Stanovení chininu v kůře chinovníku pomocí HPLC s

Stanovení chininu v kůře chinovníku pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí
Úkol:
Stanovte obsah chininu ve vzorku sušené kůry chinovníku pomocí vysokoúčinné kapalinové
chromatografie s amperometrickou detekcí
Teoretická část:
Domovem chinovníku (Cinchona sp.) je Jižní Amerika, díky svým léčivým účinkům zde byl však téměř
vyhuben. Kůru chinovníku jako první využívali ke snižování horečky indiáni. Kromě antipyretických
má chinovník také protizánětlivé, analgetické a antimalarické účinky. Po staletí byl jediným lékem
proti malárii. Kůra stromu obsahuje kromě chininu několik dalších alkaloidů chinolinového typu.
Dnes se chininu využívá především v potravinářství pro jeho povzbuzující účinky a hořkou chuť jako
aditiva do různých nápojů (tonic).
chinin
Chinin je téměř nerozpustný ve vodě (0,05 g/100 ml), mírně rozpustný ve vroucí vodě, ochotně se však
rozpouští v alkoholech, dále je rozpustný v např. v etheru nebo v chloroformu, pKa1 = 4,5; pKa2 =
8,5[1]. Pod UV zářením fluoreskuje, čehož se hojně využívá pro jeho analytické stanovení [2].
Alternativně je pro analýzu chininu a jeho derivátů možné využít také citlivé elektrochemické detekce.
Při dostatečně vysokém kladném potenciálu dochází k anodické oxidaci skeletu chininu, která
poskytuje analyticky využitelný proudový signál.
Praktická část:
Přístroje
HPLC systém ESA sestávající z izokratické pumpy a tlumiče pulzů (Model 582), potenciostatu
(Coulochem III), guard cely vřazené před dávkovací zařízení (Model 5020)a detekční cely (Model
5040) s tenkovrstvou borem dopovanou diamantovou elektrodou a hydrogen-palladiovou referentní
elektrodou; ultrazvuk; elektromagnetická míchačka, pH metr; analytické váhy
Chromatografické podmínky
• Kolona: Polaris AQ C18 150 x 3.0 mm (I.D.), 3 um
• Mobilní fáze: dihydrogenfosforečnan sodný (20 mmol/l, pH 3)/acetonitril, 75/25 (v/v)
• Průtoková rychlost: 0,4 ml/min
• Detektor: Coulochem III, cela ESA 5040, BDD pracovní elektroda
• Citlivost: 2 uA/V
• Pracovní potenciál: +1300 mV (vs. Pd/H2)
• Nástřik: 10 μl
Chemikálie
acetonitril (gradient grade), methanol (gradient grade), kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan
sodný, standard chininu, deionizovaná voda, vzorek – kůra chinovníku
Pomůcky
kádinky, odměrný válec (100 ml), odměrné baňky (25 ml), třecí miska s tloučkem, filtrační aparatura
pro vakuovou filtraci opatřená nylonovým filtrem s velikostí pórů 0,2 μm , teflonové míchadélko, inj.
stříkačka Hamilton (25 μl), plastová stříkačka, stříkačkový filtr o porozitě 0,45 μm, plastové vialky
Eppendorf (1,5 ml).
Postup
•
•
•
Příprava mobilní fáze
Příprava kalibračních roztoků
Příprava vzorků
Připravíme mobilní fázi smícháním příslušných komponent. Vodná složka obsahující pufr (pH se
upraví titrací kyselinou fosforečnou) musí být přefiltrována přes filtr o porozitě 0,2 um, aby se
odstranily případné mechanické nečistoty. Výsledná mobilní fáze se krátce odplyní za sníženého tlaku
a případně probublá proudem helia v zásobní láhvi HPLC systému.
Zhomogenizovaný vzorek kůry chinovníku se suší v sušárně při 80°C do konstantní hmotnosti, poté se
přesně odváží asi 1 g kůry a extrahuje směsí metanol/mobilní fáze (50/50, v/v) v ultrazvukové lázni po
dobu 15 minut. Suspenze se zfiltruje přes filtr o porozitě 0,45 um, naředí na požadovanou koncentraci
mobilní fází a přímo nastřikuje do HPLC systému.
Asi 10 mg standardu se přesně odváží do 25 ml baňky a doplní metanolem po rysku. Zásobní roztok se
dle potřeby rozředí do 6 vialek pro analýzu jednotlivých kalibračních bodů.
Vyhodnocení
Ze záznamu analýzy reálného vzorku se nejprve provede identifikace píku analytu na základě shody
retenčních charakteristik se standardem, případně standardním přídavkem standardu ke vzorku (tzv.
spikováním). Vyhodnocení se provádí metodou externího standardu pomocí kalibrační křivky. Tu
získáme analýzou standardních roztoků chininu o různých koncentracích volených tak, aby pokryla
očekávaný obsah chininu v reálném vzorku (5-15 % w/w). Každé měření se provádí alespoň ve třech
opakováních. Z regresní rovnice zjištěný obsah chininu se přepočítá na původní navážku vzorku.
Literatura
[1] L. Geiser, Y. Henchoz, A. Galland, P.A. Carrupt, J.L. Veuthey, J. Sep. Sci., 28 (2005) 2374-2380.
[2] M. David V, J. Chromatogr. A, 967 (2002) 1-19.