Základy ADME a toxického hodnocení léčiv v

Transkript

Univerzita Palackého v Olomouci
Přírodovědecká fakulta
Základy ADME
a toxického hodnocení léčiv
v preklinickém vývoji
Alice Nová
Petr Pávek
Olomouc 2015
Oponenti: prof. PharmDr. Martin Doležal, Ph.D.
PharmDr. Miloš Petřík, Ph.D.
Skripta vznikla v rámci realizace projektu OP VK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
s názvem „Inovace ve vzdělávání v chemii a biologii
s ohledem na aktuální trendy v biomedicinálním výzkumu“.
1. vydání
© Alice Nová, Petr Pávek, 2015
© Univerzita Palackého v Olomouci, 2015
Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv
a může zakládat občanskoprávní, správněprávní, popř. trestněprávní odpovědnost.
ISBN 978-80-244-4539-7
Obsah
1 Úvod ................................................................................................. 5
1.1 Základní pojmy – farmakokinetika a ADMETox ................................................. 6
1.2 Postavení ADMETox v preklinickém vývoji léčiva .............................................. 8
2 Základní farmakokinetické procesy
a jejich in vitro predikce ........................................................ 12
2.1 Typy průniku léčiva biologickými membránami ..............................................12
2.1.1 Pasivní difúze ...............................................................................................13
2.1.2 Facilitovaná difúze ......................................................................................14
2.1.3 Aktivní transport.........................................................................................15
2.1.4 Endocytóza a exocytóza, pinocytóza, fagocytóza ...................................16
2.2 Absorpce léčiv .........................................................................................................16
2.2.1 Absorpce léčiv a faktory ovlivňující absorpci..........................................16
2.2.1.1 Modely pro studium absorpce léčiv .........................................18
2.3 Distribuce léčiv v organizmu, faktory ovlivňující distribuci .............................22
2.3.1 Fyzikálně chemické vlastnosti – ionizace ................................................22
2.3.2 Plazmatická stabilita ...................................................................................26
2.3.3 Vazba na plazmatické proteiny ..................................................................27
2.3.3.1 Metody používané k určení vazby
na plazmatické proteiny ..............................................................28
2.3.3.2 Rovnovážná dialýza .....................................................................28
2.3.3.3 Ultrafiltrace ..................................................................................28
2.3.3.4 Ultracentrifugace .........................................................................29
2.3.4 Fyziologické bariéry distribuce ................................................................29
2.3.4.1 Hematoencefalická bariéra .........................................................29
2.3.4.2 Modely pro hodnocení průchodu látek
přes hematoencefalickou bariéru ..............................................30
2.3.4.3 Další bariéry .................................................................................31
2.3.5 Lékové transportéry ....................................................................................33
2.3.5.1 Klasifikace transportérů léčiv ....................................................33
2.3.5.2 Role transportérů při distribuci léčiv........................................35
2.3.5.3 Metody pro hodnocení interakce nově vyvíjených léčiv
s lékovými transportéry ..............................................................37
3
Základy ADME a toxického hodnocení léčiv v preklinickém vývoji
2.4 Metabolizmus léčiv .................................................................................................38
2.4.1 In vitro modely pro hodnocení metabolické stability ............................39
2.4.1.1 Jaterní mikrozomy .......................................................................39
2.4.1.2 Primární lidské hepatocyty .......................................................40
2.4.2 Nukleární receptory ....................................................................................42
2.4.3 Hodnocení potenciálu nově vyvíjených látek
způsobovat lékové interakce ......................................................................46
2.4.3.1 Indukce izoenzymů cytochromu P450 .....................................46
2.4.3.2 Inhibice izoenzymů cytochromu P450 .....................................47
2.5 Mechanizmy exkrece léčiv, faktory ovlivňující exkreci......................................49
3 Základní farmakokinetické parametry, výpočet a praktický význam ve vývoji léčiv ..................................... 51
4 In silico predikce ADMETox ................................................... 54
5 Stručný přehled toxikologického hodnocení látek
v rámci preklinického vývoje ............................................... 57
6 Seznam zkratek .......................................................................... 60
4
1 Úvod
Charakterizace a implementace poznatků ADMETox je v současnosti již
standardní součástí návrhu chemické struktury potenciálního vyvíjeného
léčiva. V posledních 20 letech se poznatky o ADMETox v rámci preklinického vývoje léčiv zformovaly do samostatné interdisciplinární vědní disciplíny,
která se zabývá vývojem léčiva od in silico predikce struktury, přes fázi lead
optimalization až po fázi výběru kandidátní molekuly pro klinický vývoj.
V těchto skriptech popisujeme vývoj klasických léčiv, tzv. malých molekul
(organické sloučeniny s molekulovou hmotností do 900 Da, které pomáhají
regulovat biologické procesy)1.
Razantní rozvoj ADMETox je spojen především s těmito faktory. Prvním
faktorem je potřeba zefektivnění, rychlení a zlevnění vývoje malých molekul. Druhým faktorem je nutnost zmírnit počet selhání vyvíjených léčiv
v klinické fázi v důsledku toxických nebo nevhodných farmakokinetických
vlastností testovaných léčiv, případně lékových interakcí, který provázel
vývoj léčiv na konci milénia. Třetím faktorem bylo zavedení nových progresivních analytických metod (především LC/MS), nových buněčných
biofarmaceutických modelů (např. Caco-2 buněk), nových screenovacích
metod (tzv. high-throughput screening – HTS) a možnost in silico počítačové simulace ADMETox i toxických vlastností vyvíjených molekul. Čtvrtým faktorem jsou neustále se zvyšující nároky na bezpečnost a účinnost
nových léčiv, ať již regulačními autoritami nebo odbornou veřejností. Pátým faktorem je razantní zvýšení počtu nově syntetizovaných a testovaných
molekul (angl. new chemical entities, NCE), produkovaných akademickou
i komerční sférou.
ADMETox tak v současné době čerpá z rozvoje všech důležitých oborů
zabývajících se vývojem léčiva, ať už je to farmaceutická, fyzikální nebo
analytická chemie, biofarmacie, farmakologie nebo toxikologie. Je zřejmé,
že racionální vývoj léčiv se dnes proto bez expertízy ADMETox neobejde
a farmaceutické firmy i akademické instituce zabývající se vývojem léčiv
proto zavádí samostatná oddělní nebo laboratoře určené pro ADMETox
preklinické hodnocení vyvíjených léčiv. V České republice vznikly labora1
Farmakokinetické hodnocení biologických léčiv (např. monoklonálních protilátek, je často
limitováno na in vivo hodnocení).
5
toře zabývající se ADMETox na Ústavu molekulární a translační medicíny
Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci, na Farmaceutické fakultě Univerzity Karlovy v Hradci Králové (Centrum vývoje léčiv) a v Ústavu
organické chemie a biochemie AV ČR.
Tato skripta přinášejí studentům první stručné nahlédnutí do oboru
ADMETox a jsou první monografií tohoto druhu v České republice.
1.1 Základní pojmy – farmakokinetika a ADMETox
Farmakokinetika (PK) je jedním z podoborů farmakologie, zabývající se
osudem léčiva v organizmu od jeho vstupu až po vyloučení. Pro studium metabolizmu a farmakokinetiky léčiv se také někdy používá akronym
DMPK (angl. drug metabolism and pharmacokinetics). Základními farmakokinetickými ději jsou absorpce, distribuce, metabolizmus a exkrece. Jejich
akronym dal název celému oboru, který se dnes označuje ADME. Pojem
eliminace spojuje procesy metabolizmu a exkrece a pojem dispozice léčiva
(angl. drug disposition) v sobě zahrnuje distribuci léčiva a jeho eliminaci.
ADME se zabývá vývojem léčiva od in silico predikce struktury, přes
fázi lead optimalization až po fázi výběru kandidátní molekuly pro klinický
vývoj z pohledu optimalizace jeho farmakokinetických vlastností. Zabývá
se proto především faktory a procesy, které řídí farmakokinetické vlastnosti
vyvíjený léčiv a vývojem vhodných modelů pro předpověď ADME vlastností
na in silico a in vitro úrovních.
ADME má dnes několik mutací. Z pohledu preklinického vývoje léčiv se
někdy používá pojem ADMET, neboli ADMETox. V tomto názvu je zahrnuto systematické studování a predikce farmakokinetických vlastností nově
vyvíjeného léčiva a zároveň potenciální toxicity s cílem vyvinout nadějné
kandidátní molekuly s optimálními farmakokinetickými a (ne)toxickými
vlastnostmi pro klinický vývoj.
Hlavním cílem ADMETox je racionální výběr a identifikace molekul
s optimálními farmakokinetickými a toxikologickými vlastnostmi v rámci
širšího vývoje léčiv, které mají naději se stát úspěšnými klinickými kandidátními molekulami. Druhým cílem je naopak eliminovat molekuly se
suboptimálními vlastnostmi před tím, nežli vstoupí do nákladných, především klinických, fází vývoje.
Jelikož fáze farmakokinetiky nastupují po uvolnění léčiva z lékové formy,
byl rovněž zaveden pojem LADME, který v sobě zahrnuje uvolnění léčivé
látky (Liberation) z technologicky připravené formulace.
6
1 Úvod
Biofarmacie (biofarmaceutics) je obor (vědní disciplína), který studuje
vztah mezi fyzikálně chemickými vlastnostmi léčiv, vliv formulací a cesty
aplikace na systémovou absorpci léčiva. Biofarmacie se tedy částečně překrývá s ADME ve svém poslání i v metodické stránce modelů, které obě
disciplíny používají.
Pojem PK/PD (Pharmacokinetic/Pharmacodynamic) označuje spojení
farmakokinetiky a farmakodynamiky (disciplína studující účinek léčiva).
Používá se především v souvislosti s PK/PD modelováním – predikcí farmakodynamického účinku léčiva v závislosti na jeho distribuci v organizmu.
Absorpce v sobě zahrnuje vstup léčiva do krevního řečiště, které se označuje spolu s dobře prokrvenými orgány jako centrální kompartment. Léčivo
vstupuje do těla několika cestami podání, jako jsou perorální, intravenózní,
subkutánní, inhalační a topické podání (např. dermální, intrakavitální aj.).
Absorpci po perorálním podání se věnuje detailněji kapitola 2.2.
Distribucí se rozumí proces, kdy je léčivo krví rozneseno po celém těle
do jednotlivých orgánů. Pro distribuci jsou proto zásadní fyzikálně chemické vlastnosti léčiva. Nejdůležitější fyzikálně-chemické vlastnosti léčiv, které
určují osud léčiva v těle, jsou lipofilita, molekulová hmotnost a disociační
konstanta pKa. Tyto vlastnosti určují přechod léčiv přes epitel tkání při
distribuci (viz kapitola 2.3).
Metabolizmus je chemická přeměna léčiva na metabolit. Metabolizmu (neboli biotransformaci) podléhá většina léčiv i xenobiotik, které se
absorbují do těla. Biotransformační enzymy I. (oxidoredukční) a II. fáze
(konjugační) biotransformace se podílí na eliminaci léčiv tím, že mění chemickou strukturu látky obvykle na více hydrofilní a neúčinnou molekulu,
která snáze podléhá exkreci.
Transport léčiv prostřednictvím tzv. „lékových transportérů“ lokalizovaných na cytoplazmatické membráně buněk epitelií se někdy v odborné
literatuře označuje jako nultá nebo III. fáze detoxifikace. Tento termín je
trochu zavádějící, jelikož se ve své podstatě nejedná o další fázi biotransformace. Přesto si lékové transportéry v tomto učebním materiálu zmíníme,
jelikož řídí významně zejména absorpci léčiv ve střevě a distribuci na fyziologických bariérách i v exkrečních orgánech jako jsou játra a ledviny.
Exkrece je proces, kdy léčivo opouští tělo ve formě metabolitu nebo v nezměněné formě v moči (ledvinná exkrece), ve stolici (biliární eliminace).
Dalšími minoritními cestami exkrece léčiv je eliminace potem, slinami nebo
exhalace.
7
Okrajovým faktorem ovlivňujícím farmakokinetiku léčiv jsou nukleární
receptory a jejich aktivita při tzv. indukci genové exprese biotransformačních enzymů I. a II. fáze biotransformace i lékových transportérů. Ligandy
nukleárních receptorů jsou často xenobiotika, která jsou biotransformována
indukovaným enzymem (fenomén tzv. autoindukce).
V rámci ADMETox jsou léčiva rovněž testována, zda inhibují biotransformační enzymy cytochromu P450, zda jsou ligandy nukleárních receptorů nebo zda interferují s transportními mechanizmy. Důkladnou znalostí
interakčního potenciálu vyvíjené látky s těmito faktory můžeme odhadnout rizika tzv. lékových interakcí (angl. drug-drug intearactions). Lékové
interakce jsou charakterizovány jako interakce dvou spolupodaných léčiv,
kdy dojde k negativnímu ovlivnění nebo snížení terapeutického účinku
jednoho léčiva v důsledku druhého léčiva. Nezastupitelnou rolí ADMETox
je predikovat potenciál těchto rizik a případně se jim v rámci preklinického
vývoje nového léčiva vyvarovat.
1.2 Postavení ADMETox v preklinickém vývoji léčiva
Na počátku devadesátých let minulého století selhávalo v klinickém vývoji
40 % NCE z důvodu špatných farmakokinetických vlastností. Po implementaci ADMETox jakožto racionálního přístupu preklinického vývoje se toto
číslo za necelých 15 let snížilo na méně než 7 %.
Z hlediska farmakokinetických vlastností by vyvíjená látka měla splňovat
tato obecná kritéria:
– dobrá rozpustnost ve vodě
– biologická dostupnost po perorálním podání více než 50 % bez interindividuální variability
– optimální biologický poločas (t1/2 přibližně 12 hodin) umožňující jednu
denní dávku v rozmezí 5–10 mg
– minimální nebo žádné nežádoucí účinky
Samozřejmé je, že pro vývoj je zásadní terapeutická indikace nebo předpokládaná cesta podání vyvíjeného léčiva, aspekt léčby akutní nebo chronické
nemoci, nutnost přestupu hematoencefalické bariéry aj.
Vývoj léčiv se řídí algoritmem (viz obrázek 1), který nejlépe optimalizuje
vývoj léčiva na podkladě cílů ADMETox, tj. selektovat nadějné kandidátní
molekuly a zároveň eliminovat ty neperspektivní.
8
Obrázek 1 Schéma vývoje léčiv
1 Úvod
9
Na obrázku 2 je naznačen modelový algoritmus vývoje léčiva v rámci preklinického testování a sledu zapojení jednotlivých ADMETox metod. Algoritmus je koncipován tak, aby nejdůležitější a zároveň nejproblematičtější
vlastnosti vyvíjeného léčiva (biologická dostupnost po per os podání, metabolická stabilita) byly ověřeny co nejdříve a vyhnuli jsme se tak neracionální
práci na neperspektivních molekulách. V algoritmu je také zohledněna finanční a časová náročnost jednotlivých metod. Nutno dodat, že opět platí,
že vývoj každého léčiva vyžaduje svůj algoritmus a že velké farmaceutické
firmy užívají svoje vlastní algoritmy vycházející z možností a potřeb těchto firem. Jednotlivé metody v rámci ADMETox testování budou probrány
v následujících kapitolách.
Obrázek 2 Modelový algoritmus ADMETox metod v rámci preklinického testování látek
10
1 Úvod
Literatura
Gad SC. Preclinical development handbook. Hoboken, N. J.: Wiley Interscience, 2008.
ISBN: 9780470248478.
Shargel L, Wu-Pong S, Yu ABC. Applied biopharmaceutics & pharmacokinetics. 6th ed.
New York: McGraw-Hill Medical, 2012. ISBN: 9780071603935.
Tsaioun K, Kates SA. ADMET for medicinal chemists: a practical guide. Hoboken, N. J.:
John Wiley & Sons, 2011. ISBN: 9780470484074.
Zhang D, Surapaneni S. ADME-enabling technologies in drug design and development.
Hoboken, N.J.: John Wiley & Sons, 2012. ISBN: 9780470542781.
11
2 Základní farmakokinetické procesy
a jejich in vitro predikce
2.1 Typy průniku léčiva biologickými membránami
Elementárním procesem při absorpci léčiv, distribuci z centrálního kompartmentu přes tzv. fyziologické bariéry, při jeho vstupu do hepatocytů
jakožto hlavního metabolického „reaktoru“ i při eliminaci do žluče nebo
primární moče je přestup přes plazmatickou membránu. Z tohoto důvodu
se zastavme nad mechanizmy přestupu přes biologické membrány.
Biologická membrána je složena ze dvou vrstev fosfolipidů, přičemž lipofilní (a hydrofobní) části alifatického řetězce jsou orientovány dovnitř membránové dvojvrstvy a hydrofilní části směřují do extracelulárního prostoru
nebo do cytoplazmy. Šířka biologické membrány se pohybuje od 7 do 10 nm
(70–100 Å).
Integrální nebo periferní membránové proteiny jsou zanořeny do buněčných membrán a tvoří tzv. rafty (viz obrázek 3). Proteiny bývají často
glykosylovány směrem do extracelulárního prostoru. Protože je biologická
membrána složena převážně z fosfolipidů, má charakter lipoidní vrstvy,
který je rozhodující pro překonání biologické membrány léčivem.
Obrázek 3 Biologická membrána
12
2 Základní farmakokinetické procesy a jejich in vitro predikce
Mezi nejdůležitější transportní mechanizmy léčiv přes biologické membrány
patří:
■ Pasivní difúze
■ Prostup membránovými póry
■ Facilitovaná difúze
■ Aktivní transport
■ Pinocytóza
■ Endocytóza a exostóza
S výjimkou pasivní difúze vyžaduje transport látek přes biologické membrány přítomnost specifických membránových proteinů jako jsou např. iontové
kanály, transportéry (přenašeče), vodné kanály nebo receptory podílející se
na endocytóze.
2.1.1 Pasivní difúze
Pasivní difúze je hlavním mechanizmem přestupu přes biologickou membránu především lipofilních léčiv s malou molekulovou hmotností. Látky
pasivně difundují z prostředí s vyšší koncentrací látky do prostředí za biologickou membránou s nižší koncentrací (tj. transport pasivní difúzí se děje
ve směru koncentračního gradientu bez spotřeby energie z hydrolýzy ATP).
Pasivní difúze probíhá do té doby, než se vyrovnají koncentrační rozdíly
mezi extracelulárním prostorem a cytoplazmou. Pasivní difúzi popisuje
první Fickův zákon pasivní difúze.
J =
D A (C1 − C 2 )
l
,
kde J je rychlost difúze neboli tok látky vztažený na jednotkovou plochu
membrány [g . s–1. cm–2 ], D je difúzní koeficient charakterizující prostupnost membrány pro danou látku, A je plocha membrány a l je tloušťka
membrány. C1 – C2 je rozdíl koncentrací látky na obou stranách membrány,
tzv. koncentrační gradient (spád) látky.
Z této rovnice vyplývá, že rychlost přestupu látky je přímo úměrná velikosti koncentračního gradientu, ploše membrány, velikosti difúzního koeficientu a nepřímo úměrná tloušťce membrány. Součinitel DA/l je konstantou
charakterizující prostupnost dané látky přes určitou membránu a může být
vyjádřen jako tzv. koeficient permeability P.
13
Faktory ovlivňující přestup látek pasivní difúzí:
Lipofilita
Lipofilitu pro neionizované látky udává nejčastěji tzv. rozdělovací koeficient P, který se vypočítá z poměru koncentrace látky rozpuštěné v lipofilní
fázi (nejčastěji oktanol nebo olivový olej) ke koncentraci látky rozpuštěné
v hydrofilní fázi (voda nebo pufr) v ustáleném stavu. Často se lipofilita
udává ve formě dekadického logaritmu rozdělovacího koeficientu log P. Pro
ionizované látky se používá zdánlivý rozdělovací koeficient log D, který je
závislý na pH.
Molekulová hmotnost látky
Difúzní koeficient D látky je nepřímo úměrný třetí odmocnině molekulové
hmotnosti látky. Menší molekulová hmotnost a tedy i menší molekula látky
proto určuje rychlejší a snadnější přestup látky přes biologickou membránu
mechanizmem pasivní difúze.
Disociace léčiva
Pro přestup slabých kyselin a zásad přes biologické membrány je rozhodující
ionizace vyjádřená disociační konstantou (viz kapitola 2.3.1).
Prostup membránovými póry
V membráně se předpokládá přítomnost membránových pórů. Rozměry
těchto pórů (< 10 nm) však umožňují přestupovat pouze nízkomolekulárním látkám, např. molekulám vody, močoviny a iontům. Membránové póry
proto nemají zásadnější význam pro transport léčiv. Hnací silou přestupu
vody skrze póry je osmóza, v případě močoviny a iontů je to koncentrační
gradient.
2.1.2 Facilitovaná difúze
Facilitovaná difúze (synonymum usnadněná difúze) je transportní mechanizmus, při kterém se látka pohybuje přes membránu ve směru koncentračního gradientu pomocí membránového přenašeče, přičemž přenašečový
protein (neboli transportér) nespotřebovává energii z hydrolýzy ATP ani
z jiného zdroje. Transport trvá do vyrovnání koncentrací látky na obou
stranách membrány.
14
Přítomnost přenašečového proteinu v tomto mechanizmu předurčuje specifitu transportu pro strukturně podobné látky. Např. transportéry
facilitované difúze pro glukózu transportují téměř výhradně D-glukózu,
nikoli však L-glukózu. Díky omezenému množství transportních proteinů
facilitovaného transportu i jejich limitované transportní aktivitě může dojít
k vysycení (saturaci) přechodu látky přes membránu. Vysycení transportní
aktivity přenašeče facilitované difúze lze popsat rovnicí Michaelise a Mentenové.
Tímto typem transportu se například přenáší glukóza a některé aminokyseliny na bazolaterální membráně buněk proximálního tubulu a enterocytů, z léčiv to jsou látky podobné endogenní látkám.
2.1.3 Aktivní transport
Na rozdíl od pasivní difúze a facilitovaného transportu, při aktivním mechanizmu transportu léčiv dochází při přenosu molekuly léčiva přes biologickou
membránu ke spotřebě energie (nejčastěji hydrolýzou ATP). Léčivo je přenášeno proti koncentračnímu gradientu, tj. z prostředí s nižší koncentrací
léčiva do prostředí s vyšší koncentrací. Aktivní transport se dělí na primární
aktivní transport a sekundární aktivní transport. Při primárním aktivním
transportu se spotřebovává energie pro transport z hydrolýzy makroergických vazeb ATP – tj. transportér má přímou hydrolytickou enzymatickou
aktivitu. Při sekundárním aktivním transportu dochází při přenosu látky
přes membránu ke spotřebě energie uchované v membránovém elektrochemickém gradientu některého iontu, nejčastěji sodíku. Podobně jako v případě facilitované difúze platí i zde, že primární transport je saturovatelný,
dva substráty mohou kompetovat o vazebné místo na transportním proteinu
a inhibitory mohou blokovat transportér.
Primární transportéry rozpoznávají především endogenní substance,
ale také řadu léčiv a jiných xenobiotik. Příkladem primárního aktivního
transportéru je P-glykoproteinový transportér (ABCB1/MDR1), a některé
další ABC transportéry podílející se na eliminaci léčiv v játrech a ledvinách
(viz kapitola 2.3.5).
15
2.1.4 Endocytóza a exocytóza, pinocytóza, fagocytóza
Při endocytóze dochází k vchlípení části buněčné membrány společně
s transportovanou makromolekulou. Tomuto kroku předchází navázání
molekuly na specifický receptor. V cytoplazmě se vytváří tzv. endozom obsahující pohlcenou látku, membrána měchýřku splývá s lyzozomy a obsah
podléhá degradaci lyzozomálními enzymy. Příkladem může být příjem železa do buněk po navázání na transferin, absorpce vitamínu B12 společně
s vnitřním faktorem nebo vstřebávání Sabinovy vakcíny proti poliomyelitidě
po perorálním podání. Stejným způsobem, tj. receptorem zprostředkovanou
endocytózou, dochází k příjmu cholesterolu ve formě LDL lipoproteinů
do buněk. Mechanizmem exocytózy se z buňky secernují makromolekuly
peptidových hormonů (např. inzulín z β-buněk Langerhansových ostrůvků).
Specifickým typem endocytózy je pinocytóza a fagocytóza.
Pinocytóza
Tímto mechanizmem se do buňky dostávají látky rozpuštěné v roztoku.
Vchlípením cytoplazmatické membrány se vytváří měchýřek, který se v cytoplazmě rozpadá.
Fagocytóza
Fagocytóza je významný proces vstupu velkých částeček do buněk. Fagocytóza není obecným jevem u všech typů buněk, ale je vlastní pouze některým
buňkám imunitního systému. Fagocytóze předchází specifické rozpoznání
fagocytované částice protilátkou nebo receptorem lokalizovaným na povrchu buňky imunitního systému.
2.2 Absorpce léčiv
2.2.1 Absorpce léčiv a faktory ovlivňující absorpci
Většina nově vyvíjených léčiv je určena pro perorální podání a proto se
u nových látek očekává dobrá biologická dostupnost. Testování biologické
dostupnosti na zvířecích modelech je sice možné, ale nevyhovuje požadavkům rychlého otestování velkého množství látek v krátkém čase. Proto bylo
vyvinuto několik in vitro modelů, kterými se testuje permeabilita látek přes
buněčnou monovrstvu nebo artificiální membránu.
16
Hlavní způsoby transportu přes buněčnou membránu enterocytu (obrázek 4):
Pasivní difúze – ve směru koncentračního gradientu
– paracelulární difúze – mezi buňkami, připadá v úvahu hlavně pro malé
hydrofilní látky
– transcelulární difúze – skrz buňky, procházejí tak lipofilní sloučeniny
Aktivní transport – je spjatý se spotřebou energie, je zajišťován transportními proteiny, např. efluxním transportérem P-glykoproteinem (P-gp). Látky
jsou takto aktivně „vypumpovány“ zpět do střevního lumen a tímto způsobem se snižuje jejich střevní absorpce. Současným podáním P-gp inhibitoru
lze zvýšit střevní absorpci látek, které jsou substráty P-gp. Substráty P-gp
současně obvykle vůbec nebo jen těžko pronikají přes hematoencefalickou
bariéru, proto tyto látky nebudou vhodnými kandidáty v projektech, které
vyžadují CNS aktivní látky. Totéž riziko platí i u potenciálních antitumorových látek, jelikož tumory často exprimují P-gp. Pokud je chemoterapeutikum substrátem P-gp a nádor exprimuje P-gp, dochází k dramatickému
snížení terapeutického efektu.
Obrázek 4 Typy transportu látek přes buněčnou membránu
17
Faktory ovlivňující permeabilitu:
– vysoce hydrofilní látky neprochází snadno přes buněčné membrány
– vysoce lipofilní látky přestupují velmi snadno přes buněčné membrány
Pro optimální perorální absorpci je tedy nutné najít rovnováhu mezi rozdílnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Rozpustnost je možné ovlivnit
i v pozdějších stádiích vývoje léčiva, na počátku se tedy zaměřujeme na optimalizaci permeability (lipofilita).
2.2.1.1 Modely pro studium absorpce léčiv
In vitro modely – dělí se na metody modelující transport látek přes artificiální membránu nebo přes monovrstvu buněk.
PAMPA (angl. parallel artificial membrane permeability assay) je metoda využívající artificiální membránu. Klasifikuje látky na základě pasivní
difúze. Protože umělá membrána nemá žádné transportéry, tato metoda
tedy nemodeluje aktivní transport. Jedná se o metodu první volby, protože
umožňuje otestovat velké množství látek během krátké doby, je levnější
a mnohem méně náročná než metody založené na buněčných modelech.
Existují dvě základní modifikace této metody, kterými se vytváří imitace
buněčné membrány, a to pomocí lipidů nebo hexadekanu.
PAMPA – lipidová varianta
Speciální membrána tvoří dna jamek 96 jamkové destičky. Tato destička je
obvykle akceptorová, položí se na donorovou destičku, která má jamky širší,
takže pokud donorová jamka obsahuje pufr, akceptorová jamka se částečně
ponoří do donorové jamky, což zajistí stálý styk obou kapalin s membránou (obrázek 5). Složení tohoto „sendviče“ předchází příprava samotné
membrány z hydrofobního materiálu, na kterou se nanese malé množství
lecitinu rozpuštěného v dodekanu (s dodekanem pracujeme v laminárním
boxu, jedná se o toxickou látku). Koncentrace roztoku lecitinu se pohybuje
o 1 do 10 %. Takto upravená membrána se musí použít do experimentu během 10 minut. Inkubační doba experimentu je 16–18 h, kdy dochází k difúzi
testované látky z donoru přes membránu do akceptoru.
18
PAMPA – hexadekanová metoda
Sestavení PAMPA je shodné jako u lipidové varianty, ale liší se úpravou
membrány. Pro hexadekanovou metodu se používá membrána z hydrofilního materiálu, která se impregnuje roztokem hexadekanu v hexanu (5 % v/v)
a hexan se následně nechá asi 60 minut zcela odpařit. S hexanem se pracuje
v laminárním boxu, jedná se o toxickou látku. Destičky s takto upravenou
membránou lze skladovat několik týdnů. Inkubace se u této varianty zkracuje na 5 hodin.
Obrázek 5 Schématické znázornění PAMPA
Výhodou artificiální membrány je možnost použití relativně vysokých koncentrací látek a následná možnost detekce pomocí UV/Vis u látek obsahujících chromofor ve své molekule. Tato analytická metoda je velmi rychlá
a jednoduchá, analýza je možná v 96 jamkové destičce s UV propustným
dnem, analýza celé destičky proběhne v řádu minut. Koncentraci látek
v obou kompartmentech lze také analyzovat pomocí LC-MS.
Výhody:
– možnost high-throughput testování velkého množství látek
– rychlost – není nutné čekat, než narostou a diferencují buňky
– rychlé rozdělení látek v počátečních stádiích vývoje podle pasivní difúze
Nevýhody:
– absence transportních proteinů, nemožnost odhadu aktivního transportu, nepřítomnost metabolických enzymů
19
Interpretace dat získaných z modelu absorpce PAMPA:
Výstupem z PAMPA eseje je hodnota koeficientu permeability Papp, který
se vypočítá podle rovnice
c
VD × VA
Papp = C × –ln(1 – cA ), kde C = (V × V
)×A×t
E
D
A
VD a VA jsou objemy donorového a akceptorového kompartmentu, A je plocha membrány násobená porozitou, t je čas, cA je koncentrace látky v akceptorovém kompartmentu a cE je koncentrace látky v teoretické rovnováze
mezi donorovým a akceptorovým kompartmentem.
Na základě hodnoty koeficientu permeability lze klasifikovat látky jako
vysoce nebo nízko permeabilní.
Caco-2 model absorpce
Caco-2, buněčná linie odvozená od kolorektálního karcinomu, se používá pro stanovení intestinální absorpce. Caco-2 esej se obvykle provádí
ve 24 nebo 96jamkovém formátu. Caco-2 buňky se kultivují na polopropustné membráně, kde během 21denní kultivace utvoří monovrstvu a následně
diferencují, dochází k polarizaci buněk (bazální a apikální pól) a k částečné
expresi enzymů cytochromu P450 metabolizujících léčiva a transportních
proteinů (např. P-gp, BCRP, MRP1).
Výhody:
– poskytuje informaci o pasivní i aktivní permeabilitě
– hodnoty koeficientů permeability získaných z modelu Caco-2 korelují
se střevní absorpcí u člověka (HIA – angl. human intestinal absorption)
Nevýhody:
– experimentální náročnost
– délka kultivace buněk na polopropustné membráně (21 dní)
– exprese transportérů v Caco-2 buňkách mohou kolísat v závislosti na počtu pasáží
Interpretace dat získaných z modelu absorpce Caco-2:
Rychlost přestupu látek přes monovrsvu se vyjadřuje jako koeficient zdánlivé permeability Papp, který lze vztáhnout k in vivo absorpci látek, u kterých
20
je střevní absorpce kvantifikována. Tímto způsobem tedy lze predikovat
střevní absorpci nově vyvíjených léčiv.
Koeficient permeability se vypočítá podle rovnice
Papp =
dQ/dt
,
C0 × A
kde dQ/dt je rychlost přechodu látky přes buňky, c0 je koncentrace v donorovém kompartmentu v čase 0 a A je plocha buněčné monovrstvy.
Obousměrná permeabilita
Přestup látek přes Caco-2 monovrstvu sledujeme jak ve směru AB, tj. transport látky z kompartmentu A do kompartmentu B, tak ve směru BA, tedy
přestup látky v opačném směru (obrázek 6). Podílem koeficientů permeability v obou směrech získáme hodnotu efluxního poměru ER (angl. efflux
ratio).
ER =
PappBA
,
PappAB
Pokud je hodnota ER vyšší než dva, dochází k aktivnímu transportu testované látky, což znamená, že testovaná látka je substrátem některého z efluxních
transportérů exprimovaných v Caco-2 buněčné monovrstvě.
Obrázek 6 Caco-2 buněčný model absorpce
21
Látky lze podle dat získaných z obousměrné transportní studie rozdělit
do kategorií vysoce, středně a nízce permeabilních látek v souladu s Biofarmaceutickým klasifikačním systémem (BCS). Nejatraktivnější látky tedy
budou ty, které patří do kategorie vysoce permeabilní, a zároveň nebudou
substráty P-glykoproteinu.
2.3 Distribuce léčiv v organizmu,
faktory ovlivňující distribuci
2.3.1 Fyzikálně chemické vlastnosti – ionizace
Disociační konstanta udává pH roztoku, v němž jsou koncentrace ionizované a neionizované formy disociované slabé kyseliny nebo báze ekvivalentní.
Disociaci slabých kyselin a zásad v roztocích o různém pH popisuje Hendersonova-Hasselbalchova rovnice:
Rovnice pro slabé kyseliny
Rovnice pro slabé báze
log [A–] / [AH] = pH – pKa
log [B] / [BH+] = pH – pKa.
Z těchto rovnic je zřejmé, že poměr disociované a nedisociované formy látky
lze vypočítat z rozdílu pH roztoku a disociační konstanty látky. V tabulce 1
jsou uvedeny disociační konstanty některých známých léčiv.
Tabulka 1 Disociační konstanty vybraných léčiv
Léčivo
Slabé kyseliny
ampicilin
fenytoin
furosemid
ibuprofen
kyselina
acetylsalicylová
levodopa
22
pKa
čím je pKa slabých
kyselin nižší,
tím snadněji látka
odštěpuje proton
2,5
8,3
3,9
4,4; 5,2
3,5
Léčivo
Slabé báze
terbutalin
alopurinol
amilorid
atropin
efedrin
pKa
čím je pKa
slabých bází vyšší,
tím látka snadněji
váže proton
10,3
9,4; 12,3
8,7
9,7
9,6
2,3
chlorpromazin
9,3
Léčivo
methotrexát
methyldopa
tolbutamid
warfarin
theofylin
chlorothiazid
paracetamol
pKa
4,8
2,2; 9,2
5,3
5,0
8,8
6,8; 9,4
9,5
Léčivo
imipramin
kokain
klonidin
kodein
metadon
morfin
prokain
lidokain
hydralazin
diazepam
pKa
9,5
8,5
8,3
8,2
8,4
7,9
9,0
7,9
7,1
3,3
Ionizace slabých kyselin a bází značně ovlivňuje jejich přestup přes biologické membrány. Neionizovaná látka nemá v molekule náboj, je tedy lipofilnější
a snadněji proniká biologickými membránami. Naopak ionizovaná forma
léčiva má ve své struktuře záporný (kyseliny) nebo kladný náboj (zásady),
který znesnadňuje jejich průchod membránami pasivní difuzí.
Na rozhraní dvou kompartmentů s různým pH oddělených biologickou
membránou, epiteliální vrstvou nebo fyziologickou bariérou může dojít
k jevu, který zobrazuje tabulka 2. Díky lipofilnější povaze neionizované
formy látky a tudíž i snadnějšímu prostupu přes membránu je tato forma
přítomna ve stejné koncentraci na obou stranách membrány. Naopak
ionizovaná forma léčiva neprostupuje biologickou membránou. V závislosti
na pH prostředí je léčivo v různé míře disociováno na opačných stranách
membrány. Důsledkem této odlišné disociace léčiva a rovnováze koncentrací neionizované formy na membráně dochází k tomu, že celková koncentrace látky, tj. ionizované i neionizované, je na jedné straně membrány
výrazně vyšší než na straně druhé. Pro tento jev se používá anglický výraz
ion trapping.
Ion trapping demonstrují následující příklady a tabulka 2.
23
Tabulka 2 Rozdělení kyseliny acetylsalicylové (slabá kyselina) a slabé báze
hydralazinu mezi třemi kompartmenty s různým pH oddělenými membránou (vlnovka). Mezi disociovanou a nedisociovanou formou látky v kompartmentu dochází k vytvoření rovnováhy v závislosti na pH prostředí a pKa
látky (přerušovaná šipka). Neionizovaná forma léčiva snadno prostupuje
membránami pasivní difúzí (plná šipka), čímž dochází k ustálení stejných
koncentrací neionizované formy léčiva na obou stranách membrány.
Moč
pH
[A–]/[AH–]
Celková
koncentrace
8,0
31 622
347
7,4
7943
87
Žaludeční
šťáva
3,0
0,32
0,015
347 (99,997 %)
kyselina
A–
acetylKoncentrace
salicylová (podíl formy)
87 (99,99 %)
A–
pKa 3,5
AH
0,011 (0,003 %)
AH
0,011 (0,01 %)
10 (88,81 %)
B
10 (66,53 %)
B
BH+
1,2 (11,19 %)
BH+
5 (33,46 %)
11
15
BH+
125
944
(99,992 %)
125 954
7,9
2
7,9 · 10 –4
hydralazin
Koncentrace
(podíl formy)
pKa 7,1
Celková
koncentrace
[B]/[BH+]
24
Plazma
0,004
(26,66 %)
A–
AH
0,011
(73,33 %)
10
(0,008 %)
B
Kyselina acetylsalicylová je slabá kyselina s disociační konstantou pKa = 3,5.
V plazmě o pH 7,4 je téměř úplně disociována, což lze snadno vypočítat
na základě Henderson-Hasselbalchovy rovnice.
log [A–]/[AH] = pH – pKa
log [A–]/[AH] = 7,4 – 3,5 = 3,9
Odlogaritmováním obou stran rovnice dostáváme poměr mezi oběma formami látky [A–]/[AH] = 7943,28. Jestliže je nedisociovaná forma přítomna
např. v koncentraci 0,011%, bude na základě předchozího poměru koncentrace disociované formy 87,37 %. Celková koncentrace látky je dána součtem
disociované a nedisociované formy látky, tedy 87,381. Z tohoto výpočtu
vyplývá, že v plazmě o pH 7,4 se nachází 99,99 % kyseliny acetylsalicylové
v disociované formě.
Jinak je tomu v žaludeční šťávě o pH 3,0. Stejným výpočtem dostáváme
poměr disociované a nedisociované formy [A–]/[AH] = 0,32. Poměr obou
forem bude v tomto případě opačný a v žaludeční šťávě je 78,6 % kyseliny
acetylsalicylové nedisociované a jen 21,4 % disociované.
V zásadité moči o pH 8,0 je poměr mezi koncentrací ionizované a neionizované formy kyseliny acetylsalicylové roven 31 622, což značí téměř
úplnou disociaci léčiva.
V případě slabé báze hydralazinu s pKa 7,1 bude v krvi o pH 7,4 66,53 %
hydralazinu disociovaného (viz tabulka 2). V žaludeční šťávě bude hydralazin disociován téměř úplně (99,92 %). V zásadité moči bude naopak pouze
11,19 % hydralazinu disociovaného.
Disociace léčiva často způsobuje zdržení a kumulaci léčiva v kompartmentu před další absorpcí, distribucí nebo eliminací. Naopak pH prostředí, které zabraňuje ionizaci léčiva, jeho další transport a distribuci
usnadní. Jako příklad poslouží již zmíněná kyselina acetylsalicylová. Žaludeční prostředí s nízkým pH udržuje velkou část slabé kyseliny acetylsalicylové v nedisociované formě, která se snadno vstřebává v žaludeční sliznici.
Pozn.: Ve skutečnosti se však kyselina acetylsalicylová vstřebává převážně ve střevě díky obrovské absorpční ploše tenkého střeva. Rozloha absorpční plochy střeva se díky dvojitému členění lumen střeva na klky a mikroklky
odhaduje na 200 m2, zatímco plocha absorpce v žaludku je pouze 1 m2.
K ion trappingu dochází na řadě míst organizmu, které mají odlišné pH
než plazma. Například slabé báze se kumulují ve fetální krvi. Plazma plodu
má pH sice jen o 0,1 nižší než mateřská plazma, ovšem vzhledem k tomu, že
25
levá strana Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice je logaritmem poměru
dvou forem látky, i takto nepatrná změna pH se projeví výrazným zvýšením ionizace bazických léčiv ve fetální krvi. Dalším příkladem je kumulace
slabých bází v kyselé moči a slabých kyselin v bazické moči. Disociovaná
forma léčiva se nereabsorbuje v tubulech a vylučuje se močí.
Tabulka 3 pH vybraných tělních tekutin
Tělní tekutina
Moč
Žaludeční štáva
Tenké střevo – duodenum
– ileum
Tlusté střevo
Plazma
Cerebrospinální tekutina
Fetální plazma
Mateřské mléko
pH
4,0–8,0
1,0–3,0
5,0–6,0
8
8
7,36–7,44
7,35
7,3
6,4–7,6
2.3.2 Plazmatická stabilita
Hydrolýza látek v plazmě má zásadní vliv na plazmatický poločas, rychlost
eliminace a je často příčinou nedostatečného účinku až selhání in vivo.
Nedostatečná stabilita v plazmě ovlivňuje i samotné in vitro testování, například testování vazby na plazmatické bílkoviny. Plazmatickou hydrolýzu
látek způsobuje nejčastěji enzymatická hydrolýza katalyzovaná plazmatickými esterázami, ale i jinými cirkulujícími enzymy, jako jsou amidázy,
lipázy, fosfatázy a peptidázy. Nejnáchylnější k hydrolýze jsou samozřejmě
estery, ale za rizikové jsou považovány i amidy, karbamáty, laktamy, laktony
a sulfonamidy.
Plazmatická nestabilita je naopak žádaná u tzv. proléčiv. Proléčivo
obsahuje ve své molekule chránící skupinu, díky které je farmakologicky neaktivní, ale vykazuje např. lepší rozpustnost nebo střevní absorpci.
Po plazmatické hydrolýze dojde k rychlému uvolnění aktivní formy léčiva.
Experimenty zjišťující stabilitu látek v plazmě jsou velmi jednoduché.
Krevní plazma si i v inkubačních podmínkách (37 °C) zachovává enzymatickou aktivitu až 24 hodin. Plazmatické enzymy, hlavně esterázy, nevyžadují
26
přídavek kofaktorů pro svoji aktivitu, reakce je tedy iniciována pouhým
přidáním látky k plazmě a ukončena přídavkem organického rozpouštědla
a následnou centrifugací, která odstraní precipitované proteiny.
2.3.3 Vazba na plazmatické proteiny
Vazba látky na plazmatické proteiny může výrazně ovlivnit terapeutický
účinek léčiva, protože jen volné, nenavázané léčivo se může distribuovat
v organizmu, procházet z krevního řečiště do extravaskulární tkáně a dospět k místu účinku. Vazba na plazmatické bílkoviny je nespecifická a reverzibilní, tedy nezabrání farmakologickému účinku, ale zpomalí ho. Mezi
navázanou a volnou frakcí se ustanovuje dynamická rovnováha. Léčiva se
váží hlavně na albumin, α1-kyselý glykoprotein a lipoproteiny (tabulka 4),
přičemž léčiva s vyšší lipofilitou vykazují větší tendenci vázat se na plazmatické bílkoviny.
Zjistit, zda se nově vyvíjené látky váží na plazmatické bílkoviny v počátečních stádiích preklinického testování je tedy důležité, informace o míře
vazby látky na plazmatické proteiny dotváří farmakokinetický profil a je
zásadní pro představu ohledně dávkování vyvíjeného léčiva. Pokud se látka
váže extenzivně na proteiny, je nutné počítat s vyšším dávkováním. Současně
vytváří navázaná látka na proteiny rezervoár léčiva. Podáním vysoké dávky
léčiva může dojít k saturaci vazebné kapacity proteinů a další podání léčiva
může vyvolat neúměrný nárůst koncentrace volné frakce látky v plazmě.
Vytěsnění léčiva z vazby jiným spolupodaným léčivem se již nepovažuje
za významný rizikový faktor, protože vazba na proteiny je dynamická a reverzibilní.
Tabulka 4 Vazba na plazmatické proteiny – přehled
Plazmatický protein
Mr [kDa] koncentrace [uM]
albumin
67
500–700
42
9–23
α1 – kyselý glykoprotein
lipoproteiny
200–2400
variabilní
cortisol – binding protein
53
0,6–1,4
preference vazby
kyselá léčiva
bazická léčiva
lipofilní a bazická léčiva
steroidy
Tabulka převzata a upravena dle Tsaioun a Kates 2011
27
2.3.3.1 Metody používané k určení vazby na plazmatické proteiny
2.3.3.2 Rovnovážná dialýza
Metoda založená na rovnovážné dialýze je považována za zlatý standard pro
testování vazby látek na plazmatické proteiny. Do testovacího zařízení se
vloží inzert se semipermeabilní membránou, která odděluje kompartment
obsahující proteiny od kompartmentu bez proteinů. Do jednoho kompartmentu se umístí plazma s testovanou látkou a do druhého jen pufr.
Během dosahování rovnováhy může látka, která se neváže na proteiny, procházet přes semipermeabilní membránu. Tato membrána není propustná
pro velké molekuly, jako jsou proteiny, proto látka, která se na proteiny váže,
zůstane v kompartmentu s plazmou. Po dosažení rovnováhy se analyzuje
koncentrace látky v obou kompartmentech a vypočítá se, jaké množství
látky se váže na proteiny.
Výhody:
– přesnost (pro vysoce vázající se látky lze použít 10% nebo 50% plazmu
a tím dosáhnout přesného rozlišení)
– minimalizace nespecifické vazby látky na součásti testovacího zařízení
(minimalizace falešně pozitivních výsledků)
– možnost high-throughput provedení
Nevýhody:
– vyšší cena než u ostatních metod
2.3.3.3 Ultrafiltrace
Ultrafiltrace se provádí v kolonkách nebo 96 jamkových destičkách, které obsahují filtr se semipermeabilní membránou. Na filtr se umístí roztok
s testovanou látkou a proteiny, během centrifugace prochází nenavázaná
látka přes semipermeabilní membránu a látka navázaná na proteiny zůstává
zachycena na filtru. Zjištění míry vazby látky na proteiny se provede na základě poměru koncentrací látky v kompartmentu s a bez proteinů.
Výhody:
– rychlost, cena, high-throughput
28
Nevýhody:
– horší rozlišení vysoce se vázajících látek
– riziko nespecifické vazby látky na plast
2.3.3.4 Ultracentrifugace
Plazma se pomocí ultracentrifugace (100 000 × g) rozdělí do tří vrstev.
Na povrchu se nacházejí chylomikrony a LDL částice, pod povrchem je
frakce bez proteinů a na dně proteiny. Koncentrace léčiva se měří z frakce
bez proteinů.
Nevýhody:
– dlouhá doba centrifugace (6 hodin)
– spotřeba velkého množství plazmy
– malá kapacita vzorků
Existuje řada dalších technik pro studium vazby látek na plazmatické proteiny, např. chromatografické a spektroskopické metody, ale vzhledem k tomu,
že se většinou rutinně nepoužívají, nejsou zde detailně popsány (detailní
informace lze nalézt např. v Zhang a Surapaneni, 2012).
2.3.4 Fyziologické bariéry distribuce
Jako fyziologické bariéry se označuje specifické uspořádání kapilár a epitelií,
které má omezit distribuci látek do některých orgánů z centrálního kompartmentu a zároveň zachovávat stálé vnitřní prostředí za fyziologickou
bariérou. Bariéry chrání životně důležité nebo vůči toxickému poškození
citlivé orgány jako jsou centrální nervový systém (CNS), varlata a plod.
2.3.4.1 Hematoencefalická bariéra
Centrální nervový systém je oddělen od ostatního vnitřního prostředí hematoencefalickou bariérou (HEB). Hematoencefalická bariéra je tvořena
těmito součástmi (viz obrázek 7):
– endoteliální buňky mozkových kapilár spojené mezi sebou těsnými spoji
(angl. tight junctions). Tyto spoje endotelií znemožňují paracelulární
přestup
– astrocytární výběžky přiléhají k endoteliím mozkových kapilár i k sobě
navzájem a dokonale obepínají mozkové kapiláry
29
V důsledku tohoto uspořádání vysokomolekulární látky téměř neprostupují
přes HEB. Podobně hydrofilní xenobiotika, ionizovaná léčiva a jejich metabolity prostupují touto bariérou omezeně. Naopak léčiva nízkomolekulární
s optimální hodnotou log P (1,8–2,2) pronikají do CNS pasivní difúzí.
V hematoencefalické bariéře hrají zásadní roli také transportéry, např.
P-glykoprotein a BCRP transportéry.
Obrázek 7 Znázornění struktury hematoencefalické bariéry
2.3.4.2 Modely pro hodnocení průchodu látek
přes hematoencefalickou bariéru
BBB-PAMPA (angl. blood brain barrier PAMPA)
Pro high-throughput testování velkého množství látek lze použít metodu
PAMPA (detailně popsaná v kapitole 2.2.1.1). Existuje řada publikací, která
se zabývá modifikací metody PAMPA pro hodnocení permeability látek přes
hematoencefalickou bariéru. Autoři se přiklánějí k různým složením lipidů,
které se nanášejí na filtry v 96 jamkových destičkách. Pro detailní studium
odkazujeme např. na publikaci Mensch a kol. 2010. Hlavní nedostatek této
metody spočívá v absenci transportních proteinů.
MDR1-MDCK
Buněčná linie MDR1-MDCK je odvozena stabilní transfekcí MDR1 genu
kódujícího P-glykoprotein linie MDCK (angl. Madin Darby canine kidney,
Madin Darbyho psí ledvinové buňky). Tato linie se používá pro studium
30
substrátů a inhibitorů P-glykoproteinu a také pro hodnocení přestupu nově
vyvíjených léčiv přes hematoencefalickou bariéru.
Buňky se kultivují na semipermeabilní membráně, uspořádání experimentu je velmi obdobné jako u Caco-2 modelu absorpce (kapitola 2.2.1.1),
ale doba kultivace je v případě MDR1-MDCK buněk jen 3 až 4 dny (na rozdíl od Caco-2 buněk je P-glykoprotein stabilně exprimován, není tedy třeba
dlouhá doba kultivace). Stejně jako u Caco-2 modelu absorpce se vypočítá
koeficient permeability a na základě této hodnoty se usuzuje, zda látka prochází či neprochází přes hematoencefalickou bariéru.
2.3.4.3 Další bariéry
Placentární bariéra
Placenta je orgán, který zajišťuje výměnu látek a plynů mezi matkou a plodem. Placenta je tvořena částečně z mateřských (decidua basalis sliznice
dělohy, septa) a fetálních tkání (choriová ploténka, klky s fetálními cévami).
Mateřská a plodová krev se v placentě nemísí! Odkysličená fetální krev je
přiváděna do placenty dvěma pupečníkovými artériemi, okysličená krev se
vrací z placenty jednou pupečníkovou vénou. K výměně látek mezi matkou
a plodem dochází na placentární bariéře, která se skládá z následujících
částí:
– syncytiotrofoblast – kontinuální mnohojaderná vrstva, vzniklá splynutím buněk. Syncytiotrofoblast je rozhodující vrstvou bariéry
– neúplná vrstva cytotrofoblastu – v druhé polovině těhotenství vymizí
– fetální endotel kapilár – endotel fetálních kapilár není dokonale spojen
těsnými spoji a obsahuje fenestrace, není proto významnou součástí
bariéry pro přestup léčiv.
Faktory, které určují přestup léčiv přes placentární bariéru jsou molekulová
hmotnost, lipofilita, náboj, pKa a vazba na plazmatické bílkoviny. Lipofilní
látky (např. thiopental) se transportují rychle a rovnováha mezi matkou
a plodem je dosažena během několika minut. Podobně hydrofilní látky
do molekulové hmotnosti 600 Da přecházejí placentární bariéru snadno.
Slabé báze jsou v kyselejší fetální krvi (pH 7,3) více ionizovány a kumulují
se v plodu. Dochází k tzv. ion trapping fenoménu.
31
Obrázek 8 Schéma placentární bariéry a hematotestikulární bariéry
Hematotestikulární bariéra
Hematotestikulární bariéra chrání genetickou výbavu spermií před toxickým působením xenobiotik. Testes obsahují kapiláry bez těsných spojů,
které jsou permeabilní i pro větší hydrofilní látky. Hlavní součástí hematotestikulární bariéry jsou těsně přiléhající Sertoliho buňky tvořící semenotvorný kanálek (viz obrázek 8). Hematotestikulární bariéra zabraňuje vstupu
především hydrofilních látek, lipofilní látky pronikají snáze pasivní difúzí.
32
2.3.5 Lékové transportéry
Rozvoj buněčné biologie, biofarmacie a farmakologie v minulých dvou dekádách přispěl k zjištění, že membránové transportéry jsou klíčové pro vstup
léčiv do buněk. Padla tak částečně teorie o zásadní roli pasívní difúze. Pojem
„lékový transportér“ (z anglického „drug transporter“) vyjadřuje fakt, že
některé membránové transportéry lokalizované v biologických membránách
buněk jsou schopné primárně transportovat léčiva nebo jiná xenobiotika
aniž by byl pro ně znám endogenní substrát.
2.3.5.1 Klasifikace transportérů léčiv
V současnosti bylo detailněji charakterizováno několik desítek membránových přenašečových proteinů (transportérů), které mají význam pro
farmakokinetiku léčiv. Testování interakcí látek s nejdůležitějšími transportéry v rámci preklinického hodnocení léčiv je zakotveno v guidelinech
nejuznávanějších regulačních autorit řídících vývoj léčiv (včetně evropské
European Medicines Agency-EMA a Food and Drug Administration – FDA
ve Spojených státech amerických). Transportéry dělíme podle proteinové
struktury do dvou velkých skupin, na tzv. ABC transportéry a transportéry
hydrofilních látek (angl. solute carriers – SLC transportéry). Nejdůležitější
lékové transportéry jsou uvedeny v tabulce 5.
33
34
metformin, H2 antagonisté
p-aminohipurát, diuretika
antivirotika
Názvy transportérů nemají v českém jazyce ekvivalenty, proto jsou uvedeny anglické názvy.
Tabulka převzata a zkrácena z monografie Skálová a kol. 2011
OCT1
OAT1
antipod s dikarboxylovými kyselinami
facilitovaná difúze
antiport
antiport
statiny a glinidy
AT inhibitory
steroidní konjugáty, statiny
OATP1B1
OATP1B3
OATP2B1
sinusoidální membrána hepatocytů
sinusoidální membrána hepatocytů,
placentární trofoblast
bazolaterální membrána ledviných tubulů
kotransport s bikarbonátem
nebo gluthationem
žlučové kyseliny,
digoxin
ATP
H+ antiport
konjugáty, statiny, chinolony
ATP
např. penicilíny
jako P-glykoprotein
konjugáty sulfátu, diuretika
antibiotika
ATP, kotransport GSH
ATP hydrolýza (primární transport)
Mechanizmus transportu
Solute Carrier transportéry
PEPT1/PEPT2
apikální membrána enterocytů,
hematoencefalická membrána
OATP1A2
hematoencefalická bariéra,
BCRP
MRP4
konjugáty, statiny
kanalikulární membrána hepatocytů,
sekrece do žluče
apikální strana epitelových buněk
proximálního tubulu
MRP2
Substráty
celá řada lipofilních léčiv
Tkáň
ABC transportéry
P-glykoprotein
apikální membrány všech fyz. bariér
Název
Tabulka 5 Stručná charakteristika nejdůležitějších lékových transportérů
ABC transportéry jsou především primární transportéry, získávající
energii nutnou k transportu vlastní enzymatickou hydrolýzou ATP. Transportéry rodin OAT, OATP, OCT, a PEPT náležející mezi SLC transportéry
jsou naproti tomu považovány za sekundární nebo terciární transportéry
získávající energii z kotransportu nebo antiportu iontů nebo jiných látek,
které tvoří na membráně koncentrační gradient.
Podle směru transmembránového transportu jsou transportéry také klasifikovány na tzv. „uptake“ transportéry přenášející substráty do buňky
(většina SLC transportérů, např. OATP transportéry) a na „efflux“ transportéry, které transportují substráty z buňky (ABC transportéry).
Pozn.: Prvním objeveným transportérem léčiv byl na začátku sedmdesátých let P-glykoprotein. Nádorové buňky s vysokou expresí P-glykoproteinu
byly rezistentní k širokému spektru cytostatik, jelikož P-glykoprotein vypuzoval cytostatika z nádorových buněk. Tento fenomén byl později označen
jako multidrug resistance phenomenon (MDR, český ekvivalent – fenomén
mnohočetné lékové resistence).
2.3.5.2 Role transportérů při distribuci léčiv
Lékové transportéry plní zásadní funkci při transportu léčiv především
v hepatocytech, v tubulech ledvin, v enterocytech a ve fyziologických bariérách těla.
Studium transportérů léčiv v posledních letech změnilo doposud přijímanou představu, že membránové transportéry přenášejí pouze hydrofilní
látky. Například nejdůležitější lékový transportér P-glykoprotein je klíčovým
transportérem lipofilních léčiv s vyšší molekulovou hmotností. Navíc doposud není zcela zřejmé, zdali tento transportér má nějaké významné endogenní substráty transportu. Předpokládá se proto, že fyziologickou funkcí
P-glykoproteinu je transport xenobiotik spojený s jejich eliminací z těla.
Většina transportérů endogenních substrátů současně transportuje
některá xenobiotika na základě strukturální chemické podobnosti s endogenními substráty. Například transportér aminokyselin PEPT1 přenáší
aminokyselinám strukturálně blízké antiepileptikum gabapentin.
V hepatocytech na sinusoidální (basolaterální) membráně se na vstupu
léčiv do hepatocytů podílí především transportéry z rodiny OATP (např.
OATP1B1, OATP2B1). Eliminace léčiv a jejich konjugátů do žluče je zprostředkována především efluxními transportéry MRP2, P-glykoproteinem
a BCRP.
35
Ve střevě se transportér PEPT1 podílí na transportu di- a tripeptidů
do enterocytů, ale také řady β-laktamových antibiotik, ACE inhibitorů (inhibitorů angiotenzin konvertujícího enzymu), cytostatik a antivirotik. Podobně někteří zástupci podrodiny OATP zajišťují vstup léčiv z lumen střeva
do enterocytů. Efluxní transportéry P-glykoprotein a BCRP lokalizované
na apikální membráně enterocytů naopak brání vstřebání lipofilních léčiv
a toxinů do těla.
V ledvinách se transportéry podílí na tubulární sekreci a reabsorpci. Sekrece některých β-laktamových antibiotik (cefamandol, cefazolin)
a antivirotik (aciklovir, cidofovir) v proximálním tubulu prostřednictvím
transportérů OAT3 a OAT1. Podobně aktivní transportéry podrodiny MRP
a P-glykoprotein se účastní sekrece (exkrece) látek do moči. Naproti tomu
transportéry PEPT1 a PEPT2 se podílejí v proximálních tubulech na reabsorpci amoxicilinu nebo cefadroxilu z moči do tubulů.
Transportéry také selektivně určují, jakou cestou se bude eliminovat
léčivo z organizmu. Zjednodušeně lze říct, že amfipatické organické anionty
s velkou molekulovou hmotností jsou exkretovány do žluče ABC transportéry, zatímco malé a hydrofilní organické anionty jsou secernovány OAT
transportéry do moči.
V hematoencefalické bariéře se předpokládá klinický významná funkce především efluxních ABC transportérů P-glykoproteinu a BCRP. Tyto
transportéry zamezují vstupu mnoha léčiv do mozku.
Placentární bariéra je částečně také tvořena aktivitou P-glykoproteinového a BCRP transportéru.
Vliv transportérů v dalších orgánech je pro celkovou distribuci léčiv
minoritní.
36
Obrázek 9 Lokalizace nejdůležitějších transportérů v hepatocytech, enterocytech,
ledvinných tubulech, v hematoencefalické a placentární bariéře.
Převzato a modifikováno dle Tsuji 2006.
2.3.5.3 Metody pro hodnocení interakce nově vyvíjených léčiv
s lékovými transportéry
MDR1-MDCK
MDR1-MDCK model absorpce je popsán v kapitole 2.3.4.2, kde je vysvětleno, že buněčná linie MDR1-MDCK exprimuje P-glykoprotein. Proto se
tato linie používá pro studium substrátů a inhibitorů P-glykoproteinu.
Pokud je efluxní poměr (viz kapitola 2.2.1.1) vyšší než dva, je daná látka
hodnocena jako substrát P-glykoproteinu. V paralelním experimentu se
současně s testovanou látkou inkubuje známý inhibitor P-glykoproteinu,
např. verapamil, a pokud dojde k snížení efluxního poměru testované látky,
potvrzuje se tím, že daná látka je substrátem tohoto transportéru. Verapamil zablokuje transportní funkci P-glykoproteinu a ten testovaný substrát
37
nemůže přenášet, hodnota koeficientu permeability ve směru AB se zvýší
a tím dojde ke snížení efluxního poměru.
Aby se testovaná látka charakterizovala jako inhibitor P-glykoproteinu,
použije se známý substrát P-glykoproteinu, např. digoxin a pokud dojde
ke zvýšení permeability digoxinu ve směru AB, a tudíž ke snížení efluxního
poměru digoxinu, hodnotí se testovaná látka jako inhibitor P-glykoproteinu.
Caco-2
Caco-2 model absorpce je detailně popsán v kapitole 2.2.1.1. Princip studia
substrátů a inhibitorů lékových transportérů je shodný jako u výše popsaného modelu MDR1-MDCK, ale u Caco-2 linie lze kromě P-glykoproteinu
využít další exprimované transportéry (např. BCRP, transportéry z rodiny
MRP).
2.4 Metabolizmus léčiv
Metabolizmus (biotransformace) je metabolická přeměna léčiva v organizmu s cílem zvýšit jeho exkreci z organizmu. Většina metabolických reakcí léčiv směřuje k hydrofilnějším metabolitům léčiv s větší molekulovou
hmotností, které mají předpoklady být vyloučeny jedním ze dvou hlavních
procesů exkrece – biliární sekrecí do žluče nebo ledvinnou exkrecí.
Metabolizmus léčiv je vždy spojen s chemickou modifikací léčiva zprostředkovanou metabolickými enzymy. Ty se dělí na enzymy I. fáze metabolizmu (oxidoredukční enzymy) a enzymy II. fáze (konjugační enzymy). Pojmy
první a druhá fáze jsou matoucí, jelikož řada léčiv je metabolizována pouze
enzymy druhé fáze nebo enzymy obou fází současně. Mezi nejdůležitější
enzymy první fáze biotransformace patří enzymy mikrozomálního systému cytochromu P450. Ze sedmnácti známých rodin enzymů cytochromu
P450 se na metabolizmu léčiv podílí významně pouze první tři rodiny. Tyto
enzymy se významně účastní na metabolizmu více než poloviny soudobých léčiv. Mezi nejdůležitější enzymy cytochromu P450 náleží enzymy
CYP3A4, CYP2C9, CYP2D6, CYP1A2 a CYP2B6. Se všemi těmito formami
cytochromu P450 je třeba testovat látky v rámci preklinického vývoje podle
doporučení regulačních agentur. Testuje se metabolizmus látky jednotlivými
enzymy (pro určení tzv. metabolické stability látky) nebo inhibice biotransformačního enzymu vyvíjenou látkou z důvodu eliminace rizik lékových
interakcí.
38
Mezi nejdůležitější enzymy II. fáze biotransformace náleží konjugační
systémy UDP-glukuronosyltransferázy (UGT) a sulfotransferázy (SULT).
Protokoly regulačních agentur opět pamatují na testování metabolické stability nebo metabolického profilování (určení metabolitů nebo metabolizmu
jednotlivými biotransformačními enzymy) s enzymy druhé fáze biotransformace.
Detailnější obecný přehled metabolizmu léčiv je uveden v monografii
Skálová a Boušová, Metabolizmus léčiv a jiných xenobiotik.
Metabolická stabilita látek se testuje v počátečních fázích vývoje léčiv, je
to jeden z nejdůležitějších parametrů v rámci ADMETox hodnocení nových
látek. V počátečních stádiích vývoje léčiv je důležité vyřadit nejméně vhodné kandidáty, které by bylo zbytečné testovat dále. Látky, které podléhají
rychlému metabolizmu, by se musely v terapii podávat několikrát denně,
což je pro pacienta nepohodlné a časté dávkování snižuje compliance (spolupráci pacienta při léčbě). Další možností podání rychle metabolizované
látky je kontinuální infúze, ale u nově vyvíjených léčiv je snaha najít látky,
které se podávají perorálně, což je opět výhodnější pro pacienta. Na druhou
stranu, látky, které se metabolizují velmi pomalu nebo vůbec, se také pomalu
eliminují z těla a mohou působit toxicky.
Nejprve se tedy zjišťuje pomocí jednoduchých testů metabolická stabilita látek, tzn., jak rychle se testovaná látka metabolizuje. Nestabilní látky se vyřadí z dalšího testování. V dalších fázích vývoje léčiva se studuje
podrobněji metabolizmus kandidátních látek, aby se odhalily potenciální
lékové interakce, které by nově vyvíjené látky mohly způsobovat zásahem
do metabolizmu spolupodaných léčiv, a tím zvyšovat jejich toxicitu nebo
naopak snižovat terapeutický účinek (většinou mechanizmem inhibice nebo
indukce metabolizujících enzymů).
Perorálně podané látky se absorbují ze střeva do krve a portální žílou
putují do jater, která jsou hlavním orgánem metabolizmu a důležitým orgánem eliminace.
2.4.1 In vitro modely pro hodnocení metabolické stability
2.4.1.1 Jaterní mikrozomy
Jaterní mikrozomy jsou subcelulární frakce hepatocytů (obrázek 10), obsahující enzymy cytochromu P450. In vitro model s jaterními mikrozomy je metodou volby pro počáteční testování metabolické stability látek.
39
Kvalitní mikrozomy, izolované z řady druhů zvířat a samozřejmě i lidské,
jsou komerčně dostupné, smícháním např. z 50 jedinců se navíc podstatně
eliminuje riziko interindividuální variability. V samotném experimentu se
mikrozomy inkubují pouze s pufrem a kofaktorem – nikotinamidadenindinukleotidfosfátem (NAPDH), který je rovněž komerčně dostupný.
Jaterní mikrozomy obsahují mimo enzymů P450 také UDP-glukuronosyltransferázy, které se jako konjugační enzymy řadí k metabolizmu II. fáze
a jako kofaktor vyžadují uridin 5’-difosfoglukuronovou kyselinu, takže aktivity enzymů P450 a UGT lze „oddělit“ použitím vhodného kofaktoru.
Výhody:
– nízká cena
– high-throughput screening
– obsahují kompletní enzymy I. fáze metabolizmu
Nevýhody:
– mikrozomy jsou subcelulární frakce, a tudíž nemají intaktní buněčnou
membránu (k mikrozomům mají tedy přímý přístup i ty látky, které
neprocházejí přes buněčnou membránu)
– vyžadují dodání kofaktorů
2.4.1.2 Primární lidské hepatocyty
Hepatocyty představují in vitro model blížící se více in vivo podmínkám,
protože obsahují buněčnou membránu a nevyžadují přídavek kofaktorů.
V hepatocytech jsou samozřejmě jak enzymy I. fáze, tak i II. fáze metabolizmu. Navíc vstup do hepatocytů řídí přirozené uptake transportéry a eliminaci hydrofilních metabolitů a konjugátů regulují efluxní transportéry,
což je podobné jako v případě in vivo podmínek. Primární hepatocyty se
po izolaci z jater kultivují v monovrstvě. Bohužel během kultivace dochází
často k dediferenciaci a ztrátě metabolických vlastností. Pokud se zachovají
mezibuněčné interakce, případně se kultivuje v přítomnosti extracelulární
matrix (kolagen), dochází k obnově polarity buňky. Kultivační médium
je nutné suplementovat glukokortikoidy (dexametazon) a inzulinem, tyto
látky jsou nezbytné pro udržení metabolických funkcí hepatocytů. Primární hepatocyty lze rovněž kultivovat mezi dvěma vrstvami kolagenového
gelu, tento typ kultivace se nazývá sendvičový. V tomto modelu dochází
ke zvýšení mezibuněčných kontaktů a takto lze hepatocyty kultivovat až
40
čtyři týdny. Primární hepatocyty mají polygonální tvar a dokonce dochází
k tvorbě žlučových kanálků. Popsána je i kultivace hepatocytů ve formě
mnohobuněčných sféroidů, což jsou shluky buněk o velikosti asi 100 μm.
Komerčně dostupné jsou již i lidské hepatocyty. Jaterní mikrozomy se
nejčastěji používají v primárním screeningu, zatímco hepatocyty v sekundárním.
Výhody:
– metabolicky kompetentní model bližší in vivo podmínkám
– přítomnost transportních proteinů
Nevýhody:
– cena
– interindividuální variabilita
– nemožnost high-throughput provedení
Obrázek 10 Modelové in vitro systémy pro stanovení metabolické stability
41
Metabolická stabilita a interpretace dat:
Při použití mikrozomů i hepatocytů se nejčastěji aplikuje přístup, kdy se
v čase měří ubývající koncentrace parentní látky, než aby se v primárním
screeningu detekovaly vznikající metabolity. Obvykle se ve čtyřech až pěti
časových intervalech měří koncentrace metabolizované látky, což umožňuje výpočet biologického poločasu t1/2 a vnitřní (intrinsic) clearance látky
(CLint). Pojem vnitřní clearance znamená jednoduše schopnost jaterních
enzymů metabolizovat testovanou látku, bez dalších vlivů, které se nacházejí
v in vivo systému, jako je vazba látky na proteiny, průtok krve játry, atd.
Látky se podle hodnot vnitřní clearance kategorizují jako látky s malou,
střední nebo vysokou CLint, což odráží rychlost jejich metabolizmu. Podle
FDA patří mezi vhodné kandidáty látky s malou nebo střední CLint (tedy
látky metabolizující se pomalu nebo středně rychle). Pro detailnější přístupy
výpočtu CLint odkazujeme na literaturu uvedenou na konci kapitoly.
2.4.2 Nukleární receptory
V průběhu evoluce se vyvinuly adaptační mechanizmy využívající tzv. nukleární receptory. Prostřednictvím zesílené transkripční regulace (indukce)
biotransformačních enzymů po expozici organizmu toxiny nebo jinými
xenobiotiky organizmus čelí toxickému poškození.
V těchto skriptech se zaměříme především na transkripční regulaci
genové exprese prostřednictvím pregnanového X receptoru (PXR), konstitutivního androstanového receptoru (CAR) a arylhydrokarbonového receptoru (AhR). Tyto nukleární receptory a transkripční faktory patří vůbec
k nejdůležitějším mechanizmům řídících genovou regulaci biotransformačních enzymů a transportérů ovlivňujících farmakokinetiku. Jejich znalost
je zásadní především pro pochopení lékových interakcí na úrovni indukce
biotransformačních enzymů cytochromu P450. V řadě případů je interakce
vyvíjeného léčiva s těmito nukleárními faktory problematická z pohledu
rizika lékových interakcí. Při vývoji se proto pokud možno eliminují silné
aktivátory a ligandy těchto receptorů.
PXR a CAR působí jako tzv. „senzory“ toxických endogenních metabolitů i exogenních chemických látek. Tato jejich unikátní funkce je odlišuje
od receptorů steroidních hormonů.
42
Obrázek 11 Schematické znázornění proteinů účastnících se transkripční aktivace genové exprese
prostřednictvím nukleárních receptorů PXR a CAR (A.) a arylhydrokarbonového receptoru (B.).
Převzato z Pávek a Dvořák, 2008.
Mechanizmus aktivace nukleárních receptorů PXR a CAR je v jednoduchosti zobrazen na obrázku 11.
V těle je PXR ve velké míře přítomen především v játrech, méně v tenkém a tlustém střevě a v ledvinách. Aktivace PXR probíhá přímou vazbou
ligandu na receptor. PXR tvoří dimer s retinoidním receptorem RXRα a společně rozpoznávají specifické sekvence promotorové DNA regulovaných
cílových genů označované jako responzivní sekvence PXR-RE (PXR response
element).
PXR společně s CAR regulují celou řadu genů pro enzymy I. a II. fáze
biotransformace a transportérů (Tabulka 6). K nejdůležitějším patří hlavní
forma cytochromu P450 – CYP3A4, zapojená do metabolizmu více jak
50 % léčiv.
43
K ligandům PXR náleží farmaka z celé řady terapeutických skupin,
některé toxiny i endogenní steroidy (tabulka 6). Díky širokému spektru
ligandů i množství regulovaných biotransformačních enzymů a lékových
transportérů je PXR receptor považován za jeden z nejdůležitějších faktorů
ovlivňujících farmakokinetiku léčiv.
Konstitutivní androstanový receptor (angl. constitutive androstane receptor, CAR, NR1I3) je intracelulárně přítomen v cytoplazmě hepatocytů,
odkud se po aktivaci dostává translokací do jádra. CAR řídí transkripci
důležitých genů podílejících se na metabolizmu endogenních látek, jako
jsou bilirubin, žlučové kyseliny, hormony štítné žlázy, steroidní hormony
a mastné kyseliny.
Aktivace CAR probíhá dvěma způsoby: přímou aktivací nukleárního
receptoru ligandem – tj. vazbou ligandu na nukleární receptor. Tímto způsobem aktivuje transkripci modelová látka CITCO. Fenobarbital a fenytoin,
nejznámější induktory kooperující s CAR receptorem, aktivují transkripci
regulovaných genů prostřednictvím tohoto nukleárního receptoru nepřímo,
bez vazby na nukleární receptor (obrázek 11). Transkripční aktivace pak
probíhá podobně jako v případě PXR receptoru.
Tabulka 6 Nejdůležitější geny kódující enzymy cytochromu P450
a lékové transportéry regulované vybranými nukleárními receptory
Nukleární receptor
Pregnanový X receptor
(PXR)
Regulované geny
CYP2B6
CYP2C9
CYP3A4/5
CYP3A7
Konstitutivní
androstanový receptor
(CAR)
UTG1A1
Sult2a1,9 CYP2C9,19
CYP3A4 CYP2B6
Arylhydrokarbonový
receptor (AhR)
CYP1A1
CYP1A2
CYP1B1
UGT1A1
UGT1A6
44
SULT2A1
UGT1A1,3,4
P-glykoprotein
Oatp2
Mrp3,Mrp4
P-glykoprotein
CYP2A6
Cyp2b2
Cyp2b10
Tabulka převzata z článku Tirona a Kim 2005, malými písmeny jsou označeny geny hlodavců.
Tabulka 7 Některá léčiva interagující s pregnanovým X (PXR) a konstitutivním androstanovým (CAR) nukleárním receptorem
PXR
CAR
rifampicin
troglitazon, rosiglitazon
glimepirid
sildenafil
loratadin
lovastatin
haloperidol
klotrimazol
terbinafin
mifepriston (RU-486)
hyperforin
nifedipin
paklitaxel (Taxol)
ritonavir
gemfibrozil
spironolakton
tamoxifen
Cyproteron
Glutethimid
Lovastatin
Metyrapon
Fenobarbital
Dexametason – ve vysokých
koncentracích
a další
fenobarbital
fenytoin
statiny
valproát
CITCO
6-(4-chlorophenyl)imidazo[2,1-b]
[1,3]thiazol-5-karbaldehyd
O-(3,4-dichlorobenzyl) oxim
Inhibitory (inverzní agonisté):
androstanol
androstenol
klotrimazol
3α,5α-androstanol
Inhibitor:
ketokonazol
Arylhydrokarbonový receptor (AhR) náleží do skupiny bazických helix-loop-helix/PAS transkripčních faktorů, není proto klasickým nukleárním
receptorem. Po navázání ligandu komplex translokuje do jádra, AhR váže
protein ARNT (angl. aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator), a tento heterodimer se váže v jádře na responzivní promotorové oblasti regulo45
vaných genů označované jako XRE nebo DRE (angl. xenobiotic nebo drug
response elements). AhR receptor je důležitým nukleárním receptorem,
který silně indukuje cytochromy CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 a konjugační
enzymy UDP-glukuronosyltransferázu UGT1A1 a UGT1A6. Naproti tomu
konstitutivní (bazální) exprese CYP1A2 enzymu i jeho inducibilní exprese
je specifická pro hepatocyty.
Mezi ligandy AhR náleží celá řada xenobiotik, produktů chemického
průmyslu, mnoho polutantů, kontaminantů, produktů hoření, pesticidů
ale i některá léčiva jako je např. omeprazol. Mezi nejznámější ligandy patří
aromatické polycyklické a halogenované sloučeniny, například 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD, dioxin).
2.4.3 Hodnocení potenciálu nově vyvíjených látek
způsobovat lékové interakce
Nejčastějšími příčinami lékových interakcí jsou indukce a inhibice metabolizujících enzymů, které mají za následek nedostatečný účinek nebo naopak
účinek toxický. Inhibice enzymů P450 pak způsobuje zvýšení plazmatické
hladiny spolupodané látky, pokud je tato látka metabolizovaná inhibovaným
enzymem. V průběhu vývoje léčiva se proto snažíme najít takové kandidátní
molekuly, které mají nízký potenciál k těmto lékovým interakcím.
2.4.3.1 Indukce izoenzymů cytochromu P450
Většina izoenzymů cytochromu P450 je indukovatelná, a to na úrovni indukce genové exprese. Indukce je na rozdíl od inhibice enzymů P450 pomalý proces, trvající řádově dny (oproti minutám v případě inhibice). Nejčastěji se studuje indukce izoforem CYP3A4, CYP1A2, CYP2B6 a CYP2C9.
Mechanizmus indukce je popsaný v kapitole 2.4.2.
Pro studium indukce P450 jsou nejvhodnější primární lidské hepatocyty. Čerstvě izolované hepatocyty se kultivují 24–72 hodin s testovanou
látkou (dochází k indukci enzymu, přehled referenčních induktorů viz tabulka 8) a poté se přidá specifický substrát enzymu. Měří se koncentrace
vznikajícího metabolitu. Také je možné izolovat mRNA a pomocí metody
reverzní transkripce a real-time PCR detekovat indukci konkrétního enzymu na transkripční úrovni.
46
Tabulka 8 Přehled in vitro induktorů izoenzymů cytochromu P450 preferovaných jako pozitivní kontroly pro studium indukce enzymů P450 dle FDA
CYP
Induktor
1A2
omeprazol
lansoprazol
fenobarbital
rifampicin
rifampicin
rifampicin
2B6
2C9
2C19
3A4
Doporučená koncentrace
(μM)
25–100
10
500–1000
10
10
10–50
Násobek enzymové aktivity
14–24
10
5–10
3,7
20
4–31
Pro studium indukce enzymů P450 se používají i rekombinantní systémy,
např. metody genové reportérové eseje, které je možné nastavit pro high-throughput screening. Podstatou genové reportérové eseje je transfekce2
vhodné buněčné linie rekombinantním plazmidem, který obsahuje regulační oblasti (responzivní elementy a vazebné místo pro nukleární receptor)
a cDNA pro reportérový gen (např. luciferázu). Často musí být také kotransfekován nukleární receptor, protože imortalizované buněčné linie ztratily
schopnost endogenní exprese nukleárních receptorů. Po transfekci se buňky
inkubují obvykle 24 hodin s testovanou látkou a po inkubaci se měří aktivita
reportérového genu (v případě luciferázy chemiluminiscenčně).
2.4.3.2 Inhibice izoenzymů cytochromu P450
Nejčastěji se zkoumá inhibice pěti nejdůležitějších izoenzymů P450, a to
CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 a CYP3A4. Substrát specifický pro
zkoumaný izoenzym (viz tabulka 9) se inkubuje s jaterními mikrozomy
(nebo rekombinantními enzymy) společně s různými koncentracemi testované látky a na konci inkubace se měří koncentrace vzniklého metabolitu
v každé reakci s jednotlivými koncentracemi testované látky. Pokud dochází
k poklesu vzniku metabolitu, dochází k inhibici izoenzymu testovanou látkou a je možné určit i IC50. IC50 je taková koncentrace testované látky, která
způsobí 50% inhibici enzymové aktivity.
2
Transfekce je metoda, která umožňuje vnesení nukleových kyselin do buněk pomocí lipozomů.
47
Tabulka 9 Substráty doporučené FDA pro in vitro inhibiční studie izoenzymů P450
CYP
substrát
reakce
1A2
fenacetin
7-ethoxyresorufin
O-deethylace
O-deethylace
2B6
efavirenz
bupropion
hydroxylace
hydroxylace
2C9
tolbutamid
diklofenak
methylhydroxylace
4’-hydroxylace
2C19
S-mefenytoin
omeprazol
4’-hydroxylace
5-hydroxylace
2D6
dextrometorfan
O-demetylace
2E1
chlorzoxazon
6-hydroxylace
3A4/5
midazolam
testosteron
1-hydroxylace
6β-hydroxylace
Pro testování inhibice enzymů P450 se používají jaterní mikrozomy nebo rekombinantní enzymy. Jaterní mikrozomy jsou bližší in vivo podmínkám než
rekombinantní enzymy a pokud jsou smíchány od více donorů, eliminuje se
i riziko interindividuální variability. V případě použití rekombinantních enzymů je možné provádět experimenty i v 384 jamkovém formátu a nehrozí
riziko interindividuální variability. V testovacím systému je ovšem pouze jediný izoenzym, ostatní nejsou přítomny, na rozdíl od jaterních mikrozomů.
Enzymy mohou být inhibovány reverzibilně a ireverzibilně. Reverzibilní inhibice je způsobena nekovalentní vazbou testované látky na enzym.
K obnovení katalytické aktivity u ireverzibilní inhibice dochází až po nasyntetizování nového enzymu.
Při spolupodání dvou látek, kdy jedna je metabolizovaná izoenzymem
P450, který druhá látka silně inhibuje, je vysoké riziko vzniku lékové interakce, které může vést až ke stažení látky z pozdních fází klinického vývoje
nebo dokonce z trhu. Proto látkám, které jsou v preklinickém vývoji identifikovány jako potentní inhibitory P450 (mají IC50 < 1 μM), hrozí vyřazení
z dalšího vývoje (obzvláště u látek způsobujících ireverzibilní inhibici).
48
2.5 Mechanizmy exkrece léčiv, faktory ovlivňující exkreci
Mezi základní exkreční orgány patří játra a ledviny. Oba tyto orgány jsou
nezastupitelné pro vylučování celé řady léčiv a ve většině případů se podílí
současně na exkreci látky nebo jejích metabolitů z těla. V optimálním případě je léčivo a jeho metabolity eliminováno oběma cestami, tj. při selhávání jaterní nebo ledvinové cesty exkrece nedojde ke kumulaci léčiva v těle.
K tomu se přihlíží i při vývoji léčiv.
Ledvinnou exkrecí jsou eliminována především nízkomolekulární hydrofilní léčiva, která nejsou vázaná na krevní bílkoviny a filtrují se v glomerulu do primární moči. Podobně jsou eliminovány i hydrofilní metabolity
a konjugáty léčiv. Organické kyseliny a konjugáty navíc mohou být sekretovány do moče mechanizmem aktivní tubulární sekrece. Některá léčiva jsou
naopak mechanizmem pasivní tubulární reabsorpce vracena do krve. Pro
tento proces je zásadní ionizace těchto léčiv v závislosti na pH moči. Alkalizace nebo okyselení moči může ovlivnit exkreci slabých bází nebo kyselin,
jelikož se zvýší ionizace v primární moči a znemožní se reabsorpce léčiv.
Jaterní biliární exkrece je podobně jako ledvinná aktivní tubulární sekrece řízena transportéry (viz obrázek 9). V hepatocytech se na kanalikulární
membráně nacházejí efluxní transportéry, které především řídí exkreci konjugátů do žluče. Konjugáty se mohou v tlustém střevě štěpit a dekonjugované
léčivo se opět vstřebává – dochází k enterohepatální cirkulaci.
Řada léčiv je exkretována do minoritních cest exkrece – např. do slin,
potu nebo mateřského mléka. Malé molekuly mohou být rovněž exhalovány
plícemi, např. ethanol. Moč při tzv. metabolických studiích, případně žluč
odebraná z kanyly žlučovodu experimentálního zvířete, jsou vhodné pro
hledání metabolitů vyvíjeného léčiva.
Literatura
Everything you needed to know about ADME, but were too afraid to ask! Cyprotex, 2006.
Gad SC. Preclinical development handbook. Hoboken, N. J.: Wiley Interscience, 2008.
ISBN: 9780470248478.
Kučera O, Lotková H, Křiváková P, Roušar T, Červinková Z. Modelové systémy pro
studium toxického poškození hepatocytů in vitro. Československá fyziologie, 2006;
55 (3): 52–59.
Mensch J, Melis A, Mackie C, Verreck G, Brewster ME, Augustijns P. Evaluation of various PAMPA models to identify the most discriminating method for the prediction
of BBB permeability. Eur J Pharm Biopharm. 2010; 74(3): 495–502.
49
Pávek P. Přenašeče (transportéry) xenobiotik. In: Skálová L, Boušová I. Metabolismus
léčiv a jiných xenobiotik. Praha: Karolinum, 2013. pp. 80–90. ISBN 9788024619170.
Pávek P, Červený L, Mičuda S, Štaud F, Novotná-Čečková M, Fendrich Z. Nukleární
receptory: xenosenzory zprostředkující odpověď organismu na xenobiotika a příčina
některých lékových interakcí. Remedia, 2005; 15: 4–5.
Pavek P, Dvorak Z. Xenobiotic-Induced Transcriptional Regulation of Xenobiotic Metabolizing Enzymes of the Cytochrome P450 Superfamily in Human Extrahepatic
Tissues. Curr Drug Metab., 2008 9: 129–43.
Shargel L, Wu-Pong S, Yu ABC. Applied biopharmaceutics & pharmacokinetics. 6th ed.
Skálová L, Boušová I. Metabolismus léčiv a jiných xenobiotik. Praha: Karolinum, 2013.
ISBN 9788024619170.
Trojan S. a kol.: Lékařská fyziologie. 3rd ed. Praha: Grada Publishing, 1999.
ISBN: 9788071697886.
Tsuji A. Impact of transporter-mediated drug absorption, distribution, elimination and
drug interactions in antimicrobial chemotherapy. J. Infect. Chemother., 2006, 12(5):
241–50.
Wu W, McKown LA: In Vitro Drug Metabolite Profiling Using HepaticS9 and Human
Liver Microsomes. In: Caldwell GW, Yan Z. Optimization in drug discovery: in vitro
methods. Totowa, N. J.: Humana Press, 2004. ISBN: 1588293327.
Zeitlinger MA, Derendorf H, Mouton JW, Cars O, Craig WA, Andes D, Theuretzbacher U. Protein binding: do we ever learn? Antimicrob Agent Chemother, 2011, 55(7):
3067–74.
Zhang D, Surapaneni S. ADME-enabling technologies in drug design and development.
Hoboken, N. J.: John Wiley & Sons, 2012. ISBN: 9780470542781.
50
3 Základní farmakokinetické parametry,
výpočet a praktický význam ve vývoji léčiv
Cílem farmakokinetiky je studium kvantitativních zákonitostí pohybu
léčivých látek v organizmu nebo vstupu do něj. Komplexnost organizmu
často redukujeme na modely, kterými simulujeme farmakokinetiku léčiv
a snažíme se pomocí těchto modelů predikovat chování léčiv v těle. Charakteristiky těchto modelů pro dané léčivo se označují jako farmakokinetické
parametry. Farmakokinetické parametry nám dovolují přehledným způsobem kvantitativně charakterizovat farmakokinetiku léčiva. Pomocí těchto
parametrů jsme schopni kvantitativně hodnotit a srovnávat různé látky co
se týče jejich celkové farmakokinetiky, i jednotlivých farmakokinetických
procesů (ADME). Některé farmakokinetické parametry charakterizují celkové chování léčiva, jiné naopak popisují elementární farmakokinetický
proces odehrávající se v některém orgánu.
Probrat všechny farmakokinetické parametry a vysvětlit zevrubněji farmakokinetické modelování léčiv je nad rámec tohoto učebního materiálu.
Budeme se proto soustředit pouze na farmakokinetické parametry zásadní
pro vývoj léčiv v rámci ADMETox.
V prvé řadě musíme zmínit farmakokinetické parametry charakterizující
eliminaci léčiva.
Biologický poločas léčiva (t1/2) je charakterizován jako čas, za který poklesne plazmatická koncentrace léčiva po i. v. podání na poloviční hodnotu
koncentrace dosažené teoreticky v čase nula.
Biologický poločas se uvádí v hodinách nebo ve dnech (viz obrázek 12).
Obecně biologický poločas říká, jak rychle se eliminuje látka z organizmu.
Z hlediska optimálních vlastností ADMETox vyvíjených léčiv by t1/2 měl
být v rozmezí 12–48 hodin tak, aby vyvíjené léčivo mohlo být aplikováno
pokud možno jednou denně. Nevhodné jsou krátké časy eliminace nebo naopak příliš dlouhé biologické poločasy. V těchto případech dochází k rychlé
eliminaci látky z organizmu nebo naopak ke kumulaci léčiva v organizmu.
Zkušený farmaceutický chemik by měl usilovat již v rámci designu molekuly o navržení optimálně metabolicky stabilní molekuly. Pravidla, jak má
optimální léčivo z pohledu metabolických vlastností a jeho stability vypadat,
lze najít v literatuře uvedené pod touto kapitolou.
51
Obrázek 12 Plazmatický profil hypotetického léčiva po perorálním a intravenózním podání
Další klíčový farmakokinetický parametr z pohledu ADMETox vlastností je
biologická dostupnost (F). Udává podíl látky, který se dostane do tzv. centrálního kompartmentu po perorálním podání k množství látky, které je
aplikováno po i. v. podání. Vypočítá se jako poměr ploch pod plazmatickou
křivkou po perorálním podání extrapolovaný do nekonečna ku poměru
po i. v. podání stejné dávky extrapolovaný do nekonečna.
0–∞
AUCp.o.
F=
0–∞
AUCi.v.
Biologická dostupnost se vyjadřuje v procentech nebo v bezrozměrných
relativních hodnotách v rozmezí 0–100 (resp. 0–1). Hodnota F = 0.5 (50 %)
značí, že se v porovnání s intravenózní aplikací stejné dávky léčiva, po perorální aplikaci do krevního oběhu dostala pouze polovina dávky. Druhá
polovina byla metabolizována při tzv. prvním průchodu játry (first pass
52
3 Základní farmakokinetické parametry, výpočet a praktický význam ve vývoji léčiv
effect) před tím, nežli se dostala do oběhu nebo se vůbec nevstřebala a odešla se stolicí.
Optimální hodnota biologické dostupnosti je samozřejmě 100%. Tu
však u léčiv málokdy pozorujeme. U nově vyvíjených léčiv by měla tato
hodnota, určená nejčastěji farmakokinetickou analýzou na laboratorních
potkanech nebo myších, dosahovat alespoň 50 %. Nevstřebává-li se vyvíjené léčivo v optimální míře, není ještě proces vývoje ztracen. Vývojový tým
může zvážit alternativní cestu podání, především intravenózní podání, při
které se veškerá látka dostává do centrálního kompartmentu a nedochází
k presystémové eliminaci při prvním průchodu játry.
Třetím důležitým farmakokinetickým parametrem je distribuční objem
(Vd). Definice distribučního objemu je poměrně komplikovaná, pro účel
těchto skript zmiňme jen, že Vd charakterizuje distribuci látky v organizmu a informuje nás o možné kumulaci léčiva v organizmu. Vd se vypočítá po intravenózním podání jako poměr aplikované dávky D k počáteční
koncentraci C0.
Vd =
D
C0
Jednotkou distribučního objemu jsou litry, případně litry na kilogram tělesné hmotnosti. Je-li Vd větší než 5 l, látka se distribuuje mimo krevní řečiště
a dobře prokrvené orgány – souhrnně se tento kompartment označuje jako
centrální kompartment. Pokud je hodnota Vd rovna 15 l, distribuuje se látka
pouze do extracelulární tekutiny. Můžeme se ale setkat s hodnotami Vd přesahujícími celkový objem těla (asi 42 l); v tomto případě se látka kumuluje
a ukládá např. v tukové tkáni nebo v kostech. Pro vyvíjenou látku je takováto
kumulace nevhodná a je potřeba zvážit další vývojové možnosti.
Neméně důležitými farmakokinetickými vlastnostmi jsou clearance (celková, hepatální nebo ledvinná), volná nevázaná frakce, rychlost vstřebávání,
eliminační rychlostní konstanta aj. Pro detailní studium farmakokinetických
parametrů odkazujeme na literaturu uvedenou na konci kapitoly.
Literatura
Shargel L, Wu-Pong S, Yu ABC. Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics. 6th ed.
Záthurecký a kol. Biofarmácia a farmakokinetika. Martin: Osveta, 1989. ISBN 8021700688.
53
4 In silico predikce ADMETox
Místo in silico predikce optimálních ADMETox vlastností vyvíjených léčiv je
na samém začátku vývoje léčiva (viz obrázek 1 a 2). V optimálním případě
by hit (tj. látka s perspektivní biologickou aktivitou), měl být neprodleně
podroben in silico i in vitro ADMETox analýze. In silico ADMETox analýza
by měla rovněž provázet fázi lead optimalization (tzn. fáze optimalizace
klíčové předlohové struktury před další syntézou) i fázi výběru kandidátní
molekuly pro klinické testování. Jinak řečeno, s ADMETox by se nemělo
v racionálním vývoji léčiv otálet.
In silico predikce využívá empirických vztahů mezi fyzikálně-chemickými vlastnostmi látek a jejich ADMETox vlastnostmi, vyjádřenými buď
jako určitá pravidla designu molekul nebo využívá počítačovou predikci
ADMETox vlastností látek na základě jejich struktury. V druhém případě
je predikce ADMETox vlastností založena na chemoinformatických kvantitativních vztazích mezi strukturou a biologickou aktivitou (QSAR) velké
knihovny látek, na základě které jsou softwarem přiřazeny látce s určitou
mírou spolehlivosti farmakokinetické vlastnosti. Mezi nejznámější přístupy
in silico predikce ADMETox vlastností bezesporu patří Lipinského pravidlo
pěti (Rule of 5, rule of thumb), které navrhnul v roce 1997 Christopher
A. Lipinski. Toto pravidlo charakterizuje optimální fyzikálně chemické
vlastnosti léčiv podávaných perorální cestou. Pravidlo říká, že špatnou absorpci léčiv můžeme očekávat, jestliže:
– molekulová hmotnost je větší než 500
– lipofilita log P je vyšší než 5
– látka má víc než 5 donorů vodíkových vazeb (atomů dusíku nebo kyslíku
s navázaným jedním nebo více vodíky)
– má víc než 10 akceptorů vodíkových vazeb (atomů dusíku nebo kyslíku)
Lipinského pravidlo nás informuje o tzv. drugability nebo drug-likeness,
tj. jaké vlastnosti by mělo mít léčivo, aby mělo optimální vlastnosti pro
perorální podání. Pravidlo se nevztahuje na intravenózně podané látky
a na léčiva, která jsou transportována ve střevě transportéry. Avšak pozor,
neinformuje nás o tom, jaké vlastnosti by měla mít naše lead struktura. Protože předlohové struktury bývají často během optimalizace na potenciální
54
4 In silico predikce ADMETox
lečiva modifikovány na látky s větší molekulovou hmotností a vyšší lipofilitou, navrhnul v roce 2003 Congreve se spolupracovníky Pravidlo 3 (Rule
of 3). Toto pravidlo říká, že optimální vlastnosti lead struktury by měly být:
– molekulová hmotnost < 300
– donory vodíkových můstků ≤ 3
– akceptory vodíkových můstků ≤ 3
– lipofilita Clog P ≤3
Bylo navrženo několik modifikací Lipinského pravidla, která berou v úvahu
např. počet volně otáčivých vazeb nebo polární povrchovou plochu (PSA)
látky. Rovněž byla navržena pravidla, která optimalizují fyzikálně chemické
vlastnosti psychoaktivních látek přestupujících hematoencefalickou bariéru.
Přes všechny tyto pokroky, finální odpověď o optimálních ADMETox
vlastnostech nám podá pouze experiment, buď na in vitro modelu, nebo
lépe na modelovém zvířeti.
V současnosti je k dispozici několik ADMETox predikčních softwarů
různých firem a na Internetu jsou dostupné některé freewarové algoritmy.
Většina těchto ADMETox balíčků má v sobě současně modul pro predikci
toxických vlastností látek na základě fyzikálně-chemické struktury. Mezi
nejznámější patří následující dva balíčky:
ACD Percepta (firma ACD/Labs, Toronto, Kanada) – obsahuje fyzikálně-chemický, ADME i toxikologický modul. Predikuje na základě vlastních
algoritmů všechny základní ADMETox vlastnosti, včetně interakcí s izoenzymy cytochromu P450, P-glykoproteinovým transportérem, přestup přes
hematoencefalickou bariéru, biologickou dostupnost, markery kardiální
i hepatální toxicity, LD50 aj. Existuje i internetová verze.
ADMET Predictor (Simulation Plus Inc, USA) – opět obsahuje fyzikálně-chemický, ADME i toxikologický modul. Predikuje ADMETox vlastnosti
na základě vlastní knihovny (výrobce uvádí 30 000 látek) a na základě vlastních algoritmů fyzikálně-chemické vlastnosti látek, jejich interakce s izoenzymy cytochromu P450, P-glykoproteinem a OATP transportéry, přestup
přes hematoencefalickou bariéru, biologickou dostupnost, markery kardiální i hepatální toxicity i genotoxicity, LD50 aj. Predikuje rovněž parametry
in vitro ADME testů.
V současnosti je na internetu možno nalézt řadu volně dostupných online algoritmů pro predikci ADMETox vlastností látek. Z vlastní zkušenosti
(užíváme oba balíčky) můžeme říci, že pro přesnou predikci je vhodnější
55
si zakoupit roční licenci některého z těchto softwarů a výsledům volných
predikčních softwarů přikládat jen orientační hodnotu.
Jelikož in silico predikce pomocí ADMETox softwarů je velmi rychlá
(nevyžaduje zvláštní nároky na hardware) a, máte-li software, i levná, doporučují autoři těchto skript in silico ADMETox analýzu (tj. včetně predikce
toxických a genotoxických vlastností) provést co nejdříve v „pipeline“ vývojového projektu.
Literatura
Lipinski CA1, Lombardo F, Dominy BW, Feeney PJ. Experimental and computational
approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev. 2001; 46(1–3): 3–26.
56
5 Stručný přehled toxikologického hodnocení
látek v rámci preklinického vývoje
Léková toxicita stále patří mezi hlavní příčiny selhání léčiv v pozdějších
fázích vývoje nebo dokonce stažení z trhu. Neexistuje léčivo, které je účinné
a současně jeho užití není spojeno s rizikem komplikací. V USA je odhadem
každoročně postiženo nežádoucími účinky léků 2 miliony pacientů a z toho
jsou nežádoucí účinky příčinou 100 000 úmrtí.
Odhalení potenciálního toxického působení vyvíjeného léčiva je žádoucí
co nejdříve, redukují se tak náklady a riziko selhání léčiva v pozdějších fázích vývoje. Preklinické testování toxicity na zvířatech má svá úskalí, často
není možné detekovat určité typy toxicity kvůli mezidruhovým rozdílům
a rozdílům ve fyziologii a metabolizmu léčiv v porovnání s člověkem. V raných fázích vývoje je k dispozici řada in vitro testů pro odhalení mechanizmů toxického působení léčiva. Výhodou in vitro testů je také možnost
testování velkého množství látek v high-throughput módu, in vitro hodnocení toxicity proto také slouží pro zúžení počtu kandidátních molekul pro
in vivo testování toxicity na hlodavcích.
Jelikož je tato problematika velmi obsáhlá a komplikovaná, budeme jí
věnovat pozornost v dalších učebních textech a v této publikaci uvádíme
pouze stručný přehled možností in vitro toxikologického hodnocení látek
v preklinickém vývoji.
Mezi nejdůležitější mechanizmy toxického působení léčiv patří:
Mitochondriální toxicita
Poškození mitochondrií je častou příčinou stažení léčiv z trhu, může vést
k řadě orgánových toxicit, hlavně hepatotoxicitě, ale i kardiotoxicitě, poškození svalů a CNS. Zvýšenou pozornost k testování mitochondriální toxicity
a zavedení high-throughput metod způsobilo stažení dvou blockbusterů3,
troglitazonu a cerivastatinu, jejichž toxicita byla způsobena poškozením
mitochondrií.
3
Léčiva, jejichž roční celosvětový obrat přesahuje 1 miliardu USD.
57
Reaktivní metabolity
Toxický účinek léčiv, který způsobují reaktivní metabolity, může být dávkově
závislý (např. paracetamol), kdy je toxicita předvídatelná nebo může být
toxický účinek idiosynkratický (diklofenak, sulfamethoxazol), kdy je toxicita
nepředvídatelná, dávkově nezávislá a nezjistitelná v preklinických testech
prováděných na zvířatech. Idiosynkratické reakce jsou relativně vzácné
a mohou vznikat i jiným mechanizmem, než prostřednictvím reaktivních
metabolitů, ale mohou mít velmi vážné, až fatální následky a bohužel mohou
být objeveny až po schválení léčiva.
Genotoxické a negenotoxické karcinogeny
Karcinogeny jsou klasifikovány podle úrovně působení, genotoxické karcinogeny působí tak, že přímo interagují s DNA a jejich účinek je zpravidla
ireverzibilní. Negenotoxické karcinogeny nereagují přímo s DNA, ale působí
jinými mechanizmy, ve kterých může být zahrnuta celá řada buněčných
procesů. Predikce kancerogenity způsobené negenotoxickými mechanizmy
je velmi obtížná.
Genotoxické testování nově vyvíjených léčiv podléhá nařízení ICH normy S2(R1) z ledna 2011, kde jsou přímo popsány doporučené kombinace
testů genotoxicity. K dispozici je také řada metod, které nejsou doporučovány žádným nařízením, např. in vitro kometový test nebo genové reportérové
eseje, nacházející uplatnění hlavně v počátečních stádiích testování.
Kardiotoxicita je jednou z hlavních příčin stažení léčiv z trhu. Zavedení
in vitro screeningu v počátečních fázích vývoje léčiv se již stalo nutností
(metody využívající buněčné modely exprimující iontový kanál hERG, jehož
blokování nově vyvíjenými léčivy je považováno za velmi nebezpečné). Kardiotoxické působení léčiv způsobuje nejčastěji prodloužení QT intervalu,
které může vést ke vzniku komorové tachykardie typu torsade de pointes
a náhlé srdeční smrti.
Hepatotoxicita je také velmi častou příčinou stažení léčiv. Avšak konvenční
preklinické studie predikující hepatotoxicitu selhávají až v polovině případů,
proto bylo nezbytné vyvinout in vitro metody, založené na lidských buněčných modelech. K in vitro testování se nejčastěji používají primární lidské
hepatocyty a HepG2 hepatomová buněčná linie. Pomocí in vitro testů lze
odhalit riziko vzniku cholestatického poškození jaterního parenchymu či
nealkoholické steatózy, která se může rozvinout až v jaterní cirhózu.
58
5 Stručný přehled toxikologického hodnocení látek v rámci preklinického vývoje
Literatura
Dykens JA, Marroquin LD, Will Y. Strategies to reduce late-stage drug attrition due to
mitochondrial toxicity. Expert Rev Mol Diagn. 2007; 7(2): 161–75.
ICH harmonised tripartite guideline: Genotoxicity testing and data interpretation for
pharmaceuticlas intended for human use. S2(R1), Nov 2011.
Mechanisms of drug-induced toxicity guide. Cyprotex, 2013.
Padda MS, Sanchez M, Akhtar AJ, Boyer JL. Drug-induced cholestasis. Hepatology. 2011;
53(4): 1377–87.
Park BK et al. Managing the challenge of chemically reactive metabolites in drug development. Nat Rev Drug Discov. 2011; 10(4): 292–306.
59
6 Seznam zkratek
ABC
ADME
ADMETox
AhR
ARNT
ATP
AUC
BBB-PAMPA
BCRP
BCS
CAR
CITCO
CLin
CNS
CYP
DMPK
DRE
EMA
ER
FDA
hERG
HIA
HTS
ICH
i. v.
LADME
LC/MS
60
ATP-binding cassete
absorpce, distribuce, metabolizmus
absorpce, distribuce, metabolizmus, toxicita
arylhydrokarbonový receptor
aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
adenosintrifosfát
plocha pod křivkou (area under the curve)
blood brain barrier parallel artificial membrane assay
breast cancer resistance protein
biofarmaceutický klasifikační systém
konstitutivní androstanový receptor
6-(4-chlorophenyl)imidazo[2,1-b]
[1,3]thiazol-5-karbaldehyd O-(3,4-dichlorobenzyl) oxim
vnitřní (intrinsic) clearance
centrální nervový systém
cytochrom P450
Drug Metabolism and Pharmacokinetics
drug response element
European Medicines Agency
efluxní poměr (efflux ratio)
Food and Drug Administration
human ether-a-go-go-related gene
human intestinal absorption
high-throughput system
The International Conference on Harmonisation
of Technical Requirements for Registration
of Pharmaceuticals for Human Use
intravenózní
liberace, absorpce, distribuce, metabolizmus
kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií
6 Seznam zkratek
LDL
NCE
PK
PK/PD
MDCK
MDR
MRP
NADPH
OAT
OATP
OCT
PAMPA
PEPT
PXR
PXR-RE
P-gp
QSAR
RXRα
SLC
SULT
TCDD
UDP
UGT
UV/Vis
XRE
low density lipoprotein
new chemical entities
farmakokinetika
farmakokinetika/farmakodynamika
Madin Darbyho psí ledvinové buňky
(Madin Darby canine kidney)
mnohočetná léková rezistence (multidrug resistence)
multidrug resistance associated protein
redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát
transportér organických aniontů
(organic anion transporter)
transportní peptid organických aniontů
(organic anion transporting polypeptide)
transportér organických kationtů
(organic cation transporter)
parallel artificial membrane permeability assay
peptide transporer
pregnanový X receptor
responzivní element PXR
P-glykoprotein
quantitative structure – activity relationship
retinoidní X receptor
solute carrier family
sulfotransferáza
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
uridindifosfát
UDP-glukuronosyltransferáza
ultrafialovo-viditelná spektroskopie
xenobiotic response element
61
Autoři
PharmDr. Alice Nová, Ph.D.
– pracuje na Ústavu molekulární a translační medicíny Lékařské fakulty
Palackého Univerzity v Olomouci, oddělení farmakologie a toxikologie,
vystudovala Farmaceutickou fakultu Univerzity Karlovy, doktorát získala
na Katedře farmakologie a toxikologie Farmaceutické fakulty Univerzity
Karlovy
Prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D.
– pracuje na Farmaceutické fakultě Univerzity Karlovy v Hradci Králové
a Ústavu molekulární a translační medicíny Palackého Univerzity v Olomouci, profesor farmakologie
– zabývá se experimentální i klinickou farmakokinetikou, ADMETox,
biofarmacií a biofarmaceutickými buněčnými modely, interakcemi léčiv a přírodních látek s biotransformačními enzymy cytochromu P450,
transportéry a nukleárními receptory
– založil Centrum vývoje léčiv při Farmaceutické fakultě UK
– vedoucí projektu centra excelence zabývající se interakcemi přírodních
potravních doplňků s léčivy
62
PharmDr. Alice Nová, Ph.D.
Prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D.
Základy ADME
a toxického hodnocení léčiv v preklinickém vývoji
Výkonná redaktorka prof. PaedDr. Libuše Ludíková, CSc.
Odpovědná redaktorka Vendula Drozdová
Technická redaktorka Jitka Bednaříková
Grafické zpracování obálky Jiří Jurečka
Publikace ve vydavatelství neprošla jazykovou redakční úpravou.
Vydala a vytiskla Univerzita Palackého v Olomouci
Křížkovského 8, 771 47 Olomouc
www.vydavatelstvi.upol.cz
www.e-shop.upol.cz
[email protected]
1. vydání
Olomouc 2015
Ediční řada – Skripta
ISBN 978-80-244-4539-7
Neprodejná publikace
VUP 2015/0163

Základy ADME a toxického hodnocení léčiv v

Transkript

Podobné dokumenty

Sborník

Protiinfekční a protiinvazní látky.

Echo - Technologické centrum AV ČR

XXXVI. Májové hepatologické dny

SOUHRN ÚDAJŮ O PŘÍPRAVKU Tento léčivý přípravek

Filip Vaníček

Leflon - PharmaSwiss

Celé číslo 3/2008 v pdf - Zdravotnictví v České republice

SPC - UCB

Biosimilars průvodce - Česká Asociace Farmaceutických Firem

Synlabianer 2016/02

na úvod - Genoservis, a.s.

IP 02 LP laboratorní příručka verze 4

sborník konference

Prezentace aplikace PowerPoint

Teze - Akademie věd ČR - Akademie věd České republiky

Rejstřík

INTERAKCE INHIBITORŮ CYKLIN- DEPENDENTNÍCH KINÁZ S