Filip Vaníček

STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST
Modelování interakcí signálních lipidů s cytochromy P450 5A1
a 8A1
Filip Vaníček
STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST
Obor SOČ: 03 chemie
Modelování interakcí signálních lipidů s cytochromy P450 5A1 a 8A1
Autor: Filip Vaníček
Škola: Masarykova střední škola zemědělská a Vyšší odborná škola, Opava
Kraj: Moravskoslezský kraj
Konzultanti: Mgr. Tereza Hendrychová, Ph.D.
RNDr. Karel Berka, Ph.D.
Mgr. Veronika Navrátilová
Prof. RNDr. Michal Otyepka, Ph.D.
Opava 2015
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem práci SOČ vypracoval samostatně pod vedením RNDr. Karla Berky, Ph.D.
a Mgr. Veroniky Navrátilové. Práce mi byla umožněna prof. RNDr. Michalem Otyepkou, Ph.D.
a Mgr. Terezou Hendrychovou, Ph.D.. V práci jsem použil pouze podklady (literaturu, SW, atd.)
uvedené v přiloženém seznamu.
Dále prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce SOČ jsou shodné.
Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb.,
o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů
(autorský zákon) v platném znění.
V ................... dne ..................
podpis:........................................................
Poděkování.
Děkuji všem konzultantům a především RNDr. Karlu Berkovi, Ph.D. za obětavou pomoc
a velmi užitečné připomínky, které mi během práce poskytoval.
ANOTACE
Působení cytochromů v lidském organismu, a nejen v něm, je úžasné. Nejsou jen příčinou pouhé
přeměny tělu cizorodých látek na látky, které je tělo schopno vyloučit, ale také zodpovídají
za syntézu steroidních hormonů, a dalších látek, které člověk potřebuje k životu. Tato práce má
pomoct objasnit, proč dochází ke vzniku signálních lipidů - látek, které jsou zodpovědné
například za mrtvici, za vznik sraženin v krevním oběhu nebo za zastavení krvácení.
Klíčová slova: Cytochromy P450, thromboxan, prostaglandin, prostacyklin, signální lipidy,
enzymy, molekulové dokování, homologní modelování
Modelování interakcí signálních lipidů s cytochromy P450 5A1 a 8A1
ABSTRAKT ................................................................................................................................................................. 6
CÍL PRÁCE .................................................................................................................................................................. 7
1. ÚVOD ...................................................................................................................................................................... 8
2. TEORETICKÁ ČÁST ..................................................................................................................................................10
2.1 CYTOCHROMY P450..........................................................................................................................................10
2.1.1 Cytochrom P450 5A1 ................................................................................................................................10
2.1.2 Mechanismus tvorby thromboxanu A2 v CYP5A1.................................................................................................... 12
2.1.3 Cytochrom P450 8A1 ................................................................................................................................13
2.1.4 Mechanismus tvorby prostacyklinu v CYP8A1 ........................................................................................................ 14
2.2 LIGANDY .............................................................................................................................................................15
2.2.1 Thromboxan A2 .........................................................................................................................................15
2.2.2 Prostaglandin I2 ........................................................................................................................................15
2.2.3 Prostaglandin H2 .......................................................................................................................................16
2.3 POUŽITÉ METODY.............................................................................................................................................17
2.3.1 Dokování ..................................................................................................................................................17
2.3.2 Homologní modelování .............................................................................................................................17
3. PRAKTICKÁ ČÁST ....................................................................................................................................................18
3.1 METODY .............................................................................................................................................................18
3.1.1 Homologní modelování CYP5A1 ................................................................................................................18
3.1.2 Dokování prostaglandinu H2 do cytochromu P450 5A1 ..............................................................................20
3.1.3 Dokování prostaglandinu H2 do cytochromu P450 8A1 ..............................................................................23
4. VÝSLEDKY A DISKUZE .............................................................................................................................................25
4.1 HOMOLOGNÍ MODEL .............................................................................................................................................25
4.2 ROZDÍL MEZI VNITŘNÍ STRUKTUROU CYP5A1 A 8A1 .....................................................................................................25
4.3 DOKOVÁNÍ PROSTAGLANDINU H2 DO CYTOCHROMU P450 5A1 A 8A1. ..............................................................................27
4.4 ZÁVĚR DISKUZE .....................................................................................................................................................28
5. ZÁVĚR ....................................................................................................................................................................29
6. SEZNAM ZKRATEK ..................................................................................................................................................30
7. CITACE....................................................................................................................................................................31
8. SEZNAM OBRÁZKŮ.................................................................................................................................................34
Abstrakt
V lidském těle existuje 56 různých typů speciálních enzymů - cytochromů P450, které katalyzují
mnoho reakcí počínaje metabolismem léčiv, až po syntézu cholesterolu, steroidních hormonů a
jiných signálních lipidů. Mezi látky zpracovávané jednotlivými zástupci cytochromů P450 patří
různá xenobiotika, neboli látky tělu nevlastní, i látky tělu vlastní, jako jsou třeba signální lipidy,
mezi které spadají prostacykliny a thromboxany. Prostacykliny s thromboxany jsou odpovědné za
regulaci průtoku krve cévami. Zatímco thromboxan A2 je zodpovědný za zužování cév, jeho
protějšek prostacyklin je zodpovědný za jejich rozšiřování. Zajímavé je, že oba tyto signální lipidy
jsou produkovány příbuznými cytochromy P450 ze stejné původní látky – prostaglandin H2. V
prvním případě je za tvorbu thromboxanu A2 odpovědný cytochrom P450 5A1, zatímco
prostacyklin (prostaglandin I2) produkuje cytochrom P450 8A1.
Otázkou je, jak to dělají a jak by se rovnováha mezi těmito signálními lipidy dala upravit například
pro léčbu infarktů. Tato práce se proto zaměřuje na studium struktury lidských cytochromů P450
5A1 a 8A1 a jejich interakce se signálními lipidy.
6
Cíl práce
Cílem této práce je studium struktury lidských cytochromů 5A1 a 8A1 a objasnění toho, jakým
způsobem s těmito cytochromy interaguje prostaglandin H2. Práce se zaměřuje na studium
odlišnosti způsobů, kterými cytochromy ovlivňují jeho výslednou podobu a jak velkou roli v tomto
procesu hraje vnitřní struktura enzymu.
7
1. ÚVOD
Cytochromy P450 (CYP) hrají přední roli v metabolismu cizorodých i tělu vlastních látek
u eukaryotických a prokaryotických buněk. Tyto cytochromy se tedy nenachází jen v těle člověka,
ale i v těle zajíce, ryby, rostlin a dokonce i u bakterií [1,2]. CYP jsou monooxygenázy – enzymy ze
skupiny oxidoreduktáz katalyzující vstup jednoho atomu molekulárního kyslíku do substrátu. CYP
katalyzují mnoho reakcí zahrnujících metabolismus léčiv, syntézu cholesterolu, steroidů a jiných
lipidů. Způsob, jakým CYP pohlcují a oxidují různé látky stále zůstává velmi zajímavým tématem
biochemie. Aktivní místo enzymu, ve kterém dochází k reakci, je skryto hluboko uvnitř a je možno
se k němu dostat na základě přístupových kanálů neboli tunelů. Poté, co ligand podstoupí přeměnu,
v aktivním místě, za účasti cytochromu, přemění se na polárnější látku, kterou je tělo schopno
vyloučit a nedochází tak k hromadění nežádoucích látek [1,3,4].
Mezi látky, které cytochromy P450 zpracovávají, se řadí signální lipidy, které zahrnují thromboxany
a prostacykliny. Udržování rovnováhy mezi thromboxany a prostacykliny je v těle důležité zejména
proto, že tyto dva tzv. eikosanoidy1 vyvíjejí protichůdné účinky. Jak prostacykliny, tak thromboxany
jsou připravovány ze stejné původní látky – z prostaglandinu H2. Za tvorbu thromboxanu A2 je
odpovědný cytochrom P450 5A1 (CYP5A1), zatímco prostacyklin (prostaglandin I2) je produkován
cytochromem P450 8A1 (CYP8A1):
·
CYP5A1 může modulovat množství vyrobených thromboxanů A2 (TXA2). Tato modulace
se poté stává důležitým faktorem v mnoha procesech jako je regulace krevního tlaku či
srážení krve. Thromboxany A2 jsou zodpovědné za stahování cév (vazokonstrikci).
·
CYP8A1 moduluje množství vyrobených prostacyklinů (PGI2). Ty jsou zodpovědné naopak
za roztahování cév (vazodilataci).
Nerovnováha mezi prostacykliny a thromboxany se může projevovat mnoha patologickými stavy,
jako je například plicní hypertenze. Vzhledem k tomu, že thromboxany hrají roli ve vazokonstrikci
a seskupování krevních destiček, může jejich dominance narušit cévní homeostázu 2 a způsobit
vznik sraženin v oběhovém systému. Kromě toho, důležitost thromboxanů a jejich syntézy dokládá
zjištění, že pacienti, jejichž krevní destičky nebyly schopné reagovat na TXA2, měli četné
hemostatické vady a nedostatek krevních destiček schopných reagovat na TXA2 vedl ke krvácivým
poruchám. Nerovnováha mezi prostacyklinem a jeho antagonistou thromboxanem A2 přispívá
k rozvoji infarktu, mrtvice a aterosklerózy [4,7-9].
1
Eikosanoidy jsou metabolity mastných kyselin o délce 20 uhlíků. Řadí se mezi ně prostaglandiny a jiné signální lipidy.
Eikosanoidy jsou zodpovědné za buněčnou signalizaci, která ovlivňuje svalovou kontrakci, bolest či například zánět [5].
2
Homeostáze znamená udržování nějaké hodnoty na stejné úrovni, pokud se změní podmínky, homeostáze udrží
požadovanou hodnotu. U člověka je to například udržování stále teploty těla nebo jiných podmínek, které mají vliv na
samotnou existenci [6].
8
Obrázek 1 – Přeměna prostaglandinu H2 na TXA2 prostřednictvím CYP5A1 a na PGI2
prostřednictvím CYP8A1. Dle ref. [10].
9
2. TEORETICKÁ ČÁST
2.1 CYTOCHROMY P450
2.1.1 Cytochrom P450 5A1
Cytochromy P450 jsou enzymy, které nesou aktivní hemovou skupinu zakotvenou hluboko ve své
struktuře. Tyto enzymy hrají významnou roli při metabolismu xenobiotik, tím, že je oxidují
na polárnější látky, které je možné snadněji vyloučit z těla [1].
Cytochromy P450 rodiny CYP5 mají u člověka jediného zástupce – cytochrom P450 5A1
(CYP5A1) nebo se také užívá jiný název - „thromboxan A2 syntáza“(zkráceně TBXAS1, taky
známa jako TS; TXS; CYP5; TXAS).
Tento protein je považován za člena rodiny P450 spíše z důvodu podobnosti sekvence k ostatním
cytochromům, než z hlediska funkční podobnosti. Většina CYPů potřebuje proteinového partnera
k tomu, aby dodal jeden či více elektronů k redukci reaktivního železa v hemu v aktivním místě.
CYP5A1 (a ani CYP8A1) nepotřebuje externího proteinového partnera, který by dodával elektrony.
Výsledkem není u CYP typická reakce - monooxygenace, ale izomerizace prostaglandinu H2 [4,14].
CYP5A1 katalyzuje přestavbu prostanglandinu H2 na thromboxane A2, který je velmi důležitý
při vazokonstrikci (tj. proces při kterém dochází k zúžení cév, zejména tepen a žil, při krvácení)
a také při procesu shlukování krevních destiček (tzv. trombů). Enzym tedy hraje roli v několika
procesech zahrnujících zastavení krvácení, kardiovaskulární nemoci a mrtvici. Používají se také
inhibitory CYP5A1, které jsou používány jako léčiva napomáhající průtoku krve, působí proti
shlukování krevních destiček, a tím předcházejí vzniků trombů a tedy předcházejí infarktu [11,12].
Lidská thromboxan A syntáza je protein s 533 aminokyselinami a hemovou prostetickou skupinou.
Tento enzym, ukotvený v endoplasmatickém retikulu, se nachází i v trombocytech, monocytech a
několika dalších typech buněk. NH2 konec obsahuje dva hydrofobní segmenty, jejichž sekundární
struktura je považována za helikální. Důkazy naznačují, že tyto peptidické sekvence slouží jako
membránová kotva pro enzym [13]. Podobně jako u ostatních členů rodiny cytochromu P450,
thromboxan A syntáza má hemovou skupinu koordinovanou na thiolátovou skupinu náležící
cysteinovému residuu (zbytku) s pořadovým číslem v řetězci 480 [4,14].
10
Obrázek 2 – Hemová skupina koordinovaná na thiolátovou skupinu uvnitř cysteinu s pořadovým
číslem 480.
Naneštěstí je zřejmě velmi obtížné získat krystalovou strukturu TXA2 syntázy, neboť zatím není
oproti jiným CYP k dispozici. A proto bylo zapotřebí ke studiu CYP5A1 vyrobit 3D homologní
model na základě podobnosti k již známým krystalovým strukturám (např. CYP3A4).
Obrázek 3 – model CYP5A1 s transmembránovou kotvou. CYP5A1 je zobrazen v tzv. reprezentaci
cartoon, hemová skupina jako tyčinky. Transmembránová kotva je tvořena helixem na N-koncové
části struktury, zde je vybarvena tmavě modrou barvou. Uniprot ID: P24557
11
2.1.2 Mechanismus tvorby thromboxanu A2 v CYP5A1
Thromboxane A je derivát molekuly prostaglandinu H2 (PGH2). Hemová skupina v aktivním místě
TBXA syntázy hraje velmi důležitou roli. Izomerizační mechanismus ukazuje prostaglandin H2
přeměňující se na thromboxan A2. Studiemi bylo zjištěno, že navázání substrátu na aktivní místo
probíhá ve dvou krocích. Prvně je tady rychlá vazba na protein a následné navázání na železo
v hemové skupině. Následně dochází k přesmyku kyslíků dovnitř molekuly [4].
Obrázek 4 – Mechanismus přeměny prostaglandinu H2 na thromboxane A2 v aktivním
místě CYP5A1. Je zde znázorněn izomerizační mechanismus viditelný jako přesmyk kyslíků
dovnitř struktury. Železo se váže na kyslík blíže postrannímu řetězci s kaboxylovým zakončením.
CYP5A1 je znázorněn pomocí železa hemového kofaktoru, vázaným na atom síry uvnitř
aminokyseliny cysteinu 480. R1 je řetězec s karboxylovým zakončením. R2 je řetězec s postraní
hydroxylovou skupinou. Dle ref. [15].
12
2.1.3 Cytochrom P450 8A1
Cytochrom P450 8A1 (CYP8A1) známý také jako Prostaglandin-I syntáza, prostaglandin I2
(prostacyklin) syntáza (také PTGIS, PGIS), je zařazen do této rodiny P450 spíše z důvodu
podobnosti řetězce než z hlediska funkční podobnosti a to proto, že mnoho CYP potřebuje
proteinového partnera k tomu dodat jeden či více elektronů k redukci železa na hemovém
kofaktoru, (a eventuálně molekulárního kyslíku), ale cytochrom 5A1 a 8A1 nepotřebuje externího
proteinového partnera, který by dodával elektrony, tím pádem jsou reakce rozdílné, jde pouze
o izomerizaci ligandu.
Tento protein ukotvený v endoplasmatickém retikulu katalyzuje přeměnu prostaglandinu H2
na prostacyklin (PGI2), potenciální „vasodilátor“a inhibitor srážení krve. Narozdíl od většiny CYP
enzymů, CYP8A1 nepotřebuje molekulární kyslík. Místo toho používá hemový kofaktor
na katalýzu izomerace prostaglandinu H2 na prostacyklin [1,8].
Obrázek 5 - CYP8A1 s transmembránovou kotvou. CYP8A1 je zobrazen v tzv. reprezentaci cartoon,
hemová skupina jako tyčinky. Transmembránová kotva je tvořena helixem na N-koncové části
struktury, zde je vybarvena tmavě modrou barvou. PDB ID: 2IAG – upraveno.
13
2.1.4 Mechanismus tvorby prostacyklinu v CYP8A1
Prostacyklin je derivát molekuly PGH2, k jeho izomerizaci dochází prostřednictvím železa
na hemovém kofaktoru, kde se železo váže na kyslík blíže postrannímu řetězci s hydroxylovou
skupinou uprostřed.
Obrázek 6 – Mechanismus přeměny prostaglandinu H2 na prostacyklin v aktivním místě CYP8A1.
Železo se váže na kyslík blíže postrannímu řetězci s hydroxylovou skupinou uprostřed. R3 je řetězec
zakončený karboxylem. R4 je řetězec s hydroxylovou skupinou uprostřed. Dle ref. [16].
Obrázek 7 – Ukázka vazby v jednotlivých cytochromech P450 5A1 a 8A1. V případě CYP8A1
(PGI-synthase) vlivem deformace, uvnitř aktivního místa, interaguje železo s kyslíkem blíže
hydroxylu. U CYP5A1 (TxA-synthase) železo interaguje s kyslíkem blíže karboxylovému
zakončení postranního řetězce. Dle ref. [17].
14
2.2 Ligandy
2.2.1 Thromboxan A2
Thromboxan A2 (TXA2) je produkován aktivními destičkami a má prothrombotické vlastnosti,
stimuluje aktivitu nových destiček stejně dobře, jako zvyšuje jejich schopnost shlukovat se. Je znám
jako vasokonstriktor a je speciálně důležitý během poškození tkáně a zánětu. TXA2 je velmi
nestabilní ve vodném roztoku a má velmi krátký poločas rozpadu [9].
Obrázek 8 - Thromboxan A2. Dle ref. [18].
2.2.2 Prostaglandin I2
Prostaglandin I2 (prostacyklin – PGI2) je člen rodiny molekul tuků známých jako eikosanoidy.
Inhibuje shlukování krevních destiček a je taky efektivní vasodilatátor (roztahuje cévy). Je znám
jako léčivo – epoprostenol.
Jeho význam je v tom, že zabraňuje krevním destičkám srážet se. Prostacyklin pracuje v kontrastu
s jiným eikosanoidem thromboxanem A2, který se účastní opačného procesu, kterým je
vazokonstrikce [7].
Obrázek 9 – Prostacyklin I2. Dle ref. [19].
15
2.2.3 Prostaglandin H2
Prostaglandin H2 je typ prostaglandinu, derivát arachidonové kyseliny a prekurzor pro mnoho
biologicky důležitých molekul [20].
Obrázek 10 – Prostaglandin H2. Dle ref. [21].
Obrázek 11 – Přeměna prostaglandinu H2 na PGI2 a TXA2. Přeměna původní látky – kyseliny
arachidonové ze které jsou odvozeny leukotrieny a prostaglandiny. Prostaglandin H2 je přeměňován
na velké množství látek, které zahrnují i přeměnu na thromboxany a prostacykliny za účasti
CYP5A1 (pro thromboxany) a CYP8A1 (pro prostacykliny). Dle ref. [22].
16
2.3 POUŽITÉ METODY
2.3.1 Dokování
Metoda automatického dokování pomáhá určit, jak spolu budou interagovat 2 molekuly díky tomu,
že najde vhodnou pozici, jak do sebe budou „zapadat“. Pokud taková pozice existuje, tak systém
vyhledá nejvhodnější pozici v závislosti na energii, počtu nevazebných interakcí, apod. Výsledné
pozice jsou systémem hodnoceny jako přijatelné, avšak závisí na lidském faktoru, který by měl
všechno ve výsledku zhodnotit [23].
2.3.2 Homologní modelování
Tato metoda je založena na porovnání již známých struktur proteinů se strukturou proteinu, jehož
terciální struktura je neznámá. Slouží k vytvoření struktury CYP, u něhož nelze struktura zjistit
pomocí rentgenové krystalografie 3 . Homologní model CYP je vytvořen na základě znalosti
struktury CYP se známou krystalovou strukturou (obsaženou v PDB databází), a s co nejvyšší
sekvenční podobností. Homologenní modelování lze použít pouze v případě, pokud je sekvence
templátu a cílová sekvence identická minimálně z 30%, pokud je nižší, tak jsou vytvořené modely
většinou nekvalitní a nelze s nimi pracovat [24,25].
Pokud víme, jaká je sekvence, a jak po sobě následují jednotlivé aminokyseliny, pak jsme schopni
vytvořit strukturu neznámého cytochromu na základě již známé struktury. V tomto případě se jedná
o sekvenci CYP5A1.
Obrázek 12 - Aminokyselinová sekvence použitá pro homologní modelování CYP5A1. Uniprot ID:
P24557
3
Rentgenová krystalografie je metoda, pomocí které se získává prostorová struktura proteinu [26].
17
3. PRAKTICKÁ ČÁST
3.1 Metody
3.1.1 Homologní modelování CYP5A1
Vzhledem k tomu, že neexistuje známá struktura cytochromu P450 5A1, který by byl získán
pomocí rentgenové krystalografie, bylo nutné vytvořit homologenní model podle již známé
struktury cytochromu 3A4 (PDB ID: 1TQN). Naštěstí je známa aminokyselinová sekvence
cytochromu P450 5A1 (UNIPROT ID=P24557), takže není tak těžké vymodelovat její prostorovou
strukturu.
Vymodelování struktury probíhalo v programu Chimera (verze 1.8.1). Tento program slouží
k analýze 3D struktur, k vytváření homologních modelů, i k předělávání již existujících struktur.
Pro vymodelování struktury v programu Chimera (verze 1.8.1) byla jako předloha použita již známá
struktura CYP3A4 (PDB ID: 1TQN). Na obrázku níže lze vidět, jakým způsobem program
vyhodnocuje podobnost sekvence CYP3A4 a CYP5A1 (pomocí sekvenčního alignmentu).
Obrázek 13 – Modelování na základě podobnosti sekvence CYP3A4 a CYP5A1. CYP3A4 je
označen jako 1tqn.pdb (dle pdb) a CYP5A1 je označen jako P24557 (dle databáze uniprot).
18
Obrázek 14 – Naalignované struktury CYP3A4 a CYP5A1 po vytvoření v programu chimera 1.8.1.
CYP5A1 je zobrazen žlutě, CYP3A4 je zobrazen červeně.
19
3.1.2 Dokování prostaglandinu H2 do cytochromu P450 5A1
Na obrázku níže je zobrazeno nadokování prostaglandinu H2 do CYP 5A1.
Aby bylo možné nadokovat ligand dovnitř struktury, je třeba, aby uvnitř struktury byla prázdná
kavita, tj. určitý prostor, do kterého se vejde molekula ligandu.
Obrázek 15 – Zobrazení kavity s prostaglandinem H2 nad aktivním místem HEMu a v okolí
CYP5A1. Je důležité povšimnout si volného prostoru nad HEMem a v okolí prostaglandinu H2,
nenalézají se zde žádné aminokyseliny, které by bránily úspěšně reakci.
20
Dokovací program vyhodnotí několik možností, jak by mohl být ligand uvnitř molekuly stočený,
abychom získali kýžený výsledek, v podobě nejideálnější pozice ligandu, tak je důležité vyhodnotit
faktory jako je vzdálenost aktivního místa HEMU s reagujícím místem ligandu, kterým jsou kyslíky
na cyklickém řetězci uprostřed molekuly, nebo interakce ligandu s dalšími aminokyselinami v okolí.
Obrázek 16 – Nadokovaný prostaglandin H2 nad aktivním místem uvnitř cytochromu 5A1.
Je ideálně stočený a v takové blízkosti, aby mohl interagovat se železem na hemovém kofaktoru.
21
Program byl nastaven, aby poskytl 20 výsledků, jak u CYP5A1 tak u CYP8A1. 20 výsledků je
dostačující počet na to, aby se dal stanovit závěr.
V případě CYP5A1 jsem vyhodnotil velké množství pozic jako nevyhovující, protože reakční místo
ligandu, tj. cyklický okruh s dvěma kyslíky uprostřed molekuly (reagujícím je kyslík blíže řetězci
s karboxylovým zakončením), nebyl v takové blízkosti aktivního místa HEMU (železo uprostřed),
aby byl schopen s ním reagovat a zároveň byl nevhodně stočen (např. řetězec s karboxylem byl
u aktivního místa, apod.)
Obrázek 17 – Nevhodná orientace prostaglandinu H2 uvnitř cytochromu 5A1. Prostaglandin H2 není
v ideální vzdálenosti ani v ideální orientaci, aby mohl reagovat.
22
3.1.3 Dokování prostaglandinu H2 do cytochromu P450 8A1
V případě CYP8A1 jsem vyhodnotil 18 pozic z 20 jako nevyhovující, protože molekula nebyla
schopna vhodné orientace, ve které jí bránil tryptofan 282. Pouze 2 pozice se projevily jako vhodné,
ale molekula prostaglandinu H2 byla značně deformována. Postraní řetězce se rozjížděly do strany.
Obrázek 18 - Dokování PGH2 do CYP8A1. PGH2 je stočen k aktivnímu místu ve vzdálenosti,
ve které může interagovat s železem. Jeho postranní řetězce jsou deformovány do stran vlivem
tryptofanu 282.
23
Vnitřní kavita u cytochromu P450 8A1 je velmi těsná. Je to zapříčiněno stavbou proteinu,
především tryptofanem 282, který se nalézá přímo nad aktivním místem. Tryptofan 282 donutí
molekulu prostaglandinu H2 roztáhnout své řetězce do strany, což zapříčiní stočení molekuly
a prostaglandin H2 interaguje pomocí kyslíku, který je blíže postrannímu řetězci s hydroxylovou
skupinou uprostřed.
Obrázek 19 – Zobrazení kavity s prostaglandinem H2 nad aktivním místem HEMu a v okolí
CYP8A1. Je důležité si povšimnout, jak je prostaglandin H2 vlivem malého prostoru v okolí HEMu
deformován a jak tryptofan 282 nalezající se nad aktivním místem HEMu tlačí na molekulu
prostaglandinu H2.
24
4. Výsledky a diskuze
4.1 Homologní model
Byl vytvořen homologní model na základě již známé struktury CYP3A4. Model 5A1 neměl velkou
shodnost sekvence vůči ostatním cytochromům P450, a proto jsme vybrali CYP3A4, jelikož
sekvence měla větší procento shody, než v případě ostatních cytochromů. Vyhotovený model byl
použit k nadokování prostaglandinu H2.
4.2 Rozdíl mezi vnitřní strukturou CYP5A1 a 8A1
Obrázky byly vytvořeny zarovnáním struktur CYP5A1 a CYP8A1 na sebe. Je zobrazena kavita
obou HEMů ze stejné vzdálenosti od aktivního místa a ze stejného úhlu pohledu.
Je možné si povšimnout zásadně odlišného tvaru kavity aktivního místa mezi jednotlivými CYPy,
které zřejmě řídí rozlišnou specifitu těchto cytochromů.
25
Obrázek 20 – Kavita CYP5A1. Je důležité všimnout si, jak rozlehlá je kavita nad aktivním místem
HEMu.
Obrázek 21 – Kavita CYP8A1. Je důležité všimnout si, jak je prostor blokován zejména
tryptofanem 282.
26
4.3 Dokování prostaglandinu H2 do cytochromu P450 5A1 a 8A1.
(10 z 20)
Vzdálenost aktivního místa HEMu
Vzdálenost aktivního místa HEMu
v CYP5A1 (V angströmech)
v CYP8A1 (V angströmech)
Od aktivního
Od neaktivního
Od aktivního
Od neaktivního
kyslíku PGH2
kyslíku PGH2
kyslíku PGH2
kyslíku PGH2
1
4
3,4
4,1
5,4
2
4,2
4,5
4,1
5,2
3
4,6
5,6
8,8*
9,8*
4
4,7
5,8
8,8*
9,5*
5
5,2*
5,1*
9*
9,8*
6
5,4*
4,5*
9,2*
9,9*
7
5,4*
5,1*
9,8*
10,4*
8
6,2*
7,5*
9,9*
10*
9
6,6*
7,6*
9,9*
9,8*
10
6,7*
6,2*
9,9*
10,6*
(1 angström = 10-10 m)
V tabulce lze vidět vzdálenost aktivního místa hemové skupiny a aktivního kyslíku prostaglandinu
H2. Aktivním (ovlivňovaným) kyslíkem prostaglandinu H2 je uvnitř CYP5A1 kyslík blíže řetězci
zakončenému karboxylovou skupinou a uvnitř CYP8A1 je to kyslík blíže řetězci s hydroxylovou
skupinou uprostřed. Aktivním místem v HEMu je železo koordinované na thiolátovou skupinu.
Zeleně jsou v tabulce označeny výsledky, kde vzdálenost dokládá tvrzení, že HEMová skupina je
schopna působit na aktivní kyslík v prostaglandinu H2, příslušící danému cytochromu P450 5A1,
nebo 8A1. Hvězdičkou (*) jsou označeny výsledky, u kterých lze polemizovat o tom, jestli v takové
vzdálenosti dochází k interakci.
27
4.4 Závěr diskuze
Ze vzdáleností aktivního místa ligandu s aktivním místem HEMu se dá usuzovat, že cytochrom 5A1
působí na kyslík blíže řetězci s karboxylovým zakončením narozdíl od cytochromu 8A1,
který působí na kyslík blíže řetězci s hydroxylem.
Znalost aktivního místa obou cytochromů do budoucna umožní navrhovat látky, které budou
selektivně ovlivňovat jednotlivé cytochromy P450 a tím nám umožní modulovat účinky těchto
enzymů.
Obrázek 7 – Ukázka vazby v jednotlivých cytochromech P450 5A1 a 8A1. V případě CYP8A1
(PGI-synthase) vlivem deformace, uvnitř aktivního místa, interaguje železo s kyslíkem blíže
hydroxylu. U CYP5A1 (TxA-synthase) železo interaguje s kyslíkem blíže karboxylovému
zakončení postranního řetězce. Mezi karboxylovým zakončením prostaglandinů a aminokyselinami
v okolí, dochází ke slabým vazebným interakcím, které pouze zaručují jeho držení pozice během
reakce, ale pravděpodobně nemají na samotnou interakci vliv. Dle ref. [17].
28
5. ZÁVĚR
Prostaglandin H2 je těmito dvěma cytochromy P450 upravován podobným způsobem, avšak vnitřní
struktura enzymů v okolí aktivního místa určuje jeho výslednou podobu, tj. jestli se z něj stane
thromboxan A2 nebo prostacyklin.
U stavby cytochromu P450 5A1 má molekula prostaglandinu H2 nad aktivním místem volný
prostor, není ničím poutána a železo díky této volné struktuře působí na kyslík blíže
karboxylu, pravděpodobně díky tomuto vlivu se následně přestavuje na thromboxan A2.
U stavby cytochromu P450 8A1, který ve své vnitřní struktuře obsahuje aminokyselinu
TRYPTOFAN 282 (Trp282), je molekula prostaglandinu H2 deformována v aktivním místě tak,
že není možnost vzniku TXA2. Trp282 (i ostatní aminokyseliny) ovlivňuje velikost kavity uvnitř
enzymu a přístup k aktivnímu místu. Prostaglandin směřuje svými postranními řetězci silně
a nepřirozeně do stran, a proto železo v aktivním místě působí na jiný kyslík, než tomu bylo
v případě interakce s CYP5A1. Díky tomuto vlivu je prostaglandin H2 přestaven na prostacyklin.
V této studii jsme prokázali, že pomocí kombinace homologního modelování a molekulárního
dokování jsme schopni popsat odlišnou vazbu prostaglandinu H2 do aktivních míst těchto
cytochromů. Podobným způsobem tedy bude možné navrhnout a vyzkoušet vazbu možných
inhibitorů, které by mohly pomoci při regulaci cév, například po infarktu a doléčování cévních
příhod.
29
6. Seznam zkratek
5A1 – Cytochrom P450 5A1
8A1 – Cytochrom P450 8A1
CYP - Cytochrom P450
CYP3A4 - Cytochrom P450 3A4
CYP5A1 - Cytochrom P450 5A1 (Thromboxane A2 syntáza)
CYP8A1 - Cytochrom P450 8A1 (Prostaglandin I2 syntáza)
PGH2 - Prostaglandin H2
PGI2 - Prostacyklin
TXA2 - Thromboxane A2
Trp282 – Tryptofan 282
30
7. Citace
1. Cytochrome P450. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001[cit. 2015-02-18]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Cytochrome_P450
2. Cytochrome P450 inhibition assay. Cyprotex [online]. 2014 [cit. 2015-02-18]. Dostupné z:
http://www.cyprotex.com/admepk/in-vitro-metabolism/cytochrome-p450-inhibition/
3. FOWLER, Lex a Audrey MERCER. Mechanism of Cytochrome P450. In: Mechanism of Cytochrome P450 [online].
2008 [cit. 2015-02-18]. Dostupné z: http://elearn.pharmacy.ac.uk/flash/view/Cytochrome_P450.html
4. Thromboxane-A synthase. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation,
2001- [cit. 2015-02-18]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Thromboxane-A_synthase
5. Eikosanoid. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001- [cit.
2015-02-21]. Dostupné z: http://cs.wikipedia.org/wiki/Eikosanoid
6. Homeostáza. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001- [cit.
2015-02-18]. Dostupné z: http://cs.wikipedia.org/wiki/Homeost%C3%A1za
7. Prostacyclin. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001- [cit.
2015-02-18]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Prostacyclin&redirect=no
8. Prostacyclin synthase. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation,
2001- [cit. 2015-02-18]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Prostacyclin_synthase
9. Thromboxane A2. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001[cit. 2015-02-18]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Thromboxane_A2
10. Dle Yanai, TK, Mori S - Density Functional Studies on Thromboxane Biosynthesis: Mechanism and Role of the
Heme-Thiolate System Chem. , [cit. 24.2.2015] Asian J. 2008, 3, 1900 – 1911
11. Antiplatelet drug. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001[cit. 2015-02-18]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Antiplatelet_drug
12. DEPARTMENT OF INTERNAL MEDICINE. Functional analysis of human thromboxane synthase polymorphic
variants. In: National Center for Biotechnology Information [online]. 2012 [cit. 2015-02-18]. Dostupné z:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22735388
31
13. VASCULAR BIOLOGY RESEARCH CENTER, UNIVERSITY OF TEXAS HEALTH SCIENCE CENTER,
HOUSTON 77030. Characterization of the structure and membrane interaction of NH2-terminal domain of
thromboxane A2 synthase. National Center for Biotechnology Information [online]. 1994 [cit. 2015-02-25]. Dostupné z:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8063711
14. TBXAS1: thromboxane A synthase 1 (platelet) [ Homo sapiens (human) ]. In: NCBI: National Center for
Biotechnology Information [online]. 2008, 8-Feb-2015 [cit. 2015-02-18]. Dostupné z:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=6916
15. HIGHFIVESTUDENT. Wikimedia [online]. [cit. 24.2.2015]. Upraveno. Dostupný na WWW:
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/95/Thromboxane_Synthase_Mechanism.png2.1.3
16. Podle: Yanai, Tetsuya K, and Seiji Mori. “Mechanistic Insights into Prostanoid Transformations Catalyzed by
Cytochrome P450 . Prostacyclin and Thromboxane Biosyntheses.” In Advances in Medicine and Biology, [cit.
24.2.2015] edited by Leon V. Berhardt, 15:231–253. Nova Science Publishers, Inc., 2011.
17. Podle: Ullrich, Volker, and Roland Brugger. “Prostacyclin and Thromboxane Synthase: New Aspects of
Hemethiolate Catalysis.” [cit. 24.2.2015] Angewandte Chemie Intl 1994, 33,19, 1911–1919.
doi:10.1002/anie.199419111.
18. CALVERO. Wikimedia [online]. [cit. 24.2.2015]. Dostupný na
WWW: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/09/Thromboxane_A2_acsv.svg/1000pxThromboxane_A2_acsv.svg.png
19. BENJAH-BMM27. Wikimedia [online]. [cit. 24.2.2015]. Dostupný na
WWW: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3f/Prostacyclin-2D-skeletal.png
20. Prostaglandin H2. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001[cit. 2015-02-18]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Prostaglandin_H2
21. Dle:FVASCONCELLOS. Wikimedia [online]. [cit. 24.2.2015]. Dostupný na
WWW: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/16/Prostaglandin_H2_skeletal.svg/200pxProstaglandin_H2_skeletal.svg.png
22. JFDWOLFF. Wikimedia [online]. [cit. 24.2.2015]. Dostupný na WWW:
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/40/Eicosanoid_synthesis.svg - upraveno.
32
23. KŘÍŽ, Zdeněk. NÁRODNÍ CENTRUM PRO VÝZKUM BIOMOLEKUL. Docking (dokování) [online].
Přírodovědecká fakulta MU, Brno, 2006, 37 s. [cit. 2015-02-18]. Dostupné z:
https://lcc.ncbr.muni.cz/~kulhanek/activities/summer_schools/2006/downloads/Docking-Kriz.pdf
24. BERKA, Karel. KFC/STBI Strukturní bioinformatika: 06_predikce struktury [online]. Olomouc, 2011, 38 s. [cit.
2015-02-18]. Dostupné z: http://fch.upol.cz/skripta/stbi/06_STBI_predikce_struktury.pdf
25. KUBÍK, Vladimír. Nástroj pro vizualizace, úpravu a testování hypotetických struktur proteinů [online]. Brno, 2012
[cit. 2015-02-18]. Dostupné z: http://is.muni.cz/th/325260/fi_b/BP_text.pdf. Bakalářská práce. Masarykova univerzita fakulta informatiky.
26. DOHNÁLEK, Jan a Tomáš KOVAĽ. Krystalografie proteinů. Fyzikální ústav AV ČR [online]. 2009 [cit. 2015-0221]. Dostupné z: http://www.fzu.cz/oddeleni/oddeleni-strukturni-analyzy/research-subjects/krystalografie-proteinu
33
8. Seznam obrázků
Obrázek 1 – Přeměna prostaglandinu H2. Přeměna na TXA2 prostřednictvím CYP5A1. Přeměna
na PGI2 prostřednictvím CYP8A1 [10].
Obrázek 2 – Hemová skupina koordinovaná na thiolátovou skupinu uvnitř cysteinu s pořadovým
číslem 480.
Obrázek 3 – Model CYP5A1 s transmembránovou kotvou. Uniprot ID: P24557
Obrázek 4 – Mechanismus přeměny prostaglandinu H2 na thromboxane A2 v aktivním
místě CYP5A1 [15].
Obrázek 5 - CYP8A1 s transmembránovou kotvou. PDB ID: 2IAG – upraveno.
Obrázek 6 – Mechanismus přeměny prostaglandinu H2 na prostacyklin v aktivním místě CYP8A1
[16].
Obrázek 7 – Ukázka vazby v jednotlivých cytochromech P450 5A1 a 8A1 [17].
Obrázek 8 - Thromboxan A2 [18].
Obrázek 9 – Prostacyklin I2 [19].
Obrázek 10 – Prostaglandin H2 [21].
Obrázek 11 – Přeměna prostaglandinu H2 na PGI2 a TXA2 [22].
Obrázek 12 - Aminokyselinová sekvence použitá pro homologní modelování CYP5A1. Uniprot ID:
P24557
Obrázek 13 – Modelování na základě podobnosti sekvence CYP3A4 a CYP5A1. CYP3A4 je
označen jako 1tqn.pdb (dle pdb) a CYP5A1 je označen jako P24557 (dle databáze uniprot).
Obrázek 14 – Naalignované struktury CYP3A4 a CYP5A1 po vytvoření v programu chimera 1.8.1.
34
Obrázek 15 – Zobrazení kavity s prostaglandinem H2 nad aktivním místem HEMU a v okolí
CYP5A1.
Obrázek 16 – Nadokovaný prostaglandin H2 nad aktivním místem uvnitř cytochromu 5A1.
Obrázek 17 – Nevhodná orientace prostaglandinu H2 uvnitř cytochromu 5A1.
Obrázek 18 - Dokování PGH2 do CYP8A1.
Obrázek 19 – Zobrazení kavity s prostaglandinem H2 nad aktivním místem HEMU a v okolí
CYP8A1.
Obrázek 20 – Kavita CYP5A1.
Obrázek 21 – Kavita CYP8A1.
35