.upol.cz www.e-shop.upol.cz [email protected] 1. vydání Olomouc 2015 Ediční řada – Skripta ISBN 978-80-244-4543-4 Neprodejná publikace vup 2015/0171
Podobné dokumenty
2. - Základy biochemie
5. Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym:
orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatní...
Protiinfekční a protiinvazní látky.
Paul Ehrlich (14. 3. 1854 - 20. 8. 1915)
zakladatel moderní chemoterapie
Publikačná činnosť autora TUČEK, M
[1] PINYAYEV, T. S., SELISKAR, C. J., HEINEMAN, W. R. Fluorescence spectroelectrochemical
sensor for 1-hydroxypyrene. In Analytical Chemistry, ISSN 0003-2700. 2010, 82, 23, s. 97439748.
[1] ROCKETT...
Úvod do chemie léčiv
Boj s nemocemi však nekončí ani v 21. století. Objevují se nové (AIDS, legionářská nemoc aj.),
bakterie a viry, ale i nádorové buňky získávají rezistenci na léčiva. Se stárnutím populace se dříve v...
Fertility Blend Klinická studie
Graf 2. – Počet dní s bazální teplotou nad 37 °C(98 °F) v tabulce bazální teploty.
U žen s kratšími cykly ve skupině FB (< 27 dní, N=15 u skupiny FB a N=9 u skupiny P) došlo k signifikantnímu prodl...
Téma 14 - Excerpta z teoretické chemie
samozřejmě také v chemii je třeba řešit problematiku univerzální, také případy s neurčitě
definovaným prostředím a s nepředpokládanými změnami. Postupně byla pravidla upravována,
doplňována, systém...
4. Inhibitory viru HIV - Biotrend
• Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Science, New York, 5th edition, 2008
Otiskovací hmoty - Ústav lékařské biochemie
(C) Ústav lékařské biochemie 1.LF UK, a Výzkumný ústav stomatologický v Praze
Diagnostika, klasifikace a léčba monoklonálních gamapatií
nejsou patrné. Komprese všech obratlových těl hrudní páteře se snížením jejich výšky
zejména ventrálně a ve středních částech. Nalézáme tzv. rybí obratle.Tyto změny jsou
důsledkem kostního postižen...
